CN1154731C

CN1154731C - 啤酒花潜伏病毒基因及该病毒的检测方法

Info

Publication number: CN1154731C
Application number: CNB961203706A
Authority: CN
Inventors: 须田成志; 儿; 丝贺裕; 畑谷达儿
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 2004-06-23
Anticipated expiration: 2016-10-28
Also published as: AU7033796A; SK138896A3; AU717790B2; CA2188900A1; JPH09173100A; US6132960A; DE69635882D1; CZ293438B6; CZ317096A3; EP0775747A2; DE69635882T2; SK283202B6; EP0775747A3; CN1157325A; EP0775747B1; US5869235A

Abstract

本发明公开了啤酒花潜伏病毒感染株的有效的基因诊断法。还涉及在来自啤酒花潜伏病毒基因组的基因中，编码啤酒花潜伏病毒外壳蛋白并具有序列表的序列号1的碱基序列的DNA。

Description

啤酒花潜伏病毒基因及该病毒的检测方法

本发明涉及啤酒花潜伏病毒基因及该病毒的检测方法。

啤酒花潜伏病毒(Hop Latent Virus，以下简称HLV)被认为广泛地感染啤酒花栽培地区的啤酒花(Tresh & Ormerod，Rep.E.Malling Res.Stn for 1968：41(1969)，Probas.co & Skotland，植物病理学68：277(1978)，Adams & Barbara，应用生物学年鉴101：483(1982)，Inoue et al.，Ann.Phytopath Soc.Japan 3.9：229(1973)。

这种HLV是属于香石竹潜病毒组的丝状体，关于其基因结构和蛋白质的一级结构等还不清楚。因此，在啤酒花中，当制作无病毒菌落时，作为无病毒菌落的选别方法，采取使用抗HLV抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。但是，在利用ELISA的HLV检测诊断中，因试样采集期的不同而产生检定精度低和抗体制作费事等种种问题。

鉴于上述状况，本发明的目的是，通过开发HLV感染株的有效且可靠的基因检测法来解决上述课题。

为了达到上述目的，本发明人首先对HLV基因进行解析、研究，结果，率先鉴别了HLV的外壳蛋白基因，成功地解释清楚其碱基序列，进而也解释清楚其蛋白质的一级结构。利用所得到的HLV外壳蛋白基因或其一部分或者基于这些碱基序列而合成的合成DNA，借助遗传学的方法可以检测HLV。作为该遗传学的方法，例如可举出聚合酶链式反应法(PCR)和Southern杂交法等。例如，在PCR中使用具有该碱基序列的一部分或包含其互补序列的DNA为引物，通过特异于HLV感染植物的DNA扩增产物的产生，进行HLV的检测。进而，在以HLV基因的互补链DNA作为探针进行杂交的情况下，通过在HLV感染株上出现特异的阳性条带，就能检测HLV感染株。

因此，本发明的第一个方面是编码啤酒花潜伏病毒的外壳蛋白具有序列表的序列号1的碱基序列的DNA。

在上述序列表的序列号1的碱基序列之中，第58-975位的碱基序列编码306个氨基酸残基。

在序列表的序列号1中记载的碱基序列之中，第981-1292位碱基序列编码104个氨基酸残基。

编码上述HLV外壳蛋白基因(包括DNA、RNA)或其部分，都可以用于上述遗传学检测方法。在PCR和Southern杂交中，可以优先使用序列表中的下述碱基序列作为探针，例如：

a)序列号2(相当于序列号1中的第405-423位)；

b)序列号3(相当于序列号1中的第457-474位)；

c)序列号4(相当于序列号1中的第618-637位)；

d)序列号5(相当于序列号1中的第761-781位)。

这些DNA也可以从由HLV提取并纯化的RNA得到，而且可以使用自动DNA合成仪制得。尤其，在像序列号2-5那样的短单链DNA的情况下，可以简便地通过合成而得到。

本发明的另一个方面是啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征是，以从啤酒花提取的核酸作为模板，通过使用上述序列号2-5的任一种合成DNA作为探针进行反转录PCR以进行DNA的扩增，对所得到的扩增产物进行电泳分析。

更详细地说，使用序列号2的合成DNA和序列号4的合成DNA作为引物，通过反转录PCR进行DNA的扩增，在将所得的扩增产物进行电泳分析时，根据有无233碱基对的特异DNA片段存在，可以检测啤酒花潜伏病毒。

类似地，使用序列号3的合成DNA和序列号4的合成DNA作为模板，通过反转录PCR进行DNA扩增，在将所得到的扩增产物进行电泳分析时，根据有无181碱基对的特异DNA片段存在，可以检测啤酒花潜伏病毒。

使用序列号2的合成DNA和序列号5的合成DNA作为模板，利用反转录PCR进行DNA扩增，在将所得到的扩增产物进行电泳分析时，根据有无377碱基对的特异DNA片段存在，可以检测啤酒花潜伏病毒。

使用序列号3的合成DNA和序列号5的合成DNA作为模板，利用反转录PCR进行DNA的扩增，在将所得到的扩增产物进行电泳分析时，根据有无325碱基对的特异DNA片段存在，可以检测啤酒花潜伏病毒。

本发明另一个方面是啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征是，将序列号4或5的合成DNA或者用该DNA作为引物延伸合成的互补链DNA作为探针，与从啤酒花提取的核酸进行杂交。

本发明的再一个方面是啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征是，以序列号1的DNA的限制性内切酶切片段作为探针与从啤酒花提取的核酸进行杂交。

本发明的又一个方面是啤酒花潜伏病毒的外壳蛋白，该外壳蛋白是从序列表的序列号1的碱基序列中的第58-975位碱基序列翻译来的，具有序列表的序列号6的306个氨基酸残基序列。

图1示出由蛋白质序列分析仪分析得到的啤酒花潜伏病毒的外壳蛋白的氨基酸序列。

图2示出用PCR对啤酒花潜伏病毒进行基因诊断而得到的电泳图。

按以下次序分析HLV的基因，鉴别HLV的外壳蛋白基因，弄清楚其碱基序列。

(1)HLV的分离

按照常规方法可以从HLV感染的啤酒花中分离出HLV，例如可以利用聚乙二醇浓缩病毒、利用有机溶剂和热处理使抽提物澄清化、分级离心分离、蔗糖密度梯度离心等来进行。

(2)从HLV提取RNA

从HLV中提取RNA，例如可以利用主要用于其他植物病毒的SDS-酚法等来实现。

(3)cDNA的克隆

以从HLV颗粒中提取的RNA作为模板，利用Gubler-Hoffman法(Gubler & Hoffman.Gene，25，263(1983))，体外内合成双链cDNA。利用常规方法进行连接，将合成的cDNA掺入到质粒载体中。作为质粒可举出pUC119、pBluescriptII等。使用上述连接混合物进行大肠杆菌转化，从所得到的转化子中按常规方法选择克隆cDNA的重组质粒，并进行纯化。

(4)来自HLV基因组的cDNA碱基序列的确定

使用按上述方法得到的重组质粒，采用Maxam-Gilbert法(Maxam & Gilbert，Proc，Natl.Acad.Sci.，74，560(1977))或者双脱氧法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463(1977))确定碱基序列。

由此确定含有编码HLV外壳蛋白的基因(以下简称HLV外壳蛋白基因)的DNA的碱基序列，在序列表的序列号1中记载了该序列。

(5)HLV外壳蛋白的部分氨基酸序列的确定

利用蛋白酶将HLV外壳蛋白部分消化后，用高效液相色谱法进行分离、纯化，然后用蛋白质测序仪(ABI社制造)来确定HLV外壳蛋白的部分氨基酸序列。在图1中示出像这样确定的HLV外壳蛋白的部分氨基酸序列。通过将这部分氨基酸序列与从序列表的HLV外壳蛋白基因的碱基序列预测的HLV外壳蛋白的氨基酸序列进行比较研究，就清楚外壳蛋白的一级结构(氨基酸序列)(参照图1)。

(6)HLV感染的啤酒花的病毒基因诊断

①利用反转录PCR法的基因诊断

利用常规方法合成具有由上述方法确定的HLV外壳蛋白基因碱基序列或该碱基序列的互补序列中的部分碱基序列的大约20个碱基的引物DNA，使用PCR法根据是否得到扩增产物，可以诊断HLV感染的啤酒花的病毒基因。

引物可以使用具有序列表的序列号2-5的碱基序列的寡聚核苷酸。其中，序列表的序列号2的碱基序列与序列号1的碱基序列中的第405-423位碱基序列相同，以下简称3P。序列表的序列号3的碱基序列与序列号1的碱基序列中的第457-474位碱基序列相同，以下简称4P。另外，序列表的序列号4的碱基序列是序列号1的碱基序列中的第618-637位碱基序列的互补序列，以下简称3M。序列表的序列号5的碱基序列是序列号1的碱基序列中的第761-781位碱基序列的互补序列，以下简称4M。

另外，具有序列表的序列号2-5号所示碱基序列的一部分序列的合成寡聚核苷酸也可以作为引物使用。即，因为PCR本来是将从许多碱基序列中得到的特定的基因信息扩增的方法，所以如果是具有与本发明引物的碱基序列近似的碱基序列的寡聚核苷酸，则同样可以作为引物使用。

在本发明的中使用的引物DNA，例如可以使用利用β-氰乙基磷酰胺酸法或硫代硫化物法的市售的自动DNA合成仪得到。

在本发明中使用的啤酒花植物的核酸，可以用常规方法提取，如普通的核酸提取方法。

使用这样得到的啤酒花核酸和上述的引物，通过病毒RNA的反转录和PCR使来自HLV基因组的DNA进行扩增。PCR是反复进行由变性过程、引物退火过程和利用DNA聚合酶产生的延伸过程组成的DNA复制循环，例如在Saiki等，Science第230卷，1350-1354页等中所记载的普通方法。

作为在本发明中进行的PCR，可以举出以下方法，即在含有预先添加了合成寡聚核苷酸、DNA聚合酶、4种碱基(dATP、dTTP，dCTP、dGTP)和啤酒花DNA的约1.0mM-约4.0mM、最好约1.5mM-约3.0mM的氯化镁、氯化钾、明胶、牛血清白蛋白、表面活性剂(Tween 20、NP-40、Triton X-100等(均是商品名))、二甲亚砜等的扩增用缓冲液中，反复进行约20次至约50次，最好约25次至约40次的DNA复制循环的方法。

再者，在PCR中的各过程，例如可以在下述条件下进行。

变性过程通常是通过在90-95℃、最好约94-95℃加热约1-3分钟、最好约1-2分钟来进行。

引物退火过程通常是通过在30-50℃、最好约35-42℃进行约1-3分钟、最好约1-2分钟的引物温育来进行。

由DNA聚合酶产生的延伸过程，通常是通过在约70-73℃、最好约72-73℃进行约1-4分钟、最好约2-3分钟的耐热性DNA聚合酶处理来进行。耐热性DNA聚合酶可以举出PERKIN ELMER公司制造的耐热性DNA聚合酶等市售品。

由上述PCR得到的扩增DNA，采用在通常的DNA分离中使用的电泳法进行分离。一般可以使用约0.2％至约2％的琼脂糖凝胶。作为电泳中使用的缓冲液，可举出三磷酸系(pH7.5-8.0)、三乙酸系(pH7.5-8.0)、三硼酸系(pH7.5-8.3)等，最好是三硼酸系。另外，根据需要可以添加EDTA等。

作为电泳条件，例如是50-300V、10-20分钟，最好是150V、30分钟，作为分子量大小标记物，例如可以使用100Base-PairLadder(Pharmacia公司制造)等市售品。

例如可以使用溴化乙锭等物质，在暗处对凝胶照射254nm或366nm的紫外线，即使在电泳过程中也能检测DNA和溴化乙锭的结合体的红色条带。不过，通常是在电泳结束后，将凝胶在溴化乙锭等物质溶液中浸渍约10分钟至60分钟，然后在暗处对凝胶照射254nm或366nm的紫外线，检测DNA和溴化乙锭结合体的红色条带。

根据有无被检测的扩增DNA存在，能够识别病毒感染。即，在使用同一引物进行PCR时，来自病毒感染的啤酒花，检测出特异的扩增DNA，来自未感染的啤酒花，检测不出特异的扩增DNA。

例如，在权利要求9所述的方法中，根据有无233碱基对的特异DNA片段，在权利要求10所述的方法中，根据有无181碱基对的特异DNA片段，在权利要求11所述的方法中，根据有无377碱基对的特异DNA片段，另外在权利要求12所述的方法中，根据有无325碱基对的特异DNA片段，分别可以检测啤酒花潜伏病毒。

②利用杂交的基因诊断

利用化学合成或基因操作制备具有与HLV外壳蛋白基因互补的序列的寡聚核苷酸，用该寡聚核苷酸作为探针进行杂交，可以进行与以往的免疫学方法不同的诊断。

作为探针，通常使用链长20至数千碱基，例如可举出具有序列表的序列号6和7的碱基序列的那些，以及由HLV外壳蛋白基因克隆的质粒制备的cDNA用限制酶消化的DNA片段，这些探针在用同位素、生物素荧光物质等按照常规方法标记后，用于杂交。

杂交中使用的啤酒花植物的核酸，可以利用常规方法提取，例如可以利用Murray & Thompson，Nucl.Acid Res.，8，4321-4325(1980)等中记载的普通核酸提取法进行。所得到的核酸在变性处理后，点在过滤膜上。过滤膜可以使用硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜等，例如Hybond-N⁺(Amersham公司制造)是理想的。

将核酸在含有甲酰胺、甲醛、MOPS、乙酸钠、EDTA等的变性溶液中，在69-70℃、最好65℃，进行5-20分钟、最好15分钟的热处理后急冷，进行核酸的变性处理。变性处理后，添加20XSSC进行混合，在过滤膜上进行点样。

使用这样得到的过滤膜(点有啤酒花核酸)和上述探针在杂交溶液中，在42-65℃、最好46℃，进行12-20小时、最好16小时的杂交。然后润湿过滤膜，进行干燥，利用放射自显影术等检测手段观察有关斑点的信号。

即，来自病毒感染的啤酒花的核酸，由于进行了杂交，可以检测出信号，而来自未感染的啤酒花的核酸，由于未杂交，所以没有检测出信号。

下面通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1

HLV的分离

将1kg的HLV感染的啤酒花的萌芽茎在3倍体积的0.05M磷酸盐缓冲液(pH8.0，含0.2％抗坏血酸、0.2％尼古丁、0.2％PVP)中磨碎，于室温放置1小时后，用纱布过滤，得到粗提液。将该粗提液热处理(55℃，8分钟)后，立即在冰浴中进行急冷，以3000xg进行30分钟离心，得到上清液。在上清液中添加5％聚乙二醇和0.15M氯化钠，搅拌1小时后，以3000xg进行30分钟离心，将沉淀物悬浮在0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.4，含0.02MEDTA)中。

进而以高速离心(15000xg，10分钟)得到上清液后，将以超离心(100000xg，120分钟)回收沉淀物的操作反复进行二次，使病毒与夹杂物分离。

将所得到的沉淀物悬浮在2ml的0.01M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中后，进行20-10％的蔗糖密度梯度离心(150000xg，120分钟)，回收病毒组分。最后，进行180000xg、150分钟的离心，得到沉淀物病毒颗粒，再悬浮在0.01M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，作为纯化病毒样品而保存。

另外，除非事先说明，上述操作都是在4℃条件下进行。

实施例2

从HLV中提取RNA

从HLV颗粒中提取RNA，按照SDS-酚法(Proll et al.，Pota to Research 24，1-10(1981))进行。

在84μl按照与实施例1相同的方法得到的HLV纯化样品(1μg/ml)中添加5μl的20％SDS、1μl的20xSSC、10μl(10mg/ml)蛋白酶(商品名：蛋白酶K)，进行混合，在37℃保温30分钟。

接着，添加50μl的0.5％膨润土悬浮液和150μl的TE饱和酚，进行酚萃取。然后，用酚：氯仿混合液(1∶1)再进行酚萃取。用氯仿萃取水层后，向水层中添加10μl的3M乙酸钠、250μl的冷乙醇，进行混合，在-80℃静置30分钟。然后，以15000xg进行5分钟离心，得到沉淀物。接着用70％乙醇进行离心清洗，干燥除去乙醇后，在沉淀物中添加50μl蒸馏水进行溶解，向此溶液中添加50μl的4M氯化锂，进行混合后，在冰中静置1夜。

然后，以15000xg进行5分钟离心，得到沉淀物，再用70％乙醇进行离心清洗，干燥除去乙醇后，向沉淀物中添加8μl蒸馏水，进行溶解，作为RNA样品而保存。

实施例3

cDNA的克隆

使用cDNA合成试剂盒(Amersham公司制造)，按照厂商的建议和程序，从实施例2制备的RNA样品合成cDNA，溶解在10μl TE缓冲液中。

接着，将质粒pUC119(50ng/μl)用SmaI消化并去磷酸化，向2μl的去磷酸化处理的上述质粒中添加1μl上述的合成cDNA、10mMATP、10x连接缓冲液(Boehringer公司制造)、T4DNA连接酶(5U/μl，Boehringer公司制造)、13μl蒸馏水，进行混合后，在22℃保温一夜，进行连接反应。

制备大肠杆菌MV1184的感受态细胞，将100μl该感受态细胞和上述连接反应液混合，在冰上静置30分钟。

接着，在42℃保温60秒后，立即在冰中进行急冷，添加500μl的S0 C培养基，在37℃保温1小时。添加各为50μl的2％X-gal和100mMIPTG，在2个含50μg/ml氨苄青霉素的2x YT琼脂板培养基上进行涂布，在37℃培养一夜。

按照常规方法，从所得到的白色菌落大肠杆菌提取质粒DNA，选择具有插入长cDNA片段的质粒的大肠杆菌，进行保存。

随后，为了确认cDNA是来自HLV基因组，将已纯化的HLV-RNA样品进行部分碱变性，使用以T4多核苷酸激酶[γ³²P]ATP进行5’末端标记的探针，对选择出的cDNA进行Southern印迹杂交。

结果得到具有插入来自HLV基因组的0.7kb、1.2kb、1.35kb、3.5kb、5.0kb的cDNA片段的质粒的大肠杆菌。

实施例4

来自HLV基因组的cDNA的碱基序列的确定

用2x YT培养基，在37℃下将实施例3得到的具有插入来自HLV基因组的cDNA片段的质粒的大肠杆菌振动培养一夜，按照常规方法纯化质粒。按照常规方法，由该质粒制备来自HLV基因组的cDNA片段，将其作为模板使用，按照双脱氧法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，74，5463(1977))，使用DNA测序仪(ABI公司制造)和测序试剂盒(USB公司制造，商品名：SEQUENASE)，将碱基序列解码，确定1375个碱基长的序列。

其结果，在该碱基序列中鉴定出编码，外壳蛋白基因(编码306个氨基酸残基，分子量约31.4KD)的翻译区域(序列表的序列号1的第58-975位碱基序列)和编码分子量约12.0KD蛋白质(101个氨基酸残基)的翻译区域(序列表的序列号1的第981-1292位碱基序列)。

另外，在序列表的序列号6和7中示出了从各碱基序列翻译的推测的氨基酸序列。而且，在这些氨基酸序列中，序列号6中所示的氨基酸序列，因为包含相当于在后面详述的图1中所示的HLV外壳蛋白的部分氨基酸序列，因此已证明其存在。

通过转化如此得到的编码HLV外壳蛋白的基因，本发明预期可用于生产抗所述病毒的啤酒花。因此，用如此获得的所述外壳蛋白编码基因转化微生物如大肠杆菌等可以生产所述的蛋白。另外，基于所述蛋白的氨基酸序列，可以使用例如蛋白质合成仪等获得其任何片段。该外壳蛋白或其片段可用于生产HLV抗体以用于检测HLV。

实施例5

HLV外壳蛋白的部分氨基酸序列的确定

将120μl的实施例1制备的HLV纯化样品(1μg/μl)用蛋白酶(Lysyl Endopeptidase，和光纯药公司制造)在常温(25℃)、16小时的条件下进行部分消化，将所得到的肽片段用逆相HPLC(Rep RPC HR5/5柱，Pharmacia公司制造)分离纯化后，使用蛋白质测序仪(ABI公司制造)分析肽片段的N末端氨基酸序列，发现三个肽片段的N末端氨基酸序列与上述HLV外壳蛋白的推定氨基酸序列完全一致。在图1中示出这三个肽片段的N末端氨基酸序列和其在HLV外壳蛋白的氨基酸序列中的位置。

实施例6

利用HLV感染的啤酒花的反转录PCR进行病毒基因诊断

在1ml的0.05M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中将HLV感染的啤酒花叶(品种：信州早生)和无病毒啤酒花叶(品种：信州早生)各0.1g磨碎并用氯仿萃取，之后上清液进行酚处理和三次醚处理后，用乙醇使核酸沉淀。接着，用70％乙醇将沉淀物离心清洗，干燥除去剩余的乙醇后，溶解在100μl的TE缓冲液中，其中的2μl供反转录PCR试验。

PCR用的4种引物，是根据该碱基序列，使用ABI公司制造的DNA合成仪(型号380B)按照常规方法设计、合成的，具有序列表的序列号2-5的碱基序列(分别简称3P、4P、3M、4M)。各引物以3P/3M、4P/3M、3P/4M、4P/4M的4种组合用于反转录PCR。

反转录反应添加25皮摩尔(pM)的互补链引物、5单位的反转录酶(ANV-RTase XL，宝酒造(株)社制造)和2μg的上述制备的啤酒花核酸，在含有75mM KCl、3mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM dNTP的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中，在55℃进行30分钟。

然后，在反转录产物中添加0.5单位的耐热性DNA聚合酶(Boe hringer公司制造)和25pM的扩增用引物，进行PCR。反应体积为10μl，为了防止反应液蒸发，添加约20μl矿物油。

PCR的各步骤按下述条件进行。

首先在94℃保持3分钟后，进行30次的下述循环：变性过程在94℃进行1分钟，引物退火过程在55℃进行1分钟，DNA的延伸过程在72℃进行2分钟。反应溶液在72℃保持5分钟后，在4℃下保存。

用琼脂糖凝胶电泳分析由上述聚合酶链反应得以扩增的基因组DNA。

使用2％的琼脂糖凝胶，在含有2mM EDTA的Tris-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中进行100V、30分钟的电泳，实现DNA的分离。此时，作为分子量标记使用以限制酶HindIII和EcoRI酶切的λDNA(Nippon Energy公司制造)。

电泳结束后，在0.5μg/ml的溴化乙锭水溶液中将凝胶浸渍10分钟后，在暗处用254nm的紫外线照射凝胶，检测DNA和溴化乙锭的结合体的红色条带。

由电泳分析(反复进行2次)得到的结果示于图2中。图中的DW意指灭菌水。

琼脂糖凝胶电泳的结果是，感染的啤酒花与所用引物相对应得到特异的DNA扩增片段，未感染的啤酒花没有得到这样的DNA扩增片段，从而可以将两者区别开。

另外，与引物相应的特异DNA扩增片段是3P/3M：233碱基对、4P/3M：181碱基对、3P/4M：377碱基对、4P/4M：325碱基对。

实施例7

利用斑点印迹杂交的基因诊断

在1ml的0.05M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中磨碎HLV感染的啤酒花叶(品种：信州早生)和无病毒啤酒花叶(品种：信州早生)各0.1g，并用氯仿萃取，之后将上清液进行酚处理和3次醚处理，然后用乙酸使核酸沉淀。接着，用70％乙醇离心清洗该沉淀物，干燥除去剩余的乙醇后，溶解在100μl的TE缓冲液中。将其中的2μl添加到3倍体积的核酸变性溶液(65％甲酰胺、20％甲醛、1.54M MOPS、6.5mM乙醇钠、1.3mMEDTA)中，在65℃保温15分钟后急冷。接着，添加8μl的20xSSC(0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸纳，pH7.0)混合后，在过滤膜(Amersham公司制造，商品名：Hybond-N⁺)上将其中10μl进行点样，供斑点印迹杂交试验。

探针是用限制性内切酶BamHI和ECoRI消化实施例4制备的大肠杆菌的质粒(含有来自HLV基因组的约1.35kb cDNA片段)后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，在柱(宝酒造(株)社制造，商品名：Suprec-01柱)上将来自HLV基因组的cDNA洗脱，进行纯化。接着，纯化的cDNA利用随机标记试剂盒(宝酒造(株)社制)以[α³²]dCTP进行标记后，在Sephadex G-50柱上纯化后而使用。

在5xSSC、100μg/ml酵母tRNA(Boehringer公司制造)、0.5％SDS、0.1％Ficoll、0.1％PVP、0.1％BSA溶液中，在46℃、16小时的条件下进行杂交。

放射自显影图的结果显示，在来自HLV感染的啤酒花的点样上观察到信号，而来自无病毒啤酒花的点样未观察到信号。由此证实了，根据有无信号可以区分HLV感染的啤酒花和无病毒啤酒花。

按照本发明，弄清楚了HLV外壳蛋白基因的结构，研制、开发了HLV基因诊断法，不需要以往进行的HLV分离、抗血清的制备、抗体的纯化等烦杂的操作，比利用ELISA能够更简便且高灵敏度地诊断HLV感染的啤酒花的病毒。进而利用该基因，能够对生产抗该病毒的啤酒花作出贡献。

序列表

序列号1

长度：1375

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：蛋白质

序列描述：

TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG 60

GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120

GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180

TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240

AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300

CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360

CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420

AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480

CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540

AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600

GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660

TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720

GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780

AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840

ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900

GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960

TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020

TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080

ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140

GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200

ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260

GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320

TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375

序列号2

长度：19

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

序列描述：

TGAGGTCGTGTCAAACAAC

序列号3

长度：18

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

序列描述：

GTTGATCTGGAGGGGTTG

序列号4

长度：20

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

序列描述：

TCTCGGCATCCTTCTTTATT

序列号5

长度：21

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

序列描述：

TTTCAACGTAATCCAAGCAAT

序列号6

长度：306

类型：氨基酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：肽

序列描述：

Met Ala Asp Lys Gln Gly Gln Met Thr Glu Gln Gln Lys Val Asp Ser Gln Lys

1 10

Leu Gln Gly Glu Ala Lys Asn Lys Glu Lys Ala Glu Ser Ser Lys Arg Lys Asp

20 30

Glu Leu Leu Lys Lys Tyr Ile Asp Pro Gly Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu

40 50

Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lys Leu Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg

60 70

Ala Ala Ile Arg Val Thr Asn Ala Gly Leu Glu Thr Gly Arg Pro Ala Leu Lys

80 90

Pro Thr Pro Asp Met Leu Pro Asp Pro Thr Asn Pro Tyr Asn Lys Pro Set Leu

100

Asp Ala Leu Leu Met Ile Lys Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Thr Ser

110 120

Glu Asp Met Met Lys Ile Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu

130 140

His Val Gln Ser Val Ile Leu Gln Ala Val Phe Tyr Cys Lys Asp Ser Ser Ser

150 160

Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Trp Arg Gly Gly Ala Ile Ser

170 180

Ala Asp Ser Val Leu Ala Ile Ile Lys Lys Asp Ala Glu Thr Leu Arg Arg Val

190

Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Thr Trp Asn Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro

200 210

Pro Ser Asp Trp Ser Glu Met Gly Phe Gln Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe

220 230

Asp Cys Leu Asp Tyr Val Glu Asn Ala Ala Ala Val Gln Pro Leu Glu Gly Leu

240 250

Ile Arg Val Pro Tyr Ala Arg Glu Lys Ile Ala Asn Lys Thr His Lys Asp Leu

260 270

Ala Leu Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gln Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu Ile

280

Thr Gly Gly Lys Asn Gly Pro Glu Leu Gln Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Asn Asn

290 300 306

序列号7

长度：104

类型：氨基酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：肽

序列描述：

Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lys Phe Leu Glu Gln Cys

10

Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met Ile Ser Leu Gln Val His Arg Pro

20 30

Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Ala Lys Leu Val Gly

40 50

Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Trp Pro Pro Thr Ala Phe Thr Thr Arg Cys

60 70

Asp Asn Lys Thr Cys Phe Pro Gly Leu Thr Tyr Asn Ala Ser Ile Ala Arg Phe

80 90

Ile Arg Asp Gly Val Thr Glu Val Ile Pro Ser Ala Pro Asn

100 104

Claims

1、一种来自啤酒花潜伏病毒基因组的分离的DNA序列，其特征在于它具有序列表的序列号1所示的碱基序列。

2、一种来自啤酒花潜伏病毒基因组的分离的DNA序列，其特征在于它具有序列表的序列号1的碱基序列中的第58-975位碱基序列。

3、一种特异于啤酒花潜伏病毒基因组的合成DNA，其特征在于具有序列表的序列号2的碱基序列。

4、一种特异于啤酒花潜伏病毒基因组的合成DNA，其特征在于具有序列表的序列号3的碱基序列。

5、一种特异于啤酒花潜伏病毒基因组的合成DNA，其特征在于具有序列表的序列号4的碱基序列。

6、一种特异于啤酒花潜伏病毒基因组的合成DNA，其特征在于具有序列表的序列号5的碱基序列。

7、啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征在于，以从啤酒花中提取的核酸作为模板，通过使用权利要求3-6中任一项记载的合成DNA作为引物的反转录聚合酶链式反应进行DNA扩增，对所得到的扩增产物进行电泳分析。

8、检测啤酒花潜伏病毒的诊断方法，其特征在于，使用权利要求3记载的合成DNA和权利要求5记载的合成DNA，通过反转录聚合酶链式反应进行DNA的扩增，电泳分析所得到的扩增产物，根据有无233碱基对的特异DNA片段，检测啤酒花潜伏病毒。

9、检测啤酒花潜伏病毒的诊断方法，其特征在于，使用权利要求4记载的合成DNA和权利要求5记载的合成DNA，通过反转录聚合酶链式反应进行DNA的扩增，电泳分析所得到的扩增产物，根据有无181碱基对的特异DNA片段，检测啤酒花潜伏病毒。

10、检测啤酒花潜伏病毒的诊断方法，其特征在于，使用权利要求3记载的合成DNA和权利要求6记载的合成DNA，通过反转录聚合酶链式反应进行DNA的扩增，电泳分析所得到的扩增产物，根据有无377碱基对的特异DNA片段，检测啤酒花潜伏病毒。

11、检则啤酒花潜伏病毒的诊断方法，其特征在于，使用权利要求4记载的合成DNA和权利要求6记载的合成DNA，通过反转录聚合酶链式反应进行DNA的扩增，电泳分析所得到的扩增产物，根据有无325碱基对的特异DNA片段，检测啤酒花潜伏病毒。

12、啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征在于，将权利要求5和权利要求6中任一项记载的合成DNA或该DNA的互补链DNA作为探针，与从啤酒花中提取的核酸进行杂交。

13、啤酒花潜伏病毒的检测方法，其特征在于，以权利要求1记载的DNA的限制性内切酶BamHI-EcoRI酶切片段作为探针，与从啤酒花中提取的核酸进行杂交。

14、一种源自啤酒花潜伏病毒的分离的蛋白质，它是从序列表的序列号1的碱基序列的第58-975位核苷酸翻译而来并包含序列表的序列号6的306个氨基酸残基序列。