CN1305901C - 肿瘤转移相关蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤转移相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的肿瘤转移相关蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：5氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与肿瘤转移相关的由SEQ ID №：5衍生的蛋白质。该肿瘤转移相关蛋白的活性片段，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多肽，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与肿瘤转移相关的由SEQ ID №：2衍生的多肽。本发明的肿瘤转移相关蛋白及其编码基因为进一步研究肿瘤转移发生的分子机制提供了线索，并具有潜在的临床应用价值。

Description

肿瘤转移相关蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及基因工程领域中的肿瘤转移相关蛋白及其编码基因。

背景技术

肿瘤转移一直以来是肿瘤临床治疗所面临的最严峻挑战。虽然人们早已知道肿瘤转移是一个包括多个步骤的过程，但对其分子生物学机理尚未完全明了。近十几年来，肿瘤转移研究的重点转入克隆和鉴定调控肿瘤转移表型相关基因或转移过程不同阶段相关基因的领域，试图揭示肿瘤转移在基因水平的本质。上世纪八十年代，在Filder的肿瘤异质理论的基础上，Wessinman提出了表型克隆的概念，使得在基因的确切染色体定位及其生化功能未知的情况下克隆与细胞某一表型相关的基因成为可能，基于此理论的技术已成为现代分子生物学一个重要的研究手段。

发明创造内容

本发明的目的是提供肿瘤转移相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的肿瘤转移相关蛋白，名称为PCMAG1，来源于人属人(Homosapiens)，是具有序列表中SEQ ID №：5氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQID №：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与肿瘤转移相关的由SEQ ID №：5衍生的蛋白质。

序列表中的序列5由434个氨基酸残基组成。

上述肿瘤转移相关蛋白的活性片段PCMAG1-A，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多肽，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与肿瘤转移相关的由SEQ ID №：2衍生的多肽。

序列表中的序列2由122个氨基酸残基组成，由序列表中序列5的自氨基端的第313-434位氨基酸残基组成。

生物信息学分析表明PCMAG1具有两个N-糖基化(N-glycosylation)位点(自序列5的氨基端第378-381位氨基酸残基和第386-389位氨基酸残基，即自序列2的氨基端第66-69位氨基酸残基和第74-77位氨基酸残基)，一个酪蛋白激酶(Caseinkinase)II磷酸化位点(自序列5的氨基端第329-332位氨基酸残基，即自序列2的氨基端第17-20位氨基酸残基)和一个N-豆蔻酰化(N-myristoylation)位点(自序列5的氨基端第361-366位氨基酸残基，即自序列2的氨基端第49-54位氨基酸残基)。

上述肿瘤转移相关蛋白及其活性片段的编码基因均属于本发明的保护范围。

上述肿瘤转移相关蛋白的编码基因，名称为pcmag1，可具有下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：4的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列4的cDNA序列由2354个碱基组成，该基因的编码序列为自5’端第124到第1428位碱基序列。

上述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因，名称为pcmag1-a，可具有下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列1的cDNA序列由1420个碱基组成，该基因的编码序列为自5’端第34到第402位碱基序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有本发明肿瘤转移相关蛋白及其活性片段的编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

实验表明PCMAG1的活性片段PCMAG1-A对人肺巨细胞癌细胞系PLA-801的低转移株PLA-801C细胞生长有明显的促进作用；转染pcmag1-a正义表达载体的PLA-801C细胞株的S期和S+G2/M期所占的比例明显高于空载体对照；RT-PCR结果显示，在转染pcmag1-a正义表达载体的PLA-801C细胞株中，MMP-2的mRNA含量是转染空载体对照细胞的2.5倍；细胞定位实验初步表明pcmag1-a表达产物存在于细胞浆中；在已经经病理诊断证实有肺内或淋巴结转移的12个病例中，pcmag1-a在8例标本中有较强的表达；在病理诊断尚未发现转移的12个病例中，pcmag1-a在4例中有较强的表达；在5例癌旁组织标本中，pcmag1-a仅在两例标本中有微弱表达。以上实验结果说明PCMAG1及其活性片段PCMAG1-A与肿瘤转移密切相关。

本发明的肿瘤转移相关蛋白及其编码基因为进一步研究肿瘤转移发生的分子机制提供了线索，并具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为PCR检测抑制消减杂交效率

图2为RT-PCR验证目的序列在两株细胞中表达的差异

图3为pcmag1-a的Northern杂交结果

图4为MTT掺入实验分析pcmag1-a对细胞生长的影响曲线

图5为流式细胞分析转染各株细胞周期组成的变化柱状图

图6为pcmag1-a亚细胞定位照片

图7为RT-PCR分析转染前后细胞中MMP-2的mRNA变化的电泳图谱

图8A为RT-PCR分析pcmag1-a在已经病理诊断证实有肺内或淋巴结转移的标本中表达情况的电泳图谱

图8B为RT-PCR分析pcmag1-a在经病理诊断证实尚未发生转移的标本中表达情况的电泳图谱

图9为PCMAG1-A原核表达结果

图10为抗PCMAG1-A兔多克隆抗体的效价分析

图11为应用抗His标签抗体检测原核表达的PCMAG1-A

图12为pcmag1在PLA-801D中的表达检测

图13为应用抗PCMAG1-A兔多克隆抗体检测PLA-801C和PLA-801D中PCMAG1内源性表达的差异

图14为应用siRNA方法影响PCMAG1在PLA-801D中的表达

具体实施方式

下述实施例中所提到的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

模型细胞株

所用细胞株为PLA-801C和PLA-801D(购自三○一医院)，是应用有限稀释法从人肺巨细胞癌母系PLA-801中分离建株的细胞(陆应麟等.人肺巨细胞癌PLA-801母系细胞及其克隆化细胞株(A，C，D，E)裸鼠皮下种植后自发转移特性的研究.中华肿瘤杂志，1989，11(1)，3-7)，分子遗传学分析表明二者具有较为一致的核型(Mei L，Lezhen C，Po Z et al.Study on the metastatic mechanisms of human giant-celllung carcinoma comparison between the strains C and D.Asian Pac J AllergyImmunol.1998，16(4)，167-176)，其中D株具有较强的转移能力而C株细胞没有转移能力(蒋代凤，刘万里，陆应麟等：IL-18促进肺癌细胞转移的功能鉴定，中华肿瘤杂志，2003，25(4)，348-352；Jiang D，Ying W，Lu Y，et al Identification ofmetastasis-associated protein by protiomic analysis and functionexploration of interleukin-18 in metastasis.Proteomics，2003，3(5)，724-737)。它们是研究肿瘤转移的良好模型。细胞株用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃、5％CO₂的条件下培养。

实施例1、PCMAG1活性片段PCMAG1-A及其编码基因的获取及其在模型细胞中表达差异的验证

1、抑制消减杂交

利用Advantage cDNA PCR试剂盒(ClonTech)，按试剂盒操作建议进行抑制消减杂交。具体步骤如下：以具有高转移潜能的PLA-801D为实验方(Tester)，不具有转移潜能的PLA-801C为驱动方(Driver)。从上述两株细胞中分离mRNA合成cDNA并经过Rsa I酶切并纯化后溶于水中，Driver不做处理，Tester分为两份，利用T₄连接酶分别接上两种特异的接头1和2(接头1：5-ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3

                                                        3-ggcccgtcca-5接头2：5-ctaatacgactcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt-3

                                   3-gccggctcca-5)，得到Tester1和Tester2，然后进行两次杂交。第一轮杂交为Tester1和Tester2分别与Driver杂交，然后再将第一次的两种杂交产物和过量的Driver三者同时混合进行第二次杂交。杂交产物经巢式PCR进行两次扩增后与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌J M109，PCR鉴定是否有插入片段。通过比较看家基因G3PDH在消减和未消减样品中的丰度分析抑制消减杂交效率。结果如图1所示，表明在SSH中得到的多个含有目的基因片段的细菌克隆经PCR确认含有长度在250-700bp之间的外源基因片段；经过消减，在两株细胞中丰度相同的转录子得到有效抑制。图1中，1-4为未消减对照样品在PCR第18、23、28、33个循环时的电泳情况；5-8分别为两轮消减后样品在PCR第18、23、28、33个循环时的电泳情况，M：DL2000 Marker。

2、基因芯片对抑制消减杂交得到的差异片段进行初筛

挑选步骤1中的能够扩增出单一、清晰条带的克隆，并将其PCR产物进行纯化后以0.5μg/μl的浓度点在氨基化玻片上制成基因芯片，然后参照Schena(SchenaM，Shalon D，Dayis RW，et al.Quantitative monitoring of gene  expressionpatterns with a complementary DNA microarray.Science 1995，270(5235)，467-470)的方法用源于两株细胞、分别用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP标记cDNA探针，与芯片在48℃杂交14-18h，杂交完成后用ScanArray3000激光扫描仪用两种不同波长(Cy3，550nm Cy5，649nm)的激光分别扫描，最后ImaGene3.0软件分析以确定在两种波长的激光下荧光信号的强度和比值，从而得知每一个克隆在两株细胞中的表达情况。结果共得到101条表达具有显著性差异的EST片段(分别命名为1-101号)。将上述具有表达差异的EST片段进行测序以后，与核酸数据库和蛋白质数据库中的序列进行比较。除去相同的序列共得到79条与肺巨细胞癌细胞转移呈正相关的序列。

3、测序、生物信息学分析

序列测定由诺赛基因公司协助进行，使用的测序仪为ABI-3730XL。然后利用互联网上相关资源对与高转移表型密切相关的ESTs进行分析。结果表明3号(346bp，序列表中序列3)与BC006236同源，设计引物(上游引物：5-cttgcaggaacttgcatcaa-3，下游引物：5-caacggcattatattgctgtc-3)按照常规方法从PLA-801D细胞中利用RT-PCR扩增出长度为1420bp的片段，测序结果表明其具有序列表中序列1的核苷酸序列，名称为pcmag1-a；生物信息学分析该1420bp片段在基因组上的相应序列定位于4q21，由4个外显子组成，长约为8.5Kbp，所有的内含子/外显子符合GT/AG剪切模式，序列末端具有典型的“AATAAA”添加polyA尾的信号。对该cDNA序列在基因组上的相应序列前约2000bps的基因序列进行了分析，发现在该cDNA的第一个外显子前面有可能的启动子序列，该1420bp片段预测所得的分值为0.92(此值表明仅有0.1-0.3％的假阳性的可能)。ORF分析表明，该1420bp片段有一个编码122个氨基酸残基(序列2)的ORF，为序列表中序列1的自5’端第34到第402位碱基。通过对这个多肽序列进行同源检索后，未发现与已知功能蛋白序列同源。该多肽以α螺旋为主并含有部分片层结构和无规卷曲，更精细的分析表明：该多肽具有两个N-糖基化(N-glycosylation)位点(自序列2的氨基端第66-69位氨基酸残基和第74-77位氨基酸残基)，一个酪蛋白激酶(Casein kinase)II磷酸化位点(自序列2的氨基端第17-20位氨基酸残基)和一个N-豆蔻酰化(N-myristoylation)位点(自序列2的氨基端第49-54位氨基酸残基)。

4、RT-PCR

针对pcmag1-a序列分别设计如下引物，上游引物5-TGTTTAAAAAGG GGAGCTTTG-3，下游引物：5-CAACGGCATTATATTGCTGTC-3；内参照G3PDH引物序列：上游引物5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3利用PLA-801C和PLA-801D的总RNA和OligodT₁₅引物按常规方法逆转录成cDNA后，进行PCR扩增。扩增参数如下：于94℃变性5分钟之后，再于94℃30秒；54℃30秒；72℃90秒，扩35个循环，最后于72℃延伸7分钟。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果如图2所示，pcmag1-a的扩增片段长度为1399bp，pcmag1-a在PLA-801D中的表达远高于在PLA-801C中的表达。图2中，C表示PLA-801C，D表示PLA-801D。

5、Northern杂交

将PLA-801C、D两株细胞的总RNA甲醛变性凝胶电泳后利用毛细管法转到硝酸纤维素膜上，分别以3号片段(346bp，序列3)为模板，利用PCR法标记的³²P同位素探针与膜在杂交液(50％甲酰胺、0.1％SDS、5×SSPE、2×Denhardt)中于42℃杂交16-24小时，按常规方法洗膜、显影。结果如图3所示，表明pcmag1-a在PLA-801D中的表达远远高于在PLA-801C中的表达。图3中，C表示PLA-801C，D表示PLA-801D。

实施例2、pcmag1-a功能的鉴定

1、真核表达载体的构建及转染

按照常规方法将pcmag1-a的cDNA(1420bp)序列正向(EcoRI单酶切)或反向(EcoRI、BamHI双酶切)插入pcDNA3(美国Clontech公司)的多克隆位点构建得到其正义真核表达载体pcDNA3-spcmag1-a和反义真核表达载体pcDNA3-apcmag1-a。以空载体peDNA3为对照，利用lipofectamin2000(美国GIBCO/Invitrogen公司)将正义表达载体转染入具有低转移潜能的细胞株PLA-801C中，反义载体转染入具有高转移潜能的细胞株PLA-801D中，利用G418筛选出抗性细胞，并对抗性细胞进行PCR鉴定，得到转染正义表达载体pcDNA3-spcmag1-a的细胞株-PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和转染反义表达载体pcDNA3-apcmag1-a的细胞株-PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。将空载体pcDNA3转入PLA-801C或PLA-801D中，得到转染空载体的对照细胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3。

2、转染细胞的生长特性

通过MTT掺入实验观察转染细胞的生长特性：将用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃、5％CO₂的条件下培养至对数生长期的PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a及转染空载体pcDNA3的对照细胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3消化、计数，调整到1000个细胞/毫升，然后在96孔板中每孔分别接种200个细胞，分别在接种的第2、4、6、8、10、12、14天，在细胞中加入MTT(25mg/ml)20μl后继续培养4小时后，小心吸弃上清并加入200μl二甲基亚砜，每株细胞每次设6个平行孔，待紫色结晶溶解完全后，用酶联仪测其492nm处的吸光度以检测各株细胞的增殖活力。结果如图4所示，表明pcmag1-a对PLA-801C细胞生长有促进作用，pcDNA3-apcmag1-a抑制了PLA-801D细胞的生长。

3、pcmag1-a对细胞周期的影响

采用流式细胞仪分析细胞周期：将用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃、5％CO₂的条件下培养至对数生长期的PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a以及转染空载体的对照细胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3用PBS洗涤后，以含3％小牛血清的70％乙醇于-20℃固定24小时后以PBS洗去固定液，加入0.2ml RNase(1mg/ml)于37℃消化30分钟后，以100μg/ml的碘化丙啶(PI)染色20分钟后上机检测。结果如图5所示，表明与对照细胞相比，转染正义载体pcDNA3-spcma1-a的细胞株的S期(P＜0.01)和S+G2/M期(P＜0.05)明显升高；转染反义载体pcDNA3-apcmag1-a细胞株的S期和S+G2/M期均无明显变化。图5中，cv为对照PLA-801CpcDNA3、dv为对照PLA-801DpcDNA3；c1为PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a，d1为PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。

4、pcmag1-a对细胞MMP-2(明胶酶)转录的影响

利用PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a以及转染空载体的对照细胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3的总RNA和OligodT₁₅引物分别按常规方法逆转录成cDNA后，进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，结果如图7。其中，MMP-2上游引物：CGCCTTTAACTGGAGCAAAAA，下游引物：GGAGCCACTCTCTGGAATCTT；内参照为G3PDH，其上游引物：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。通过图像分析电泳照片发现转染正义载体的细胞株PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a其MMP-2的mRNA含量是空载体对照PLA-801CpcDNA3的2.5倍。图7中，cv为对照PLA-801CpcDNA3、dv为对照PLA-801DpcDNA3；c1为PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a，d1为PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。

大量研究表明，明胶酶在多种恶性肿瘤组织、培养的肿瘤细胞及癌基因转化细胞中活性增强，体内、外侵袭实验均证实肿瘤细胞的高侵袭能力与明胶酶的活性增强有关，因而被认为可能是肿瘤侵袭、转移过程中主要蛋白水解酶。越来越多的研究表明MMP-2在肿瘤细胞介导的细胞外基质降解中起关键作用。MMP-2活性和表达的增加与人类多种恶性肿瘤侵袭转移潜能及预后密切相关(Dayies B，Waxman J，Wasan H，et al.Levels of matrix metalloproteinase in bladder cancer correlatewith tumor grade and invasion.Cancer Res，1993，53：5365-5369.)，而pcmag1-a可能通过增强MMP-2的表达影响肿瘤侵袭和转移，与肿瘤转移密切相关。

5、pcmag1-a在临床标本中的表达检测

取经病理诊断证实有肺内或淋巴结转移的12个病例的新鲜肿瘤标本和病理诊断尚未发现转移的12个病例的新鲜肿瘤标本以及5例癌旁组织标本细胞，按常规方法提取总RNA，以OligodT₁₅为引物逆转录成cDNA，进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。其中，扩增pcmag1-a的引物为：上游引物5-TGTTTAAAAAGGGGAGCTTTG-3，下游引物：5-CAACGGCATTATATTGCTGTC-3；内参照为G3PDH，其引物序列同步骤4。结果如图8A和图8B所示，表明在已经经病理诊断证实有肺内或淋巴结转移的12个病例中，pcmag1-a在8例标本中有较强的表达；在病理诊断尚未发现转移的12个病例中，pcmag1-a在4例中有较强的表达。此外，在5例癌旁组织标本中，pcmag1-a仅在两例标本中有微弱表达。图8A为经病理诊断证实有肺内或淋巴结转移的12个病例；图8B为经病理诊断未发现肺内或淋巴结转移的12个病例；它们均购自北京医科大学肿瘤医院标本库。

实施例3、pcmag1-a表达产物的细胞定位

按照常规方法将pcmag1-a的ORF(自序列1的5’端第34到第402位碱基)插入质粒pDsRed1-N1(美国，Clontech公司)的EcoRI、BamHI两个限制性内切酶识别位点之间，构建表达pcmag1-a与红色荧光蛋白融合蛋白的质粒pDsRed1-N1-M1，将其转染入PLA-801C细胞株中，观察融合蛋白的亚细胞定位，借此来初步判断pcmag1-a蛋白产物的亚细胞定位，以空载体pDsRed1-N1为对照。结果如图6所示，表明融合蛋白定位于细胞浆中，而空载体对照弥散于全细胞中。图6中，左侧图片为转染空载体pDsRed1-N1的细胞株，右侧图片为转染融合表达载体pDsRed1-N1-M1的细胞株。

实施例4、PCMAG1及其编码基因的获得

1、PCMAG1-A的原核表达及抗体制备

将pcmag1-a的ORF(自序列1的5’端第34到第402位碱基序列)克隆入原核表达载体pGEX-6p-1(Amersham Biosciences)的限制性内切酶EcoR I和Xho I的识别位点间或pET-28a(+)(Novagen)的限制性内切酶EcoR I和Xho I的识别位点间，经酶切鉴定和PCR鉴定得到的含有GST或6×his的融合蛋白质基因的重组质粒pGEX-6p-1-pcmag1-a和pET-28a(+)-pcmag1-a。将pGEX-6p-1-pcmag1-a或pET-28a(+)-pcmag1-a分别导入宿主菌BL21，经筛选得到含有pGEX-6p-1-pcmag1-a或pET-28a(+)-pcmag1-a的工程菌。37℃，225rpm，1mM IPTG诱导6h表达相应的融合蛋白质。随即以10000rpm离心收获细菌，加入1×上样缓冲液将菌体煮沸裂解，再次以10000rpm离心10min收获上清液，进行15％SDS-PAGE，结果如图9所示，表明该工程菌株表达出预期大小的融合蛋白PCMAG1-A-GST(37kDa)和PCMAG1-A-His(16kDa)。图9中，1为pGEX-6p-1-pcmag1-a未诱导；2为pGEX-6p-1-pcmag1-a诱导；3为pGEX-6p-1未诱导；4为pGEX-6p-1诱导；5为pET-28a(+)-pcmag1-a未诱导；6为pET-28a(+)-pcmag1-a诱导；M为低分子量蛋白质标准，箭头示目的条带。

将含pET-28a(+)-pcmag1-a工程菌株诱导后离心收集菌体，超声破碎后离心取沉淀进行15％SDS-PAGE，用干净的手术刀片将目的带切下，用PBS将目的蛋白质溶出，透析浓缩蛋白，作为抗原免疫家兔，按常规方法得到抗PCMAG1-A多克隆抗体。ELISA方法检测结果表明，该抗PCMAG1-A多克隆抗体的效价为1∶160000(图10)。图10中，1为1∶1000，2为1∶5000，3为1∶10000，4为1∶20000，5为1∶40000，6为1∶80000，7为1∶160000，8为1∶320000，9为1∶640000，10为1∶1280000，11为免疫前血清，12为空白对照。

利用抗His标签抗体(抗六个连续组氨酸表位的单克隆抗体，购自Novagen公司)通过免疫印迹方法检测目的融合蛋白质表达情况。图11表明在诱导表达和纯化后的蛋白中均检测到PCMAG1-A-His融合蛋白的表达。图11中，1为未纯化蛋白，2为纯化后蛋白。

2.pcmag1基因的获取及其在PLA-801D中表达的确证

利用抗PCMAG1-A多克隆抗体，通过免疫印迹方法进行PLA-801D细胞内PCMAG1-A的内源性表达分析时，在分子量约44kDa区域有明显的阳性条带存在，而在预期分子量区域——9kDa则未能检测到相应目的蛋白存在。将序列表中SEQ ID №：1的DNA序列重新进行同源性检索后发现该序列与MGC11324蛋白(GenBank登录号为NM_032717)基因序列(SEQ ID №：4)的3’端具有100％的同源性。MGC11324蛋白是一个日本研究小组在分析肝母细胞瘤的基因表达谱和筛选与正常肝细胞的差异基因中发现的新蛋白质，并依据其基因序列，推测出其可能编码434个氨基酸的蛋白质产物。但他们对于MGC11324蛋白并未进行深入研究，亦没有通过实验验证该蛋白质产物的真实存在。

针对MGC11324的基因序列分别设计如下引物，上游引物：5-CCGGAATTCGTCATGGAGGGCGCAGAG-3，下游引物：5-CCGCTCGAGGCTGAGAGAGCCATTGCCCA-3；内参照G3PDH引物序列：上游引物5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，利用PLA-801D的总RNA和0ligodT₁₅引物，按常规方法逆转录成cDNA后，进行PCR扩增。扩增参数如下：于94℃变性5分钟之后，再于94℃45秒；54℃45秒；72℃90秒，35个循环，最后于72℃延伸7分钟。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果如图12所示，1，2泳道是MGC11324基因的ORF扩增片段长度为1323bp，M为DL2000核酸分子量标准，3为阴性对照。经三博远志公司测序确认该扩增产物与MGC11324基因的登陆序列完全一致。从而在核酸水平证实MGC11324基因在PLA-801D中的存在。

以抗PCMAG1-A多克隆抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔为二抗(购自中杉公司，系进口分装)，按常规方法对PLA-801D和PLA-801C细胞的总蛋白进行western blotting，结果如图13所示，表明PLA-801D株细胞中44kDa蛋白质的表达显著高于C株，这与PCMAG1-A基因在两株细胞中核酸水平上的差异一致。结合PCMAG1-A的功能研究，免疫印迹实验和同源性比对结果，说明PCMAG1-A与MGC11324是有关联的，利用抗PCMAG1-A多克隆抗体检测出约44kDa的蛋白质理论上与MGC11324蛋白的大小一致。通过生物信息学分析，PCMAG1-A是MGC11324蛋白的羧基端。PCMAG1-A本身具有较强的抗原性，由此所制备的抗PCMAG1-A多克隆抗体对于MGC11324产生较强的结合作用而使全长蛋白质得到有效检出。

3、RNAi方法干涉PCMAG1蛋白表达

针对pcmag1-a的基因序列，利用Ambion.Invitrogen.darmacon等网站上的siRNA design tools在线设计，选择三条在三个网站上预测均相同的序列：自序列1的5′端第997-1016位碱基序列，1093-1112位碱基序列，1133-1154位碱基序列，设计如下的siDNA1、siDNA2和siDNA3序列，并且与人类其他基因比对小于或等于三个互补碱基。

siDNA1：按自序列1的5′端第997-1016位碱基序列合成两条DNA链：正义链：

5’-GATCCATTGGAACCATACATCTTCAAGAGATGTATGGTTCCTCCAATTTTTTTTGGAAA-3’反义链：

5’-AGCTTTTCCAAAAAAATTGGAGGAACCATACATCTCTCTTGAAGATGTATGGTTCCTCCAAT-3’

siDNA2：按自序列1的5′端第1093-1112位碱基序列合成两条DNA链：正义链：

5’-GATCCAGCTACCTGCTTCGAATGATTCAAGAGATCATTCGAAGCAGGTAGCTCATTTTTTGGAAA-3’反义链：

5’-AGCTTTTCCAAAAAATGAGCTACCTGCGAATGATCTCTTGAATCATTCGAAGCAGGTAGCTG-3’

siDNA3：按自序列1的5′端第1133-1154位碱基序列合成两条DNA链：正义链：

5’-GATCCGGAGAAGATGCAGTCCAGTTTCAAGAGAACTGGACTGCATCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3’反义链：

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGATGCAGTCCAGTTCTCTTGAAACTGGACTGCATCTTCTCCG-3’

两条DNA链分别在退火缓冲液中等摩尔比混合后95℃变性5分钟，缓慢退火至室温形成双链DNA。

将质粒U62.1(由阳性对照和阴性对照组成，购自Ambion公司)的阳性对照分别以BamH1以及HindIII限制性内切酶消化后，回收纯化，得到线性化载体，分别与退火形成的双链模板DNA连接，转化感受态细菌大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板中培养16小时后挑选菌落，测序(上海申能博彩公司)，表明插入序列正确，得到siRNA1、siRNA2和siRNA3表达质粒。采用LIPOFECTAMIN 2000(Invitrogen)转染试剂，分别将2μg siRNA1、siRNA2和siRNA3表达质粒及质粒U62.1的阴性对照转染至PLA-801D中。转染24小时后，传代并加入G418使终浓度为700μg/ml，继续培养15天将绝大部分未转染的细胞杀死。维持G418浓度为200μg/ml，继续进行抗生素压力筛选直至获得稳定转染的多克隆细胞簇。分别收集抗性细胞，PBS洗涤，离心弃上清，加入100μl预冷的RIPA细胞裂解液，置冰上40分钟。4℃，10000g离心15min，收获上清即为细胞总蛋白。以BCA法进行蛋白质定量，取5μg细胞总蛋白以8％的SDS-PAGE分离，常规进行免疫印迹检测。一抗为自制抗PCMAG1-A多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(购自中杉公司，进口分装)。免疫印迹结果与图13类似，针对pcmag1-a的基因设计的siRNA序列影响了MGC11324蛋白的表达，如图14所示，在转染siRNA1表达质粒的PLA-801D细胞(第一泳道)、siRNA2表达质粒的PLA-801D细胞(第二泳道)和siRNA3表达质粒的PLA-801D细胞(第三泳道)中MGC11324蛋白的表达水平与PLA-801D(第五泳道)相比呈现明显下降，而阴性对照(转染质粒U62.1的阴性对照的PLA-801D细胞，第四泳道)则无明显改变。进一步确证该MGC11324蛋白在PLA-801D细胞中的存在，并且印证了PCMAG1-A与MGC11324蛋白是有关联的。

上述实验结果表明PCMAG1-A是MGC11324蛋白的羧基端，针对pcmag1-a设计的siRNA序列影响了MGC11324蛋白的表达，说明MGC11324是肿瘤转移相关蛋白，PCMAG1-A是其活性片段。将MGC11324蛋白命名为PCMAG1，它具有序列表中序列5的氨基酸残基序列，其编码基因pcmag1具有序列表中序列4的核苷酸序列。

                            序列表

<160>5

<210>1

<211>1420

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

cttgcaggaa cttgcatcaa caatacttca gtcatgatgt ttaaaaaggg gagctttgaa    60

attggaggaa ccatacatcc agttgcaatt aagtataacc ctcagttcgg tgatgcattt    120

tggaacagta gtaaatacaa catggtgagc tacctgcttc gaatgatgac cagctgggcc    180

atcgtctgtg acgtgtggta catgcccccc atgaccagag aggaaggaga agatgcagtc    240

cagtttgcta acagggttaa gtctgctatt gctatacaag gaggcctgac tgaacttccc    300

tgggatggag gactaaagag agcaaaggtg aaggacatct ttaaggaaga gcagcagaaa    360

aattacagca agatgattgt gggcaatgga tctctcagct aagaggacgg atgacagcct    420

ttagatctag aactagccct tagaaatgga atggcttttt ttgttttgtt ttgttttatt    480

gttttgtttt tattattgtt aatcttttct acagaatgat tgtctctacc tctttatgcc    540

agaggcagaa cctacaggtg ccctttttgg cttttgttgt tgttgtaaca ttagccccat    600

ggattgtaag gtggtttact gagttaaaac agattctgct tttgtaaaat gatggcatca    660

ctgtggactg aatgaaatat ttgtatagaa aaaagtgctt gaaaagtgtg gtttggaact    720

catcgatagg gtaattctcc aaaaatgccc aaactctttt tctgtaatta gccttgccac    780

ttccttcagt cacttaaatg gtgagattac acatcagtgc aagatgacca ttatggttat    840

ggtctactgc aaggttgaaa gaaaaaatgg aggattgtat ttaggaaaag ggacaacttt    900

gtggccacct gctctgaaag tcaaaaggaa atgtaaatta gtgtcattag tgtgttggaa    960

gagaaatact attcagtaac ttcgccaaag aaaagtgagt caaagttaat gtgtgtgcgc    1020

atttatatgt aggcagctcg tagaccacat tttaaccagc aactggtaac aaagagctta    1080

gttttccttg tttgaatgct gtagatctgt acctagtacc cctcccatct actgatttgt    1140

ttgtttttgt aaccaaacac attttcagat agaaggagcc taaaaaaaaa aaaatcacat    1200

tgagtaactt cagtatgaat gaatgagagt gtgtggagct acccctcacc ctccacccct    1260

ttgtgctttt tattcccgaa ttttcccagt ctcttaaaca gaaaaatgac tgatataatt    1320

atcttttgga aactgagcct taattttttt tagaggggga aataagtttt ccccaactca    1380

cacagcataa gcaatgtttg acagcaatat aatgccgttg                          1420

<210>2

<211>122

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Met Phe Lys Lys Gly Ser Phe Glu Ile Gly Gly Thr Ile His Pro

1               5                   10                  15

Val Ala Ile Lys Tyr Asn Pro Gln Phe Gly Asp Ala Phe Trp Asn Ser

            20                  25                  30

Ser Lys Tyr Asn Met Val Ser Tyr Leu Leu Arg Met Met Thr Ser Trp

        35                  40                  45

Ala Ile Val Cys Asp Val Trp Tyr Met Pro Pro Met Thr Arg Glu Glu

    50                  55                  60

Gly Glu Asp Ala Val Gln Phe Ala Asn Arg Val Lys Ser Ala Ile Ala

65                  70                  75                  80

Ile Gln Gly Gly Leu Thr Glu Leu Pro Trp Asp Gly Gly Leu Lys Arg

                85                  90                  95

Ala Lys Val Lys Asp Ile Phe Lys Glu Glu Gln Gln Lys Asn Tyr Ser

            100                 105                 110

Lys Met Ile Val Gly Asn Gly Ser Leu Ser

        115                 120

<210>3

<211>346

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

gtacccctcc catctactga tttgtttgtt tttgtaacca aacacatttt cagatagaag    60

gagccttaaa aaaaaaaatc acattgagta acttcagtat gaatgaatga gagtgtgtgg    120

agctacccct caccctccac ccctctgtgc tttttattcc cgaattttcc cagtctctta    180

aacagaaaaa tgactgatat aattatcttt tggaaactga gccttaattt tttttagagg    240

gggaaataag ttttccccaa ctcacacagc ataagcaatg tttgacagca atataatgcc    300

gttgtaaact actgagagta ttgtatctgt tctggtaacc atgtac                   346

<210>4

<211>2534

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>4

gcagaggtga gtgccgggct cggcgctctg ctcctggagc tcccgcggga ctgcctgggg    60

acagggactg ctgtggcgct cggccctcca ctgcggacct ctcctgagtg ggtgcgccga    120

gtcatggagg gcgcagagct ggccgggaag atcctttcca cctggctgac gctggttctc    180

ggcttcatcc ttttaccttc ggtcttcgga gtgtctctgg gcatctccga gatctacatg    240

aagatcctag tgaaaacttt agagtgggcc acaatacgaa ttgaaaaagg aaccccaaag    300

gagtcgattc ttaaaaactc tgcttctgtt ggtattatcc aaagagatga gtcacccatg    360

gaaaaagggc tctctggtct acgaggaagg gactttgagc tgtctgacgt gttttatttc    420

tccaagaagg gattggaagc cattgtagaa gatgaagtga cccagaggtt ttcctcagag    480

gagctagtgt catggaatct cctcacaaga accaatgtaa atttccagta catcagtctg    540

cggctcacta tggtgtgggt gctgggcgtc atagtgcgct attgtgtcct actgcctctg    600

agggttacct tggctttcat tgggatcagt ttgctggtta taggaactac actggttggg    660

cagctgccag acagcagcct caaaaactgg ctgagtgaac tggtccatct gacttgctgc    720

cggatctgtg tgcgagccct ctctggtacc attcattatc ataacaagca gtacagaccc    780

cagaagggag gcatttgtgt tgccaaccat acttccccca ttgatgtttt aatcttgaca    840

acggatggat gttatgctat ggttggccag gttcatggcg gcttgatggg aattattcag    900

agagctatgg tcaaggcttg tcctcatgtc tggtttgaac gctcagaaat gaaggatcga    960

cacctggtta ctaagagact aaaagaacat attgctgata agaagaaact acccatacta    1020

atttttcctg aaggaacttg catcaacaat acttcagtca tgatgtttaa aaaggggagc    1080

tttgaaattg gaggaaccat acatccagtt gcaattaagt ataaccctca gttcggtgat    1140

gcattttgga acagtagtaa atacaacatg gtgagctacc tgcttcgaat gatgaccagc    1200

tgggccatcg tctgtgacgt gtggtacatg ccccccatga ccagagagga aggagaagat    1260

gcagtccagt ttgctaacag ggttaagtct gctattgcta tacaaggagg cctgactgaa    1320

cttccctggg atggaggact aaagagagca aaggtgaagg acatctttaa ggaagagcag    1380

cagaaaaatt acagcaagat gattgtgggc aatggatctc tcagctaaga ggacggatga    1440

cagcctttag atctagaact agcccttaga aatggaatgg ctttttttgt tttgttttgt    1500

tttattgttt tgtttttatt attgttaatc ttttctacag aatgattgtc tctacctctt    1560

tatgccagag gcagaaccta caggtgccct ttttggcttt tgttgttgtt gtaacattag    1620

ccccatggat tgtaaggtgg tttactgagt taaaacagat tctgcttttg taaaatgatg    1680

gcatcactgt ggactgaatg aaatatttgt atagaaaaaa gtgcttgaaa agtgtgtttg    1740

gaactcatcg atagggtaat tctccaaaaa tgcccaaact ctttttctgt aattagcctt    1800

gccactttct tcagtcactt aaatggtgag attacacatc agtgcaagat gaccattatg    1860

gttatggtct actgcaaggt tgaaaggaaa aatggaggat tgtatttagg aaaagggaca    1920

actttgtggc cacctgctct gaaagtcaaa aggaaatgta aattagtgtc attagtgtgt    1980

tggaagagaa atactattca gtaagcttcg ccaaagaaaa gtgagtcaaa gttaatgtgt    2040

gtgcgcattt atatgtaggc agctcgtaga ccacatttta accagcaact ggtaacaaag    2100

agcttagttt tccttgtttg aatgctgtag atctgtacct agtacccctc ccatctactg    2160

atttgtttgt ttttgtaacc aaacacattt tcagatagaa ggagccttaa aaaaaaaaaa    2220

tcacattgag taacttcagt atgaatgaat gagagtgtgt ggagctaccc ctcaccctcc    2280

acccctttgt gctttttatt cccgaatttt cccagtctct taaacagaaa aatgactgat    2340

ataattatct tttggaaact gagccttaat tttttttaga gggggaaata agttttcccc    2400

aactcacaca gcataagcaa tgtttgacag caatataatg ccgttgtaaa ctactgagag    2460

tattgtatct gttctggtaa ccatgtacag aatgtgaaac tgtcttatga atataaataa    2520

attctatatt tcta                                                      2534

<210>5

<211>434

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>5

Met Glu Gly Ala Glu Leu Ala Gly Lys Ile Leu Ser Thr Trp Leu Thr

1               5                   10                  15

Leu Val Leu Gly Phe Ile Leu Leu Pro Ser Val Phe Gly Val Ser Leu

            20                  25                  30

Gly Ile Ser Glu Ile Tyr Met Lys Ile Leu Val Lys Thr Leu Glu Trp

        35                  40                  45

Ala Thr Ile Arg Ile Glu Lys Gly Thr Pro Lys Glu Ser Ile Leu Lys

    50                  55                  60

Asn Ser Ala Ser Val Gly Ile Ile Gln Arg Asp Glu Ser Pro Met Glu

65                  70                  75                  80

Lys Gly Leu Ser Gly Leu Arg Gly Arg Asp Phe Glu Leu Ser Asp Val

                85                  90                  95

Phe Tyr Phe Ser Lys Lys Gly Leu Glu Ala Ile Val Glu Asp Glu Val

            100                 105                 110

Thr Gln Arg Phe Ser Ser Glu Glu Leu Val Ser Trp Asn Leu Leu Thr

        115                 120                 125

Arg Thr Asn Val Asn Phe Gln Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Thr Met Val

    130                 135                 140

Trp Val Leu Gly Val Ile Val Arg Tyr Cys Val Leu Leu Pro Leu Arg

145                 150                 155                 160

Val Thr Leu Ala Phe Ile Gly Ile Ser Leu Leu Val Ile Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Leu Val Gly Gln Leu Pro Asp Ser Ser Leu Lys Asn Trp Leu Ser Glu

            180                 185                 190

Leu Val His Leu Thr Cys Cys Arg Ile Cys Val Arg Ala Leu Ser Gly

        195                 200                 205

Thr Ile His Tyr His Asn Lys Gln Tyr Arg Pro Gln Lys Gly Gly Ile

    210                 215                 220

Cys Val Ala Asn His Thr Ser Pro Ile Asp Val Leu Ile Leu Thr Thr

225                 230                 235                 240

Asp Gly Cys Tyr Ala Met Val Gly Gln Val His Gly Gly Leu Met Gly

                245                 250                 255

Ile Ile Gln Arg Ala Met Val Lys Ala Cys Pro His Val Trp Phe Glu

            260                 265                 270

Arg Ser Glu Met Lys Asp Arg His Leu Val Thr Lys Arg Leu Lys Glu

        275                 280                 285

His Ile Ala Asp Lys Lys Lys Leu Pro Ile Leu Ile Phe Pro Glu Gly

    290                 295                 300

Thr Cys Ile Asn Asn Thr Ser Val Met Met Phe Lys Lys Gly Ser Phe

305                 310                 315                 320

Glu Ile Gly Gly Thr Ile His Pro Val Ala Ile Lys Tyr Asn Pro Gln

                325                 330                 335

Phe Gly Asp Ala Phe Trp Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Met Val Ser Tyr

            340                 345                 350

Leu Leu Arg Met Met Thr Ser Trp Ala Ile Val Cys Asp Val Trp Tyr

        355                 360                 365

Met Pro Pro Met Thr Arg Glu Glu Gly Glu Asp Ala Val Gln Phe Ala

    370                 375                 380

Asn Arg Val Lys Ser Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Leu Thr Glu Leu

385                 390                 395                 400

Pro Trp Asp Gly Gly Leu Lys Arg Ala Lys Val Lys Asp Ile Phe Lys

                405                 410                 415

Glu Glu Gln Gln Lys Asn Tyr Ser Lys Met Ile Val Gly Asn Gly Ser

            420                 425                 430

Leu Ser

Claims (6)

1、一种肿瘤转移相关蛋白的活性片段，是由序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列组成的多肽。

2、权利要求1所述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因，为下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的多核苷酸。

4、含有权利要求2或3所述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因的细胞系。

6、含有权利要求2或3所述肿瘤转移相关蛋白活性片段的编码基因的宿主菌。

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