CN1129958A

CN1129958A - 鉴定具有无限增殖或肿瘤形成潜力之人和动物细胞的方法

Info

Publication number: CN1129958A
Application number: CN94193236A
Authority: CN
Inventors: H·J·阿肯; W·艾伯特; H·容弗
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-07-15
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1996-08-28
Also published as: CA2166976A1; DE59408917D1; ATE186575T1; EP0708841B1; US6503706B1; EP0708841A1; JPH09500272A; ES2141249T3; DE4323727A1; WO1995002701A1

Abstract

本发明公开了适用于检测有无限增殖和肿瘤形成潜力之细胞的DNA-蛋白质-复合物，DNA序列和抗体。本发明还公开了得到所述蛋白质或DNA的方法和用所述蛋白质，DNA序列或抗体鉴定有无限增殖和肿瘤形成潜力之动物和人细胞的方法。

Description

鉴定具有无限增殖或肿瘤形成潜力之人和动物细胞的方法

本发明涉及适用于检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力之细胞的DNA蛋白质复合物，蛋白质DNA序列和抗体；得到所述DNA蛋白质复合物，蛋白质或DNA序列的方法以及它们鉴定具有无限增殖和肿瘤形成潜力之人和动物细胞的用途。

所有分化的人和动物细胞在其衰老和死亡之前均具有有限的体内和体外增殖潜力。在一给定的时间，可能有的细胞分裂数目取决于细胞的分化程度，其年龄和细胞所来自的供体的种类，以及细胞培养的持续时间(Goldsten，S.Replicative Senescence，Science 249(1990)，1129-1133)。然而经常在肿瘤形成的转化细胞中见到无限增殖。因此，它们形成导致肿瘤形成的不断生长的合胞体，最后随着这些细胞的其它特性的改变，导致肿瘤疾病。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤的临床特征在于它们生长迅速并经常转移。细胞的肿瘤形成转化的特征在于也取决于细胞分化程度的大量细胞形态学和生理学之改变的异型图像。到目前为止，仅仅了解很少的肿瘤转化的分子水平上可确定的参数；例如它们包括某些基因甲基化的改变程度(W.Doerfler et al.，Eukaryotic DNA甲基化：事实和问题，FEBS Letters 268(1990)，329-330)，修饰基因的表达，或某些基因产物的改变的磷酸化。

大多数肿瘤细胞的共性是具有无限的体内增殖能力。基于各种观察，研究人员认为不依赖于生长因子的肿瘤细胞的增殖确实是肿瘤形成细胞经常有的特征，但并不是绝对必需的(M.Strauss，B.E.Griffin，Cellular Immortalization，Cancer Cells 2(1990)，360-365)。然而，对于诊断和治疗领域的许多问题来说，鉴别那些不再遵循正常的增殖控制并因此获得无限增殖潜力的那些细胞是很重要的。

在此所涉及的问题是将肿瘤细胞无限增殖的这种特性与在许多组织中所见到的再生能力区别开。再生是一种受控的短期(短暂)细胞复制，并且作为对生理刺激的反应，仅仅是程序化细胞死亡的间歇抑制。在组织再生后，正常细胞的短期增殖又会由未鉴定的信号抑制。

检测恶性肿瘤细胞的已知方法是以临床，组织学和细胞学研究为基础，并以改变的生理学检测结果为依据。以组织学检测为基础，常规诊断方法通常是进行组织切片(W.A.D.Anderson and J.M.Kissane，Pathology I，II，Mosby，Saint Louis 1977，7th edition；C.S.Herrington andJ.O.D.McGee，Diagnostic Molecular Pathology，Oxford University Press，Vol.I，II.1st ed.，1992)。与良性生长相反，恶性细胞群与相邻组织仅有模糊的分界，并且细胞生长到其周围组织中浸润并破坏之。大多数情况由病灶周围的炎症引发。通常许多有丝分裂会提高肿瘤细胞的增生活性。

除这些组织学检测外，利用抗体检测增生的恶性细胞的方法变得越来越普遍使用，所述的抗体能识别最好是由增生的肿瘤细胞表达的抗原例如Ki67(D.C.Matthews，F.O.Smith，I.D.Bemstein，Monoclonalantibodies in the study and therapy of hematopoietic cancers，Curr.OpinionImmunol.4(1992)，641-646；M.Schwouzen，V.Diehl，M.Pfreundschuh，immunozytologische Phanotypisierung von Leukamien und Lymphomen，Med.Klinik 85(1990)，533-547)。但是，这些方法是以确定间接参数为基础，而没有检测与无限增生有关的分子过程。

因此，本发明的目的之一是在给实验室动物注射后，以无需体外培养这些细胞或使其繁殖的快速可行的方法鉴别具有无限增殖潜力的细胞特别是恶性肿瘤细胞。它应可以区别具有无限增殖潜力的细胞和在再生组织中短期增殖的细胞。

本发明的上述目的用DNA蛋白质复合物(下文称为复合物)来完成，所述的复合物适用于检测有无限增殖和肿瘤形成潜力的人和动物。得到所述的复合物可以通过从可永久分裂且在氯化铯梯度中的密度为约1.82-1.89g/cm³的人或动物细胞分离细胞质的无线粒体组分；然后用酚提取和乙醇沉淀从该组分中分裂所述的复合物。

实验令人吃惊地表明，与正常休眠细胞，衰老细胞或短期繁殖的细胞相反，具有无限增殖和肿瘤形成潜力的细胞在其细胞质中确实有所述的复合物。用本发明的这些复合物有可能检测所述的细胞，作为恶性生长的结果，这些细胞表现出无限生长潜力。为了达到这一目的，通过确定DNA含量或与特异性抗体的反应，在凝胶电泳中，人们用本发明复合物中的细胞质或适宜的细胞质组分作为标准。

为了分离本发明的复合物，根据已知方法(例如，EP-B-0093436，EP-B-0256512和Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)，468-472 and lysed forexample using detergents like NP40 or SDS，Wigler and Weistern，Biochem.Biphys.Res.Comm.63(1975)669-674)获取能永久分裂的人或动物细胞的胞质体。优选的用蔗糖梯度从这些胞质体组分分离线粒体(J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995)。将这些不含任何线粒体的组分与RNase，优选的是RNase A和RNase T1以及与蛋白酶，如，蛋白酶K或灰色链霉菌蛋白酶一起培养。富集该混合物中在氯化铯梯度中的密度为约1.82-1.89g/cm³的组分，然后用酚提取和乙醇沉淀从该组分中分离复合物。用氯化铯密度梯度离心和电泳分离均可以得到在氯化铯梯度中密度为约1.82-1.89g/cm³的组分；这些方法是本领域专业人员熟知的(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition，1989)。

通过反复冻融细胞或通过得到无核DNA的细胞组分也可以得到用于分离复合物的细胞质的无线粒体组分。优选的通过用氯化钠和SDS溶解细胞(″Hirt提取″，J.Mol.Biol.26(1967)365-369)然后离心得到所述的组分。接着从上清液中可以分离复合物。

在优选的方法中，经用盐梯度沉降从待测细胞的胞质溶解产物中分离复合物。通过反复冻融而不用洗涤剂，将细胞溶解在含Mg²⁺的缓冲液(50mmol/l Tris-HCl，pH7.2，10mmol/l EDTA，3mmol/l MgCl₂)中；以6000xg离心沉淀核，然后用蛋白酶K(100ug/ml)将上清液于60℃消化1小时。用CsCl两步梯度离心(150,000xg，10小时)分离释放的复合物；下层组分的密度为约1.80g/cm³，而上层的密度为约1.70g/cm³。胞质复合物会沉淀，而染色体DNA或不含共价DNA结合蛋白的复合物仍会留在上清液中。

利用下列特性，本方法可以迅速地分离胞质复合物：

-通过冻融含Mg²⁺的缓冲液而不必溶解核或使用洗涤剂可释放复合物。

-复合物对于蛋白酶来说是稳定的，而胞质细胞器和膜则被消化。

-复合物有很高的密度(约1.86g/cm³)而且利用盐梯度可以与染色体或其它胞质DNA分开。

-DNA结合蛋白对于高浓度盐是稳定的。

从任何转化细胞的胞质，尤其是永久生长的人或动物细胞或从肿瘤细胞，特别是从肿瘤活检得到的那些细胞可以得到所述复合物。转化的细胞被理解为通过加入一种试剂而不死亡的细胞。不同种(例如，人，小鼠，大鼠)的永久增殖细胞和不同分化程度的细胞(纤维瘤，骨髓瘤，腹水细胞)含有与其蛋白质和/或DNA内含物不同的复合物。因此，对于种和分化程度而言，本发明的复合物是特异性的。为了检测具有无限增殖和肿瘤形成潜力的细胞，人们从与待测的细胞为相同的种或相似的细胞类型的细胞中分离复合物。为了检测无限增殖的小鼠成纤维细胞/纤维瘤细胞或腹水肿瘤细胞，特别优选的是使用根据所描述的方法，从转化的小鼠细胞(L929细胞，ATCC CCL 1)或Ehrlich腹水细胞(ATCC CL77)的胞质体中分离的复合物。为了得到其它组织或分化程度及其它种之永久组织细胞的复合物，可以使用具有所需分化程度的其它肿瘤细胞系和种作为来源以分离复合物。若想从人子宫颈肿瘤得到相应的复合物，优选的是使用人细胞系HeLa，或B淋巴瘤细胞系和B-细胞淋巴瘤细胞系BJAB得到相应的复合物。此外，可以使用通过例如将原代细胞与永久生长细胞的胞质体融合(EP-B-0093，436，Abken et al.，J.Cell.Biol.130(1986)795-805)或通过用来自这些胞质体的DNA转染(EP-B-0256512和DE4218945.4和Abken et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)468-472)的实验性永生化过程而永生的永久生长细胞系。

实验表明密度为1.86g/cm³的胞质DNA组分分布于整个Hodgkin淋巴瘤细胞。该DNA还与蛋白质相连。在该组分中所含的DNA分子长度为50-500bp。如果是来自小鼠肿瘤的细胞，所有DNA分子都是线性的。但是，它们不与来自小鼠肿瘤细胞的DNA杂交。这表明本发明中的动物和人淋巴瘤细胞均含有胞质DNA序列。还可以在结肠和乳腺癌和人黑瘤的人肿瘤细胞中发现本发明的该组分。

可以从这些复合物中分离蛋白质和/或DNA并用它们检测具有无限增殖和肿瘤形成潜力的人或动物细胞。

因此本发明的另一目的是分子量为约52、62和/或64KD的蛋白质，它们适用于检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞；通过用DNase I处理本发明的复合物并分离释放的约52，62和/或64 KD的蛋白质，然后经层析或电泳方法可以得到它们。

为了分离这些蛋白质，用DNase I处理所述的复合物，然后经凝胶过滤从蛋白质中分离消化的核酸；同时根据大小分离蛋白质。若使用来自小鼠L细胞(L929)和/或Ehrlich腹水肿瘤细胞复合物，得到大小为52、62和64KD的蛋白质。这些蛋白质的特征在于它们在存在8mM Zn²⁺时有能力结合本发明克隆的pLC 108 DNA(SEQ ID NO 1)。来自Ehrlich腹水细胞的蛋白质的特征在于，在存在8mM Na⁺时，它们有能力结合克隆的pEFC38 DNA(SEQ ID NO 29)。优选的是使用模板结合的DNase制备这些蛋白质，例如使用与sepharose共价结合的DNase。

本发明的另一目的是适用于检测具有无限增殖和肿瘤形成潜力之人或动物细胞的抗体；通过用本发明的复合物或蛋白质或DNA免疫动物可以得到所述抗体。可以用任何常用于免疫的动物，包括小鼠(例如MNRI或BALB/c品种)或兔以及免疫方法(参见例如，J.Peters and H。Baumgarten，Monoklonale Antikorper，Springer Verlag，2nd edition1988)。

根据本发明复合物的免疫，DNA和蛋白质产生与来自具有无限增殖或肿瘤形成潜力之细胞的胞质的蛋白质特异性结合，但不与有正常增殖能力之细胞的蛋白质结合的抗体。用例如ELISA，荧光法，免疫检测和本领域专业人员已知的所有竞争性免疫测定法，可以完成本发明的抗体对这些蛋白质的检测。

除本发明复合物的蛋白质部分外，用DNA部分也可以进行检测。

因此，本发明的另一方面是适用于检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的DNA，通过本发明复合物的DNA的克隆或酶促复制过程可以得到所述的DNA。

实验令人惊奇地表明，尽管在复合物中，本发明复合物的DNA与蛋白质紧密结合，以致用洗涤剂，蛋白酶高盐浓度或热处理均不能除去，但可以使所述DNA连接到象分离的DNA这样的克隆载体中或可以经酶促扩增，例如用PCR。通过将复合物的DNA例如连接到常用载体如pUC19中可以得到DNA，然后克隆在本领域专业人员已知的宿主生物例如E.coli HB101或E.coli DH5α中可以得到所述的DNA。然后通过与本发明复合物杂交来鉴定含本发明DNA序列的重组克隆并分离该DNA。从L929细胞(ATCC CCL 1)可以得到20个重组质粒，而从Ehrlich腹水细胞(ATCC CCL 77)可以得到25个质粒克隆，它们适宜于分子鉴定有无限增殖潜力之细胞。这些DNA序列列于序列表SEQ ID NO 1-45。利用这些序列，可以检测其它不同分化程度或其它种之细胞的其它适宜的DNA序列以鉴别具有无限增殖潜力的相应细胞。

SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29所示的DNA序列适于使人或动物细胞永生(参见德国专利申请P 4218945.4)。所有其它的DNA序列(SEQ ID NO2-28和SEQ ID NO 30-45)均没有永生化作用，但适于检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞。

因此，本发明的优选方面是含有示于SEQ ID NO 2-28或SEQ ID NO30-45的DNA序列之一或与这些序列之一杂交的DNA。

本发明的另一优选目的是含有示于SEQ ID NO 46-61的DNA序列之一或与这些序列中的一个或数个杂交的DNA。SEQ ID NO 46-58得自HD 428Hodgkin细胞的DNA 。 SEQ ID NO 59-61得自MCF 7细胞(乳腺癌)的DNA。

本发明的核酸可以是DNA，但也可以是RNA或核酸类似物，例如，已经用多肽链取代了糖磷酸酯骨架的那些。所述核酸可以是双链的，但优选的是单链的。本发明还包括各互补序列。在优选的方法中，本发明的核酸含有至少15个氨基酸的序列，由此，从一组如下的至少15个氨基酸中选出这些序列

-SEQ ID NO 2-28或30-61的序列中所含的序列，

-通过连接SEQ ID NO 1-45，46-58，或59-60中的两个序列而得到的序列，

-编码与上述两类序列的氨基酸序列相同的序列，

-在特定的序列内，含有与上述所列的两类序列有至少70％，优选的至少90％以上，最好为95％以上的序列特异性的序列。

特别优选的核酸长度为16-100个核苷酸。根据长度，可以用分子生物学或化学/合成方法得到所述的核苷酸。

实验表明，到目前为止，所检测DNA序列中的大多数均含有一致序列NNAAANTNTNGAANTGTANNANTGNAA(SEQ ID NO 62)。

本发明的另一目的是通过分离人或动物细胞中的本发明复合物然后从该复合物克隆DNA或经酶促复制而得到本发明DNA的方法，所述的人或动物细胞能永久地分裂。

本发明另一优选的目的是获得本发明DNA的方法，其中所述的本发明DNA序列可以通过将人和动物细胞的基因组基因库或cDNA库与示于SEQ IDNO 1-61的DNA序列之一杂交并根据已知方法从基因库中分离杂交的克隆DNA来鉴别。可以使用永久增生的肿瘤细胞基因库以及正常细胞或组织的基因库。

本发明的另一优选目的是通过将人和动物细胞的DNA与本发明的蛋白质结合而得到本发明DNA的方法；蛋白质结合到硝酸纤维素或其它载体膜上并于存在Zn²⁺或Na⁺的条件下温育(例如4℃30分钟)。随后以高盐浓度(例如0.1％SDS，2x SSC)严格洗涤混合物。

本发明的另一优选的目的是通过酶促复制人或动物细胞的DNA或RNA组分而得到本发明DNA的方法；所用的起始分子是与示于SEQ ID NO 1-61的序列之一杂交的寡核苷酸分子。优选的寡核苷酸起始分子长度在20-30个碱基对之间。根据本领域专业人员已知的方法(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)335-350，Saiki et al.，Science 239(1988)487-491)用聚合酶链反应(PCR)可以酶促复制所需的DNA序列。可以用基因库以及DNA或RNA制品或人或动物无限增殖或正常衰老细胞的细胞溶解产物作为DNA组分。

本发明方法的另一改变是化学合成含有示于SEQ ID NO 1-61的DNA序列之一或部分该DNA序列的本发明DNA。根据本领域专业人员熟知的寡核苷酸合成方法(F.Eckstein，ed.，Oligonucleotides and analogues：A practicalapproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford(1991))完成合成；优选的是使用市售的寡核苷酸合成装置。

本发明的另一目的是检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞的方法，通过检测待测细胞之胞质中的无线粒体组分而检测本发明的复合物。具有有限增殖能力的正常细胞在胞质的该组分中不含有所述的复合物，而无限增殖的细胞，例如肿瘤细胞含有数百拷贝的这些复合物。

本发明的复合物被分泌出。这些复合物的DNA-蛋白质-连接物对于蛋白水解消化是非常稳定的。在经过水解处理数周的细胞上清液中，可以检测所述的复合物。

在可以对其进行检测的外周血，尿，或其它体液中也可能含有所述的复合物。

因此，本发明的一个优选的目的是通过检测体液中的本发明的复合物而检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的方法。

经DNA组成或经凝胶电泳可以确定所述的复合物，而以本发明的复合物为标准确定阳性反应。然而，在这些方法中，不能分辨不同种或组织类型的复合物。但是，利用本发明的抗体就可以进行所述的特异性检测。

除完全抗体外，还可以使用含有轻链和重链之特异性抗原识别区(V_L和V_H)和的抗体片段。这些片段可以与载体例如蛋白质，糖或sepharose偶联，或可以与染料连接以得到融合产物。

优选的，将抗体的抗原识别区V_L和V_H的编码基因序列与载体分子例如噬菌体的表面蛋白或病毒的衣壳蛋白之基因序列融合而得到所述的融合产物；然后在体外表达该杂合基因。分离和克隆编码抗体V区的基因序列并将其插入其它基因的DNA，例如g3p噬菌体蛋白质的基因序列的方法以及表达所述融合蛋白的方法是本领域专业人员已知的(Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 86(1989)：3833-3837；chiang et al.，BioTechniques 7(1989)：360-366；Winter，G.and Milstein，C.，Nature349(1991)：293-299)。然后象抗体一样可以在复合物的检测中使用融合产物(在噬菌体或病毒表面或以分离的形式)。

最后，通过将待测细胞中的DNA组分与本发明的DNA杂交也可以检测这些细胞中的复合物。该方法的优点是用这些DNA探针可以区别不同分化程度(纤维瘤和/或腹水肿瘤)和种(小鼠或人)的细胞。

因此，本发明的另一目的是有关通过将具有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞的DNA组分与本发明的DNA杂交，从而检测这些细胞的方法。

可以用含有本发明复合物的胞质体的细胞组分作为DNA组分。然而，也可以用待测细胞的核，染色体DNA。实验表明，与具有无限增殖能力的细胞相比，在限制性消化并用Southern印迹分析限制性片段后，正常短期增殖细胞的核染色体DNA与本发明的DNA序列杂交后，有另一种杂交的限制性片段图形。通常，与探针杂交的其它限制片段说明存在具有无限增殖和肿瘤形成潜力的细胞。

本发明的DNA序列表现出如此高的敏感性和特异性以致可以用这些样品与细胞或组织原位杂交。只有表现出无限增殖或肿瘤形成潜力的细胞在胞质中被标记。为了进行原位杂交，可以用体外培养的细胞和活检中得到细胞或活检组织切片而不要求为复制细胞材料而进行的培养步骤。

本发明的另一优选的目的是按原位杂交而完成杂交的本发明方法的改变。

根据本领域专业人员已知的方法(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)：335-350；Saiki et al.，Science 239(1988)487-491)特别是利用聚合酶链反应，在酶检测反应中，通过复制来自待测细胞之复合物的DNA，可进一步提高本方法的敏感性。

因此，本发明优选的目的是本发明方法的一个具体的实施方案，其中，利用与本发明DNA杂交的寡核苷酸，由待测细胞的溶解产物或这些细胞的DNA或RNA片段经酶促作用复制核酸。

尽管对于高温(于90℃，1小时)，高盐浓度(例如6.9mol/l氯化铯)和蛋白酶K消化(100ug/ml于60℃经1小时)来说，DNA蛋白质结合是稳定的，但所述的扩增是可能的。

用所描述的检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之细胞的方法检测恶性肿瘤，其中，用活检的细胞、组织切片或来自人或动物体液的细胞或分泌的复合物作为样品材料。因此，描述的方法适用于检测这些细胞。此外，若做相应的修改，则也可以用描述的方法分离这些细胞。在该方法中，描述的方法特别要用于分离过程中鉴定某特定组分中的所需细胞。可以用本发明的抗体，随后，借助荧光激活细胞分类法(FACS)分离细胞。

下列实施例与列出具体优选DNA序列的序列表一起更详细地说明本发明。实施例1分离复合物并克隆其DNA以及克隆适用于检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力之细胞的这些复合物的DNA

从L929小鼠肿瘤成纤维细胞(L929细胞，ATCC CCL 1)和Ehrlich腹水细胞(EAZ，ATCC CCL 77)分离胞质复合物。首先，利用细胞松弛素B(50ug/ml)根据已知方法(Wigler and Weistein，Biochem.Biophys.Res.Comm.63(1975)669-674)得到这些细胞的胞质体，然后经反复冻融而溶解。根据J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995利用蔗糖梯度从胞质体溶胞产物中分离线粒体。将不含线粒体的组分与RNase A(20ug/ml)和RNaseT1(1000U/ml)一起于37℃温育30分钟，随后，与蛋白酶K(50ug/ml)于60℃温育20-60分钟。根据分离DNA的已知方法例如，用酚或氯仿/异戊醇提取从该混合物中分离复合物；经CsCl密度梯度(Sambrook etal.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)富集在氯化铯梯度中密度为约1.82-1.89g/cm³的组分。对10mmol/l Tris-HClpH7.2，1mmol/l EDTA透析该组分，用乙醇和乙酸钠沉淀所述的复合物。

为了分离这些复合物的DNA，对10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA，pH7.2透析所述的复合物。根据本领域专业人员已知的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，2nd edition 1 989)，在存在各种dNTP的条件下，用Klenow DNA聚合酶使DNA进行“填补反应”；随后在存在0-10U连接酶的条件下将其连接到pUC19载体中，并在E.coli.中克隆所得的重组质粒。在质粒于细菌中复制期间，生产出该重组DNA分子的无蛋白质拷贝。

因此，可以得到数个独立的L929细胞胞质复合物的质粒克隆(pLC)和来自Ehrlich腹水细胞相应组分的质粒克隆(pEFC)，它们适用于检测有无限增殖潜力的肿瘤转化细胞(见实施例2)。相应的DNA序列列于SEQID NO 1-46。实施例2分离复合物的简化方法

于存在50mmol/l Tris-HCl pH7.2，10mmol/l EDTA和1.5mmol/l氯化镁的条件下，通过反复冷融来溶解小鼠肿瘤胞质体细胞系L929细胞(ATCCCCL 1)；随后以6000g离心30分钟分离核。将所得的上清液与蛋白酶K(100ug/ml)于60℃温育20分钟。然后放在氯化铯两步梯度上；底层的组分的密度为约1.80g/cm³，而上层的组分(1ml)的密度约为1.70g/cm³ 。以150,000g离心10小时后，将沉淀重悬于100ul 10mmol/lTris-HCl pH7.2，1mmol/l EDTA中，按实施例1所述确定在该组分中所得DNA的量。实施例3用胞质复合物检测具有无限增殖能力的人或动物细胞

通过确定这些细胞溶解产物中的胞质复合物来检测具有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞。首先，用细胞松弛素B(50ug/ml)根据已知方法(Wigler and Weistein，Biochem.Biophys.Res.Comm.63(1975)669-674)得到这些细胞的胞质体，然后重复冻融以使其溶解。用蔗糖梯度(J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995)从胞质体溶解产物中分离线粒体，然后将无线粒体的组分与RNase A(20ug/ml)和RNase T1(1000U/ml)温育，随后与蛋白酶K(50ug/ml)温育。按已知方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)用CsCl密度梯度使该混合物经超速离心。经密度约1.82-1.89g/cm³之组分中的DNA组成物，确定可能存在的复合物(结果见表1)。根据已知方法(Sambrooket al.)经光度计或通过摄取溴化乙锭来确定DNA组成物。

实验表明，有有限预期寿命且在培养中只有一定数目的细胞分裂(约15-20代)的正常小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在胞质的这些组分中检测不到DNA。在其达到预期的细胞死亡之前，经历了该分化阶段且在体内体外仅有3-5次细胞分裂的人外周血淋巴细胞(PBL)也没有可检测的胞质复合物。但是，有无限增殖能力的细胞例如，恶性肿瘤建立的细胞系确实在相应的组分中含有胞质复合物(表1)。

表1

通过确定胞质DNA蛋白质复合物来检测具有无限增殖能力的人或动物细胞细胞种类细胞表型增殖作用胞质DNA蛋白质复合物

(μg DNA/10⁹细胞)PBL 人正常短暂＜1ngWIL-2 人肿瘤细胞无限约200ngHS-Sultan 人肿瘤细胞无限约100ngMEF 小鼠正常短暂＜1ngL929 小鼠肿瘤细胞无限约200ngEAZ 小鼠肿瘤细胞无限约500ngAg8.653 小鼠肿瘤细胞无限约300ngPBL：外周血的人淋巴细胞WIL-2：人T细胞白血病细胞系(ATCC CRL 8062)HS-Sultan：人白血病细胞系(ATCC CRL 1484)MEF：小鼠胚胎成纤维细胞L929：小鼠L细胞的肿瘤形成的转化细胞系(ATCC CCL 1)EAZ：小鼠腹水肿瘤的肿瘤形成的转化细胞系(ATCC CCL 77)Ag8.653：小鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL 1580)实施例4

通过将胞质复合物与pLC108 DNA探针(SEQ ID NO 1)杂交而检测细胞溶解产物中的有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞

将肿瘤形成转化的小鼠细胞系L929(A)和原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(第5代)(B)于50mmol/lTris-HCl，pH7.2，10mmpl/l EDTA，3mmol/l MgCl₂存在下，重复冻融溶解。以6000g离心20分钟沉淀核。将上清液(胞质溶解产物)与蛋白酶K(50ug/ml)于60℃温育1小时。随后，将KCl(0.5mol/l)加至该组分中，通过使用“Minifold”装置的BA85硝酸纤维素滤膜(Schleicher & Schuell)以稀释系列过滤。由于待测复合物的DNA蛋白质结合对于高盐浓度是稳定的，而且由于蛋白酶不消化复合物中的蛋白质，因此，在所选的条件下，复合物(与其它DNA蛋白质结合相反)保持完整并留在滤膜上。然后用20x SSC将硝酸纤维素滤膜洗涤2次并于120℃干燥15分钟。为了检测有无限增殖能力的小鼠成纤维细胞的复合物，于42℃(Sambrook et al.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory，2nd edition，1989)在严格条件(55％甲酰胺，1mol/l NaCl，1％SES，10％葡聚糖硫酸盐，100ug/ml Hering SpermaDNA)根据已知方法与32P-标记的示于SEQ ID NO 1(pLC108)的DNA序列杂交。

结果

(A)L929细胞胞质溶解产物样品表明，与SEQ ID NO 1所示的探针序列(pLC108)的杂交信号依赖于溶解产物的稀释度。

(B)与原代小鼠成纤维细胞(MEF)的胞质溶解产物不杂交。实施例5

用原位杂交检测有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞

在显微镜玻片的DMEM培养基上培养L929小鼠肿瘤细胞(ATCC CCL1)(A)和原代小鼠胚胎成纤维细胞(第5代)(B)。两种培养物均含有正在增殖的细胞；在培养约15-20代后，L929细胞有无限增殖潜力，而原代小鼠成纤维细胞停止增殖，然后死亡。此外，皮下注射L929细胞，在C3H小鼠中诱导肿瘤；然后，得到该肿瘤的冷冻切片并放在显微镜玻片上(C)。用PBS(Dulbecco/Vogt，J.Exp.Med.99(1954)，167-182)简单洗涤显微斜面两次，并用200ul中性聚甲醛溶液(5％)固定；随后用乙醇(70％)洗涤两次。为了检测有无限增殖潜力的细胞，使用与SEQID NO 1所示序列(pLC108)类似的寡核苷酸(引物A)：5’GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3 3’(相应于SEQ ID NO 1的核苷酸1-25)。在20ul反应缓冲液(20mmol/l卡可酸钾，25mmol/l Tris-HCl，pH6.8，5mmol/l CoCl₂，0.25mg/ml牛血清白蛋白)中于37℃用地高辛配基-标记的二脱氧UTP(DIG-11-ddUTP)(1nmol)25U的末端转移酶(Boehringer Mannheim Gmbh，Cat.NO.220582)标记寡核苷酸20分钟。然后通过P10柱(Biorad制造)经凝胶过滤从无DIG-ddUTP的核苷酸分离标记的核苷酸。为了杂交，用200ul杂交溶液(50％去离子甲酰胺，4xSSC，10％葡聚糖硫酸盐，1x Denhardt溶液，0.25mg/ml变性的tRNA，0.5mg/ml变性的hering sperm DNA)包被固定了细胞或组织切片的显微镜玻片。然后用盖玻片盖在所述玻片的溶液上，在保湿器中，将显微镜玻片于42℃温育1小时。随后，再除去溶液，用DIG-ddUTP-标记的寡核苷酸(在40μl杂交溶液中有5ng DNA)包被细胞，然后于42℃在保湿箱中温育。接着，于42℃用2x SSC将显微镜玻片洗涤两次。为了检测杂交的寡核苷酸，在室温将细胞与FITC-结合的抗DIG抗体(由Boehringer Mannheim，Cat.No.1207741制造)温育20分钟。用PBS洗涤两次除去未结合的抗体。然后在470nm的波长，用荧光显微镜评估制品。结果：

(A)L929肿瘤细胞在胞质中有增强的荧光，而核没有任何荧光。在胞质的核附近，杂交信号的积累特别明显。在对照实验中(没有寡核苷酸，但与FITC-抗-DIG抗体温育的细胞的“假杂交”)没有荧光信号产生。

(B)在原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)杂交后，细胞未被标记(在胞质或核中均没有)。

(C)由L929细胞诱导的肿瘤的组织切片杂交后，肿瘤细胞在胞质中有荧光，而周围(正常)组织和皮下组织没有任何杂交信号。在对照实验中(没有寡核苷酸，但与FITC抗-DIG抗体温育的细胞的“假杂交”)，没有产生荧光信号。在组织切片中，通过与本发明的寡核苷酸样品杂交，也可以检测有无限增殖潜力的致肿瘤的L929细胞的胞质复合物。在组织切片或活检中，也可以鉴定肿瘤形成的转化细胞。实施例6

通过染色体DNA的杂交检测有无限增殖或肿瘤形成潜力的人或动物细胞

从肿瘤形成转化的L929成纤维细胞(ATCC CCL 1)，Ehrlich腹水肿瘤细胞(ATCC CCL 77)，骨髓瘤Ag8.653细胞(ATCC CRL 1580)，永久增殖的WEHI164纤维肉瘤细胞(ATCC CRL 1751)的小鼠细胞系但非致瘤性的成纤维细胞系NIH3T3(ATCC CRL 6473)和根据已知方法(Abken etal.，J.Cell Biol.103(1986)，795-805；Sambrooket al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)，通过在PBS中于73℃将胶原酶(0.1U/ml)和dipa se(0.8U/ml)切的小鼠胚胎(12型)而得到的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(6代)中分离染色体DNA。用Hind III裂解后，电泳分离DNA并用Southern印迹转移到尼龙膜上。检测有无限增殖的细胞后，用32P-标记的示于SEQ ID NO 29的DNA序列(pEFC38)与血液杂交。结果：

在检测的细胞中有不同大小的杂交限制性片段(表2)。可以鉴定下列特征：

1有有限预期寿命和有限增殖作用的细胞(例如MEF)显现约3kb和约2.6kb的Hind III谱带。

2有无限增殖潜力和肿瘤形成(L929，EAZ，Ag8.653，WEHI164)或无限增殖但没有肿瘤形成(NIH3T3)的细胞显示出有特定大小的HindIII限制片段的其它杂交信号。3kb谱带常常不出现。对于所有无限增殖细胞所共有的是有下列大小的特定的其它Hind III限制片段：10kb，13kb，14.5kb，16.6kb，和21.1kb 。如果用示于SEQ ID NO 29的DNA探针(EFC38)产生这些额外的杂交谱带和/或未出现的杂交的3kb HindIII谱带，则表明小鼠细胞有无限增殖潜力。

表2

通过将染色体DNA与pEFC38 DNA样品(SEQ ID NO 29)杂交来检测具有

无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞细胞杂交的限制性片段(kb)

1.9kb 2.6kb 3.0kb 6.0kb ＞10kbMEF - + + - -NIH 3T3 - + + - +L929 + + + + +EAZ - + + + +Ag8.653 + + - - +WEHI164 - + - - ++/-与所列大小的基因组DNA的Hind III限制性片段杂交/不杂交。

Hind III限制性片段＞10kb：10kb，13kb，14.5kb，16.6kb，

21.1kb实施例7

通过扩增某些胞质DNA蛋白质复合物的DNA来检测有无限增殖能力的人或动物细胞

永久增殖的L929小鼠纤维瘤细胞携带含有DNA的胞质DNA蛋白质复合物，所述DNA能与LC108DNA(SEQ ID NO 1)杂交。其它分化程度的小鼠肿瘤细胞，象Ehrlich腹水肿瘤细胞也有含有DNA的复合物，所述DNA与EFC38DNA(SEQ ID NO 29)杂交但不与LC108 DNA或SEQ ID NO 1-20所示的任何其它序列杂交。与有无限增殖能力的肿瘤细胞L929和Ehrlich腹水细胞相反，在有有限增殖能力的原代成纤维细胞如小鼠胚胎成纤维细胞的胞质中不能检测到所述的复合物，利用聚合酶链反应，可以特异性地扩增相应复合物的DNA以便在细胞混合物中检测是否存在永久增殖的细胞。在实验所选的条件下，可以区别这些细胞的分化程度以鉴别是纤维瘤或腹水细胞。

将104个原代小鼠胚胎成纤维细胞(6代)，肿瘤形成转化的小鼠细胞系L929(ATCC CL1)和Ehrlich腹水(ATC CCL 77)或这些细胞的混合物重悬于5μl PBS中，然后加入15μl的水，立即将混合物冷冻于-20℃，再加热到95℃持续10分钟。将样品与蛋白酶K(500ug/ml)于55℃温育1小时，随后在95℃再加热10分钟。加入下列反应混合物以便根据已知方法用PCR技术扩增胞质DNA蛋白质复合物的DNA(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)：335-350；Saiki et al.，Science 239(1988)：487-491)：3μl 10x Taq缓冲液(200mmol/lTris-Hcl，pH8.4，250mmol/lKCl，0.5％吐温20，1mg/ml BSA)；0.5μl 100mmol/l MgCl₂；1μl dNTP溶液(2mmol/l dATP，2mmol/dCTP，2mmol/l dGTP，2mmol/l dTTP)；1U Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)；100ng用于扩增LC108的引物寡核苷酸A和B扩增EFC38的同源DNA和/或引物寡核苷酸C和D胞质DNA蛋白质复合物的同源DNA。引物寡核苷酸序列(引物)是示于SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29的部分DNA序列。引物A：5’GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT 3’(SEQ ID NO 1的核苷酸1-25)。引物B：5’GATCCAAAGCCCTCTGCTGGCCTCC 3’(与SEQ ID NO 1的核苷酸2 03-1 79互补)。引物C：5’GATCCAATCAGCTCAGCCACCCCCA 3’(SEQ ID NO 29的核苷酸1-25)引物D：5’AAAACCAGGCCCTCCCACATG 3’(与SEQ ID NO 2的核苷酸372-352互补)然后用下列温度模式完成30个循环：1. 1×(95℃2分钟)2. 30×(55℃30秒；72℃90秒；95℃60秒)3. 1×(72℃15分钟)如此扩增的胞质复合物DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳分离，与溴化乙锭一起保温后用紫外灯检测。结果：

若用永久增殖的L929细胞，利用引物A和B扩增LC108同源复合物的DNA，得到扩增的DNA(203bp)，但用MEF或Ehrlich腹水细胞则不行。 EFC38同源DNA的扩增在Ehrlich腹水细胞的溶解产物中得到扩增的DNA(372bp)，但在L929细胞的MEF样品中没有(表3)。在10⁴小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中L929细胞或Ehrlich腹水细胞的反应混合物表明，在10⁴小鼠正常成纤维细胞中，用该实验可以检测到有无限增殖潜力的设定细胞(L929，EAZ)。若选择引物对(A，B，或C，D)，也可以确定在细胞混合物中，这些恶性细胞(纤维瘤(L929)或腹水(EAZ)细胞)的分化程度。

表3

通过扩增某些胞质复合物的DNA来检测具有无限

增殖能力的人或动物细胞细胞/细胞混合物细胞数用下述引物进行的PCR扩增(a) (b) (a) (b) 引物A，B 引物C，DMEF - 104 - - -L929 - 104 - + -EAZ - 104 - - +MEF L929 104 1 + -MEF EAZ 104 1 - ++/-扩增/未扩增胞质复合物的DNA实施例8

通过竞争性PCR扩增胞质复合物的DNA来检测细胞混合物中有无限增殖能力的人或动物细胞的数量

利用所述的实验安排，在有有限增殖潜力的正常预衰老细胞的混合物中，可以(近似地)确定有无限增殖和特定分化程度的细胞的数量。用特异性的引物寡核苷酸，经PCR反应扩增胞质复合物的DNA；特异性DNA(待测的)与恒定量的已知竞争DNA竞争。由于是在DIG-dUTP的存在下完成PCR反应，因此用修饰的核苷酸标记了扩增的DNA。通过与单链同源捕获探针杂交，待测复合物的扩增DNA被结合，然后利用抗DIG ELISA实验确定结合的DIG-标记的DNA的数量。设计该方法以便可以在为该目的而设计的微量滴定板上完成实验步骤。

1.制备细胞溶解产物

将含有递增浓度的待测Ehrlich腹水细胞的原代小鼠成纤维细胞(MEF)和ehrlich腹水细胞(EAZ)的细胞混合物(共10⁵个细胞)溶解在100ul 50mmol/l Tris-HCl，pH7.2，10mmol//EDTA，3mmol/l MgCl₂中，通过重复冷冻和冻融溶解细胞。以6000g离心10分钟沉淀核；将蛋白酶K(50ug/ml)加到上清液中，于55℃温育1小时。然后加热到95℃保持10分钟使蛋白酶失活。2.制备特异性的捕获探针

用捕获探针RNA检测Ehrlich腹水细胞，所述RNA含有示于SEQ ID NO29的部分序列(372bp)。根据已知方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor laboratory，2nd edition，1989)在SP6载体，例如pSPT18中克隆DNA序列(示于SEQ ID NO 29之序列的碱基对26-碱基对350)。用SP6-RNA聚合酶，根据已知方法制备并纯化单链RNA样品(Dunn and Studier，J.Mol.Biol.166：477，1983；Kassavetis et al.，M.Biol.Chem.257：5779，1982)，优选的是利用模板结合的DNase I(无RNase)。用生物素UTP和RNA连接酶在其末端标记RNA，并在Sphadex G50柱(Biorad)上，经凝胶过滤除去未掺入的生物素UTP。现在可以用生物素EFC38(28-346)捕获探针以结合链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板。3.包被微量滴定板

用链霉抗生物素蛋白包被适用于ELISA实验的96孔微量滴定板的底部，洗涤，干燥。随后，将生物素标记的捕获探针[500ng生物素EFC38(26-246)]加到100ulTE缓冲液(10mol/l Tris-HCl，pH7.5，1mmol/lEDTA)中，于37℃温育1小时。在微量滴定板上，捕获探针经生物素而与链霉抗生物素蛋白结合。随后，用TE缓冲液将微量滴定板洗涤数次。

4.制备EFC38-PCR竞争探针

使用PCR技术的竞争性(定量的)扩增需要一种DNA，它与待测DNA竞争与特异性寡核苷酸引物的结合。为了达到该目的，制备一双链竞争DNA，它有372bp的长度，与SEQ ID NO 29所示的DNA一样；碱基对1-25和碱基对351-372与示于SEQ ID NO 29的DNA序列相同。然而，碱基对26-350与SEQ ID NO 29所示的DNA序列不一致但表现为用常规寡核苷酸合成装置可以得到的随机DNA序列。5.DNA蛋白质复合物之EFC38同源DNA的竞争性PCR

将下列PCR反应混合物加到细胞溶解产物(100ul)(来自1)中以扩增待测的EFC38同源DNA：

12ul 10x Taq缓冲液(200mmol/l Tris-Hcl，pH8.4，250mmol/lKCl，0.5％吐温20，1mg/ml BSA)；

1.5ul 100mmol/l MgCl₂；

2.5ml DIG-dNTP溶液(2mmol/l dATP，2 mmol/l dCTP，2mmol/ldGTP，2mmol/l dTTP，0.7mmol/l DIG-dUTP)(Boehringer Mannheim)；

2U Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)；

引物寡核苷酸C和D各100ng(见实施例7)

按照下列温度模式完成30个循环：1. 1x(95℃5分钟)2. 30x(55℃0秒；72℃90秒；95℃60秒)3. 1x(72℃15分钟)

随后，将样品加热到95℃保持10分钟，冷却到75℃，然后加到预热的微量滴定板中，慢慢冷却到室温(2℃/每分)。6.定量扩增的DNA

用500ul的PBS将微量滴定板的孔洗涤数次，与抗DIG抗体，过氧化物酶结合的Fab片段(在PBS中150mU/ml，0.5mg/ml牛血清白蛋白)(由Boehringer Mannheim制造)于37℃温育1小时。用PBS将孔洗涤两次，然后与200ulABTS底物(过氧化物酶底物溶液)于室温温育1小时。用微量板阅读器检测孔中405nm的吸收值。吸收值与来自复合物的PCR扩增的DNA量成正比，因此，与细胞混合物中的Ehrlich腹水细胞的量成正比例。实施例9定量检测由有无限增殖潜力的细胞分泌的复合物

有无限增殖潜力的细胞分泌胞质复合物。因此，对这些分泌的复合物的检测可被用来检测有无限增殖能力的细胞，特别是检测肿瘤细胞。该实施例说明，在无细胞的培养物上清液中可以测量Ehrlich腹水细胞分泌的复合物。由该方法可以特异性的确定特定的复合物以区别不同分化程度的肿瘤细胞。1.制备无细胞的培养物上清液

在Transwells^TM盘(Costar，Cambridge，MA)中培养Ehrlich腹水细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞，使细胞在较低的部分生长，然后用有孔(直径0.3μm)的膜从细胞中分离培养物上清液；将上清液收集于上部。分泌的复合物扩散到无细胞的上层部分。将10⁴，10⁵和10⁶个细胞的部分放在3ml的培养基中，2天后，从上部得到无细胞的培养物上清液(100ul)。将蛋白酶K(50μg/ml)加到上清液中，于55℃温育1小时。随后，将探针加热到95℃10分钟以便使蛋白酶失活。2.制备微量滴定板，“捕获探针”和竞争性DNA

已在实施例8中给出了用链霉抗生物素蛋白包被ELISA微量滴定板并制备生物素化的捕获探针的方法；所用的DNA序列也是实施例8中的。同样按照实施例8中的描述制备竞争性DNA。

3.竞争性PCR扩增待测复合物的DNA

将培养物上清液加到包被的微量滴定板中，同时还加入实施例8中描述的PCR反应混合物。再按实施例8所述，在存在DIG-dUTP的条件下扩增DNA。随后，将混合物加热到95℃10分钟，然后缓慢冷却到室温(2℃/分)。4.确定扩增的DNA

用500ulPBS将微量滴定板的孔冲洗数次，然后于37℃与抗DIG抗体，与碱性磷酸酶结合(在PBS中20ug/ml，0.5mg/ml牛白蛋白)(由BoehringerMannheim生产的)的Fab片段温育1小时。每次用500ulPBS洗涤孔两次。加入NADPH，经结合抗DIG抗体的碱性磷酸酶反应以得到NADH。使用含有醇脱氢酶和心肌黄酶的酶循环(AMPAK^_，Dako)，加入INT后，经心肌黄酶使NADH反应，得到NAD⁺和甲_。加入乙醇后，醇脱氢酶将NAD⁺变成酸酐和NADH，后者又可用于经心肌黄酶的反应。在每个循环中，产生一分子的甲_。用微盘阅读器于492nm测量所生产染料的吸收值。

使用PCR技术在存在DIG-dUTP的条件下，竞争性扩增待测复合物的DNA并用碱性磷酸酶结合的抗-DIG抗体以及随后在酶循环中扩增信号从而检测扩增的DNA，使得可以极其敏感地检测细胞外分泌的复合物。测量的吸收值与来自分泌之复合物的PCR扩增、DIG-标记的DNA的量成正比，并且与在扩散室培养中所用的Ehrlich腹水细胞的量成正比。实施例10分离DNA蛋白质复合物以检测Hodgkin淋巴瘤细胞

人Hodgkin细胞系HD 540(L540)和HD428(L428)(Diehl etal.，Cancer Treat.Rev.66，615-632(1982))细胞于1994年6月29日保藏于在Ma scheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig的德国微生物和细胞培养物(DSM)，保藏号为DSM ACC2177(HD540)或者，从DSM的公共收集中心得到，保藏号为DSM ACC197(L428)。通过重复冷冻和冻融，在50mmol/l Tris，pH7.2，10mmol/l EDTA，和1.5mmol/l MgCl₂中溶解所述的细胞；以6000g离心30分钟分离核，将所得的上清液与蛋白酶K(100ug/ml)于60℃温育20分钟，随后，放在氯化铯两步梯度上；下部(1ml)的密度为约1.80g/cm³，而上部(1ml)的密度为约1.70g/cm³。以150,000g离心10小时后，将沉淀重悬于100ul 100mmol/l Tris-HCl，pH7.2，1mmol/l EDTA中。然后对10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA，pH7.2透析；按实施例1所述确定在该组分中所得的DNA的数量。

根据本领域专业人员熟知的方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor，2nd edition，1989)，在dNTP存在的条件下，利用Klenow DNA聚合酶使DNA进行“填补反应”，然后在存在10U连接酶的条件下，连接到pUC19载体中；在E.coli.中克隆所得的重组质粒。在质粒复制期间，在细菌中生产该重组DNA分子的无蛋白质拷贝。

因此，可以得到数个人Hodgkin细胞胞质复合物的独立质粒克隆(pHD540，pHD420)。当相应地使用实施例3-9时，这些质粒克隆的插入DNA适用于检测Hodgkin淋巴瘤的肿瘤形成转化细胞。所用的DNA序列是列于SEQ ID NO 45-85的序列。

这些序列不与小鼠细胞中的序列杂交。实施例11使用抗胞质DNA蛋白质复合物的多克隆兔血清以检测小鼠肿瘤细胞

用抗胞质DNA蛋白质复合物的特异性抗血清检测小鼠肿瘤细胞。为了达到该目的，制备这些细胞的蛋白质溶解产物，电泳分离，放在载体膜上，然后用WESTERN印迹与兔的特异性抗血清培养。用第二抗兔抗体和化学发光反应检测结合的兔抗体。方法：

1.获得抗血清

用DNA蛋白质复合物(从小鼠L929细胞的胞质中分离的)通过每3星期皮下注射3次来免疫兔；随后获得血清。2.获得蛋白质溶解产物

在50mM Tris-HCl，pH7.2，10mM EDTA，3mM MgCl₂，0.3％NP40存在下溶解L929细胞(小鼠肿瘤细胞)和MEF(小鼠正常胚胎成纤维细胞)。以8000 g离心2分钟分离细胞片段，核和膜。将上清液(蛋白质组分)存于-20℃。3.Western印迹和检测反应

在SDS存在下使L929细胞和MEF(相当于约10⁵个细胞)的蛋白质组分以及分离的DNA蛋白质复合物(1μg)(作为阳性对照)变性；然后根据本领域专业人员已知的方法(E.Harlow，Antibodies，Cold SpringHarbor Laboratories，CSH Press)，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离它们，接着经电泳转移到硝酸纤维素膜上。在TBS(20mM Tris，137mM，NaCl，pH7.6)，3％(V/V)吐温20，5％(w/v)于奶粉中将膜温育1小时；随后，加入兔抗血清，然后将混合物再培养1小时。用TBS，3％吐温20洗涤膜，然后，与山羊抗-兔抗体(HRPO-标记的)(1∶5000)温育。再洗涤混合物并加入检测溶液(ECL，Amersham.RPN2106，2108，2109，完成放射自显影。结果：

来自L929肿瘤细胞的蛋白质溶解产物的抗血清与分子量为约36kD，52kD，62kD，64kD的蛋白质和＞150kD的蛋白质聚集物反应。通过与抗血清反应，来自肿瘤细胞(阳性对照)的分离的DNA蛋白质复合物中还发现了分子量为52kD，62kD，64kD的蛋白质。36KD的谱带最可能是蛋白质消化产物。

在MEF正常细胞的蛋白质溶解产物中，与抗血清无特异性反应。与＞150KD的蛋白质聚集物的弱反应可能是抗血清的非特异性结合。实施例12从乳癌分离DNA蛋白质复合物

相应于实施例10中描述的方法，从乳癌的MCF 7细胞系获得DNA蛋白质复合物。对部分核酸测序，示于SEQ ID NOS 59-61中。用这些序列作为探针鉴定并分离含有本发明复合物的乳癌细胞。体内或体外复制核酸后，确定这些复合物该DNA的完整序列。到目前为止所发现的序列不与Hodgkin或小鼠细胞中的序列杂交。本发明的另一目的是核酸，所述核酸是上述复合物及其功能等同物的完整序列的部分。序列表(1)一般资料：(i)申请人：

(A)姓名：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

(B)街道：Sandhofer Str.116

(C)城市：Mannheim

(D)州：BW

(E)国家：德国

(F)邮政编码(ZIP)：D-68305

(G)电话：0621/759-4348

(H)电传：0621/759-4457(ii)发明题目：鉴别有无限增殖或肿瘤形成潜力的人和动物细胞的方法(iii)序列数：62(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：203个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)序列描述：SEQ ID NO：1：GATCTTGAGT TTCCTCGTTG TAGGTCTTCC CTGGCTCTGC TCACGCTCTC ACTGACTTCT 60CTCAGCTCAG TCACAGTGTC TATTTCTTTC CACTTAAAGA TGTGCATTTT TATTTGATGC 120GTGCAGGTGT TTTGCCTGCA TGGATGGCTG TGCACCATGT ATGGGACCTG GTGCTCTTGG 180AGGCCAGCAG AGGGCTTTGG ATC 203(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：

(A)长度：69个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：2GATCTTTTCT TGAAAGTACG TAAGCCTGGG GTTTTAATTC TCATCTTAGA ACACAGTGTA 60AAAAGGATC 69(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：

(A)长度：224个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：3：GATCTTCAGT GTCCATACAC TCAGATTCCT GATTAAATCA AAGCATCAGA ACCACTCCCC 60CTGCAAAATG TCCCAAAATG TAAAATCAAT TGATGTACAA CTCAGAATAC ACCACTCTGA 120GGCATATTTT CCAGGGACTC TAACCTACTT CAGAAGTACA TGGTACTTGC TTCTCTATTA 180CAGCATAATA GAGATGAGCA ACATAGTGCA CTTACAAACA GATC 224(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：4：GATCAGACCT CTACCTTCAC CCATGAGGCT TGCTTGCAGC AATTAAGATC 50(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：

(A)长度：55个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：5：GATCTTTAGC TCCCTGGATA CTTTCTCTAG CTCCTCCATT GGGGGCCCTG TGATC 55(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征：

(A)长度：72个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：6：GATCTTTCCA AGACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTTTCTGCA 60TCCAACGAGA TC 72 (2)SEQ ID NO：7的资料：(i)序列特征：

(A)长度：47个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：7：GATCCTGGCA TTACCCTATC CTGCATTAAG GGGGGAACAG GAAGATC 47(2)SEQ ID NO：8的资料：(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：8：GATCCATTCT ATCTCCACCC CCACCATGAG GATC 34(2)SEQ ID NO：9的资料：(i)序列特征：

(A)长度：176个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(A)长度：225个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：52：CGGACCTATT ATCCTTAATG AATTACTTAA AGTTGCTGAC ACTCGTTCAG TTCAAAACTA 60CTTATTGAAA GAAGTACAAA GACTTTATCG TCTTCAAGGT ATCACAATTA GTGATAAATA 120TATTGAAATG ATTATTCGTC AAATGCTTTC AAAAATTGTT ATTACTGATC CAGGAGATAG 180TAAATTCTTT AGTGGTAACTTA 202(2)SEQ ID NO：53的资料：(i)序列特征：

(A)长度：170个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：53：AAGAAGATTA ACTTACAAAG ATTTTTTGGA AAAATATAAA CTTATTATGG ATAAAAATAC 60TATTCTAAAA TTCAAATCAG ATAATGATAA ACTTTATGAA TTTTCATTAG AAAGCTTTAA 120AGAAAACGAT AAATATAATT TCATATGGCA GAGATTTGCA TAAAAGCAAA 170(2)SEQ ID NO：54的资料：(i)序列特征：

(A)长度：188个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：54：TTGAGTTTTA TTAGTTGAAG TTTTAAAGCG CTAGTACAAG AAAATTTTTC AGAAAACGTT 60CTTATTGTAC TTTGAACGTG GTTGTAGAAA TTTAAAAAAC ACACTAGTTA TTTGAGGATT 120CTGTAGTGAA GGCGGACATG AACTCAATTA ATAATAATTA TTTCGGCGAC GATAAGGACG 180AACATTTT 188(2)SEQ ID NO：55的资料：(i)序列特征：

(A)长度：230个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：55：CTTTAACAAT TCTTACATTT AAAACTTCTA CTAATACATC TAAATGTTTT TTAACTCCAT 60GGCTCGAGCT TAAGCATTAG TACCAGTATC GACAAAGGCA CACATTTAAC AATAGGCGAG 120TGTTAAGGTG TGTTGTATGC TCGGCCTTCG TATTTCACAT TCGGACCCCA CGGATTACTC 180ACTCGATTGA GTGTAATTAA CGCAACGCGA GTGACGGCGA AGTCAGCCTT 230(2)SEQ ID NO：56的资料：(i)序列特征：

(A)长度：139个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：56：CACTTGTAGG TACTACAGTT GTAAAAAAAG AACTTGATCA CGATTATCTT CTAGTTCAAC 60GGAATAAAAA TTTTATTTTA AATCAATTTT AAAACAGTTT TGGAAATTAG AAAATAAAAC 120CCATGGCTCG AGCTTAGCA 139(2)SEQ ID NO：57的资料：(i)序列特征：

(A)长度：225个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：57：ACGTCCGTAC GTTCGAACCG CATTACTACC AGTATCGACA AAGGCACACA TTTAACAATA 60GGCGATTGTT AAGGTGTGTT GTAAGCTCGG CCTTCGTATT TCACATTTCG GACCCCACGG 120ATTACTCACT CGATTGAGTG TAATTAACGC AACGCGAGTG ACGGGCGAAA GGTCAGCCCT 180TTGGACAGCA CGGTCGACGT AATTACTTAG CCGGTTGCGC GCCCC 225(2)SEQ ID NO：58的资料：(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：58：ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT GG 22(2)SEQ ID NO：59的资料：(i)序列特征：

(A)长度：215个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：59：CCCTAAAATT AAAGAATTTA AAGAATTAGT TAAAAGCAGC AAAGAATTAT TCTTACAAAA 60AATACAAGCA AAATTTGAAA TGACTAAAAC GAGATTCAAG AATCAAGCCT TGCATTGTTT 120CAATAATCAA TTAGCAACTT TTTCAATAGT AAAAGAAAAA GTTATTCAAC GTAATCCATT 180AAAATATTAG AAAGTTTCGA AGTTACAATG AACAC 215(2)SEQ ID NO：60的资料：(i)序列特征：

(A)长度：192个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：60：TAATTGAAAA ACATGTTGAT GAACTCGATA TGGTAGAAAA TTAAGTTACA TTTCAAAAAA 60TAGTTGAAAT TGAACAAAAT AACAAAATTA ATAAACCAAC AAAAGTAAAC ATTGAAAACG 120TTTTTGAAAA AGATTATAAA AATTACCTAA TGTAACTTAT TGAAAAAGAA AATGATAACT 180TTTTCAACGA TT 192 (2)SEQ ID NO：61的资料：(i)序列特征：

(A)长度：91个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：61：ATGACCAAAA TAAATTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG 60ATCAAAGGAT GTTCTTGAGA CCTTTTTTTCT 91(2)SEQ ID NO：62的资料：(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)序列描述：SEQ ID NO：62：NNAAANTNTN GAANTGTANN ANTGNAA 27

Claims

1.适用于检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的DNA-蛋白质-复合物，通过分离密度为约1.82-1.89g/cm³的转化的人或动物细胞胞质的无线粒体组分和从该组分中通过用酚提取和乙醇沉淀分离复合物而得到所述的DNA-蛋白质-复合物。

2.适用于检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的蛋白质，通过用DNase I处理权利要求1的复合物，然后层析分离释放的蛋白质可以得到所述蛋白质。

3.根据权利要求2的蛋白质，其分子量为52kD。

4.根据权利要求2的蛋白质，其分子量为62kD。

5.根据权利要求2的蛋白质，其分子量为64kD。

6.适用于检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的抗体，通过用权利要求1的DNA-蛋白质-复合物，权利要求2-5的任一蛋白质或权利要求7或8的DNA免疫动物可以得到所述抗体。

7.适用于检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的DNA，通过克隆或酶促复制权利要求1的复合物的DNA可以得到所述DNA。

8.根据权利要求7的DNA，所述DNA含有示于SEQ ID NO 2-28或SEQ IDNO 30-61的DNA序列之一或与这些序列之一杂交。

9.通过从转化的人或动物细胞中分离权利要求1的DNA-蛋白质-复合物，然后克隆或酶促复制该DNA-蛋白质-复合物的DNA而得到权利要求7或8之一的DNA的方法。

10.通过将人或动物细胞基因组基因库或cDNA库与示于SEQ ID NO 1-61的DNA序列杂交，然后分离杂交的DNA而得到权利要求7或8之一的DNA的方法。

11.通过在存在Zn或Na离子的条件下，将人或动物细胞的DNA与权利要求2-5之一的蛋白质结合而得到权利要求7或8之一的DNA的方法。

12.通过用寡核苷酸起始分子，酶促复制人或动物细胞的DNA或RNA组分而得到权利要求7或8之一的DNA的方法，所述的寡核苷酸起始分子与部分示于SEQ ID NO 1-61的序列或其部分同源。

13.通过化学合成示于SEQ ID NO 1-61的序列之一或该DNA序列的部分而得到权利要求7或8之一的DNA的方法。

14.得到权利要求2-5之一的蛋白质的方法，其特征在于，用DNase I处理权利要求1的复合物，根据分子大小经层析或电泳分离释放的蛋白质。

15.检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的方法，其特征在于在密度为1.82-1.89g/cm³的胞质的无线粒体组分中检测权利要求1的复合物。

16.根据权利要求15的方法，其特征在于在抗原识别反应中使用权利要求6的抗体。

17.通过将待测细胞的DNA组分与权利要求7或8之一的DNA杂交而检测有无限增殖或肿瘤形成潜力之人或动物细胞的方法。

18.根据权利要求17的方法，其特征在于杂交是按原位杂交完成的。

19.根据权利要求17的方法，其特征在于用与权利要求7或8之一的DNA杂交的寡核苷酸从细胞溶解产物或这些细胞的DNA或RNA组分酶促复制核酸。

20.用权利要求15-19之一的方法检测恶性肿瘤，其中，使用人或动物的活检细胞，组织切片或体液分泌复合物的细胞作为样品材料。