CN1807623A

CN1807623A - 一个细胞周期正向调控基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN1807623A
Application number: CN 200510135513
Authority: CN
Inventors: 常智杰; 陆东东; 郝新保; 金桂花; 王银银; 任芳丽
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2006-07-26
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: CN100372932C

Abstract

本发明公开了一个对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因及其编码蛋白与其在制备抗肿瘤药物中的应用。其cDNA是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明为设计和筛选出针对CREPT的专一、有效的肿瘤早期诊断的分子标志物及治疗肿瘤的RNAi基因工程药物提供依据，使肿瘤的针对性基因诊断和基因治疗成为可能。对肿瘤的及时监测、早期发现、早期诊断、早期治疗和降低肿瘤的发病率与死亡率产生积极意义。

Description

一个细胞周期正向调控基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因及其编码蛋白与其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

尽管近百年来研究者从不同角度，应用各种研究手段对肿瘤进行的预防、病因、诊断和治疗等方面的研究已取得了可喜进展，但迄今为止肿瘤仍然是世界范围内威胁人类健康的大敌之一，而且其发病率在我国及全球范围内仍呈上升趋势。随着科学技术的发展，肿瘤的研究已由组织、细胞水平发展到分子水平，由细胞病理学、遗传学进入分子病理学、分子遗传学领域。大量研究表明，在肿瘤发生过程中，有多种癌基因与抑癌基因异常表达，并可能涉及许多DNA序列或基因改变。某些致病因子可引起癌基因的激活，又能引起抑癌基因的失活，这种平衡的破坏，是肿瘤发生的分子生物学基础。参与肿瘤异常表达的基因主要有突变、重排、倒位、缺失、插入失活、表达差异、异常剪切等形式。细胞周期调控、细胞凋亡和信号转导被视为现代生命科学研究的三大基石，这三大基石的核心都与分子肿瘤学密切相关。导致肿瘤细胞失控性增生的根本原因，正是细胞周期调控机制遭到破坏(包括驱动机制和监控机制的破坏)。监控机制的任何一个环节遭受破坏都将导致细胞基因组的不稳定性。基因组不稳定使得突变基因的数量增加，而这些突变的基因往往就是癌基因和抑癌基因，同时，很大一部分的癌基因和抑癌基因又是细胞周期调控机制的组成部分。因此，在肿瘤发展过程中，行使监控职能的基因一旦“失察”，将会使细胞周期调控机制进一步恶化，并导致细胞周期驱动机制的破坏，表现为强力“驱使”细胞出现癌变性生长。目前国内外的肿瘤诊断还仅局限于常规的血清学与病理学标志物检测与影像学的联合诊断，在分子水平上进行的早期诊断与预防尚未普及；尽管新的肿瘤治疗方法不断出现，尤其是切除方法不断改进，用药方案不断优化，而且肿瘤的基因治疗的实验研究已取得了惊人的进展，实验涉及免疫基因治疗、反义基因治疗与RNA干扰、抑癌基因治疗、自杀基因治疗等，但临床上很少运用分子手段治疗肿瘤。然而，对肿瘤患者及时监测、早期发现、早期诊断和早期治疗，尽力使认为“不可治”者，转变为“可治”，必须从分子水平上进行研究。这就需要对所发现的大量癌基因、抑癌基因或相关基因参与肿瘤的发生、发展的机制彻底阐明，利用RNAi、knockout及knock in等手段认识这些相关基因的转录及其调控机制，并研究它们在肿瘤细胞信号传递网络中的作用机制。因为在肿瘤组织、癌前病变组织、癌旁背景组织、正常组织等之间，在RNA、蛋白水平上都存在众多的差异表达基因，尤其是在肿瘤发生的早期阶段。深入了解肿瘤发生过程中各种癌基因改变状况和出现的规律及其相互联系，对阐明肿瘤发生机制是十分必要的。肿瘤发生过程是多基因协同作用的结果，是各种癌基因乃至包括多种细胞因子在内的一种网络调节的复杂过程。深入掌握各基因在肿瘤发生中的确切作用，理顺复杂网络调节因子间的相互作用关系，抓准关键所在，对未来开展肿瘤基因治疗最终为分子水平上的防治肿瘤将会有重要意义。

RNA干扰技术是近年来新兴的一项分子生物学技术。RNA能够充当“信使”，传递DNA(脱氧核糖核酸)编码上的遗传信息，合成机体蛋白质。早先的研究显示，向生物体内注入微小RNA片段，会干扰生物体本身的RNA“信使”功能，导致相应蛋白质无法合成，从而“关闭”特定基因。RNA干扰是一种由双链RNA诱发的“基因沉默”。在此过程中，细胞中与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解，从而抑制了相关基因的表达。RNA干扰技术实际上能够识别正常和变异基因副本间在单个核苷酸上的差别，并在此基础上对正常和变异基因作出区分，最终只“敲除”变异基因，而不影响正常基因的功能。采用RNA干扰技术，直接从源头上让致病基因“沉默”，在探查基因功能和治疗人类疾病方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一个对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因及其编码蛋白。

本发明所提供的对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因，名称为CREPT，其cDNA是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1833个碱基组成，其编码序列为自5’端第276-1253位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。自5′端的第297-653位碱基为RPR结构域的编码序列。

其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID №：3由981个碱基组成，自5′端第276-425位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第426-554位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第555-689位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端第690-803位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端第804-929位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端第930-1106位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端第1107-1256位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端第276-278位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第1254-1256位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA。自5′端第297-653位碱基为RPR结构域的编码序列。

本发明对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因所编码的蛋白(CREPT，cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由326个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第8-126位氨基酸残基为RPR结构域。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增CREPT中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明所提供的对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因的小干扰RNA，是正义链为序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID №：6的双链RNA序列。

将双链RNA序列命名为CREPT siRNA。CREPT siRNA的反义链与CREPT mRNA距离CREPT cDNA起始密码子ATG 220-239位置序列互补，序列表中SEQ ID №：5由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：6由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞生长的方法。

本发明所提供的抑制肿瘤细胞生长的方法，是将所述对肿瘤细胞周期具有正向调控作用基因的小干扰RNA的编码基因导入宿主，从而抑制肿瘤细胞生长。

以pBSU6(商业名pSilence1.0-U6，购自Ambion，Austin，TX，USA)为出发载体，构建的RNAi表达载体为pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi。

本发明的RNAi表达载体可按常规方法构建。

本发明所提供的对肿瘤细胞周期具有正向调控作用基因CREPT与肿瘤的发生、发展密切相关，并在细胞周期的分子调控网络中起到特殊作用，实验证明CREPT基因的功能与P15^INK4b、P21^CIP1/WAF1相反，其主要通过影响依赖P21^CIP1/WAF1降解的RB信号通路正向控细胞周期促进肝癌细胞、肾癌细胞的恶性增殖及体内外肿瘤形成能力，并发现CREPT基因在人类肝癌及肾癌组织中均呈上调表达。此外，酵母双杂交结果显示CREPT基因能与细胞周期调控有关的基因GADD45、SOX17、pbx1、CBP/P300、Skp2等直接作用。而p53基因正向调控其下游基因P21^WAF1CIP1和GADD45的功能，推测CREPT与肿瘤抑制基因p53间有一定的关系。CREPT作为肿瘤分子水平诊治的候选基因，为设计和筛选出针对CREPT的专一、有效的肿瘤早期诊断的分子标志物及治疗肿瘤的RNAi基因工程药物提供依据，使肿瘤的针对性基因诊断和基因治疗成为可能。本发明将对肿瘤的及时监测、早期发现、早期诊断、早期治疗和降低肿瘤的发病率与死亡率产生积极意义，并能产生一定的经济与社会效益。

附图说明

图1为人类肾癌组织中CREPT基因表达情况的RT-PCR检测结果

图2为人类肾癌组织中CREPT基因表达情况的免疫组化检测结果

图3为人类肝癌组织中CREPT基因表达情况的RT-PCR、Northern blot、Westernblot检测结果

图4为人类肝癌组织中CREPT基因表达情况的免疫组化检测结果

图5为过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系的Westen blot鉴定结果

图6为对筛选到的过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系以及CREPT RNA干扰的HepG2肝癌细胞系的表达蛋白进行的免疫细胞化学检测结果

图7为用MTT法测定并绘制的过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系及CREPTRNA干扰的HepG2肝癌细胞系的生长曲线

图8为过表达CREPTG基因或CREPT RNAi HepG2肝癌细胞中CREPT，CDK2，CyclinE，ppRB，PCNA，E2F-1 P21^CIP1/WAF1，pRB表达的Western blot分析结果

图9为以CREPT基因为诱饵，用酵母双杂交的方法从小鼠胚胎文库中钓出的部分阳性克隆的β-半乳糖甘酶(LacZ)活性定量检测结果

图10为以CREPT基因为诱饵，用酵母双杂交的方法从小鼠胚胎文库中钓出的82号和19号阳性克隆的β-半乳糖甘酶(LacZ)活性及其酶切分类结果

图11为82号阳性克隆(Skp2)与CREPT相互作用的免疫共沉淀验证结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成。

实施例1、对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因CREPT的获得

以P15^INK4b同源基因p15rs(GenBank号：AK001518)作为信息探针，在GenBank中进行Blast检索，得到一个p15rs的同源基因，将其命名为CREPT(GenBank号：XM_012930)。参照GenBank中CREPT的全长序列，设计扩增CREPT全长序列的引物，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-TATAGGTAACATGTCCTCCTTCTCTGAG-3’；

P2(下游引物)：5’-TATACTCGAGGTCAGTTGAAAACAGGTC-3’

用Trizol(Gibco公司)一步法提取293T细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测定纯度及浓度，用甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量。取250ng总RNA作为模板，用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒并按照试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。反应条件为：先50℃逆转录30min，95℃15min灭活逆转录酶同时热启动Taq酶；再94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明从293T细胞的总RNA中扩增出预期大小约1kb的特异性片段。将此片断亚克隆到载体pcDNA6(购于Invitrogen公司)中，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒进行测序，测序结果表明该基因片段就是目的基因CREPT。CREPT的cDNA具有序列表中SEQID №：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由1833个碱基组成，其编码序列为自5’端第276-1253位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №：2由326个氨基酸残基组成，将该基因所编码的蛋白命名为CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein intumor)，分子量约为36Ku。CREPT的基因组基因具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：3由981个碱基组成，自5′端第276-425位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第426-554位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第555-689位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端第690-803位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端第804-929位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端第930-1106位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端第1107-1256位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端第276-278位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第1254-1256位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA。自5′端第297-653位碱基为RPR结构域的编码序列。该基因定位于20号染色体上约56kb的范围内，20q11.21-q12位置，其对应的编码区为：自5′端的第6869250-6869399(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第6875737-6875865(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第6883683-6883817(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第6892867-6892980(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第6894728-6894853(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第6901414-6901590(NT 086910)位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第6925111-6925260(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第七个外显子。自5′端的第6869400-6875736(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第6875866-6883682(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第6883818-6892866(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第6892981-6894727(NT 086910)位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第6894854-6901413(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第6901591-6925110(NT_086910)位碱基为该基因组基因的第六个内含子。对该基因的核苷酸序列进行相似性分析，分析结果表明其在小鼠、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母、拟南芥等生物体中十分保守，与人的相似性分别可达99％、96％、84％、79％、46％、27％、17％、24％。

实施例2、CREPT基因在人类肾癌组织及肾癌细胞系中的表达量检测

1、RT-PCR检测

提取8例人肾癌组织标本及癌旁组织的总RNA，并分别以此为模板，在引物P3：5’-TATAGGTACCATGTCCTCCTTCTCTGAG-3’和P4：5’-TATATCTAGACTAGTCAGTTGAAAACAGGTC-3’的引导下，RT-PCR扩增CREPT基因，Qiagen公司的一步法RT-PCR反应体系为：10×One-step RNA PCR缓冲液5μl，MgCl₂(25mM)10μl，dNTP Mix(10mM each)5μl，RNAse inhibitor 1μl，AMV-OptimizedTaq 1μl，AMV-Rtase*L 1μl，引物P3和P4各0.5μl，Total RNA 1μg，ddH₂O 25μl。反应条件为：先50℃30分钟；94℃3分钟；再94℃30s，52℃45s，72℃1min，共35个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道P：癌旁组织，泳道C：肾癌组织)，应用凝胶成像扫描分析软件对每个基因特异电泳条带的面积及密度进行扫描。β-actin信号作为上样量参照。以表达指数(EI)，即该病例肿瘤组织中基因表达量占肿瘤及癌旁组织中总表达量的相对百分率来表示肿瘤组织中该基因在转录水平上的相对表达量。RT-PCR检测结果表明CREPT基因在转录水平的上调表达率为100％，且CREPT基因的表达指数(EI)在临床分期为III-IV、在高分化的肾癌癌组织中的表达量高于临床分期I-II、中或低分化的肾癌癌组织，推断CREPT基因在肾癌中的异常表达与肿瘤的分化程度、临床分期等密切相关。

2、Northern blot检测

提取肾癌细胞系7860和GRC-1的总RNA，在引物P3和P4的引发下，进行RT-PCR扩增，然后采用TURBOBLOTTERTM对RT-PCR扩增产物进行快速RNA转膜；以实施例1RT-PCR扩增的CREPT的cDNA为探针，并利用Primea-Gene Labeling System(Promega)对杂交特异性探针进行标记；然后采用Express HybTM Hybridization杂交液进行Northern blot，方法为：将经预杂交的膜置于装有标记探针杂交液的杂交袋，68℃杂交2小时，洗膜后，用保鲜膜包好，置于磷屏曝光24-48小时，Storm扫屏(PhospherImager)检测结果。Northern blot检测结果表明CREPT基因在肾癌细胞系7860和GRC-1中具有较高的转录水平。

3、免疫组化分析

用Polymer detection system免疫组织化学染色法对8例人肾癌组织标本及癌旁组织进行CREPT基因表达量的免疫组化分析：制备组织切片；切片脱蜡、水化；用蒸馏水配制3％H₂O₂，室温10分钟以灭活内源性酶；蒸馏水洗3次，每次5分钟；微波修复抗原；0.1M PBS洗涤2-3次；滴加封闭液如正常山羊血清，室温30分钟。甩去多余液体，不洗；滴加一抗，兔的多抗CREPT抗体(用纯化的GST-CREPT融合蛋白按照标准方法免疫兔后得到抗CREPT的血清，再对抗体进行纯化得到)，4℃12-24小时或者37℃1小时(4℃12-24小时后需在37℃复温45分钟)；PBS洗3次，每次5分钟后，滴加试剂I(Immno-Bridge PV9000免疫染色试剂盒，北京中杉)，37℃孵育20分钟；PBS洗3次，每次各5分钟后，滴加试剂II(Immno-Bridge PV9000免疫染色试剂盒，北京中杉)，37℃孵育20-30分钟；PBS洗3次，每次5分钟后，DAB显色；苏木素轻度复染，盐酸酒精分化；脱水，透明；封片；显微镜观察与拍照。结果如图2所示(DAB，阳性染色显示棕褐色×100，P：癌旁组织；C：肾癌组织)，基因翻译水平表达量以标记指数(LI)表示，即每例肿瘤组织中免疫染色阳性的细胞数占肿瘤及癌旁组织中总免疫染色阳性的细胞数的相对百分率。然后利用SPSS9.0统计学软件进行基因在肿瘤中表达差异及其与患者临床病理特征间的相关性分析(p＜0.05即具有显著性差异)。分析结果表明CREPT基因在翻译水平的上调表达率为100％，且CREPT基因的标记指数(LI)在临床分期为III-IV、在高分化的肾癌癌组织中的表达量高于临床分期I-II、中或低分化的肾癌癌组织，推断CREPT基因在肾癌中的异常表达与肿瘤的分化程度、临床分期等密切相关。

实施例3、在翻译和转录水平上检测CREPT基因在人类肝癌组织中的表达情况

1、RT-PCR

用与实施例2相同的方法，对CREPT基因在214例人类肝癌及癌旁组织标本中的表达情况进行RT-PCR检测及分析，以β-actin基因为上样量参照，第42、73、104号标本的检测结果如图3所示(见大括号1包含的图；泳道P：癌旁组织，泳道C：肾癌组织)，CREPT基因在214例肝癌组织中均有表达，表达率为100％，而在179例癌旁组织中有表达，表达率为83.6％。在186例(86.92％)肝癌组织中CREPT基因上调表达，在6例(2.8％)肝癌组织中中CREPT基因下调表达。上述肝癌组织标本中CREPT mRNA的表达水平为94.69±35.12，显著高于癌旁组织6.03±2.31(P＜0.01)，表明较正常组织，人类肝癌组织中CREPT基因RNA的转录水平显著增高。

2、Northern blot检测

用与实施例2相同的方法，对CREPT基因在214例人类肝癌及癌旁组织标本中的表达情况进行Northern blot检测及分析，以GAPDH基因为上样量参照，第42、73、104号标本的检测结果如图3所示(见大括号2包含的图；泳道P：癌旁组织，泳道C：肾癌组织)，Northern blot结果显示，83.33％(30/36)肝癌病例中CREPT基因上调表达，0％(0/36)肝癌病例中CREPT基因下调表达，16.67％(6/36)肝癌病例中CREPT基因表达无显著差异(P＜0.01)。Northern blot检测结果进一步证明CREPT基因在人类肝癌组织中RNA转录水平高于其相应的癌旁肝组织，推断CREPT基因为在肝癌细胞中上调表达基因。

3、Western blot检测

用Western blot的方法对CREPT基因在214例人类肝癌及癌旁组织标本中的表达情况进行检测及分析，具体方法为：制备蛋白质样品，进行SDS-PAGE电泳；用电转移仪转膜，在4℃下，10伏、300mA转膜1.5小时。将膜放入杂交袋中，用10％脱脂奶粉封闭(37℃摇床中放置1小时)；TBST室温洗膜；加入一抗，兔的多抗CREPT抗体(用纯化的GST-CREPT融合蛋白按照标准方法免疫兔后得到抗CREPT的血清，对抗体进行纯化得到)，37℃放置1小时；用TBS-T在室温下洗膜3次后，加入荧光素偶联的二抗，anti-rabbit fluorescein-linked whole antibody(Pharmacia Biotech)后在37℃下温浴1小时；洗膜，加入碱性磷酸化酶偶联的三抗，anti-fluoresceinalkaline phosphatase(Pharmacia Biotech)，37℃温浴1小时；洗膜后，将膜放在滤纸上吸干后，与ECF底物孵育10分钟，用StormPhospher Imager System(520nm)扫膜显影。以β-actin基因为上样量参照，第42、73、104号标本的检测结果如图3所示(见大括号3包含的图；泳道P：癌旁组织，泳道C：肾癌组织)，Western Blot结果显示在65例肝癌标本中，其中有50例(76.92％)肝癌标本中CREPT蛋白上调表达，1例(1.54％)肝癌标本中CREPT蛋白下调表达，14例(21.54％)肝癌标本中CREPT蛋白表达无显著差异(p＜0.01)。RT-PCR和Western blot结果均显示CREPT基因在5例转移肝癌患者外周血中呈阳性表达，而在5例非转移肝癌患者的外周血中均呈阴性表达，可能是由于肝癌细胞血行转移所致。

4、免疫组化分析

用与实施例2相同的方法，对CREPT基因在155例人类肝癌及癌旁组织标本中的表达情况进行免疫组化分析，第46和115号标本的检测结果如图4所示(A为第46号标本，B、C为第115号标本；DAB，阳性染色显示棕褐色，×100)，免疫组化结果显示在155例肝癌标本中，在113例(72.90％)肝癌标本中CREPT蛋白上调表达，在4例(2.58％)肝癌标本中CREPT蛋白下调表达，在38例(24.52％)肝癌标本中CREPT蛋白表达无显著差异(p＜0.01)。在155例肝癌中，肝癌及癌旁组织中LI分别为97.47±31.7，3.16±1.05(p＜0.01)。CREPT蛋白表达主要见于肝(癌)细胞的胞浆、胞核，呈细颗粒状均匀分布。汇管区的淋巴细胞，单核细胞、血管内皮细胞以及Kupffer细胞均罕见其表达。有的癌组织中，阳性细胞呈散在分布及呈弥漫性片状分布，强阳性信号多见于那些胞体皱缩，胞核深缩的癌细胞；有的癌旁肝组织中，阳性细胞呈弥漫或灶状分布。另外，有些肝癌组织的染色存在明显的异质性。在肝癌细胞外间质中尚见纤维组织染色，小血管内弹力膜层及内皮细胞层亦着色，尤其在血管密集处明显增强。而有的癌旁肝组织中染色细胞呈散在分布、小簇状或散点状，信号明显弱于肝癌细胞，但在靠近肿瘤的癌旁肝组织中阳性细胞较多见，染色亦较深，并且不同的肝癌类型有不同的组织学染色。癌组织中阳性信号强度明显高于癌旁组织，且与癌细胞分化程度有关，分化愈差表达愈强。巨块型肝癌、结节型肝癌及不同临床分期的肝癌中CREPT免疫染色还存在一定程度的表达差异。且在肝癌细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性染色仅限于细胞核内，CREPT蛋白表达较高的肝癌标本中PCNA表达间也较高，即它们间表达呈正相关性(γ＝0.98)。

根据上述检测结果对CREPT的表达与肝癌临床病理特征间的相关性进行分析，分析结果表明CREPT基因的LI和EI在肿瘤包膜不完整、有肝内转移、有门静脉癌栓、有癌旁卫星灶、临床分期III-IV、高分化、Edmondson’s grade II or III-IV、PCNA(＞50％)、复发的肝癌患者癌组织中表达高于包膜完整、无转移者、无癌栓形成、无癌旁卫星灶临床分期I-II、中或低分化、Edmondson’s grade I、PCNA(＜50％)、无复发患者，P均＜0.01；而在不同性别、不同甲胎蛋白水平、不同血清HBsAg、不同肿瘤大小及伴有不同程度肝硬化的肝癌组织中CREPT基因表达水平无差异显著性(P＞0.05)。有意义的是CREPT蛋白的表达与术后复发密切相关，CREPT蛋白在复发患者中标记指数LI(n＝82)高于非复发患者(n＝73)(p＜0.01)。CREPT蛋白表达与肝癌的分级及门静脉癌栓形成有关，即III-IV级肝癌CREPT蛋白的表达水平明显高于I-II级肝癌，有门静脉癌栓形成者的表达水平高于无癌栓形成者，在肿瘤包膜不完整和有肝内转移的肝癌组织中表达高于包膜完整及无转移者(P＜0.01)。推断CREPT基因在肝癌中表达与肝癌大小、血清HBsAg、AFP、肝硬化、性别无关，但与分化程度、包膜侵犯、肝内转移、临床分期、癌旁卫星灶、Edmondson’s grade、PCNA表达等密切相关。

实施例4、过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系的建立及利用该细胞系对CREPT基因的功能进行体内外分析、验证

一、过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系的建立

1、pcDNA6/CREPT真核重组表达载体的构建

用PCR方法扩增得到两端分别携带有限制性内切酶Kpn I和Xho I识别位点的CREPT ORF序列，将其用限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pcDNA6连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒进行测序，测序结果表明获得了构建正确的含有CREPT ORF序列的重组载体，命名为pcDNA6/CREPT。

2、细胞转染

用Lipofect AMINE2000介导的脂质体法，将pcDNA6/CREPT质粒转染HepG2肝癌细胞，以pcDNA6为对照，具体方法如下：

(1)转染前一天取对数生长期细胞，接种于6孔培养板，每孔接种的细胞数为6-8×10⁵个，培养24h后细胞长至70％-80％融合，用无血清RPMI-1640培养液(GIBICO)洗涤2次，备用；

(2)配制A液：将2μg pcDNA6/CREPT质粒溶于100μl无血清、无抗生素RPMI-1640培养液；

(3)配制B液：将8μl Lipofect AMINE溶于90μl无血清、无抗生素RPMI-1640培养液；

(4)将A、B两液(DNA-脂质体转染复合物)轻柔混匀后，室温下静置30min；

(5)加入0.8mL无血清、无抗生素RPMI-1640培养液，轻轻混匀后小心加到待转染细胞中，37℃、5％CO₂常规培养6h，弃去培养液，换全培养液继续培养48h。将转染细胞按1∶4传代，继续培养36-48小时后，收获细胞。

3、过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系的筛选及鉴定

(1)BSD筛选浓度测定

将HepG2细胞培养于24孔培养板，分别加入浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL的BSD，各浓度设3个复孔，正常对照3个复孔。以7-10天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果将筛选浓度定为20μg/mL。

(2)将步骤2铺在24孔板的细胞转染24小时后加入20μg/mL BSD。

(3)持续加药压迫细胞，三天换一次培养基，筛选7-10天左右，细胞出现死亡现象。

(4)当大部分细胞死亡后，剩余细胞开始增殖时，用胰酶消化存活细胞，并将其分到96孔板中，挑选单克隆。为得到单克隆细胞，计数时应保证每个孔中只有1个或1个以下的细胞。

(5)挑取阳性克隆继续在含BSD的培养液中培养，2周后，移入24孔板扩大培养，将第4代细胞冻存。

(6)细胞转染鉴定

A、Western blot印迹检测

细胞经裂解缓冲液裂解后(冰上30min)，4℃、10000g离心20分钟，取上清液，进行SDS-PAGE凝胶电泳。用Bio-Rad电转膜系统将蛋白转印至Hybond硝酸纤维素膜。一抗为鼠抗人flag单克隆抗体(Santa Cruz公司，稀释度1∶1000)，二抗为HRP标记羊抗鼠(兔)IgG(DAKO公司，稀释度1∶2000)，用增强化学发光系统(Amersham公司，ECL Kit)检测flag-CREPT融合蛋白或CREPT的表达情况，以β-actin为量参，检测结果如图5所示(泳道A：转染pcDNA6/CREPT组，泳道B：转染pcDNA组，泳道C：转染pBSU6组)，表明CREPT基因过表达后CREPT的表达显著增加，获得了CREPT过表达的HepG2肝癌稳定细胞系。

B、免疫细胞化学验证

用细胞玻片法(贴壁生长细胞)对过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系做免疫鉴定，以分别转染有pcDNA6、pBSU6空载体的阳性克隆为对照，具体方法为：将无菌处理的盖玻片放到细胞培养皿或6孔培养板中，加入适量对数生长期的贴壁生长细胞悬液，37℃、5％CO₂孵箱中，培养12-24小时，细胞可自然贴附于盖玻片上，用镊子将盖玻片取出浸入到0.01mol/L pH7.4的PBS中冲洗3次，每次5分钟。制备好的干燥的细胞玻片用冷丙酮固定10分钟，浸入到0.01mol/L pH7.4 PBS中漂洗3次，每次5分钟，洗去固定液；3％H₂O₂-甲醇液处理30分钟，封闭细胞内源性过氧化物酶；浸入到0.01mol/L pH7.4的PBS中洗3次，每次5分钟；0.25％Triton X-100，5％的DMSO(二甲亚砜)溶液中孵育10分钟，渗透细胞膜；浸入到0.01mol/L pH7.4PBS中洗洗3次，每次5分钟；滴加5-10％正常动物血清，室温，放温盒中封闭30分钟，以防止非特异性吸附；滴加合适稀释度的一抗，湿盒内，37℃60分钟，浸入到0.01mol/L PH7.4 PBS中洗3次，每次5分钟；滴加相应稀释度的酶标二抗(HRP-Ab₂)，湿盒内，室温60分钟或37℃30分钟，浸入到0.01mol/L pH7.4 PBS中洗3次，每次5分钟；加入新鲜配制的DAB-H₂O₂底物缓冲液避光显色5-10分钟(室温)，在光镜下控制反应强度(棕色)，适时终止显色；浸入到0.01mol/L pH7.4 PBS中洗3次，每次5分钟，终止反应；经80％、90％、2×100％乙醇溶液脱水，二甲苯透明，每步均为1分钟。室温放置数分钟，使二甲苯完全蒸发掉；滴加1滴封片剂(DAB用阿拉伯树胶水)封片，在光学显微镜下观察。结果如图6所示(A：转染pcDNA6/CREPT组，B：转染pcDNA组，C：转染pBSU6组)，进一步证明了获得了CREPT过表达的HepG2肝癌稳定细胞系。

二、过表达CREPT基因的HepG2肝癌稳定细胞系细胞生物学行为的观察

1、MTT测定

同步化(选择同步化或用TdR、秋水仙素诱导同步化)处理分别转染pcDNA6、pcDNA6/CREPT的HepG2细胞以及未转染的HepG2细胞。用0.25％胰酶消化各组细胞，制备成单细胞悬液。接种于96孔板，每孔1×10³个细胞，每种细胞取6个复孔，24h后每孔加MTT(5g/L)20μl，37℃、5％CO₂孵育4h，弃上清，每孔加DMSO 150μl，振荡20min，使结晶充分溶解，在490nm波长的酶联免疫测定仪上检测各组的吸光度值(A值)；连续检测7天，统计各时期的细胞数，将结果绘制成细胞生长曲线，如图7所示(A：10％血清的完全培养液；B：无血清培养液)，生长曲线显示与转染pcDNA6和未转染的HepG2细胞相比，转染pcDNA6/CREPT的HepG2细胞生长速度明显增快(p＜0.01)。

2、细胞生长倍增时间的测定

同步化处理分别转染pcDNA6、pcDNA6/CREPT的HepG2细胞以及未转染的HepG2细胞(选择同步化或用TdR、秋水仙素等的诱导同步化)，接种细胞(1×10⁴/孔)于24孔板中，每隔24小时对每种细胞的3个孔进行消化计数，求平均值。细胞倍增时间计算方法；培养96小时后计数的细胞数＝接种的细胞数×2n(n＝细胞96小时的增殖倍数)，细胞倍增时间(小时)＝96/n，结果与转染pcDNA6和未转染的HepG2细胞相比，pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞的倍增时间PDT(Population Double Time)减少、生长速度明显增快(p＜0.01)。

3、软琼脂集落计数

对转染pcDNA6/CREPT、pcDNA6空载体和未经转染的HepG2细胞分别进行软琼脂集落形成试验，具体方法为：将琼脂溶解于去离子水中，配成2％琼脂，高温灭菌，与等体积2倍浓度的细胞相应培养液(含10％FBS)混合，配置成含1％琼脂的低层，在35mm的6孔板中每孔加入1mL低层培养液。低层培养基凝固后，加上1mL含1×10⁴个细胞、0.33％琼脂和10％FBS培养液的上层培养基。第2天将由10％FBS培养液1mL加到已凝固的上层培养基，在37℃5％CO₂条件下孵育21天。＞60μm或＞50个细胞的细胞集落由Bausch and Lomb图像分析系统计数。结果转染pcDNA6/CREPT、pcDNA6空载体和未经转染的HepG2细胞(对照)的集落形成能力分别为38.03±2.71％、16.91±1.61％、18.1±2.42％，表明pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞的集落形成能力显著增强。

4、细胞贴壁克隆形成实验

对转染pcDNA6/CREPT、pcDNA6空载体和未经转染的HepG2细胞分别进行细胞贴壁克隆形成实验，具体方法为：胰酶消化各组对数生长期细胞并制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10³/mL，取24孔培养板，每孔加入细胞悬液0.5mL，加常规培养液至1mL，混匀，每组做6个复孔。1周后，镜下见有细胞集落形成，终止培养，甲醇固定，Giemsa染色，计算各组细胞克隆形成率，克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。细胞个数大于50计为1个克隆。结果与转染pcDNA6和未转染的HepG2细胞相比，pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞的克隆形成能力明显增强(p＜0.01)。

5、细胞周期分析

对转染pcDNA6/CREPT、pcDNA6空载体和未经转染的HepG2细胞分别进行细胞周期分析，具体方法为：同步化处理细胞(选择同步化或用TdR、秋水仙素等的诱导同步化)，收集消化的2×10⁶贴壁细胞，PBS冲洗2次后，重悬在4℃、70％的乙醇中至少1-2h。PBS洗2次，加入细胞裂解液(0.2mmol/L Na₂HPO₄，0.1mol/L柠檬酸，0.1％Triton X-100，pH7.8)，室温静置45分钟，以1000r/min离心细胞后重悬在含100mg/L RNA酶PBS中，并37℃处理10分钟，PBS洗2遍。然后加入10mg/L碘化丙锭，在25℃暗处孵育30min。用FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)进行单色荧光细胞流式计数。结果用Multiplus software II软件分析数据，每个样本采集15000个细胞。转染pcDNA6/CREPT的HepG2的G1期细胞百分比(28.14±3.45％)较转染空载体的HepG2细胞(59.06±5.93％)和未处理的HepG2(58.35±2.88)明显减少，P＜0.01；转染pcDNA6/CREPT的HepG2的S期细胞百分比(57.43±5.88)较转染空载体的HepG2细胞(27.83±3.90)和未处理的HepG2(30.65±3.16)明显增加，P＜0.01；转染pcDNA6/CREPT的HepG2的G2期细胞百分比(14.50±5.71)较转染空载体的HepG2细胞(14.50±5.71)和未处理的HepG2(15.14±4.07)无明显差异，P＞0.01，表明CREPT基因可能通过参与调控细胞周期加快细胞分裂而促进HepG2细胞增殖。

6、裸鼠接种实验

对转染pcDNA6/CREPT、pcDNA6空载体的HepG2细胞分别进行致瘤试验，分别以1×10⁷个细胞/只裸鼠的浓度，将转染基因的HepG2接种至5-6周龄的Balb/c裸鼠皮下，注射体积为0.2mL，每组为6只。观察出瘤时间、出瘤率、瘤径大小、裸鼠生长状态。4周后处死小鼠，测量鼠肿瘤组织体积、重量，并用甲醛固定石蜡包埋制成切片进行病理诊断(HE染色)。测量肿瘤的体积方法为：将待测肿瘤组织完全捣碎后放入1mL微量方法为：将待测肿瘤组织完全捣碎后放入1mL微量离心管中，将瘤体组织压实，不留空隙，在离心管外平瘤体组织上端水平处用记号笔做一标记，将瘤体组织取出，记录加入的水的体积，即为肿瘤的体积(mm³)。结果显示，pcDNA6/CREPT、pcDNA6组肿瘤出现时间的分别为6.13±2.37、9.28±4.56天，与转染pcDNA6细胞相比，pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞出现肿瘤时间明显减少(p＜0.01)；pcDNA6/CREPT、pcDNA6组肿瘤平均重量分别为2.99±0.56、0.83±0.28克，与转染pcDNA6细胞相比，pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞肿瘤平均重量明显增加(p＜0.01)；pcDNA6/CREPT、pcDNA6组肿瘤平均大小分别为2.94±0.26、0.91±0.18，与转染pcDNA6细胞相比，pcDNA6/CREPT转染的HepG2细胞肿瘤平均大小明显增加(p＜0.01)；各组间肝、脾重量无显著差异(p＞0.05)。肿瘤病理切片结果显示pcDNA6/CREPT、pcDNA6组PCNA染色的阳性率分别98.45±7.08％、67.83±3.44％(P＜0.01)；低分化、中等分化、高分化发生率分别为97.78±3.13％、2.22±1.03％、0；50.59±2.78％、27.31±1.13％、22.10±2.65％(P＜0.01)。

实施例5、CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系的建立及利用该细胞系对CREPT基因功能进行体内外分析、验证

一、CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系的建立

1、CREPT RNA干扰质粒的构建

CREPT RNA干扰的靶序列为：5’-GGACCUGAAUUCACUAGAGA-3’，根据其设计两对寡核苷酸片段，序列如下：

oligo1a：5’-GGACCTGAATTCACTAGAGA-3’

oligo1b：5’-AGCTTTCTCTAGTGAATTCAGGTCC-3’；

oligo2a：5’-AGCTTTCTCTAGTGAATTCAGGTCCCTTTTTG-3’

oligo2b：5’-AATTCCAAAAAGGACCTGAATTCACTAGAGAA-3’

将载体pBSU6(商业名pSilence1.0-U6，购自Ambion，Austin，TX，USA)用限制性内切酶Apa I 25℃酶切12-24小时，回收纯化.用Klenow酶将回收片段3’端钝化，回收纯化；室温消化30分钟，将反应体系置于75℃水浴10分钟终止反应，然后将热激后的反应体系放在冰上退火。直接进行溶液体系DNA回收。回收产物用Hind III37℃酶切2-4h，回收备用；取10μl寡核苷酸片段Oligo1a和Oligo1b加到180μl去离子水中，在1.5mL离心管中轻轻混匀；将寡核苷酸混合物于沸水中煮5min，慢慢冷却退火(annealing)至室温(0.5-1h)，促进Oligo1a和Oligo1b连接形成互补寡核苷酸双链Oligo1a/1b。同法处理Oligo2a和Olig2b；将Oligo1a/1b与酶切回收的载体按40∶1比例进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞；将鉴定正确的质粒用EcoR I和Hind III双酶切，回收纯化；同法将Oligo2a/2b与回收纯化的载体片断按40∶1比例进行连接，阳性克隆命名为pBSU6/CREPTi。将pcDNA3.1与pBSU6/CREPTi分别用KpnI和NotI双酶切，连接，转化，经筛选得到CREPT RNA干扰质粒，命名为pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi。

2、CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系的获得

(1)转染前24小时，接种适量的取对数生长期细胞于6孔培养板，每孔接种细胞6-8×10⁵。培养24h后细胞长至60-70％为宜。

(2)转染前1小时，更换新鲜完全培养基，37℃、5％CO₂常规培养。

(3)配制转染工作液(6孔板，2mL培养液)，A液：5-8μg pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi载体DNA溶于150mM NaCl中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置。B液：vigoFect1-4μl加入150mM NaCl中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置5min。C液：将B液逐滴加入A液中，轻柔混匀后室温下静置15min。

(4)将转染工作液轻轻混匀后，逐滴加入2mL培养液中，轻轻混匀培养液，37℃、5％CO₂常规培养。

(5)培养24-48h后观察或收获细胞。

(6)稳定转染时，将转染细胞按1∶4传代，继续培养36-48小时后，换含800mg/LG418的全培养液筛选，并扩大培养。

(7)用与实施例4相同的方法对筛选的CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系进行鉴定，免疫细胞化学鉴定结果如图6所示(A：转染pcDNA6/CREPT组，B：转染pcDNA组，C：转染pBSU6组，D：转染pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi组)，上述结果表明筛选到的pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi转染细胞中CREPT的表达显著得到抑制，获得了CREPT基因表达被抑制的HepG2肝癌稳定细胞系。

二、CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系的细胞生物学行为的观察

用与实施例4相同的方法对CREPT基因干扰的HepG2肝癌稳定细胞系进行下述细胞生物学行为的观察，结果如下：

1)MTT测定

根据测定结果，对转染pBSU6/CREPTi、空载体转染和未经转染的HepG2细胞分别描绘生长曲线，如图7所示(A：10％血清的完全培养液；B：无血清培养液)，生长曲线显示与转染pcDNA6和未转染的HepG2细胞相比，转染pBSU6/CREPTi的HepG2细胞生长速度明显得到抑制。

2)细胞生长倍增时间的测定

与转染pBSU6和未转染的HepG2细胞相比，pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞的倍增时间PDT(Population Double Time)明显增加、生长速度明显减慢(p＜0.01)。

3)软琼脂集落计数

对转染pBSU6/CREPTi、pBSU6空载体和未经转染的HepG2细胞(对照)分别进行软琼脂集落形成试验，结果显示转染pBSU6/CREPTi、pBSU6空载体和未经转染的HepG2细胞的集落形成能力分别为5.91±1.43％、17.08±1.10％，18.1±2.42％，pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞的菌落形成能力显著降低。

4)细胞贴壁克隆形成实验

与转染pBSU6和未转染的HepG2细胞相比，pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞克隆形成能力明显降低(p＜0.01)。

5)细胞周期分析

pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞的G2细胞百分比(74.58±4.32)较空载体转染HepG2细胞(50.47±6.96)和未处理的HepG2(58.35±2.88)明显增多，P＜0.01；pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞的G2细胞百分比(16.42±2.39)较空载体转染HepG2细胞(50.47±6.96)和未处理的HepG2(58.35±2.88)明显减少，P＜0.01。pBSU6/CREPTi转染的HepG2细胞的G2细胞百分比(9.00±2.56)较空载体转染HepG2细胞(16.55±5.12)和未处理的HepG2(15.14±4.07)明显减少，P＜0.05。

6)裸鼠接种实验

对转染pBSU6/CREPTi HepG2细胞、空载体转染的HepG2细胞分别进行致瘤试验，结果显示，pBSU6、pBSU6/CREPTi组肿瘤出现时间的分别为9.83±3.28、14.33±2.68天，与转染pBSU6的HepG2细胞相比，pBSU6/CREPTi转染的HepG2出现肿瘤时间明显延长(p＜0.01)；pBSU6、pBSU6/CREPTi组肿瘤平均重量分别为0.91±0.22、0.41±0.13克，与转染pBSU6的HepG2细胞相比，pBSU6/CREPTi转染的HepG2平均重量明显减少(p＜0.01)。pBSU6、pBSU6/CREPTi组肿瘤平均大小分别为0.99±0.18、0.52±0.08，与转染pBSU6的HepG2细胞相比，pBSU6/CREPTi转染的HepG2平均大小量明显减少(p＜0.01)。各组间肝、脾重量无显著差异(p＞0.05)。肿瘤病理切片结果显示pBSU6、pBSU6/CREPTi组PCNA染色的阳性率分别70.99±4.02％、52.93±2.18％(P＜0.01)；低分化、中等分化、高分化发生率分别为55.33±2.88％、20.67±2.65％、24.00±3.99％；0、45.11±3.15％、54.89±2.75％(P＜0.01)。

实施例6、HepG2肝癌细胞系中CREPT对相关信号通路改变的检测

1、对过表达CREPT基因或CREPTRNAi HepG2肝癌细胞系中CREPT、Skp2、CDK4、CDK6、CyclinD1、P27、p16表达的Western blot和RT-PCR分析，方法与实施例3相同，结果如图8所示(泳道A：转染pcDNA6/CREPT，泳道B：转染pcDNA6，泳道C：转染pBSU6/CREPTi，泳道D：转染pBSU6)。

2、免疫共沉淀(IP)

收集细胞或采集组织，并用细胞或组织裂解液进行裂解；每毫升细胞或组织裂解上清内加入20μl Agarose-protein A/G beads，4℃旋转混合60分钟；2000r/min，4℃离心5分钟，回收上清液；每毫升细胞或组织裂解上清加入2μg相应的单(多)克隆抗体，4℃旋转混合4小时以上；再加入30μl Agarose-protein A/G beads，4℃旋转混合4小时以上或过夜；5000rpm，4℃离心5min；弃上清，用beads漂洗液漂洗beads 5×10min(吹打5次)，弃上清，用洗涤液重悬沉淀；重复漂洗5次；离心，弃上清；在沉淀中加入20μl 2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，1000r/min离心1分钟；在沉淀中加入20μl 2X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液；SDS-PAGE电泳分离蛋白复合物；转膜；用相应的抗体进行Western Blot。

3、re-IP

将所得的40μl IP产物用750μl elution buffer(0.1％Tritonx100，0.1％SDS，0.5％BSA in PBS)洗涤；室温孵育50min，然后进行第二次IP。

4、荧光素酶报告系统分析

用Lipofectamine 2000转染细胞24-48小时后，收获细胞；调节仪器(Top Count)参数和程序，设置间隔时间为3秒在荧光素酶报告分析仪(Top Count)专用的检测板(一种96孔板)的每个孔中加入30μl荧光素酶催化底物；再在不同孔中依次加入10μl上述细胞裂解物，并混匀；利用相应软件程序进行荧光素酶活性测定；测试完毕后立即添加30μl内对照底物Stop&Glo^(promega公司)，混匀后测定花虫荧光素酶(Renilla luciferase)活性，所测值为内对照值，用来校正实验测量值；每次试验重复三次，所有数据都经内参校正。

二、实验结果

1、CREPT影响细胞周期相关基因的转录激活活性

生物信息学分析显示CREPT的表达产物含有一个与pre-mRNA成熟加工有关的PRPdomain，推测CREPT可能影响一些基因的转录激活活性。实验表明pCR3.1/gal4DBD/CREPT(将带有EcoRV和Xbo I酶切位点的CREPT基因的PCR纯化产物CREPT与pCR3.1/gal4DBD(将gal4DBD基因连入pCR3.1(Invitrogen)中得到)分别用EcoRV和Xbo I双酶切、T₄ DNA连接酶连接、连接产物转化到大肠杆菌DH5中，涂布于氨苄青霉素抗性平板上进行筛选、挑取克隆，抽提质粒，用EcoRV和Xbo I双酶切、PCR、测序鉴定阳性克隆)与Gal4-tk-Luc共转染HepG2、Hela、293T细胞后，Gal4-tk-Luc的Luciferase相对活性分别是对照组的5、6、3倍，提示pCR3.1/flag/gal4DBD/CREPT促进了Gal4-tk-Luc的转录活性。染色质免疫共沉淀(CHIP)结果表明CREPT能与cyclinD1、Skp2基因的启动子结合，可能通过这一机制促进了的cyclinD1和skp2的转录活性。

2、CREPT对肿瘤细胞中WNT信号通路的影响

Wnt信号通路在胚胎发育中发挥重要作用，其异常激活时会导致肿瘤生成。我们的免疫共沉淀(IP)结果显示，HepG2肝癌细胞中CREPT能与β-catenin直接结合，并呈剂量正相关关系；荧光素酶报告基因活性测定显示CREPT促进了HepG2、Hela、NIH3T3细胞中β-catenin mutant(S→A)、Wnt-1的转录激活活性。

3、CREPT基因对肿瘤细胞中RB信号通路的影响

1)转录水平上调控

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，RT-PCR结果显示Skp2、CDK2、CyclinE、p15、p16、pRB、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1的RNA转录发生改变，即CREPT过表达后Skp2、CDK2、CyclinE、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1的mRNA量增多，p15、p16、pRB的mRNA量减少；而CREPT knockdown后，则结果相反；CyclinA、p21 CIP1/WAF1、p27的mRNA量没有改变。pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的Hela细胞系后，RT-PCR结果显示Skp2、CDK2、CyclinE、p15、p16、pRB、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1的转录发生改变，即CREPT过表达后Skp2、CDK2、CyclinE、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1的mRNA量增多；p15、p16、pRB的mRNA量减少；而CREPT knockdown后，则结果相反；CyclinA、p21CIP1/WAF1、p27的mRNA量没有改变。核中RNA转录分析(run on)显示CREPT影响肝癌细胞中skp2，cdk2，cdk4，cdk6，cdk9，cyclinE，cyclinD1，cyclihT1，p15，p16，Rb，PCNA，E2F1等的mRNA的合成，同时半定量RT-PCR显示CREPT影响CREPT/tet off NIH3T 3细胞skp2，cdk2，cdk4，cdk6，cdk9，cyclinE，cyclinD1，cyclinT1，p15，p16，Rb，PCNA，E2F1的RNA的转录水平，其中skp2、cyclinD1为受影响较早的基因。

2)CREPT影响RB通路相关信号蛋白的稳定性

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，Western blot结果显示Skp2、CDK2、CyclinE、p15、p16、p21 CIP1/WAF1、p27、ppRB、pRB、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1、cyclinA的翻译水平发生改变，即CREPT过表达后Skp2、CDK2、CyclinE、PCNA、E2F-1、CDK4、CDK6、CyclinD1、ppRB、cyclinA表达增多；p15、p16，p21CIP1/WAF1、p27、pRB表达减少；而CREPT knockdown后，则结果相反。pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的Hela细胞系后，Western blot结果显示Skp2 CyclinE、CyclinD1的mRNA表达发生改变，即CREPT过表达后Skp2 CyclinE、CyclinD1表达增强，而CREPT knockdown后，则结果相反。pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，细胞免疫化学显示CDK2，CyclinE，p21^CIP1/WAF1，pRB，ppRB，PCNA，E2F-1的表达改变，即CREPT过表达后CDK2、CyclinE、PCNA、E2F-1、ppRB表达增多；p21CIP1/WAF1、pRB表达减少；而CREPT knockdown后，则结果相反。有趣的是尽管CREPT在转录水平上没有影响cyclinA的表达，但其影响了cyclinA蛋白的表达量，推测CREPT通过某种机制影响cyclinA的翻译过程。

3)CREPT对P15基因的作用

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，Western blot和免疫细胞化学(ICC)结果均显示p15的转录和翻译水平均发生改变，即CREPT过表达后p15转录和表达减少；而CREPT knockdown后，则结果相反。免疫共沉淀结果显示pcDNA6/CREPT、pcDNA转染的HepG2细胞中，CREPT能与p15发生免疫共沉淀，且过表达CREPT的HepG2细胞中CREPT/p15的结合物相对减少，推测这可能是由于CREPT的过表达增加了抑制p15表达的水平而引起。

4)CREPT与CDK2、CyclinE间的相互作用

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，IP和rIP显示CREPT、CDK2、CyclinE形成复合物，且呈一定的剂量关系.pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染的HepG2细胞系后，IP结果显示CDK2/CyclinE、CDK2/CyclinE/p21 CIP1/WAF1的翻译水平的相互作用发生改变，即CREPT过表达后CDK2/CyclinE的量增加；CDK2/CyclinE/p21 CIP1/WAF1的量减少；而CREPTknockdown后，则结果相反。提示CREPT促进了HepG2肝癌细胞中CyclinE-CDK2复合物的形成，能与CyclinE-CDK2直接作用，形成CREPT-cyclinE-CDK2复合物。通过某种机制减少肝癌细胞中P21CIP1/WAF1-cyclinE-CDK2复合物的形成，促发P21CIP1/WAF1降解，从而调控细胞周期，促进HepG2肝癌细胞的恶性增殖。推测CREPT可能通过影响依赖P21CIP1/WAF1降解的RB信号通路导致肝癌的发生与发展。

5)CREPT对p21CIP1/WAF1、P27降解的影响

为了证明是否CREPT对p21CIP1/WAF1、P27等产生降解作用，pcDNA6/CREPT、pBSU6/CREPTi转染HepG2细胞系后，分别用蛋白酶体抑制剂LLnL、MG132处理，Westernblot结果显示蛋白酶体抑制剂加入前后CDK2、cyclinE、CDk4、CDk6、CyclinD1、CyclinA、p16、p15的翻译水平的表达均发生改变，即CREPT过表达的HepG2细胞中比CREPT knockdown的HepG2细胞中CDK2、cyclinE、CDk4、CDk6、CyclinD1、CyclinA表达增加；而p16、p15则结果相反；p21CIP1/WAF1、P27在不加蛋白酶体抑制剂时，CREPT过表达的HepG2细胞中比CREPT knockdown的HepG2细胞中表达减少，而在加入蛋白酶体抑制剂后，CREPT过表达与knockdown的HepG2细胞中p21CIP1/WAF1、P27表达没有改变。免疫共沉淀结果显示蛋白酶体抑制剂加入前后CDK2-cyclinE、CDk4/6-CyclinD1、CDK2-CyclinA的结合量发生改变，即CREPT过表达比CREPTknockdown后CDK2-cyclinE、CDk4/6-CyclinD1、CDK2-CyclinA结合量增加；CDK2-CyclinE-p21CIP1/WAF1在不加蛋白酶体抑制剂时，CREPT过表达的HepG2细胞比CREPT knockdown的HepG2细胞中结合量减少，而在加入蛋白酶体抑制剂后，CREPT过表达与knockdown的HepG2细胞中其结合量没有改变。推测CREPT可能通过某种机制对P21CIP1/WAF1、P27降解产生直接或间接的促进作用。有趣的是，尽管CyclinD1在蛋白酶体抑制剂加入前后，其在CREPT过表达HepG2细胞中比CREPT knockdown细胞中表达均增加，但在加入蛋白酶体抑制剂后，其表达总量明显增加，推测CREPT对CyclinD1的降解可能产生一定的促进作用，即CREPT一方面促进CyclinD1表达的增加，另一方面又可能通过某种机制加速CyclinD1的降解，产生了两重性的功能。

6)CREPT依赖并促进了Skp2降解肿瘤细胞中的P21CIP1/WAF1、P27

Skp2是一个非常重要的原癌基因，同时作为泛素-蛋白酶体通路中E3连接酶底物结合亚基。在正常细胞中为了保持细胞的静息状态，Skp2蛋白必须自发或被动降解。当Skp2蛋白没有降解时，蛋白质的水平会升高就推动细胞进入分裂周期-S期，在S期细胞会合成DNA以复制基因组。研究发现，细胞表达高水平突变Skp2蛋白，促进了P27、P21WAF/CIP1蛋白的降解，结果是这些细胞比表达正常Skp2的细胞更快进入细胞周期的S期。未成熟细胞进入S期是基因组不稳定的潜在原因，反过来会就刺激细胞不可控制的增殖而导致肿瘤。

(1)CREPT能与Skp2直接结合

酵母双杂交结果已证明了CREPT能与Skp2结合；免疫共沉淀结果显示HepG2细胞中，CREPT能与Skp2发生免疫共沉淀；CREPT tet off细胞所形成的裸鼠皮下肿瘤组织中，CREPT与Skp2的表达呈正相关，且CREPT也能与Skp2发生免疫共沉淀.

(2)CREPT与Skp2的结合程度影响p21CIP1/WAF1，p27的降解

CREPT与Skp2共转染实验显示，在HepG2细胞中随着CREPT-Skp2结合量的减少，p21CIP1/WAF1，p27的表达增加.

(3)CREPT影响Skp2与CDK2/CyclinE的结合，从而影响p21CIP1/WAF1的降解

将pcDNA6/CREPT、pBSU6/CREPTi、pcDNA3.1/Skp2、pBSU6/Skp2i pBSU6按不同的组合共转染HepG2细胞系后，IP结果显示CDK2/CyclinE、CREPT/CyclinE，Skp2/CyclinE的相互作用发生改变，即CREPT、skp2过表达后，CDK2/CyclinE、、CREPT/CyclinE，Skp2/CyclinE的量增加；CREPT过表达、Skp2knockdown后，CDK2/CyclinE、CREPT/CyclinE增加，Skp2/CyclinE的量减少；而CREPT knockdown、Skp2过表达后，CDK2/CyclinE、CREPT/CyclinE、Skp2/CyclinE的量均减少，提示CREPT可能促进了Skp2与CyclinE/CDk2的结合，从而影响p21CIP1/WAF1的降解。

(4)CREPT在转录水平调控Skp2的表达及其功能

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染HepG2细胞系后，再分别用pcDNA6/Skp2、pcDNA、pBSU6/Skp2i、pBSU6转染HepG2细胞系，并构建稳定细胞系。RT-PCR结果显示，CREPT过表达后，Skp2的mRNA水平增加，而CREPT knockdown后Skp2mRNA减少，但当skp2被干扰后，此改变消失。这些稳定细胞系中CREPT mRNA，p21mRNA，p27mRNA，CyclinD1 mRNA的水平不受Skp2过表达或knockdown的影响，但CREPT的表达的改变使CyclinD1的转录水平与其呈一致的变化，即CREPT的过表达增加了CyclinD1 mRNA水平，而CREPT knockdown减少了CyclinD1 mRNA的水平。同时我们的研究已显示CREPT能与Skp2的启动子结合，而调节其转录功能。

(5)CREPT在翻译水平上影响Skp2的表达

pcDNA6/CREPT、pcDNA、pBSU6/CREPTi、pBSU6转染HepG2细胞系后，再分别用pcDNA6/Skp2、pcDNA、pBSU6/Skp2i、pBSU6转染HepG2细胞系，并构建稳定细胞系。Western blot结果显示，CREPT过表达后，Skp2的表达水平增加，而CREPT knockdown后Skp2的表达减少，但当skp2被干扰后，此改变消失。p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1的表达受Skp2和CREPT表达的影响，而CREPT、p15、p16的表达不受Skp2表达的影响；p15、p16的表达受CREPT表达的影响。这些稳定细胞系中加入蛋白酶体抑制剂MG132后，Skp2对p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1表达的影响便消失；CREPT对p21CIP1/WAF1，p27表达的影响便消失，但CREPT对p15、p16、CyclinD1的表达的影响仍存在。推测CREPT和Skp2通过某种途径协同降解p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1。有趣的是，当Skp2knockdown后，过表达CREPT也不能导致p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1降解，而且CREPT knockdown后，只要Skp2过表达p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1也大量降解。进一步推测CREPT通过Skp2导致p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1的降解，或CREPT加强了Skp2对p21CIP1/WAF1，p27，CyclinD1的降解功能。同时我们也进一步发现了CREPT可能在Skp2的介导下对CyclinD1表达影响产生双重性，即CREPT的过表达不但增加了CyclinD1表达，而且CREPT也能促进CyclinD1的降解。

7)重组腺病毒Ad-CREPT在HepG2细胞中的高效表达及其对相关基因表达的影响

重组腺病毒Ad-CREPT(将带有Sal II和EcoR V酶切位点的CREPT基因的PCR纯化产物和穿梭质粒pAdTrack-CMV分别以Sal II和EcoR V进行双酶切并纯化。将纯化产物进行连接反应，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，培养的克隆经提取质粒后进行PCR、酶切和测序鉴定，筛选阳性重组质粒。阳性克隆经37℃250r/min培养12-24小时后，提取重组质粒pAdTrack-CREPT。Pme I酶切线性化处理pAdTrack-CREPT及pAdTrack-CMV后，利用电穿孔法转化感受态大肠杆菌BJ5183，涂布含50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养16-20h，挑选菌落，抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳和PacI酶切鉴定。取阳性质粒1μL化学法转化DH10B菌，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。同时以pAd-EGFP作为对照。然后将重组腺病毒载体pAd-CREPT转染HEK293细胞后进行包装。转染后每天观察EGFP的表达和细胞生长情况，待细胞出现病变(CPE)时(7-10d)收集细胞，进行滴度(pfu/L)测定。大量扩增后，经氯化铯梯度离心法纯化腺病毒Ad-CREPT，分装并于-80℃保存。同时进行滴度(pfu/L)测定)感染HepG2细胞18h后，在荧光显微镜下观察到HepG2细胞中EGFP荧光.感染72h后，WesternBlot检测表明，腺病毒载体可以在HepG2细胞中大量表达CREPT.重组腺病毒Ad-CREPT感染HepG2细胞后，细胞中skp2，cdk2，cdk4，cdk6，cdk9，cyclinE，cyclinD1，cyclinT1PCNA，E2F1的RNA转录水平增加，而p15，p16，Rb的RNA转录水平减少，p21CIP1/WAF1，p27，cyclinA的RNA转录水平无显著改变；skp2，cdk2，cdk4，cdk6，cdk9，cyclinE，cyclinD1，cyclinA，cyclinT1，PCNA，E2F1的蛋白的表达量增加，而p15，p16，p21CIP1/WAF1，p27，Rb的蛋白表达量减少。

实施例7、酵母双杂交筛选CREPT的互作蛋白

一、GBKT7/CREPT酵母表达载体的构建

PCR扩增人类CREPT基因cDNA，并使序列两端分别携带有限制性内切酶NdelI和SalI识别位点，对PCR进行1％琼脂糖胶电泳检测，并用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，定量。将纯化的PCR产物用限制性内切酶NdelI和SalI双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pGBKT7(购于Clontech公司)用T₄ DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态菌，涂布LB-Kan平板进行筛选，PCR鉴定转化子，抽提质粒，测序验证，结果表明获得了含有CREPT基因的酵母表达载体，命名为GBKT7/CREPT。

二、酵母双杂交

将重组pGBKT7/CREPT酵母表达载体质粒转化酵母菌AH109，筛选小鼠7天胚胎cDNA文库，利用Clontech公司的酵母双杂交系统3(MATCHMAKER Two-Hybrid System3)并根据产品说明书进行酵母双杂交，以筛选CREPT的互作蛋白，具体方法为：1)将酵母单克隆培养12-24小时；2)转移酵母液到50mL YPD培养基中，置于30℃摇床中，以250rpm的转速震荡培养16-18个小时，直至OD600＞1.5；3)转移部分过夜培养物到300mL YPD中使最终OD600为0.2-0.3。30℃摇床以230rpm的转速震荡培养3-4h直至OD600为0.4-0.6；4)转移酵母液至50mL离心管中，1000g室温(20℃-21℃)离心5分钟；5)弃去上清，加入25-50mL无菌水或无菌的1×TE缓冲液重悬酵母；6)将酵母液合并为一管，1000g室温离心5分钟；7)弃去上清，用1.5mL无菌的1×TE/1×LiAC重悬酵母；8)向无菌的1.5mL微量离心管中加入0.1μg质粒DNA和0.1mg鲑鱼精载体DNA，轻弹混匀；9)再向每管中加入0.1mL酵母感受态细胞，震荡混匀；10)加入0.6mL无菌PEG/LiAC溶液，剧烈震荡10s混匀，30℃摇床以200rpm的转速震荡培养30分钟；11)加入70μl DMSO轻轻的颠倒混匀，不震荡，42℃水浴中静止15分钟，取出后立即放到冰上，冷却1-2分钟；13)1000rpm室温离心5分钟，弃去上清，用0.5mL无菌的1×TE Buffer重悬酵母；14)取合适体积的菌液(一般100μl)涂到选择性的SD培养基的平板上，30℃培养箱中培养2-4天，在固体诱导培养板上获得1210菌落，重复将它们重新在SD/-Ade，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板(SD培养基，固体粉末购于Clontech公司)，其它培养基配方如下：

1.SD/-trp液体培养基/L：Minimal SD Agar培养基SD Agar培养基(CLONTECH公司)26.7g、-Trp Do supplement(CLONTECH公司)0.62g.固体培养基含2.0％琼脂；

2.SD/-Leu/-Trp液体培养基/L：Minimal SD Agar培养基SD Agar培养基(CLONTECH公司)26.7g、-Leu/-Trp Do supplement(CLONTECH公司)0.62g.固体培养基含2.0％琼脂；

3.SD/-Leu/-Trp/-His液体培养基/L：Minimal SD Agar培养基SD Agar培养基(CLONTECH公司)26.7g、-Leu/-Trp/-His Do supplement(CLONTECH公司)0.62g.固体培养基含2.0％琼脂；

4.SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基/L：Minimal SD Agar培养基SD Agar培养基(CLONTECH公司)26.7g、-Leu/-Trp/-His/-Ade Do supplement(CLONTECH公司)0.6g.固体培养基含2.0％琼脂；

5.YPD培养基(CLONTECH公司)50g/L.固体培养基含2.0％琼脂；上划板，经β-半乳糖甘酶活性定性或定量检测(如图9所示)，通过PCR及酶切进行插入片段的大小分类，筛选出136个初级阳性克隆，其中82和19号阳性克隆的β-半乳糖甘酶活性定性或定量检测及酶切分类结果如图10所示。

三、部分阳性克隆序列测定和NCBI检索分析

以pGADT7-A引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’)测定50个阳性克隆的cDNA序列，其中82号阳性克隆的cDNA序列具有序列表中序列4的核苷酸序列，并将cDNA序列送入NCBI的非重复的GenBank数据库的检索，发现了CREPT的一些较重要的互作蛋白，有些已知因子与基因转录调控、细胞周期调控直接相关，其中包括：

1)Mus musculus nucleolar protein GU2.

2)Homo sapiens Cbp/p300-interacting transactivator，with Glu/Asp-richcarboxy-terminal domain；2.

3)Drosophila melanogaster histone deacetylase dHDAC3

4)Nicotiana tabacum mRNA for MAP kinase(mekl gene).

5)Mus musculus dual specificity phosphatase 14(Duspl4).

6)Mus musculus GADD45G(Gadd45g)gene

7)Homo sapiens growth arrest and DNA-damage-inducible，gamma

8)Mus musculus L23 mitochondrial-related protein(L23mrp)

9)Rattus norvegicus tRNA-Trp，tRNA-Ala，tRNA-Asn，tRNA-Cys，and tRNA-Tyrgenes，cytochrome c oxidase subunit I(Co I)gene，complete cds；tRNA-Serand tRNA-Asp genes，complete sequence；cytochrome c oxidase subunit II(CoII)gene，complete cds；tRNA-Lys gene，complete sequence；cytochrome coxidase subunit III(Co III)gene，complete cds；and tRNA-Gly and tRNA-Arggenes，complete sequence；mitochondrial genes for mitochondrial products.

10)Rattus norvegicus integral membrane protein Tmp21-I(p23)(Tmp21).

11)Mus musculus zinc finger protein 265(Zfp265).

12)Mus musculus amiloride binding protein 1(amine oxidase，copper-containing)

13)Mus musculus mRNA for HMG-box transcription factor.

14)Mus Sox 17；HMG-box transcription factor

15)Mus musculus acidic ribosomal phosphoprotein PO

16)Mus musculus thioredoxin domain containing 7(Txndc7)，

17)Mus musculus lactate dehydrogenase 1，A chain

18)Homo sapiens AngRem46.

19)Mus musculus interferon，alpha-inducible protein

20)Mus musculus transmembrane protein 59

21)Mus musculus transcription factor PBX1a(PBX1a)

22)Mus musculus pre B-cell leukemia transcription factor 1

23)Homo sapiens placenta-specific 8(PLAC8)

24)Mus musculus eukaryotic translation elongation factor 1 beta 2

25)Mus musculus host cel 1factor C1regulator 1(XP01-dependent)

26)Homo sapiens ribosomal protein L37

27)Homo sapiens S-phase kinase-associated protein 2(p45)(Skp2).

28)Mus musculus adaptor protein complex AP-2，mu1(Ap2ml).

29)Homo sapiens chromosome 1 open reading frame 91

30)Mus musculus S-adenosylmethionine decarboxylase 1(Amd1).

31)Mus musculus laminin，alpha 2(Lama2)

3.82号阳性克隆的免疫沉淀验证

鉴于酵母双杂交的假阳性现象，对上述筛选出的82号阳性克隆用免疫沉淀的方法做进一步验证，将82号(Skp2)阳性克隆的插入片段重组入pCMV-Myc载体(Clontech公司)中，得到重组载体pCMV-HA-CREPT，而将人类CREPT基因重组入pCMV-HA载体(Clontech公司)中，得到重组载体pCMV-HA-CREPT。用脂质体转染方法将pCMV-HA-CREPT、pCMV-Myc-Skp2、pCMV-HA、pCMV-Myc按不同的组合共转染HepG2细胞，结果如图11所示(“+”、“-”分别表示添加或不添加)，免疫共沉淀结果显示CREPT与Skp2能直接结合。

序列表

<160>6

<210>1

<211>1833

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

gagctccgac gcctctcggt gcccctctgc tccggccctt gccctttgac ctcgctctcg 60

cggcagggtg agaggtcggg tggccatctt gtggcggcgg cgcgggcggc tgttactgcg 120

gagacccatc ccctccccct tctcgcaccc ctgtcagtct gtcagtcggt aaaaagtccc 180

gcagcctgtc aggtgaggcc ccggcatcgt gccgtcgctc ttcccgccgc actgggcggc 240

caggcgctac actgccgggc ctcactgccg ccaccatgtc ctccttctct gagtcggcgc 300

tggagaagaa gctctcggag ctgagcaact ctcagcagag cgtgcagacc ctgtcccttt 360

ggctcatcca ccaccgcaag cacgcgggac ccatcgtctc cgtgtggcac cgcgagctcc 420

gcaaagccaa atcaaataga aagcttactt ttctgtattt agcgaatgat gtcatccaaa 480

acagtaaaag gaaaggacct gaattcacta gagaatttga atctgtcctt gtggatgctt 540

tttctcatgt tgccagagag gcagatgaag gctgtaaaaa acctttagaa agattgctga 600

acatctggca agaacgaagt gtgtatggcg gcgagttcat acagcagctg aagctgtcta 660

tggaggactc caagagccct ccccccaaag caacagaaga gaagaaatct ctgaaacgaa 720

cttttcagca aattcaggag gaggaggatg acgactaccc tggcagctac tctcctcagg 780

atccttctgc aggacccctc ttgactgagg aactaatcaa agctttgcag gatctggaaa 840

atgccgcatc aggggatgct actgtccgac agaaaattgc ttctctgccc caggaagtgc 900

aagatgtttc tctattggaa aaaataacag acaaagaggc agctgaacgt ctttcaaaaa 960

cagtagatga agcatgtctg ttactagcag aatataacgg gcgcctggca gcagaactgg 1020

aggaccgtcg ccagctggct cggatgttgg tggagtatac ccagaatcag aaagatgttt 1080

tgtcggagaa ggagaaaaaa ctagaggaat acaaacagaa gcttgcacga gtaacccagg 1140

tccgcaagga actgaaatcc catattcaga gcttgccaga cctctcactg ctgcccaacg 1200

tcacaggggg cttagccccc ctgccctctg ctggggacct gttttcaact gactaggatg 1260

ggtgtcatgt cccagatttc tgtttgtacc agcagaaaga agagggcaag tcatggttgg 1320

aaataacctt ctagcccctg gttctatccc ttcttccgcc cagcccccca gcctcaagaa 1380

agaacctcag actctgattc tcctcttcag cctctcatct tgagcacagt tcagaacacc 1440

gtcgactgga atctggttat attcatattt gcaagactac agatttttct cccacttcat 1500

attttcatgc cccctgtggg ttgtcattct taagtgtctc cttataacta agaagtgatg 1560

aaatcatggg tattctggag gcttcgaaga atctgtcctc agaagcatta atcaggaaga 1620

ccgtctcctt agggggcggc agtcgggggt acaaaggatg ccggaggagt ggttcactgc 1680

cgtcccaagg gggcaggcgc acgggccaaa gtgcacaact gtacctccag gtccagggga 1740

gaaaggcaat ggcaggcgac cacacactcg agagacacac gaaacaaagg ccaacacccg 1800

cgcaagacgc gctgcgcata gcttatcgtg gtc 1833

<210>2

<211>326

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ser Ser Phe Ser Glu Ser Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ser Glu Leu

1 5 10 15

Ser Asn Ser Gln Gln Ser Val Gln Thr Leu Ser Leu Trp Leu Ile His

20 25 30

His Arg Lys His Ala Gly Pro Ile Val Ser Val Trp His Arg Glu Leu

35 40 45

Arg Lys Ala Lys Ser Asn Arg Lys Leu Thr Phe Leu Tyr Leu Ala Asn

50 55 60

Asp Val Ile Gln Asn Ser Lys Arg Lys Gly Pro Glu Phe Thr Arg Glu

65 70 75 80

Phe Glu Ser Val Leu Val Asp Ala Phe Ser His Val Ala Arg Glu Ala

85 90 95

Asp Glu Gly Cys Lys Lys Pro Leu Glu Arg Leu Leu Asn Ile Trp Gln

100 105 110

Glu Arg Ser Val Tyr Gly Gly Glu Phe Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ser

115 120 125

Met Glu Asp Ser Lys Ser Pro Pro Pro Lys Ala Thr Glu Glu Lys Lys

130 135 140

Ser Leu Lys Arg Thr Phe Gln Gln Ile Gln Glu Glu Glu Asp Asp Asp

145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ser Tyr Ser Pro Gln Asp Pro Ser Ala Gly Pro Leu Leu

165 170 175

Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Leu Glu Asn Ala Ala Ser

180 185 190

Gly Asp Ala Thr Val Arg Gln Lys Ile Ala Ser Leu Pro Gln Glu Val

195 200 205

Gln Asp Val Ser Leu Leu Glu Lys Ile Thr Asp Lys Glu Ala Ala Glu

210 215 220

Arg Leu Ser Lys Thr Val Asp Glu Ala Cys Leu Leu Leu Ala Glu Tyr

225 230 235 240

Asn Gly Arg Leu Ala Ala Glu Leu Glu Asp Arg Arg Gln Leu Ala Arg

245 250 255

Met Leu Val Glu Tyr Thr Gln Asn Gln Lys Asp Val Leu Ser Glu Lys

260 265 270

Glu Lys Lys Leu Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ala Arg Val Thr Gln

275 280 285

Val Arg Lys Glu Leu Lys Ser His Ile Gln Ser Leu Pro Asp Leu Ser

290 295 300

Leu Leu Pro Asn Val Thr Gly Gly Leu Ala Pro Leu Pro Set Ala Gly

305 310 315 320

Asp Leu Phe Ser Thr Asp

325

<210>3

<211>981

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

atgtcctcct tctctgagtc ggcgctggag aagaagctct cggagctgag caactctcag 60

cagagcgtgc agaccctgtc cctttggctc atccaccacc gcaagcacgc gggacccatc 120

gtctccgtgt ggcaccgcga gctccgcaaa gccaaatcaa atagaaagct tacttttctg 180

tatttagcga atgatgtcat ccaaaacagt aaaaggaaag gacctgaatt cactagagaa 240

tttgaatctg tccttgtgga tgctttttct catgttgcca gagaggcaga tgaaggctgt 300

aaaaaacctt tagaaagatt gctgaacatc tggcaagaac gaagtgtgta tggcggcgag 360

ttcatacagc agctgaagct gtctatggag gactccaaga gccctccccc caaagcaaca 420

gaagagaaga aatctctgaa acgaactttt cagcaaattc aggaggagga ggatgacgac 480

taccctggca gctactctcc tcaggatcct tctgcaggac ccctcttgac tgaggaacta 540

atcaaagctt tgcaggatct ggaaaatgcc gcatcagggg atgctactgt ccgacagaaa 600

attgcttctc tgccccagga agtgcaagat gtttctctat tggaaaaaat aacagacaaa 660

gaggcagctg aacgtctttc aaaaacagta gatgaagcat gtctgttact agcagaatat 720

aacgggcgcc tggcagcaga actggaggac cgtcgccagc tggctcggat gttggtggag 780

tatacccaga atcagaaaga tgttttgtcg gagaaggaga aaaaactaga ggaatacaaa 840

cagaagcttg cacgagtaac ccaggtccgc aaggaactga aatcccatat tcagagcttg 900

ccagacctct cactgctgcc caacgtcaca gggggcttag cccccctgcc ctctgctggg 960

gacctgtttt caactgacta g 981

<210>4

<211>555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ccccaccaaa cccaaaaaaa gagatctcta tggcttaccc atacgatgtt ccagattacg 60

ctagcttggg tggtcatatg gccatggagg ccccggggat ccgaatagtt cgcgggtcca 120

actgctgggg ccccggggat cactctaagc cgagcgctaa aacaggagtc tggaaggcag 180

gcagcgcttc aattaattca agcatcaaaa ctcctgaatc agtggacacc atgcatagga 240

agcaccttca ggagattccg gaccagagtg gcaacgtcac caccagcttc acgtggggat 300

gggattccag caagacttct gaactgctat caggcatggg tgtctcggcc ttggagaagg 360

aggaggtgga cagtgagaac atcccacatg gactgctctc aaacctcggc cacccccaga 420

gccctccaag gaaacgagtc aagggcaaag ggagtgacaa agactttgtg atcatccgtc 480

ggccgaagct tagtcgggag aactttccag gtgtctcctg ggactccctt ccagatgagc 540

tgctccttgg gatct 555

<210>5

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ggaccugaau ucacuagaga 20

<210>6

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ucucuaguga auucaggucc 20

Claims

1、对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因，其cDNA是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述cDNA具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因，其基因组基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

4、权利要求1所述对肿瘤细胞周期具有正向调控作用的基因的小干扰RNA，是正义链具有序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：6的双链RNA序列。

5、权利要求1或2或3所述基因编码的蛋白，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

6、根据权利要求5所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

7、含有权利要求1或2或3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

8、一种体外抑制肿瘤细胞生长的方法，是将权利要求4所述对肿瘤细胞周期具有正向调控作用基因的干扰RNA的编码基因导入宿主，从而抑制肿瘤细胞生长。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述对肿瘤细胞周期具有正向调控作用基因的干扰RNA的编码基因通过含有的RNAi表达载体导入宿主；以pBSU6为出发载体，构建的RNAi表达载体为pcDNA3.1/pBSU6/CREPTi。

10、权利要求1或2或3所述基因在制备抗肿瘤药物中的应用。