CN108949718A - Crept（s145a）突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用 - Google Patents

Crept（s145a）突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CREPT（S145A）突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。本发明采用定点突变方法将CREPT蛋白质第145位由丝氨酸S突变为丙氨酸A，得到CREPT（S145A）蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明还将CREPT(S145A)蛋白的编码基因导入宿主细胞，获得了稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系。通过实验证明：稳定表达CREPT（S145A）蛋白的细胞系的细胞周期相关蛋白Cyclin B1转录和表达水平显著降低，并失去了促肿瘤细胞增殖和迁移的能力。说明CREPT（S145A）蛋白具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移的功能。

Description

CREPT(S145A)突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及CREPT(S145A)突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。
背景技术
细胞不同时期的转换是很多蛋白调控的结果，其中最重要的调控蛋白就是CDK(cyclin-dependent kinases)，这是一类在细胞分裂的不同时期处于不同活性状态的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。当这些激酶处于激活状态时，可以磷酸化下游底物去调节细胞周期，细胞分裂的不同时期需要不同表达水平的Cyclins。CyclinD1/2/3和CDK4/6复合物的形成是细胞进入G1期所必须的。Cyclin E与CDK2复合物的形成决定细胞是否可以通过G1期进入S期。Cyclin A与CDK2的结合是细胞处于S期所必须的。在G2期末期和M期初期，Cyclin A与CDK1的结合是促进细胞完成G2-M期转换所必需的。细胞进入M期后，Cyclin B1与CDK1的结合又是必需的。在M期后期，CyclinB1的降解又是细胞离开M期进入下一个G1期所必需的。
细胞周期与肿瘤发生密切相关，研究人员在寻找肿瘤相关基因的研究中发现了一种新的肿瘤相关基因CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein intumor，专利号ZL200510135513.4)。该基因能够和转录中的关键酶——RNA聚合酶II在细胞周期蛋白Cyclin D1基因上结合，并且使Cyclin D1基因形成环状结构，而这种环状结构的形成可能会促进基因的转录。质谱结果显示，CREPT与一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AuroraB具有密切相互作用，Aurora B激酶在细胞分裂过程起重要作用，主要在细胞分裂的G2以及M期高表达，在细胞分裂过程中染色体固缩、纺锤丝形成，动粒微管相互作用以及染色体中期赤道板形成等中都发挥着极其重要的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何抑制肿瘤细胞的生长。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是将CREPT蛋白质第145位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质，并将其命名为CREPT(S145A)蛋白质；
所述CREPT蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.4所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述CREPT(S145A)蛋白质为SEQ ID No.2所示的蛋白质。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了编码CREPT(S145A)蛋白质的核酸分子。
本发明提供的编码CREPT(S145A)蛋白质的核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码CREPT(S145A)蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码CREPT(S145A)蛋白质的DNA分子。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1)-A3)中的任一种生物材料：
A1)含有上述核酸分子的表达盒；
A2)含有上述核酸分子的重组载体；
A3)含有上述核酸分子的转基因细胞系。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述CREPT(S145A)蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或CREPT蛋白质第145位氨基酸作为靶点的新用途。
本发明提供了上述CREPT(S145A)蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或CREPT蛋白质第145位氨基酸作为靶点在下述B1)-B5)中的任一种：
B1)抑制肿瘤细胞的生长；
B2)抑制肿瘤细胞的增殖和/或迁移；
B3)下调Cyclin B1水平；
B4)调控细胞周期；
B5)开发或筛选治疗肿瘤的产品。
进一步的，所述B3)中，所述Cyclin B1水平为Cyclin B1转录水平。
所述B5)中，所述产品可为针对CREPT蛋白质第145位氨基酸的小分子抑制剂。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种抑制肿瘤细胞的生长的方法。
本发明提供的抑制肿瘤细胞的生长的方法包括提高肿瘤细胞中CREPT(S145A)蛋白质的表达量和/或活性。
进一步的，所述提高肿瘤细胞中CREPT(S145A)蛋白质的表达量和/或活性的方法为在肿瘤细胞中过表达CREPT(S145A)蛋白质。
更进一步的，所述过表达的方法为将CREPT(S145A)蛋白质的编码基因导入肿瘤细胞；所述CREPT(S145A)蛋白质的编码基因是SEQ ID No.1所示的DNA分子。
在本发明中，所述CREPT(S145A)蛋白质的编码基因是通过pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒导入肿瘤细胞中。所述pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
上述方法中，所述肿瘤细胞可为现有技术中常见的肿瘤细胞系，如人结直肠腺癌细胞系，也可为敲除CREPT的肿瘤细胞系，如敲除CREPT的人胃癌细胞系。在本发明中，所述人结直肠腺癌细胞系具体为DLD1细胞；所述人胃癌细胞系具体为MGC803细胞。
本发明采用定点突变的方法将CREPT蛋白质第145位由丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala，得到CREPT(S145A)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因序列如SEQ IDNo.1所示。本发明还将CREPT(S145A)蛋白的编码基因导入宿主细胞，获得了稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系。通过实验证明：稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系的细胞周期相关蛋白Cyclin B1转录和表达水平显著降低，并失去了促肿瘤细胞增殖和迁移的能力。说明CREPT(S145A)蛋白具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移的功能，CREPT第145位丝氨酸位点对于CREPT维持其促进肿瘤形成的功能至关重要，在今后的实际应用中，可开发、设计和筛选专门针对CREPT第145位丝氨酸位点的小分子抑制剂用于肿瘤的治疗。
附图说明
图1为CREPT(S145A)突变体对Cyclin B1转录水平的影响。
图2为CREPT(S145A)突变体对人结直肠腺癌细胞系DLD1细胞生长的影响。
图3为EZ-GuideXH图谱。
图4为CREPT野生型及敲除CREPT的MGC803的Western blot检测结果。
图5为CREPT(S145A)突变体对人胃癌细胞系MGC803细胞生长的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、CREPT(S145A)突变蛋白及其编码基因的获得
1、突变位点的选取
根据细胞周期正向调控蛋白CREPT和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Aurora Kinase B的相互作用，挑选符合Aurora Kinase B磷酸化下游底物的保守序列为突变位点。本发明经过多次试验和摸索，选取细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸位点作为突变位点。
2、定点突变引物的设计
根据突变位点设计定点突变引物，设计的定点突变引物序列如下：
S145A-F：5’-CAGAAGAGAAGAAAGCCCTGAAACGAAC-3’；
S145-R：5’-GGCTTTCTTCTCTTCTGTTGCTTTGG-3’。
3、PCR扩增
以野生型CREPT过表达质粒(pCDNA3.1-Myc-CREPT)为模板，采用步骤2设计的引物S145A-F和S145-R进行PCR扩增，得到PCR产物。
4、测序
对步骤3获得的PCR产物进行测序。测序结果表明：PCR扩增得到SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，将SEQ ID No.1所示的基因名称为CREPT(S145A)基因。CREPT(S145A)基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将SEQ ID No.2所示的蛋白命名为CREPT(S145A)蛋白。
CREPT(S145A)蛋白为将细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala，且保持蛋白CREPT的其他氨基酸序列不变得到的蛋白；CREPT(S145A)基因为将编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的GCT，且保持蛋白CREPT编码基因的其他序列不变得到的基因。细胞周期正向调控蛋白CREPT的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码基因如SEQ ID No.3所示。
实施例2、CREPT(S145A)突变体的制备及其在抑制结直肠腺癌细胞中的应用
一、CREPT突变体的制备
采用定点突变试剂盒(购自上海赛百盛基因技术有限公司)构建各个CREPT突变体。具体步骤如下：
1、重组质粒的构建
(1)引物的设计
设计用于定点突变的引物，引物序列如下：
S145A F：5’-CAGAAGAGAAGAAAGCCCTGAAACGAAC-3’；
S145A R：5’-GGCTTTCTTCTCTTCTGTTGCTTTGG-3’；
S145E F：5’-CAGAAGAGAAGAAAGAGCTGAAACGAAC-3’；
S145E R：5’-CTCTTTCTTCTCTTCTGTTGCTTTGG-3’。
S128A F：5’-CAGCTGAAGCTGGCCATGGAGGACTCCAAG-3’；
S128A R：5’-TCCTCCATGGCC AGCTTCAGCTGCTGTATGAACT-3’；
T218A F：5’-ATTGGAAAAAATAGCCGACAAAGAGGCAGCTG-3’；
T218A R：5’-CTTTGTCGGCTATTTTTTCCAATAGAGAA-3’；
S227A F：5’-CAGCTGAACGTCTTGCCAAAACAGTAGATGA-3’；
S227A R：5’-TGCTTCATCTACTGTTTTGGCAAGACGTTC-3’。
(2)PCR扩增
以pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒(pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒为将SEQ ID No.3所示的CREPT编码基因插入pCDNA3.1-Myc(Thermo Fisher，V80020)载体的KpnI和EcoRI酶切位点间得到的质粒)为模板，分别采用S145A F/S145A R、S145E F/S145E R、S128A F/S128A R、T218A F/T218A R、S227A F/S227A R引物进行PCR扩增，分别得到PCR产物。
PCR扩增反应体系如下：10×reaction buffer 5μL、pCDNA3.1-Myc-CREPT(10ng/μL，共20ng)2μL、Sample primer(F)(10pmol/μL)1μL、Sample primer(R)(10pmol/μL)1μL、dNTP mixture(each 2.5mM)2μL、Muta-directTM Enzyme 1μL、RNase-free Water 38μL。
PCR扩增反应条件如下：1、95℃，30s；2、95℃，30s；3、55℃，1min；4、72℃，1min perplasmid Kb。2-4循环15次。
(3)阳性质粒的获得
向步骤(2)获得的PCR产物中加入1μL的MutazymeTM酶消化甲基化质粒(未被突变的pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒)从而选择突变质粒DNA，37℃消化1小时，得到消化产物。取10μL消化产物进行转化，第二天挑克隆送测序，挑选正确的质粒，并分别将其命名为pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)质粒、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)质粒、pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)质粒和pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)质粒。
pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸的密码子TCT突变为编码谷氨酸的密码子GAG，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第128位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第218位苏氨酸的密码子ACA突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第227位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。
2、重组质粒的包装
分别将pCDNA3.1-Myc、pCDNA3.1-Myc-CREPT、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)和pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)质粒进行包装，分别得到含有慢病毒颗粒pCDNA3.1-Myc、pCDNA3.1-Myc-CREPT、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)和pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)的上清。具体步骤如下(以六孔板的一个孔为例)：
1)转染前一天，接种适量的HEK293T细胞(ATCC，CRL-3216)，至转染时细胞密度为70-90％。
2)取5μg质粒(包病毒为3质粒系统，pMD2G：PSApX2：目的质粒＝1：1.5：2.5)加入到100μL的0.9％NaCl中，吹打混匀。
3)取2μL Vigofect转染试剂，加入100μL的0.9％NaCl中轻轻混匀，室温放置5min。
4)将步骤2)稀释的质粒加入到步骤3)稀释的转染试剂中，轻轻吹打混匀，室温放置15min。
5)将转染工作液逐滴加入到细胞培养基中，轻轻混匀培养基，放入细胞培养箱中。
6)4-6小时之后换成2mL的新鲜培养基。
7)24小时后换成新鲜培养基，收取48-72小时的包含病毒的上清即可。
3、目的细胞的侵染
分别将含有慢病毒颗粒pCDNA3.1-Myc、pCDNA3.1-Myc-CREPT、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)和pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)的上清加入人结直肠腺癌细胞系DLD1细胞(ATCC，CCL-221)，分别得到如下突变体：空载体对照细胞、稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞、稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞、稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞、稳定表达CREPT(S128A)蛋白的DLD1细胞、稳定表达CREPT(S227A)蛋白的DLD1细胞和稳定表达CREPT(T218A)蛋白的DLD1细胞。具体步骤如下：
(1)将DLD1细胞铺到六孔细胞培养板中在37℃、5％CO2条件下进行培养，培养基为RPMI1640(Gibco，11875093)。
(2)培养至第二天密度为30-50％时进行慢病毒转染。从五个孔中选取四个孔作为实验组，剩余一个孔作为对照组。
实验组：吸掉1mL培养基，每孔加入1mL病毒上清液和2μL的polybrene(SigmaAldrich，107689)，使polybrene在体系中的终浓度为5ng/μL。在操作台上画“8字”轻轻混匀。
对照组：吸掉1mL培养基，每孔加入1mL完全培养基。
(3)转染24小时后换成新鲜的培养基，48小时后加入相应抗生素筛选至阴性对照细胞全部死亡，收集实验组的活细胞扩大培养进行后续实验。
二、CREPT(S145A)突变体对Cyclin B1转录水平的影响
为了探究CREPT突变体对Cyclin B1表达水平的影响，采取荧光素酶报告实验检测各个CREPT突变体中Cyclin B1的转录水平。具体步骤如下：
1、提前一天在细胞培养板中分别铺好HEK293T(ATCC，CRL-3216)在37℃、5％CO2条件下进行培养，培养基为含有10％FBS(Gibco，10099141)的DMEM(Gibco，11965-092)。
2、第二天待细胞密度为60-90％时进行转染，根据转染细胞不同分为如下六组，每组设3个重复。
MOCK：将pCDNA3.1-Myc与Cyclin B1 promoter报告质粒以及内参质粒(pRL-TK，promega，E2261)采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。Cyclin B1promoter报告质粒的构建方法如下：1)使用天根基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304)提取HEK293T的DNA。2)以HEK293T的DNA为模板，采用引物hB1-luc-1171KpnI F：attGGTACCCCGTGACTTCCAGCGCCAGGAGTCTCTATT和hB1-luc-1171 XhoI R：aatCTCGAGGCCATGGCTTCCTCTTCACCAGGCAGCAGCT，使用NEB公司的Phusion DNA Polymerases(M0530S)高保真DNA酶进行PCR扩增，得到CCNB1的promotor区的序列。3)将CCNB1的promotor区的序列替换载体pGl3(Addgene，64784)的XhoI和KpnI酶切位点间的序列，且保持载体pGl3的其他序列不变，得到Cyclin B1 promoter报告质粒。
WT：将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒与Cyclin B1 promoter报告质粒以及内参质粒采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。
S145A：将pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒与Cyclin B1promoter报告质粒以及内参质粒采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。
S128A：将pCDNA3.1-Myc-CREPT(S128A)质粒与Cyclin B1 promoter报告质粒以及内参质粒采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。
S227A：将pCDNA3.1-Myc-CREPT(S227A)质粒与Cyclin B1 promoter报告质粒以及内参质粒采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。
T218A：将pCDNA3.1-Myc-CREPT(T218A)质粒与Cyclin B1 promoter报告质粒以及内参质粒采用Vigofect脂质体转染法共转染至HEK293T细胞中。
3、转染24小时后，弃掉培养基，用PBS洗两遍细胞，采用威格拉斯生物技术(北京)有限公司的5×Universal Lysis Buffer(ULB)裂解收获细胞。每孔加入100μL用双蒸水稀释的1×ULB，在微型振荡器上震荡混匀15min。
4、取10μL细胞裂解液加入白色96孔板中，加入30μL Fassay Reagent I于孔底部，轻轻敲击孔板数次，放入仪器中测定Firefly luciferase虫荧光素酶活性的发光单位，得到虫荧光素酶活性的发光值。取30μL Rassay Reagent II于孔底部，混匀，放入仪器中测定Ranilla luciferase海肾荧光素酶活性的发光单位，得到海肾荧光素酶活性的发光值。每次测6个孔的样品。
5、将每个孔的虫荧光素酶活性的发光值和海肾荧光素酶活性的发光值的比值作为报告质粒的相对活性值。根据三次实验，求得其平均值，计算其标准差，即为报告质粒的相对活性。
结果如图1所示(红色柱代表MOCK)，从图中可以看出：与WT相比，CREPT(S145A)突变体(稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞)中Cyclin B1转录水平显著降低，将细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸S突变为丙氨酸A后，CREPT对Cyclin B1转录水平的提高促进作用消失。说明Aurora Kinase B通过磷酸化CREPT进而促进Cyclin B1的转录和表达，CREPT第145位丝氨酸位点的失活突变是影响Cyclin B1转录表达的关键位点。CREPT(S145A)蛋白可下调Cyclin B1转录水平，进而参与调控细胞周期。
三、CREPT(S145A)突变体在调控结直肠腺癌细胞生长、增殖和迁移中的应用
1、分别以稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞和稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞作为供试细胞，采用Western blot检测供试细胞中CREPT蛋白表达情况。使用的一抗为抗HA(Santa Cruze)和抗H3(Cell signaling technology)的抗体，二抗为山羊抗鼠和山羊抗兔的抗体(Jackson ImmunoReseach)。同时以空载体对照细胞(Mock)和稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞(WT)作为对照细胞。
结果如图2A(Mock为转空载体对照细胞，WT-CREPT为稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞，CREPT-S145A为稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞，CREPT-S145E为稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞)所示，从图中可以看出：稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞和稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞中均成功表达目的蛋白。
2、克隆形成和划痕实验
分别以稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞和稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞作为供试细胞进行克隆形成实验。同时以空载体对照细胞和稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞作为对照细胞。
克隆形成实验具体步骤如下：
1)取生长状态良好的各个供试细胞和对照细胞计数，稀释成5×102个/mL。取出2mL细胞液，加到6孔板中，每组三个重复，每隔一天换液一次。
2)7-10天后，弃掉培养基，向每孔加入1mL 0.1％结晶紫染色液，染色15-30分钟。
3)拍照、统计并作图分析。
分别以稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞和稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞作为供试细胞进行划痕实验。同时以空载体对照细胞和稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞作为对照细胞。
划痕实验具体步骤如下：
1)取生长状态良好的各个供试细胞和对照细胞计数，稀释成5×105个/mL。取出2mL细胞液，加到6孔板中，每组三个重复。
2)24小时后用黄枪头画出宽度相同的细胞划痕。预热的PBS洗三次保证没有悬浮细胞。换成无血清的DMEM继续培养。
3)24小时后拍照、统计并作图分析。
结果如图2B(Mock为转空载体对照细胞，WT-CREPT为稳定表达野生型CREPT蛋白的DLD1细胞，CREPT-S145A为稳定表达CREPT(S145A)蛋白的DLD1细胞，CREPT-S145E为稳定表达CREPT(S145E)蛋白的DLD1细胞)所示，从图中可以看出：第145位丝氨酸位点由丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala后的CREPT(S145A)突变体失去了抑制肿瘤细胞增殖的能力，说明CREPT(S145A)蛋白具有抑制肿瘤细胞生长的功能，CREPT第145位丝氨酸位点对于CREPT维持其促进肿瘤形成的功能至关重要。
实施例3、CREPT(S145A)突变体的制备及其在抑制胃癌细胞中的应用
一、CREPT突变体的制备
1、敲除CREPT的MGC803细胞的构建
(1)敲除CREPT的Cas9载体的构建
(1-1)利用网站CRISPR DESIGN(网址为http://crispr.mit.edu/)设计两对针对CREPT的guide RNA，具体序列如下：
Sg-1：5’-caccGCGGTGCCACACGGAGACGAT-3’；
Sg-1’：5’-aaacATCGTCTCCGTGTGGCACCG C-3’；
Sg-2：5’-caccGGCTAAGCCCCCTGTGACGTT-3’；
Sg-2’：5’-aaacAACGTCACAGGGGGCTTAGCC-3’。
(1-2)将Sg-1和Sg-1’退火，得到双链guide RNA1；将Sg-2和Sg-2’退火，得到双链guide RNA2。
(1-3)将双链guide RNA1插入px459pspCas9-2A-puro-MCS载体(简称px459，Addgene，#62988)的BbSI酶切位点中，得到px459-guide RNA1；
将双链guide RNA2插入EZ-GuideXH(EZ-GuideXH载体是将EZ-T载体(购自康润生物)改造后得到的载体，EZ-GuideXH载体图谱如图3所示)的BbSI酶切位点中，得到EZ-GuideXH-guide RNA2。
(1-4)用XhoI和HindIII限制性内切酶分别酶切px459-guide RNA1和EZ-GuideXH-guide RNA2。px459-guide RNA1回收大片段，EZ-GuideXH-guide RNA2回收小片段，然后进行连接，转化，挑取两对guide RNA都成功连入的阳性载体即为敲除CREPT的Cas9载体。
(2)敲除CREPT的MGC803细胞的获得及鉴定
提前一天铺好需要转染的人胃癌细胞MGC803(人胃癌细胞MGC803记载于文献：CREPT Accelerates Tumorigenesis by Regulating the Transcription of Cell-Cycle-Related Genes中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)，将敲除CREPT的Cas9载体采用Viofect转染至人胃癌细胞MGC803中。转染24小时后取三分之一到五分之一的细胞放入直径为10cm的培养皿中。48小时后加入相应的抗生素开始筛选。筛选2-3天至没有转染质粒的对照全部死亡即可换成正常完全培养基培养至可以挑选细胞克隆。首次挑选的克隆培养在24孔板里，长满之后提取蛋白采用Western blot技术(Western blot所使用的一抗记载于文献：Characterizationof a monoclonal antibody against CREPT,a novel protein highly expressed intumors中，二抗为购自Jackson ImmunoReseach公司的山羊抗鼠的二抗)进行CREPT的表达鉴定。鉴定成功的阳性细胞克隆扩大培养进行后续实验。Western blot检测结果如图4所示。敲除CREPT的MGC803细胞中成功敲除CREPT。
2、CREPT突变体的制备
将实施例2中的慢病毒颗粒pCDNA3.1-Myc的上清加入人胃癌细胞系MGC803细胞，得到过表达空载体的MGC803细胞；
分别将实施例2中的慢病毒颗粒pCDNA3.1-Myc、pCDNA3.1-Myc-CREPT、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)、pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145E)的上清加入敲除CREPT的MGC803细胞，分别得到过表达空载体的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达野生型CREPT的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达CREPT(S145A)的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达CREPT(S145E)的敲除CREPT的MGC803细胞。
二、CREPT(S145A)突变体在调控胃癌细胞生长、增殖和迁移中的应用
分别以步骤一构建的如下CREPT突变体：过表达空载体的MGC803细胞、过表达空载体的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达野生型CREPT的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达CREPT(S145A)的敲除CREPT的MGC803细胞、过表达CREPT(S145E)的敲除CREPT的MGC803细胞作为供试细胞进行克隆形成实验。
结果如图5所示，图5中，从左至右分别是野生型MGC803细胞中过表达空载体，敲除CREPT的MGC803细胞中过表达空载体，敲除CREPT的MGC803细胞中过表达野生型CREPT，敲除CREPT的MGC803细胞中过表达CREPT(S145A)，敲除CREPT的MGC803细胞中过表达CREPT(S145E)蛋白。从图中可以看出：第145位丝氨酸位点由丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala后的CREPT(S145A)突变体失去了恢复因CREPT缺失而导致的抑制肿瘤细胞增殖的能力，说明CREPT(S145A)蛋白具有抑制肿瘤细胞生长的功能，CREPT第145位丝氨酸位点对于CREPT维持其促进肿瘤形成的功能至关重要。
序列表
<110>清华大学
<120>CREPT（S134A）突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>981
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgtcctcct tctctgagtc ggcgctggag aagaagctct cggagctgag caactctcag 60
cagagcgtgc agaccctgtc cctttggctc atccaccacc gcaagcacgc gggacccatc 120
gtctccgtgt ggcaccgcga gctccgcaaa gccaaatcaa atagaaagct tacttttctg 180
tatttagcga atgatgtcat ccaaaacagt aaaaggaaag gacctgaatt cactagagaa 240
tttgaatctg tccttgtgga tgctttttct catgttgcca gagaggcaga tgaaggctgt 300
aaaaaacctt tagaaagatt gctgaacatc tggcaagaac gaagtgtgta tggcggcgag 360
ttcatacagc agctgaagct gtctatggag gactccaagg cccctccccc caaagcaaca 420
gaagagaaga aagctctgaa acgaactttt cagcaaattc aggaggagga ggatgacgac 480
taccctggca gctactctcc tcaggatcct tctgcaggac ccctcttgac tgaggaacta 540
atcaaagctt tgcaggatct ggaaaatgcc gcatcagggg atgctactgt ccgacagaaa 600
attgcttctc tgccccagga agtgcaagat gtttctctat tggaaaaaat aacagacaaa 660
gaggcagctg aacgtctttc aaaaacagta gatgaagcat gtctgttact agcagaatat 720
aacgggcgcc tggcagcaga actggaggac cgtcgccagc tggctcggat gttggtggag 780
tatacccaga atcagaaaga tgttttgtcg gagaaggaga aaaaactaga ggaatacaaa 840
cagaagcttg cacgagtaac ccaggtccgc aaggaactga aatcccatat tcagagcttg 900
ccagacctct cactgctgcc caacgtcaca gggggcttag cccccctgcc ctctgctggg 960
gacctgtttt caactgacta g 981
<210>2
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
Met Ser Ser Phe Ser Glu Ser Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ser Glu Leu
1 5 10 15
Ser Asn Ser Gln Gln Ser Val Gln Thr Leu Ser Leu Trp Leu Ile His
20 25 30
His Arg Lys His Ala Gly Pro Ile Val Ser Val Trp His Arg Glu Leu
35 40 45
Arg Lys Ala Lys Ser Asn Arg Lys Leu Thr Phe Leu Tyr Leu Ala Asn
50 55 60
Asp Val Ile Gln Asn Ser Lys Arg Lys Gly Pro Glu Phe Thr Arg Glu
65 70 75 80
Phe Glu Ser Val Leu Val Asp Ala Phe Ser His Val Ala Arg Glu Ala
85 90 95
Asp Glu Gly Cys Lys Lys Pro Leu Glu Arg Leu Leu Asn Ile Trp Gln
100 105 110
Glu Arg Ser Val Tyr Gly Gly Glu Phe Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ser
115 120 125
Met Glu Asp Ser Lys Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ala Glu Glu Lys Lys
130 135 140
Ala Leu Lys Arg Thr Phe Gln Gln Ile Gln Glu Glu Glu Asp Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ser Tyr Ser Pro Gln Asp Pro Ser Ala Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Leu Glu Asn Ala Ala Ser
180 185 190
Gly Asp Ala Thr Val Arg Gln Lys Ile Ala Ser Leu Pro Gln Glu Val
195 200 205
Gln Asp Val Ser Leu Leu Glu Lys Ile Thr Asp Lys Glu Ala Ala Glu
210 215 220
Arg Leu Ser Lys Thr Val Asp Glu Ala Cys Leu Leu Leu Ala Glu Tyr
225 230 235 240
Asn Gly Arg Leu Ala Ala Glu Leu Glu Asp Arg Arg Gln Leu Ala Arg
245 250 255
Met Leu Val Glu Tyr Thr Gln Asn Gln Lys Glu Val Leu Ser Glu Lys
260 265 270
Glu Lys Lys Leu Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ala Arg Val Thr Gln
275 280 285
Val Arg Lys Glu Leu Lys Ser His Ile Gln Ser Leu Pro Asp Leu Ser
290 295 300
Leu Leu Pro Asn Val Thr Gly Gly Leu Ala Pro Leu Pro Ser Ala Gly
305 310 315 320
Asp Leu Phe Ser Thr Asp
325
<210>3
<211>981
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
atgtcctcct tctctgagtc ggcgctggag aagaagctct cggagctgag caactctcag 60
cagagcgtgc agaccctgtc cctttggctc atccaccacc gcaagcacgc gggacccatc 120
gtctccgtgt ggcaccgcga gctccgcaaa gccaaatcaa atagaaagct tacttttctg 180
tatttagcga atgatgtcat ccaaaacagt aaaaggaaag gacctgaatt cactagagaa 240
tttgaatctg tccttgtgga tgctttttct catgttgcca gagaggcaga tgaaggctgt 300
aaaaaacctt tagaaagatt gctgaacatc tggcaagaac gaagtgtgta tggcggcgag 360
ttcatacagc agctgaagct gtctatggag gactccaaga gccctccccc caaagcaaca 420
gaagagaaga aatctctgaa acgaactttt cagcaaattc aggaggagga ggatgacgac 480
taccctggca gctactctcc tcaggatcct tctgcaggac ccctcttgac tgaggaacta 540
atcaaagctt tgcaggatct ggaaaatgcc gcatcagggg atgctactgt ccgacagaaa 600
attgcttctc tgccccagga agtgcaagat gtttctctat tggaaaaaat aacagacaaa 660
gaggcagctg aacgtctttc aaaaacagta gatgaagcat gtctgttact agcagaatat 720
aacgggcgcc tggcagcaga actggaggac cgtcgccagc tggctcggat gttggtggag 780
tatacccaga atcagaaaga tgttttgtcg gagaaggaga aaaaactaga ggaatacaaa 840
cagaagcttg cacgagtaac ccaggtccgc aaggaactga aatcccatat tcagagcttg 900
ccagacctct cactgctgcc caacgtcaca gggggcttag cccccctgcc ctctgctggg 960
gacctgtttt caactgacta g 981
<210>4
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
Met Ser Ser Phe Ser Glu Ser Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ser Glu Leu
1 5 10 15
Ser Asn Ser Gln Gln Ser Val Gln Thr Leu Ser Leu Trp Leu Ile His
20 25 30
His Arg Lys His Ala Gly Pro Ile Val Ser Val Trp His Arg Glu Leu
35 40 45
Arg Lys Ala Lys Ser Asn Arg Lys Leu Thr Phe Leu Tyr Leu Ala Asn
50 55 60
Asp Val Ile Gln Asn Ser Lys Arg Lys Gly Pro Glu Phe Thr Arg Glu
65 70 75 80
Phe Glu Ser Val Leu Val Asp Ala Phe Ser His Val Ala Arg Glu Ala
85 90 95
Asp Glu Gly Cys Lys Lys Pro Leu Glu Arg Leu Leu Asn Ile Trp Gln
100 105 110
Glu Arg Ser Val Tyr Gly Gly Glu Phe Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ser
115 120 125
Met Glu Asp Ser Lys Ser Pro Pro Pro Lys Ala Ala Glu Glu Lys Lys
130 135 140
Ser Leu Lys Arg Thr Phe Gln Gln Ile Gln Glu Glu Glu Asp Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ser Tyr Ser Pro Gln Asp Pro Ser Ala Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Leu Glu Asn Ala Ala Ser
180 185 190
Gly Asp Ala Thr Val Arg Gln Lys Ile Ala Ser Leu Pro Gln Glu Val
195 200 205
Gln Asp Val Ser Leu Leu Glu Lys Ile Thr Asp Lys Glu Ala Ala Glu
210 215 220
Arg Leu Ser Lys Thr Val Asp Glu Ala Cys Leu Leu Leu Ala Glu Tyr
225 230 235 240
Asn Gly Arg Leu Ala Ala Glu Leu Glu Asp Arg Arg Gln Leu Ala Arg
245 250 255
Met Leu Val Glu Tyr Thr Gln Asn Gln Lys Glu Val Leu Ser Glu Lys
260 265 270
Glu Lys Lys Leu Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ala Arg Val Thr Gln
275 280 285
Val Arg Lys Glu Leu Lys Ser His Ile Gln Ser Leu Pro Asp Leu Ser
290 295 300
Leu Leu Pro Asn Val Thr Gly Gly Leu Ala Pro Leu Pro Ser Ala Gly
305 310 315 320
Asp Leu Phe Ser Thr Asp
325

Claims (10)

1.一种蛋白质，是将CREPT蛋白质第145位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述CREPT蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.4所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
5.下述A1)-A3)中的任一种生物材料：
A1)含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒；
A2)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体；
A3)含有权利要求3或4所述核酸分子的转基因细胞系。
6.权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述的生物材料或CREPT蛋白质第145位氨基酸作为靶点在下述B1)-B5)中的任一种：
B1)抑制肿瘤细胞的生长；
B2)抑制肿瘤细胞的增殖和/或迁移；
B3)下调Cyclin B1水平；
B4)调控细胞周期；
B5)开发或筛选治疗肿瘤的产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述Cyclin B1水平为Cyclin B1转录水平。
8.一种抑制肿瘤细胞的生长的方法，包括提高肿瘤细胞中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述提高肿瘤细胞中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在肿瘤细胞中过表达权利要求1中所述的蛋白质；
或，所述过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入肿瘤细胞；
或，所述权利要求1所述的蛋白质的编码基因是SEQ ID No.1所示的DNA分子。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为人结直肠腺癌细胞。
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