CN109423522B

CN109423522B - 猪cd4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用

Info

Publication number: CN109423522B
Application number: CN201710771839.9A
Authority: CN
Inventors: 赵书红; 李新云; 倪娟; 张�杰; 刘华珍; 朱猛进; 刘小磊; 马云龙; 余梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: CN109423522A

Abstract

本发明提供了猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用。具体地，本发明提供了CD4基因的4个功能突变位点，所述的4个突变位点影响CD4基因的表达水平、膜定位以及免疫水平。该分子标记的4个关键突变位点特征为在CDS区域第193(A/G)、195(G/C)、196(A/G)、202(C/G)位碱基处存在突变。本发明为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的分子标记。

Description

猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用。

背景技术

规模化养殖的优势在于可以降低养殖成本，使养殖走向标准化，食品安全更有保障。面对疫病挑战，养猪人往往会做出两种选择：大剂量使用抗生素和频繁接种各种疫苗。虽然抗生素能够杀死大部分有害菌，但是耐药性、药物残留等问题不容忽视。频繁接种疫苗不但增加养殖成本，而且容易对猪造成应激。因此，在饲养环节做好饲料质量把控、猪场及饲养人员消毒管理、疾病防疫等工作尤为重要。此外，还可以从根源上寻找途径，培育抗病新品系，减少疾病发生的机会，这从长远看不仅降低养殖成本，还可以改善猪肉食品环境。

机体的免疫系统能够抵抗细菌、病毒等抗原而使机体免于疾病伤害，免疫系统分为固有免疫(非特异性免疫)和适应性免疫(特异性免疫)，适应性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。CD₄ ⁺T细胞作为一类重要的免疫细胞，其在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用。

CD(Cluster of Differentiation)是位于淋巴细胞表面一类分化抗原的总称。CD4为表达于淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞表面的单链糖蛋白。CD4胞外区通过与MHCII类分子的结合来稳定TCR与抗原肽-MHCII类分子复合物；CD4的胞内区通过半胱氨酸基序招募Lck聚集于TCR中间形成大分子簇，使得TCR-CD3上的ITAM(ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif)得以被Lck磷酸化从而启动信号传导过程。

已有研究报道CD4基因的突变和免疫疾病、病毒感染相关。人CD4基因启动子区3个碱基的突变和I型糖尿病的发生有关；CD4基因增强子区域的2个碱基突变与类风湿性关节炎有关；CD4分子作为HIV-I的主要受体，研究发现CD4D1区的突变可以改变其与HIV-I的亲和力；猕猴CD4基因上第39位的氨基酸突变可能与其对HIV病毒具有抵抗力有密切关系。

基于CD4基因在免疫调节中的重要性，其可以作为猪抗病育种的候选基因，但是目前对于猪CD4基因的功能突变研究仍未见报道。因此，本领域迫切需要对猪CD4基因的功能突变研究

发明内容

本发明的目的在于提供猪CD4基因4个功能突变位点的鉴定及应用。

具体地，申请人通过GWAS(Genome Wide Association Study)的方法，对杜洛克×二花脸F2群体的T细胞亚群(CD₄ ⁺T％)和60K基因芯片(Illumina,USA)进行了分析，分析发现CD4基因位于该性状的候选区域内，具体结果见附图2。

申请人通过基因克隆的方法，利用如下引物对：

正向引物：CTCGGCAAAACCACAATG(见序列表SEQ ID NO:3)

反向引物：GGAAAAGGGAAAGAGGAAGAAAG(见序列表SEQ ID NO:4)；

对杜洛克×二花脸F2群体的cDNA进行CD4基因的PCR扩增，测序分析得到两种单倍型，单倍型的序列见序列表SEQ ID NO:1(单倍型A)和SEQ ID NO:11(单倍型B)。申请人再在得到的两种单倍型序列基础上，利用突变引物对进行扩增，扩增得到D1区部分位点突变的序列，将扩增得到的片段连接重组后插入超表达载体pEGFP-n1中。

通过两单倍型个体间的CD4表达分析，以及构建的突变载体体外超表达实验发现猪CD4基因的突变会影响CD4基因的表达以及膜定位，并且其中的4个突变位点为关键的突变位点，具体结果图见附图3、4、5。

申请人通过上述发现的4个连锁突变位点重新对T细胞亚型和60K芯片进行分析，发现CD4基因是该性状的候选基因，具体结果见附图8。

与现有发现相比本发现具有以下有益的效果：

本发明通过体内外实验，将影响CD4表达的多态位点范围缩小到了D1区并且比较明确在哪几个关键突变位点，这可以为CD4抗体的制备、HIV-I病毒感染研究提供思路。

在本发明的第一方面，提供了一种CD4膜蛋白的单核苷酸多态性位点或其检测试剂的用途，用于制备确定CD4膜蛋白表达水平的试剂或试剂盒，其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点包括选自以下A组的一种或多种SNP：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:1。

在另一优选例中，所述的SNP包括选自A组的至少2个SNP；较佳地至少3个SNP，最佳地4个SNP。

在另一优选例中，所述的表达水平指CD4膜蛋白在细胞膜上的表达水平。

在另一优选例中，所述的CD4膜蛋白为人或非人哺乳动物的CD4膜蛋白。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猪。

在另一优选例中，所述的猪选自下组：

杜洛克、二花脸、或其杂交品种。

在另一优选例中，所述的猪为杜洛克×二花脸杂交F2群体。

在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)用于扩增含一种或多种所述SNP位点的扩增产物的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:3和4所示的序列。

在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测选自以下A组的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)位点的检测试剂：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:1。

(b)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片；

在另一优选例中，所述的试剂盒用于确定CD4膜蛋白表达水平。

在本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品是否存在单核苷酸变异的方法，包括步骤：

(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在选自以下A组的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)位点：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:1。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为80-2000bp，且含有选自A组的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)位点。

在另一优选例中，所述检测为非诊断性的。

在本发明的第四方面，提供了一种检测待测对象CD4基因单倍型的方法，包括步骤：

(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.:1。

在另一优选例中，当第193位A、第195位G、第196位A、和/或第202位C时，所述的待测对象CD4基因为A单倍型，且CD4膜蛋白表达下调，细胞膜定位不完整。

在另一优选例中，当第193位G、第195位C、第196位G、和/或第202位G时，所述的待测对象CD4基因为B单倍型，且CD4膜蛋白表达上调，细胞膜定位完整。

在另一优选例中，所述的待测对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法为体外非诊断性方法。

在本发明的第五方面，提供了一种分离的编码CD4膜蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，并且具有以下核苷酸突变：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；和

第202位C→G。

在本发明的第六方面，提供了一种突变的CD4膜蛋白，所述的CD4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，并且具有以下氨基酸突变：

第65位Arg→Gly；

第66位Ser→Gly；和

第68位Arg→Gly。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的总体技术路线。

图2显示了体内验证CD4基因突变对CD4表达水平的影响。其中，图2a显示了在转录水平分析CD4基因突变对不同转录本转录水平的影响(A单倍型，n＝6,B单倍型，n＝6)，CD4fl为全长转录本，CD4Δ4为第4外显子缺失的转录本，CD4Δ8为第8外显子缺失的转录本；图2b显示了在蛋白水平分析CD4基因突变对蛋白表达水平的影响(A单倍型，n＝5,B单倍型，n＝5)。

图3显示了GWAS分析及候选区域定位。其中，图3a和图3b分别显示了20天和33天T细胞亚型的曼哈顿图，红色点表示p<0.05/43481，绿色点表示p<1/43481，ALGA0120187为最显著SNP；图3c显示了最显著峰±1Mb区域内的基因，红点表示p<1.15×10-6(0.05/43481)。

图4显示了CD4基因4个连锁突变位点的GWAS重分析结果图。其中，图4a和图4b分别显示了20天和33天T细胞亚型的曼哈顿图，绿色点表示p<0.05，红色点表示p<0.01，CD4基因的4个功能突变位点作为随机效应，ALGA0120187为最显著SNP；图4c和图4d分别显示了20天和33天T细胞亚型的曼哈顿图，CD4基因的4个功能突变位点作为固定效应。

图5显示了本发明体外验证CD4基因突变对CD4表达水平的影响实验结果图。图5a显示了免疫荧光分析CD4基因突变对CD4膜蛋白定位的影响，绿色荧光为荧光检测的CD4-GFP融合蛋白，红色荧光为CD4抗体检测的CD4-GFP融合蛋白；图5b显示了在蛋白水平分析CD4基因突变对蛋白表达水平的影响。

图6显示了鉴定影响CD4基因表达、膜定位的关键突变位点实验结果图。其中，图6a显示了突变载体模式图，红框和蓝框代表SNP突变位点，图6b显示了免疫荧光分析CD4基因突变对CD4膜蛋白定位的影响，绿色荧光为荧光检测的CD4-GFP融合蛋白；图6c显示了在蛋白水平分析CD4基因突变对蛋白表达水平的影响。

图7显示了鉴定影响CD4基因表达、膜定位的关键突变位点实验结果图。其中，图7a显示了突变载体模式图，红框和蓝框代表SNP突变位点，图7b显示了免疫荧光分析CD4基因突变对CD4膜蛋白定位的影响，绿色荧光为荧光检测的CD4-GFP融合蛋白；图7c显示了在蛋白水平分析CD4基因突变对蛋白表达水平的影响。

图8显示了鉴定影响CD4基因表达、膜定位的关键突变位点实验结果图。其中，图8a显示了突变载体模式图，红框和蓝框代表SNP突变位点，图8b显示了免疫荧光分析CD4基因突变对CD4膜蛋白定位的影响，绿色荧光为荧光检测的CD4-GFP融合蛋白。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现猪的CD4基因存在多处核苷酸多态，并且在杜洛克×二花脸F2群体中形成两种单倍型，这两种单倍型的CD4表达是存在差异的。进一步的体外超表达实验鉴定了其中的4个位于D1区的功能突变位点，这4个功能突变位点影响CD4的表达水平与膜定位，我们预测这些突变位点影响了重要结构域的形成，而这个结构域能够和MHCII分子相互作用，并且这个结构域存在gp120的结合位点。

如本文所用，术语“单核苷酸多态性位点”、“SNP位点”、“功能突变位点”和“单核苷酸变异”可互换使用，是指在基因组水平上引起的DNA序列多态性的单个核苷酸的变异。

本发明的功能突变位点可以用于确定CD4基因的表达水平、膜定位以及CD₃ ⁺CD₄ ⁺CD₈ ^-T细胞比率(简称为CD₄ ⁺T％)。

本发明的功能突变位点还可用于以下用途：

针对本发明的4个功能突变位点所在的氨基酸序列进行抗体制备；

针对本发明的4个功能突变位点所在的氨基酸序列进行的CD4结构的研究；

针对本发明的4个功能突变位点所在的氨基酸序列进行的与MHC-II分子结合能力的研究；

针对本发明的4个功能突变位点所在的氨基酸序列在育种中的应用；

针对本发明的4个功能突变位点所在的氨基酸序列进行HIV等病毒亲和力的研究。

单倍型是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合；通俗的说法就是若干个决定同一性状的紧密连锁的基因构成的基因型。按照某一指定基因座上基因重组发生的数量，单倍型甚至可以指至少两个基因座或整个染色体。

申请人发现，猪CD4基因可分为两种单倍型，单倍型A(SEQ ID NO:1)和单倍型B(SEQ ID NO:11)，当CD4基因CDS区域第193(A/G)、195(G/C)、196(A/G)、202(C/G)位碱基从单倍型A往单倍型B发生突变时(AGAC突变为GCGG)，CD4膜蛋白的表达将恢复，当单倍型B往单倍型A突变时，CD4膜蛋白的表达将受阻。

猪CD4基因两种单倍型的核心区别序列(第193-204位)如下所示

AGGAGTCACCGC(单倍型A)→GGCGGTCACGGC(单倍型B)

核心序列的翻译情况如下

本发明涉及的序列表信息如下：

序列表SEQ ID NO：1是本发明鉴定的单倍型A的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明鉴定的单倍型A的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明鉴定单倍型的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：4是本发明鉴定单倍型的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明构建突变载体2a+2a、2b+2b的正向引物1序列。

序列表SEQ ID NO：6是本发明构建突变载体2a+2a的反向引物1序列。

序列表SEQ ID NO：7是本发明构建突变载体2a+2a的正向引物2序列。

序列表SEQ ID NO：8是本发明构建突变载体2a+2a、2b+2b的反向引物2序列。

序列表SEQ ID NO：9是本发明构建突变载体2b+2b的反向引物1序列。

序列表SEQ ID NO：10是本发明构建突变载体2b+2b的正向引物2序列。

序列表SEQ ID NO：11是本发明鉴定的单倍型B核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：12是本发明鉴定的单倍型B氨基酸酸序列。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明的4个功能突变位点不仅会影响CD4不同转录本的转录水平，还会影响CD4蛋白表达；

(b)本发明的4个功能突变位点影响CD4蛋白的膜定位；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

猪60K基因芯片与T细胞亚型的全基因组关联分析(GWAS)

杜洛克×二花脸F2群体的60K基因芯片(Illumina,USA)，运用混合模型分析每个SNP与T细胞亚型的关系，模型可表示为Y＝Xb+Sα+Zμ+e，其中Y为表型向量，b为固定效应性别、批次的估计值，μ为基因的加性效应(μ-N(0,Gσ_α ²)，G为基因组相似矩阵，σ_α ²为多基因加性方差)，X和Z为b和μ的关联矩阵，S为α的关联向量，e为残差矩阵(呈N(0,Iσ_e ²)分布，其中I为单位矩阵，σ_e ²为剩余方差)。具体分析运用R中的软件包，参考Aulchenko等研究(Aulchenko et al.,2007a,b)，基因组水平显著和建议显著的阈值经Bonferroni矫正后设定。结果如图3所示，CD4位于最显著峰的±1Mb区域内。对4个完全连锁突变位点GWAS重分析时，分别以其中一个SNP为代表加入模型中进行分析以及把该SNP作为一个cofactor拟合到模型中进行分析。结果如图4所示。

实施例2

猪CD4基因两种单倍型的确定

实验方法如下：

(1)利用TRIZOL裂解法提取杜洛克×二花脸F2群体的白细胞总RNA

1)将加有1mlTRIZOL的白细胞裂解液从-80℃取出，冰上溶解，剧烈振荡裂解细胞；

2)加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温静置2-3min，RNA溶于上清水样层，DNA和蛋白质溶于下面的有机层；

3)将离心管置于冷冻离心机，12000rpm转速、4℃离心15min，小心吸取水样层移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置15min以沉淀总RNA；

4)将离心管置于冷冻离心机，12000rpm转速、4℃离心15min，弃上清，可观察到总RNA沉淀在管底；

5)加入1ml预冷的75％乙醇，7500rpm转速、4℃离心8min，弃上清以洗涤RNA沉淀；

6)加入1ml预冷的无水乙醇，7500rpm转速、4℃离心8min，弃上清，室温干燥10min以挥发无水乙醇；

7)用10-20μL DEPC水溶解总RNA，取出1μL测定总RNA浓度，余下RNA样品置于-80℃保存备用。

(2)白细胞总RNA反转录

1)在进行RNA反转录之前，用gDNA Eraser处理总RNA，弃去残余的基因组DNA。反应体系如下：

2)42℃温育2min，取出及时放冰上，得到的RNA作为反转录模板；

3)反转录，依次在上述所得RNA反转录模板中加入如下试剂：

4)37℃温育15min，85℃温育5s以灭活RNA反转录酶。反转录得到的cDNA5倍稀释后-20℃保存备用。

(3)单克隆测序

1)PCR扩增回收

以杜洛克×二花脸F2群体的白细胞cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增PCR产物凝胶回收，凝胶回收所用试剂盒为Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0。具体步骤如下：

①紫外仪下按DNA Marker指示的条带大小切下目的条带胶条放于1.5ml离心管中；

②称取回收胶的质量，以1g回收胶加1ml Buffer GM，37℃溶解回收胶，期间摇晃离心管，促进胶溶解；

③将Spin Column放于2ml collection tube中；

④取700μL溶解后的溶液加入到Spin Column中，12000rpm转速室温离心1min，弃去collection tube中的收集液，直到将全部溶液都过柱；

⑤往Spin Column加入700μL Buffer WB，12000rpm转速室温离心30s，弃去collection tube中的收集液，重复2次；

⑥将Spin Column放入collection tube中，12000rpm转速室温离心1min；

⑦将Spin Column放入新的1.5ml离心管中，室温放置1-2min，使酒精散发后往Spin Column中间加入30μL Elution buffer(可将Elution buffer加热至60℃后使用以提高洗脱效率)，室温放置1min，12000rpm转速室温离心1min；

⑧回收产物4℃暂时保存备用。

2)挑单克隆及单倍型确定

①连接，体系如下：

Solution I 5μL

PCR回收产物 4μL

pMD-19T 1μL

16℃连接2小时；

②转化：以10:1的比例混合E.coli DH5α与连接产物，冰浴30min，42℃热激45s，取出后迅速冰浴2min，加入约500μL SOC medium，37℃摇床培养复苏1h，取适量(约50μL)涂布于Amp抗性固体LB培养基，37℃培养箱倒置培养过夜。

3)挑单克隆扩大培养及阳性鉴定：用灭菌枪头挑取单克隆菌落置于Amp抗性液体LB培养基，37℃摇床培养4-5h。之后进行菌液PCR鉴定阳性菌液，阳性菌液送公司测序。

实验结果如下：

所鉴定的单倍型情况如表1

表1两种单倍型鉴定结果

注：CDS Position表示突变碱基在CDS上的位置

实施例3

突变载体构建及关键突变位点鉴定

实验方法如下：

(1)突变载体构建

以单倍型A和单倍型B超表达载体为模板，设计突变载体引物，引物序列如SEQ IDNO：5-8，将扩增得到的包含A型的SNPs区域与包含B型的SNPs区域进行重组连接，具体步骤如下：

1)PCR扩增回收。以构建好的单倍型A和单倍型B载体为模板，以SEQ ID NO：5-8引物对进行PCR扩增，扩增体系如下(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，反应程序如下：

PCR产物凝胶回收，回收产物电泳检测。

2)重组连接。回收后的产物进行重组连接，连接体系如下(25μL)(其中产物1和产物2分别为切胶回收产物)：

混匀离心后进行重组连接，反应程序如下：

重组连接后凝胶电泳检测连接效果。

3)PCR扩增回收。以重组连接后的产物为模板，以SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：8引物对进行PCR扩增，扩增体系如下(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，反应程序如下：

PCR产物凝胶电泳回收，回收产物电泳检测。

4)回收产物加A。回收产物加A，体系如下(10μL)：

混匀离心后72℃温育20min，取出及时放冰上1-2min，用于后续连T载体以及目的载体构建。

(2)细胞培养及转染

1)细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中轻轻摇晃迅速解冻，以1000rpm转速离心3-5min，用75％酒精擦拭细胞冻存管，超净台中打开盖子，弃去上层冻存液，留细胞沉淀，加入1ml完全培养基，轻轻吹打使细胞悬浮。将悬浮细胞移入细胞培养皿中，补足培养基至合适体积，放入37℃、饱和湿度、5％CO2细胞培养箱中培养生长，实时观察。

2)细胞传代：待细胞贴壁生长至70％-80％融合度，弃去培养基，用DPBS清洗1-2遍，加入适量的0.25％Trypsin-EDTA(1×)摇匀后放入细胞培养箱消化5-6分钟，待细胞回缩分离后以1:1的比例加入完全培养基终止消化，轻轻吹打混匀成细胞悬液，以1:3-1:4的比例传入新的培养皿中，加入适量的培养液继续培养。

3)细胞冻存：用细胞传代的步骤将细胞制成细胞悬液，分装到细胞冻存管中，以1000rpm转速离心3-5min，弃去培养基，加入冻存液轻轻吹打悬浮细胞。将冻存管中的细胞用脱脂棉包好后放入-80℃超低温冰箱中过夜，隔天转入细胞罐中长期保存。

4)细胞转染：转染前一天，将细胞接种到相应的细胞培养板中。用于半定量检测抽提RNA的细胞接至12孔板中，用于共聚焦显微镜观察的细胞接于24孔板中，用于总蛋白抽提的细胞接于6孔板中。当长至合适密度的时候弃培养基，用DPBS清洗细胞2次后加入Opti-MEM(Gibco)放回细胞培养箱备用。转染体系参照Lipofectamine^TM2000产品说明书，将Opti-MEM分别与质粒和LipofectamineTM2000混合，静置5min，将脂质体混合物与质粒混合物轻轻混匀，静置20min后加入到已经换成Opti-MEM的细胞培养板中。转染5-6小时后换成完全培养基继续培养。

(3)细胞爬片与共聚焦照相

1)24孔细胞板每孔加入1μL细胞培养基或DPBS，将灭菌后的圆形玻片置于液滴上，通过表面张力将玻片吸附于培养板上。

2)胰酶消化细胞后重悬细胞，以适量密度接种于细胞培养板上，经过16-24h细胞长至合适密度进行转染。

3)用构建好的载体转染细胞，每种质粒转染3个孔，转染24h、48h后分别用DPBS清洗细胞2次，以200μL/孔的量加入4％多聚甲醛室温固定15min。

4)弃去4％多聚甲醛，用DPBS清洗细胞2次，以200μL/孔的量加入0.3％TritonX-100室温透膜10min。如果转染的是pEGFP系列载体，则不需要透膜这一步。

5)用DPBS清洗细胞2次，以200μL/孔的量加入封闭液室温封闭2h。

6)弃去封闭液，用DPBS清洗细胞2次，以1:100的比例稀释CD4流式抗体(克隆号74-12-4)，然后以200μL/孔的量加入稀释后的抗体，4℃避光孵育过夜。

7)弃去一抗，用DPBS清洗细胞2次，以1:1000的比例稀释1mg/ml的DAPI，然后以200μL/孔的量加入稀释后的DAPI，室温避光染色10min。

8)弃去DAPI，用DPBS清洗细胞2次。

9)在准备好的玻璃片上滴加一小滴防荧光淬灭剂，用小镊子将备用细胞玻片取出反扣于载玻片上，在圆形玻片四周用指甲油封片。

10)将做好的玻片放于湿盒，共聚焦显微镜照相。

(4)总蛋白提取及western blot检测

1)总蛋白提取

用于抽提总蛋白的细胞，培养在6孔板中。总蛋白抽提前，先用DPBS清洗贴壁细胞，然后每孔加1mlDPBS，用细胞刮刮下细胞，收集于1.5ml离心管中，以1000rpm转速、室温离心5min。将细胞沉淀用100-150μL含1％PMSF和1％Na3VO4的RIPA裂解液悬浮，冰上裂解细胞30min，之后以12000rpm转速、4℃离心10min。上清液即为总蛋白溶液，取上清液转移至新的1.5ml离心管中，取出一部分样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，剩余部分保存于-80℃。

2)BCA蛋白浓度测定

a)配制蛋白标准溶液

取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，存于-20℃备用。将适量25mg/ml的蛋白标准溶液稀释到终浓度2.5mg/ml。

b)BCA工作液的配制

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

c)蛋白浓度测定

将标准品按0、2、4、6、8、10、12、20μL加入1.5ml离心管中，加PBS补足至20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.25、0.50、0.75、1、1.25、1.5、2.5mg/ml。加适当体积待测样品于1.5ml离心管中，如果样品不足20μL，加PBS补足至20μL，并注意记录样品体积。各离心管加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30min。如果蛋白浓度低，可适当提升孵育温度，或适当延长孵育时间。

d)用蛋白浓度测定仪测定A562的吸光度。

e)根据标准曲线和使用样品的体积计算样品的蛋白浓度。

3)蛋白变性

Western blot上样前，将5×loading buffer和20×DTT以1:4的比例和蛋白溶液混合均匀，于100℃变性5-10min，分装后-20℃保存，避免反复冻融。

4)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

制胶、电泳、转膜等步骤都使用Bio-Rad公司设备。根据目的蛋白大小，选择12％浓度的分离胶和5％浓度的浓缩胶。制胶过程按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶试剂盒说明书进行。

12％分离胶配方(15ml)：

分离胶注胶完成后立即用无水乙醇封胶。待分离胶凝固后吸干无水乙醇，双蒸水清洗两遍后用滤纸吸干，配制浓缩胶。

5％浓缩胶配方(6ml)：

从-20℃取出变性后的蛋白样品，冰上溶化后以每孔80μg的量上样用于检测融合表达蛋白，并在两侧胶孔中加入蛋白分子量标准。点样完毕后，先以80V恒压电泳约30min，样品进入分离胶部分后，调高电压至100V，直至染料跑至分离胶底部停止电泳。

切胶转膜，使用PVDF膜，孔径大小为0.2μm。根据蛋白分子量标准所示的蛋白大小切下条带，同时裁剪同样大小的PVDF膜，在左上角做点样顺序及样品标记。在甲醛中活化至膜透明，以转膜仪正极-湿润滤纸-膜-胶-湿润滤纸-转膜仪负极的顺序将胶和膜固定好，赶走滤纸和胶膜间的气泡，以250mA的电流恒流转膜42min。转膜完成后，根据PVDF膜上蛋白分子量标准的转移情况判断蛋白是否转移至膜上。也可以用马考斯亮蓝染色鉴定蛋白是否转膜成功。

杂交，杂交过程包括如下几步：封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜。在摇床上用封闭液室温封闭2h，将GFP一抗用封闭液按1:3000的比例稀释，β-actin用抗体稀释液按1:5000的比例稀释。4℃孵育过夜。注意蛋白面朝上，夹取时只接触膜边缘。一抗孵育完毕后，回收一抗-20℃保存，用TBST洗膜，每次10-15min，共洗三次。将二抗按1：1000的比例稀释，蛋白面朝上，在摇床上室温孵育1h。1h后用TBST洗膜，每次10-15min，共洗三次。

显影，使用Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP substrate试剂盒对PVDF膜进行显影。

体内实验结果表明，CD4基因的突变不仅会影响CD4不同转录本的转录水平，还会影响CD4蛋白表达，具体结果见图2；突变载体膜定位及蛋白检测发现，当CD4基因CDS区域第193(A/G)、195(G/C)、196(A/G)、202(C/G)位碱基从单倍型A往单倍型B发生突变时(AGAC突变为GCGG)，CD4膜蛋白的表达将恢复，当单倍型B往单倍型A突变时，CD4膜蛋白的表达将受阻，具体结果见图6、7、8。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用

<130> P2017-1505

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

atggacccag gaacctctct gaggcacctg ttcctggtgc tgcaactggc gatgctccca 60

gctgcatcgg gcactcagga aaaatatctg gtgctgggta aggcaggaga tctcgcagag 120

ctgccatgcc actcttccca gaagaagaac ctacctttca gttggaaaaa ttctgaccag 180

atcaagattc tgaggagtca ccgcaacttg tggcacaaag cctcagttac cgagttgagc 240

tctcgcctcg attcgaaaaa aaacatgtgg gaccatggat cctttcccct gatcatcaag 300

aatcttgaag taaccgactc cgggatttac atctgcgaag tggaagacaa gaggatagag 360

gtgcaattgc tggtgttcag actgactgcc agtgtcaccc gcgtgctgct ggggcagagc 420

ctgaccctga cgctggaggg cccctctggg agtcacccta cagtgcaatg gaaaggtcca 480

gggaataaaa gcaagaatga cgtcaagagc ctgttgctgc cccaggtggg gttggaggac 540

agtggcctct ggacttgcac tgtctcccag gaccagaaga cactggtgtt caggagtaac 600

atcttcgtgc tggccttcca gaaggttcct agcacagtct atgtgaagga aggggaccag 660

gtggtgctct ccttcccact caccttcgaa gccgagagcc tgagcgggga gctgatgtgg 720

cggcagacga agggggcttc ctccccccag tcctggatca ccttctccct gaaggacagg 780

aaggtgactg tgcaaaagtc tctccagaac ctcaagctcc ggatggcgga gaagctcccg 840

ctccagatca ctctgctcca ggccttgcct cagtacgcgg gttctggaaa cctgaccttg 900

gttctccctg aggggaggct gcacagggaa gtgaacctcg tggtgatgag agcgactcag 960

tctaagaacg aagtgacctg tgaggttctg ggacccaccc ccccgaaggt ggtgctgagc 1020

ttgaagctgg ggaaccagag tatgaaagtc tcagatcagc agaagctggt gacggtgctg 1080

gaccctgagg cagggatgtg gcggtgtcta ctgagggaca aagacaaagt cctgctggaa 1140

tcccaggtcg aggttctgcc cacagcattc acgcgggcct ggccgaagct cctggccttt 1200

gtgatagggg ggatcatagg ccttctgttt ctcgctgggt tctgcatcgt ctgtgttaaa 1260

tgttggcacc gcaggcgccg ggcggagcgg atgtctcaga tcaagagact ccttagtgag 1320

aagaagacct gccaatgcgc ccaccggcaa cagaagaact attccctcac ctga 1374

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 2

Met Asp Pro Gly Thr Ser Leu Arg His Leu Phe Leu Val Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ala Met Leu Pro Ala Ala Ser Gly Thr Gln Glu Lys Tyr Leu Val Leu

20 25 30

Gly Lys Ala Gly Asp Leu Ala Glu Leu Pro Cys His Ser Ser Gln Lys

35 40 45

Lys Asn Leu Pro Phe Ser Trp Lys Asn Ser Asp Gln Ile Lys Ile Leu

50 55 60

Arg Ser His Arg Asn Leu Trp His Lys Ala Ser Val Thr Glu Leu Ser

65 70 75 80

Ser Arg Leu Asp Ser Lys Lys Asn Met Trp Asp His Gly Ser Phe Pro

85 90 95

Leu Ile Ile Lys Asn Leu Glu Val Thr Asp Ser Gly Ile Tyr Ile Cys

100 105 110

Glu Val Glu Asp Lys Arg Ile Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Arg Leu

115 120 125

Thr Ala Ser Val Thr Arg Val Leu Leu Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr

130 135 140

Leu Glu Gly Pro Ser Gly Ser His Pro Thr Val Gln Trp Lys Gly Pro

145 150 155 160

Gly Asn Lys Ser Lys Asn Asp Val Lys Ser Leu Leu Leu Pro Gln Val

165 170 175

Gly Leu Glu Asp Ser Gly Leu Trp Thr Cys Thr Val Ser Gln Asp Gln

180 185 190

Lys Thr Leu Val Phe Arg Ser Asn Ile Phe Val Leu Ala Phe Gln Lys

195 200 205

Val Pro Ser Thr Val Tyr Val Lys Glu Gly Asp Gln Val Val Leu Ser

210 215 220

Phe Pro Leu Thr Phe Glu Ala Glu Ser Leu Ser Gly Glu Leu Met Trp

225 230 235 240

Arg Gln Thr Lys Gly Ala Ser Ser Pro Gln Ser Trp Ile Thr Phe Ser

245 250 255

Leu Lys Asp Arg Lys Val Thr Val Gln Lys Ser Leu Gln Asn Leu Lys

260 265 270

Leu Arg Met Ala Glu Lys Leu Pro Leu Gln Ile Thr Leu Leu Gln Ala

275 280 285

Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Pro Glu

290 295 300

Gly Arg Leu His Arg Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln

305 310 315 320

Ser Lys Asn Glu Val Thr Cys Glu Val Leu Gly Pro Thr Pro Pro Lys

325 330 335

Val Val Leu Ser Leu Lys Leu Gly Asn Gln Ser Met Lys Val Ser Asp

340 345 350

Gln Gln Lys Leu Val Thr Val Leu Asp Pro Glu Ala Gly Met Trp Arg

355 360 365

Cys Leu Leu Arg Asp Lys Asp Lys Val Leu Leu Glu Ser Gln Val Glu

370 375 380

Val Leu Pro Thr Ala Phe Thr Arg Ala Trp Pro Lys Leu Leu Ala Phe

385 390 395 400

Val Ile Gly Gly Ile Ile Gly Leu Leu Phe Leu Ala Gly Phe Cys Ile

405 410 415

Val Cys Val Lys Cys Trp His Arg Arg Arg Arg Ala Glu Arg Met Ser

420 425 430

Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Ala His

435 440 445

Arg Gln Gln Lys Asn Tyr Ser Leu Thr

450 455

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcggcaaaa ccacaatg 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaaaggga aagaggaaga aag 23

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagc aatggaccca ggaacctctc t 31

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agttgccatg accgcccaga atc 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gattctgggc ggtcatggca act 23

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaactgcag ggtgagggaa tagttcttct gttg 34

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtgccagaa gctgcggtga ctcctcagaa tcttg 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caagattctg aggagtcacc gcagcttctg gcaca 35

<210> 11

<211> 1374

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 11

atggacccag gaacctctct gaggcacctg ttcctggtgc tgcaactggc gatgctccca 60

gctgcatcgg gcactcagga aaaatatctg gtgctgggta aggcaggaga tctcgcagag 120

ctgccgtgcc actcttccca gaagaagaac ctacctttca attggaaaaa ttctaaccag 180

accaagattc tgggcggtca tggcagcttc tggcacacag cctcagttac cgagttgacc 240

tctcgcctcg attcgaaaaa aaacatgtgg gaccatggat cctttcccct gatcatcaag 300

aatcttgaag taaccgactc cgggatttac atctgcgaag tggaagacaa gaggatagag 360

gtgcaattgc tggtgttcag actgactgcc agtgtcaccc gcgtgctgct ggggcagagc 420

ctgaccctga cgctggaggg cccctctggg agtcacccta cagtgcaatg gaaaggtcca 480

gggaataaaa gcaagaatga cgtcaagagc ctgttgctgc cccaggtggg gttggaggac 540

agtggcctct ggacttgcac tgtctcccag gaccagaaga cactggtgtt caggagtaac 600

atcttcgtgc tggccttcca gaaggttcct agcacagtct atgtgaagga aggggaccag 660

gtggtgctct ccttcccact caccttcgaa gccgagagcc tgagcgggga gctgatgtgg 720

cggcagacga agggggcttc ctccccccag tcctggatca ccttctccct gaaggacagg 780

aaggtgactg tgcaaaagtc tctccagaac ctcaagctcc ggatggcgga gaagctcccg 840

ctccagatca ctctgctcca ggccttgctt cagtacgcgg gttctggaaa cctgaccttg 900

gttctccccg aggggaggct gcacagggaa gtgaacctcg tggtgatgag agcgactcag 960

tctaagaacg aagtgacctg tgaggtgctg ggacccaccc ccccgaaggt ggtgctgagc 1020

ttgaagctgg ggaaccagag tatcaaagtc tcagatcagc ggaagctggt gacggtgctg 1080

gaccctgagg cagggatgtg gcggtgtcta ctgagggaca aagacaaagt cctgctggaa 1140

tcccaggtcg aggttctgcc cacagcattc acgcgggcct ggccagagct cctggcctct 1200

gtgatagggg ggatcatagg ccttctgttt ctcgctgggt tctgcatcgt ctgtgttaaa 1260

tgctggcacc gcaggcgccg ggcggagcgg atgtctcaga tcaagagact ccttagtgag 1320

aagaagacct gccaatgcgc ccaccggcaa cagaagaact attccctcac ctga 1374

<210> 12

<211> 457

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 12

Met Asp Pro Gly Thr Ser Leu Arg His Leu Phe Leu Val Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ala Met Leu Pro Ala Ala Ser Gly Thr Gln Glu Lys Tyr Leu Val Leu

20 25 30

Gly Lys Ala Gly Asp Leu Ala Glu Leu Pro Cys His Ser Ser Gln Lys

35 40 45

Lys Asn Leu Pro Phe Asn Trp Lys Asn Ser Asn Gln Thr Lys Ile Leu

50 55 60

Gly Gly His Gly Ser Phe Trp His Thr Ala Ser Val Thr Glu Leu Thr

65 70 75 80

Ser Arg Leu Asp Ser Lys Lys Asn Met Trp Asp His Gly Ser Phe Pro

85 90 95

Leu Ile Ile Lys Asn Leu Glu Val Thr Asp Ser Gly Ile Tyr Ile Cys

100 105 110

Glu Val Glu Asp Lys Arg Ile Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Arg Leu

115 120 125

Thr Ala Ser Val Thr Arg Val Leu Leu Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr

130 135 140

Leu Glu Gly Pro Ser Gly Ser His Pro Thr Val Gln Trp Lys Gly Pro

145 150 155 160

Gly Asn Lys Ser Lys Asn Asp Val Lys Ser Leu Leu Leu Pro Gln Val

165 170 175

Gly Leu Glu Asp Ser Gly Leu Trp Thr Cys Thr Val Ser Gln Asp Gln

180 185 190

Lys Thr Leu Val Phe Arg Ser Asn Ile Phe Val Leu Ala Phe Gln Lys

195 200 205

Val Pro Ser Thr Val Tyr Val Lys Glu Gly Asp Gln Val Val Leu Ser

210 215 220

Phe Pro Leu Thr Phe Glu Ala Glu Ser Leu Ser Gly Glu Leu Met Trp

225 230 235 240

Arg Gln Thr Lys Gly Ala Ser Ser Pro Gln Ser Trp Ile Thr Phe Ser

245 250 255

Leu Lys Asp Arg Lys Val Thr Val Gln Lys Ser Leu Gln Asn Leu Lys

260 265 270

Leu Arg Met Ala Glu Lys Leu Pro Leu Gln Ile Thr Leu Leu Gln Ala

275 280 285

Leu Leu Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Pro Glu

290 295 300

Gly Arg Leu His Arg Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln

305 310 315 320

Ser Lys Asn Glu Val Thr Cys Glu Val Leu Gly Pro Thr Pro Pro Lys

325 330 335

Val Val Leu Ser Leu Lys Leu Gly Asn Gln Ser Ile Lys Val Ser Asp

340 345 350

Gln Arg Lys Leu Val Thr Val Leu Asp Pro Glu Ala Gly Met Trp Arg

355 360 365

Cys Leu Leu Arg Asp Lys Asp Lys Val Leu Leu Glu Ser Gln Val Glu

370 375 380

Val Leu Pro Thr Ala Phe Thr Arg Ala Trp Pro Glu Leu Leu Ala Ser

385 390 395 400

Val Ile Gly Gly Ile Ile Gly Leu Leu Phe Leu Ala Gly Phe Cys Ile

405 410 415

Val Cys Val Lys Cys Trp His Arg Arg Arg Arg Ala Glu Arg Met Ser

420 425 430

Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Ala His

435 440 445

Arg Gln Gln Lys Asn Tyr Ser Leu Thr

450 455

Claims

1.一种猪CD4膜蛋白的单核苷酸多态性位点或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备确定猪CD4膜蛋白表达水平的试剂或试剂盒，其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点包括以下SNP：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；和

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO: 1。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的表达水平指CD4膜蛋白在细胞膜上的表达水平。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针、或芯片。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a) 用于扩增含一种或多种所述SNP位点的扩增产物的特异性引物；

(b) 用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c) 用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片。

5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特异性引物为SEQ ID NO:3和4所示的序列。

6. 一种非诊断性的检测待测对象CD4基因单倍型的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性(SNP)位点：

第193位A→G；

第195位G→C；

第196位A→G；和

第202位C→G；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO: 1，并且所述待测对象为猪，

当第193位A、第195位G、第196位A、和第202位C时，所述的待测对象CD4基因为A单倍型，且CD4膜蛋白表达下调，细胞膜定位不完整，

当第193位G、第195位C、第196位G、和第202位G时，所述的待测对象CD4基因为B单倍型，且CD4膜蛋白表达上调，细胞膜定位完整。