CN116490217A - 新型PiggyBac转座子系统及其用途 - Google Patents
新型PiggyBac转座子系统及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116490217A CN116490217A CN202180069727.3A CN202180069727A CN116490217A CN 116490217 A CN116490217 A CN 116490217A CN 202180069727 A CN202180069727 A CN 202180069727A CN 116490217 A CN116490217 A CN 116490217A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- cells
- transposon
- transposase
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims abstract description 197
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims abstract description 194
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 175
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 154
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 142
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims abstract description 70
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims abstract description 63
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 357
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 125
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 108
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 55
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 55
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 51
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 43
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 27
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 26
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 18
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 16
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 15
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 11
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 5
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 101150058750 ALB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150009437 APOA2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150003270 Agxt gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150025804 Asl gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150071258 C3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 4
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 claims description 4
- 101150083830 FGA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150073169 HPX gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000772905 Homo sapiens Polyubiquitin-B Proteins 0.000 claims description 4
- 101150110809 ORM1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100030432 Polyubiquitin-B Human genes 0.000 claims description 4
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 4
- 101100111629 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 101150028578 grp78 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 3
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 57
- 230000006870 function Effects 0.000 description 55
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 33
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 32
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 14
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 13
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 7
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 7
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- -1 promoters Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 101150027243 pb gene Proteins 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 3
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 102100026683 Angiogenic factor with G patch and FHA domains 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032165 Corticotropin-releasing factor-binding protein Human genes 0.000 description 2
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000690725 Homo sapiens Angiogenic factor with G patch and FHA domains 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000921095 Homo sapiens Corticotropin-releasing factor-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102220606900 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase_P2A_mutation Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100037651 AP-2 complex subunit sigma Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102100039703 Androglobin Human genes 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038710 Capping protein-inhibiting regulator of actin dynamics Human genes 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100030506 Coiled-coil domain-containing protein 179 Human genes 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102100023949 Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108091046839 DAOA-AS1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033462 DENN domain-containing protein 1B Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102100034001 DNA replication licensing factor MCM5 Human genes 0.000 description 1
- 102100040679 Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100022820 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 28 Human genes 0.000 description 1
- 102100022183 E3 ubiquitin-protein ligase MIB1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023792 ETS domain-containing protein Elk-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100039559 Exocyst complex component 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100026546 Fibronectin type III domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100027988 GTP-binding protein Rhes Human genes 0.000 description 1
- 101001035782 Gallus gallus Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000806914 Homo sapiens AP-2 complex subunit sigma Proteins 0.000 description 1
- 101000959466 Homo sapiens Androglobin Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000957909 Homo sapiens Capping protein-inhibiting regulator of actin dynamics Proteins 0.000 description 1
- 101000772633 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 179 Proteins 0.000 description 1
- 101001111225 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4 Proteins 0.000 description 1
- 101000870914 Homo sapiens DENN domain-containing protein 1B Proteins 0.000 description 1
- 101001017545 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM5 Proteins 0.000 description 1
- 101001039272 Homo sapiens Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000756756 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 28 Proteins 0.000 description 1
- 101000973503 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase MIB1 Proteins 0.000 description 1
- 101001048716 Homo sapiens ETS domain-containing protein Elk-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000813490 Homo sapiens Exocyst complex component 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000913643 Homo sapiens Fibronectin type III domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000578396 Homo sapiens GTP-binding protein Rhes Proteins 0.000 description 1
- 101001083591 Homo sapiens Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 1
- 101000988647 Homo sapiens Humanin-like 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001050472 Homo sapiens Integral membrane protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101001050616 Homo sapiens KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001050575 Homo sapiens Kinesin-like protein KIF2B Proteins 0.000 description 1
- 101000984044 Homo sapiens LIM homeobox transcription factor 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000942133 Homo sapiens Leupaxin Proteins 0.000 description 1
- 101000605076 Homo sapiens Ligand-dependent nuclear receptor corepressor-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101001032848 Homo sapiens Metabotropic glutamate receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000979120 Homo sapiens Neurensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000996109 Homo sapiens Neuroligin-4, Y-linked Proteins 0.000 description 1
- 101000600779 Homo sapiens Neuromedin-B receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000878253 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP5 Proteins 0.000 description 1
- 101000689399 Homo sapiens Phospholipid scramblase family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000923320 Homo sapiens Phospholipid-transporting ATPase IF Proteins 0.000 description 1
- 101000923340 Homo sapiens Phospholipid-transporting ATPase VB Proteins 0.000 description 1
- 101001040717 Homo sapiens Probable G-protein coupled receptor 174 Proteins 0.000 description 1
- 101000881678 Homo sapiens Prolyl hydroxylase EGLN3 Proteins 0.000 description 1
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001065016 Homo sapiens Protein FAM9A Proteins 0.000 description 1
- 101001065010 Homo sapiens Protein FAM9B Proteins 0.000 description 1
- 101000945469 Homo sapiens Protein kish-B Proteins 0.000 description 1
- 101000613366 Homo sapiens Protocadherin-11 X-linked Proteins 0.000 description 1
- 101000703463 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 35 Proteins 0.000 description 1
- 101000684730 Homo sapiens Secreted frizzled-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000704221 Homo sapiens Serine palmitoyltransferase small subunit A Proteins 0.000 description 1
- 101001026870 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase D1 Proteins 0.000 description 1
- 101000651890 Homo sapiens Slit homolog 2 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000651893 Homo sapiens Slit homolog 3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000701440 Homo sapiens Stanniocalcin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000820460 Homo sapiens Stomatin Proteins 0.000 description 1
- 101000801076 Homo sapiens TOM1-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000658739 Homo sapiens Tetraspanin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000772173 Homo sapiens Tubby-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000772122 Homo sapiens Twisted gastrulation protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000794430 Homo sapiens Uncharacterized protein C1orf53 Proteins 0.000 description 1
- 101000900760 Homo sapiens Uncharacterized protein encoded by LINC01551 Proteins 0.000 description 1
- 101000743863 Homo sapiens ZW10 interactor Proteins 0.000 description 1
- 101000916537 Homo sapiens Zinc finger and BTB domain-containing protein 43 Proteins 0.000 description 1
- 101000743781 Homo sapiens Zinc finger protein 91 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102100029067 Humanin-like 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100023351 Integral membrane protein 2A Human genes 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023408 KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023427 Kinesin-like protein KIF2B Human genes 0.000 description 1
- 102100025457 LIM homeobox transcription factor 1-beta Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102100032755 Leupaxin Human genes 0.000 description 1
- 102100038259 Ligand-dependent nuclear receptor corepressor-like protein Human genes 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108091007707 MIR4454 Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100038352 Metabotropic glutamate receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023233 Neurensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034448 Neuroligin-4, Y-linked Human genes 0.000 description 1
- 102100037283 Neuromedin-B receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100034404 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 102100037026 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP5 Human genes 0.000 description 1
- 102100024536 Phospholipid scramblase family member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100032687 Phospholipid-transporting ATPase IF Human genes 0.000 description 1
- 102100032666 Phospholipid-transporting ATPase VB Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100021199 Probable G-protein coupled receptor 174 Human genes 0.000 description 1
- 102100037247 Prolyl hydroxylase EGLN3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100031840 Protein FAM9A Human genes 0.000 description 1
- 102100031842 Protein FAM9B Human genes 0.000 description 1
- 102100034837 Protein kish-B Human genes 0.000 description 1
- 102100040913 Protocadherin-11 X-linked Human genes 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 102100038914 RalA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150041852 Ralbp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100030676 Rho GTPase-activating protein 35 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100023744 Secreted frizzled-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100031872 Serine palmitoyltransferase small subunit A Human genes 0.000 description 1
- 102100037310 Serine/threonine-protein kinase D1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027340 Slit homolog 2 protein Human genes 0.000 description 1
- 102100030511 Stanniocalcin-1 Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102100021685 Stomatin Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100033693 TOM1-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035873 Tetraspanin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029293 Tubby-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029320 Twisted gastrulation protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030193 Uncharacterized protein C1orf53 Human genes 0.000 description 1
- 102100022066 Uncharacterized protein encoded by LINC01551 Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 102100039102 ZW10 interactor Human genes 0.000 description 1
- 102100028131 Zinc finger and BTB domain-containing protein 43 Human genes 0.000 description 1
- 102100039070 Zinc finger protein 91 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010053584 alpha-Globins Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091056085 miR-4465 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091029101 miR-8054 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464403—Receptors for growth factors
- A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464403—Receptors for growth factors
- A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/464488—NY-ESO
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供了一种核酸构建物，其包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子。还提供了包含所述核酸构建物的宿主细胞或药物组合物及其用途。
Description
本发明涉及转座子载体领域，具体地涉及一种新型PiggyBac转座子系统及其用途。
将外源基因导入目的细胞内稳定表达从而实现对目的细胞的转基因改造是包括免疫细胞治疗在内的众多细胞治疗技术实现的必要条件。相较于瞬时表达，稳定表达的外源基因能够整合进入目的细胞基因组中，在细胞多次传代或培养条件变化的情况下仍能保持长时间持续稳定表达。常用的转基因系统包括基于病毒的载体、真核表达质粒载体和转座子载体。使用基于非病毒载体的方法对人原代T细胞进行遗传改造修饰被证明是及其困难的。因而在全世界范围内，大部分实验室仍然在使用病毒载体系统进行细胞的转基因修饰，包括逆转录病毒载体，如慢病毒载体系统。病毒载体系统虽然一直被广泛使用，但其存在病毒制备操作复杂、安全风险相对较高、生产成本较高等难以克服的问题。
近年来，转座子载体系统越来越多地被用于修饰免疫细胞进而进行肿瘤免疫治疗。最早应用于哺乳动物的转座子是源于鱼类的“睡美人”转座子(Sleeping Beauty)，但其存在过量抑制效应和携带片段偏小(5kb左右)等缺陷，在哺乳动物细胞的转基因操作中应用受到严重的限制。PiggyBac转座子是另一类源于鳞翅目昆虫的转座子系统，其能够携带较大的片段，能够整合多种真核宿主细胞。PiggyBac(PB)转座子系统主要通过“切割-黏贴”(cut-paste)机制发生转座，不会在转座发生后在原位点留下印迹(footprint)，被越来越多地改造后用于基因组研究、基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导和诱导后分化等领域。
WO2019046815A1公开了一种传统的基于PiggyBac转座子的二元系统，其包括含有PiggyBac转座酶的载体与含有5’ITR和3’ITR的辅助载体。该PiggyBac转座子系统配合电转法能够将外源基因导入T细胞、NK细胞和HSPC细胞。但二元系统需要PiggyBac转座酶载体与辅助载体同时转进细胞内以后才能发生转座，对转染的 要求较高，难度较大。同时，PiggyBac转座系统的机制PiggyBac转座酶通过“切割-黏贴”(cut-paste)机制将转座片段插入基因组，而这一过程是可逆的，因此只要当PiggyBac酶的表达在持续进行，已经整合到基因组上的转座片段还可能被重新切割下来，造成基因组不稳定，实质上降低了转座效率。普通的PiggyBac二元转座系统在T细胞中的转座效率通常在10％左右的水平，效率较低。并且WO2019046815A1同时也记载了质粒DNA对T细胞的毒性较大，且其对T细胞的毒性与电转所用DNA的量有关。二元系统无疑扩大了电转所需的质粒DNA的用量，增加了对细胞特别是T细胞的毒性，降低了转染质粒DNA的T细胞的存活率。
CN105154473B公开了一种一元PiggyBac转座子载体，该载体将传统二元PiggyBac转座系统中的PiggyBac转座酶载体与辅助载体合并到一个载体中，并通过在同一表达载体中PiggyBac表达框与外源基因表达框共用同一段双向polyA序列，设置整合后PiggyBac转座酶表达框中的polyA即被切割而自失活(self-inactivating)的机制，有效减少了组成型PiggyBac转座酶的持续表达，提升了PiggyBac转座酶的转座效率，同时二元体系精简为一元单载体大幅度减少了DNA总量，降低了外源DNA对T细胞产生的毒性。但PiggyBac转座酶表达框与外源基因表达框共用同一段双向polyA序列会使两个方向相对的表达框之间产生相互影响，并且在某些种类的细胞中该一元转座子载体介导的整合效率仍有待进一步提高。
因此，目前仍然缺乏能够在高效整合外源基因的同时及时关闭整合功能的高效一元转座子体系。
发明内容
发明人构建了一种基于PiggyBac转座子的整合系统，该系统能介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达。
本发明一方面涉及一种核酸构建物，其包含以下元件或由其组成：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：转座酶编码序列、控制该转座酶表达的启动子、多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因。
本发明还提供一种核酸构建物，其包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶编码序列、所述控制该转座酶表达的启动子、所述5’UTR和所述第二polyA序列中的任一种或多种在所述转座子3’末端重复序列和所述转座子5’末端重复序列之间的区域以外。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座 子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
在一个或多个实施方案中，所述多克隆插入位点用于可操作地插入所述外源基因的编码序列以及任选的控制外源基因表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，第一polyA序列与第二polyA序列的加尾信号功能的方向相同或相反。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶的表达框的方向与外源基因表达框的方向相同或相反。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶的表达框的方向与转座子3’末端重复序列和转座子5’末端重复序列之间的序列的方向相同或相反。
在一个或多个实施方案中，上述的各元件各自独立地为单拷贝或者多拷贝。
在一个或多个实施方案中，上述的各元件直接连接或通过接头或酶切位点连接。
根据本发明任一项所述的核酸构建物，其中，所述转座子5’末端重复序列与所述转座子3’末端重复序列的位置能够互换。
在一个或多个实施方案中，所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列。在优选实施方案中，所述转座子3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个或多个实施方案中，所述多克隆插入位点的序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述第一polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示。
在一个或多个实施方案中，所述第二polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示。
在一个或多个实施方案中，增强子选自：CMV增强子序列、SV40增强子、人ε球蛋白5’HS2增强子、鸡β球蛋白基因5’HS4增强子。优选地，增强子序列如SEQ ID NO:4、26-28中任一所示。
在一个或多个实施方案中，具有转录终止功能的绝缘子序列如SEQ ID NO:5或15所示。
在一个或多个实施方案中，所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列。在优选实施方案中，所述转座子5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶为PiggyBac转座酶。在一个或多个实施方案中，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；优选地，所述PiggyBac转座酶的编码序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个或多个实施方案中，5’UTR序列选自C3基因、ORM1基因、HPX基因、FGA基因、AGXT基因、ASL基因、APOA2基因、ALB基因的5’UTR。优选地，5’UTR序列如SEQ ID NO:8、17-24中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述启动子选自：CMV启动子、miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子、YB_TATA启动子、EF1α启动子、SV40启动子、UbiquitinB启动子、CAG启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子。优选地，所述启动子选自miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子和YB_TATA。在一个或多个实施方案中，所述启动子的序列如SEQ ID NO:9、37-42中任一所示。优选地，所述启动子是miniCMV启动子，其序列如SEQ ID NO:9所示。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶编码序列含有或者可操作地连接单拷贝或者多拷贝的核定位信号编码序列。在一个或多个实施方案中，核定位信号为c-myc核定位信号，优选具有SEQ ID NO:35所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含SEQ ID NO:10或14所示序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组克隆载体或重组表达载体。
本发明还提供宿主细胞，其包含：(1)本文任一实施方案中所述的核酸构建物，和/或(2)本文任一实施方案中所述的核酸构建物的转座子3’末端重复序列与转座子5’末端重复序列之间的序列。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞选自免疫细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、CIK细胞、LAK细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、NK T细胞和γδT细胞中的任一种或多种。
本发明还提供药物组合物，包含本文任一实施方案中所述的核酸构建物或宿主细胞以及药学上可接受的辅料。
本发明还提供本文任一实施方案所述的核酸构建物或宿主细胞在制备或作为药物、试剂或工具中的用途，所述药物、试剂或工具用于将外源基因表达框整合到靶细胞基因组中，或用于基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导或分化。
在一个或多个实施方案中，所述靶细胞为哺乳动物细胞。
在一个或多个实施方案中，所述靶细胞选自T细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
本发明还提供一种将外源基因或其表达框整合到细胞基因组中的方法，包括将含有外源基因和任选的其启动子的本文任一实施方案所述的核酸构建物导入所述细胞，和任选的在转座酶将外源基因或其表达框整合到细胞基因组的条件下孵育所述细胞。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶是PiggyBac转座酶
在一个或多个实施方案中，所述导入包括病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。在本发明的一个实施方案中，所述导入为电穿孔。
在一个或多个实施方案中，所述细胞孵育至少三代。
本发明还提供本文所述方法获得的基因组中整合有外源基因或其表达框的细胞。
图1A和图1B，本文所述核酸构建物的示意图。
图2，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP的Jurkat细胞的荧光照片。
图3，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的Jurkat细胞的流式检测结果。
图4，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGFP的Jurkat细胞的活细胞数。
图5，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的Jurkat细胞中PB转座酶的表达水平。
图6，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGFP的K562细胞的荧光照片。
图7，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGFP的K562细胞的活细胞数。
图8，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的K562细胞的流式检测结果。
图9，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的K562细胞的荧光阳性率。
图10，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGF的原代T细胞荧光照片。
图11，分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的T细胞的流式检测结果。
图12，双质粒PB转座系统电转Jurkat细胞的阳性率结果。
图13，双质粒PB转座系统电转原代T细胞的阳性率结果。
图14，用降低的质粒用量电转pKB20-EGFP的Jurkat细胞的阳性率。
图15，细胞内载体残留拷贝数随时间的变化。
图16，电转pKB2003-EGFP的Jurkat细胞的阳性率。
图17，电转pKB205-EGFP的原代T细胞的阳性率。
图18，K562样本1中pKB20载体介导的基因组整合位点示意图。
图19，K562样本2中pKB20载体介导的基因组整合位点示意图。
图20，Jurkat样本1中pKB20载体介导的基因组整合位点示意图。
图21，Jurkat样本2中pKB20载体介导的基因组整合位点示意图。
图22，电转了pKB20-HER2CAR的原代T细胞的阳性率流式结果。
图23，HER2CAR-T细胞对靶细胞SKOV-3的体外RTCA杀伤结果。
图24，电转了pKB20-NY-ESO-1 TCR的原代T细胞的阳性率流式结果。
图25，NY-ESO-1 TCR-T对靶细胞A375的体外RTCA杀伤结果。
图26，电转了pNB328-EGFP的K562细胞的阳性率流式结果。
图27，电转了pNB328-EGFP的原代T细胞的阳性率流式结果。
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包括”及其变化形式不具有限制意义，其中这些术语出现在本说明书和权利要求中。因此，术语“包括”、“包含”、和“含有”可互换使用。
核酸构建物和细胞
术语“核酸构建物”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建物还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括蛋白或多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。本文所述的转座系统优选是一元核酸构建物，即一个核酸构建物即可实现高效转座。
在本发明中，如果没有特别说明，以转座酶表达框的方向为反向。上述的“依次包含如下元件”中的“依次”所指的方向和/或顺序是指从上游至下游。在本发明中，如果没有特别说明，沿着上述“正向”的方向为从上游至下游，沿着上述“反向”的方向为从下游至上游。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“可操作地插入/连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导蛋白或多肽的表达。在本发 明的核酸构建物中，多克隆位点通过DNA重组技术可操作地插入有一个或多个相同或不同的外源基因以及可选的控制外源基因表达的启动子，或者其多克隆位点被替换为一个或多个相同或不同的外源基因编码序列以及可选的控制外源基因表达的启动子。所述“可操作地连接”可以通过DNA重组的手段实现，具体地，所述核酸构建物为重组核酸构建物。
本文所述“外源基因”可以是任何来源的核酸分子，其在转座到宿主细胞基因组后表达或行使功能。外源基因的非限制性示例包括荧光素报告基因(例如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、荧光素酶基因(例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶等)、天然功能蛋白基因、RNAi基因以及人工嵌合基因(例如嵌合抗原受体基因、Fc融合蛋白基因、全长抗体基因)。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
本文中术语“调控序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码蛋白或多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、polyA序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码蛋白或多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。
调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白或多肽表达的转录调控序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白或多肽的核酸序列的3’末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白或多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
本发明的核酸构建物包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子。所述核酸构建物还可包含选自以下的一种或多种元件：多克隆插入位点、增强子、5’UTR和第二polyA序列。在一种特别优选的实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子，如图1A所示。在另一种特别优选的实施方案中，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列以及第二polyA序列，如图1B所示。本文核酸构建物中的各元件各自独立地为单拷贝或者多拷贝。
本文中，转座子5’末端重复序列与所述转座子3’末端重复序列的位置能够互换。优选地所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列；所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列。
本文中，转座酶优选为PiggyBac转座酶，其编码序列含有或者可操作地连接单拷贝或者多拷贝的核定位信号编码序列，从而提高转座效率。示例性PiggyBac转座酶编码序列如SEQ ID NO:7所示。示例性核定位信号编码序列如SEQ ID NO:35所示。
本发明的核酸构建物针对转座酶和外源基因可以使用polyA序列。这种设计可以一定程度上缩短核酸构建物的全长，有助于纳入更长的外源基因用于转座。或者，本发明的核酸构建物针对转座酶和外源基因也可以使用分开的polyA序列，二者的加尾信号功能的方向可以相同或相反。这种设计避免了共用同一段双向polyA序列会使两个方向相对的表达框之间的相互影响。本文所述polyA序列可以具有或不具有双向转录终止功能。优选地，polyA序列独立地选自SEQ ID NO:3、13或16。
本发明的核酸构建物针对转座酶和外源基因也可以或进一步使用绝缘子序列用 于转录终止。因此，在任意polyA序列的任意端可包含绝缘子序列。优选地，本发明的绝缘子序列位于转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列之间。本文所述绝缘子序列具有转录终止功能，该序列可以是本领域已知的任何具有转录终止功能的序列。优选地，具有转录终止功能的绝缘子序列如SEQ ID NO:5或15所示。
因此，转座酶可以使用polyA序列、绝缘子序列、或polyA序列和绝缘子序列实现转录终止；外源基因可以使用polyA序列、绝缘子序列、或polyA序列和绝缘子序列实现转录终止。优选地，任意所述绝缘子序列位于所述转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列之间。
本发明的核酸构建物中，合适的转座酶的启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的转座酶高水平表达的启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。在一个或多个实施方案中，转座酶的启动子选自：CMV启动子、miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子、YB_TATA启动子、EF1α启动子、SV40启动子、UbiquitinB启动子、CAG启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子。优选地，所述启动子选自miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子和YB_TATA启动子。更优选地，所述启动子是miniCMV启动子。miniCMV相比CMV启动子短了很多，使得载体长度更小，更有利于整合更大的外源基因。在一个或多个实施方案中，在miniCMV和转座酶之间添加5’UTR序列以增强转录和翻译。5’UTR序列可如SEQ ID NO:8、17-24中任一所示。
本发明的核酸构建物可含有增强子，该增强子可位于本文所述核酸构建物中除了增强子以外的任何元件的任意端。优选地，增强子位于转座子3’末端重复序列和转座子5’末端重复序列之间。更优选地，增强子位于第一polyA序列的下游。增强子序列可如SEQ ID NO:4、25-28中任一所示。本文中，核酸构建物可不包含所述5’UTR序列和增强子序列，或包含二者之一，或包含二者，所得核酸构建物均能将外源基因高效整合入细胞基因组。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出 反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白或多肽的核酸序列与调控序列可操作地连接在一起。
在含一个polyA信号序列的具体实施方案中，本发明的核酸构建物依次包含PiggyBac转座子3’末端重复序列(3’ITR)(SEQ ID NO:1)、多克隆位点(SEQ ID NO:2)、polyA信号序列(SEQ ID NO:3、13或16)、任选的增强子基序序列(SEQ ID NO:4、25-28中任一)、绝缘子序列(SEQ ID NO:5或15)、PiggyBac转座子5’末端重复序列(5’ITR)(SEQ ID NO:6)的反向互补序列、PiggyBac转座酶编码序列(SEQ ID NO:7)的反向互补序列、任选的5’UTR序列(SEQ ID NO:8、17-24中任一)的反向互补序列和miniCMV启动子序列(SEQ ID NO:9)的反向互补序列。在一个或多个实施方案中，本发明的核酸构建物SEQ ID NO:10所示的序列。
在含两个polyA信号序列的具体实施方案中，本发明的核酸构建物依次包含PiggyBac转座子3’末端重复序列(3’ITR)(SEQ ID NO:1)、多克隆位点(SEQ ID NO:2)、第一polyA信号序列(SEQ ID NO:3、13或16)、任选的增强子基序序列(SEQ ID NO:4、25-28中任一)、绝缘子序列(SEQ ID NO:5或15)、PiggyBac转座子5’末端重复序列(5’ITR)(SEQ ID NO:6)、miniCMV启动子序列(SEQ ID NO:9)、任选的5’UTR序列(SEQ ID NO:8、17-24中任一)、PiggyBac转座酶编码序列(SEQ ID NO:7)和第二polyA信号序列(SEQ ID NO:3、13或16)。在一个或多个实施方案中，本发明的核酸构建物具有SEQ ID NO:14所示的序列。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是重组载体。重组载体可以是重组克隆载体，也可以是重组表达载体。本发明的核酸构建物的各元件可被装入许多类型的载体，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。
为了评估所携带基因的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从细胞群中鉴定和选择细胞。可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括Flag、HA或V5。报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿 色萤光蛋白基因的基因。
重组克隆载体可用于提供含有本发明核酸构建物的各元件和可选的外源基因的编码序列。重组克隆载体可为本发明核酸构建物的各元件与pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体经重组得到的重组载体。
重组表达载体可用于在合适的宿主细胞中通过本发明核酸构建物的各元件将外源基因表达框整合到基因组中并表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。重组表达载体为本发明核酸构建物的各元件与pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体经重组得到的重组载体；
重组载体(重组克隆载体或重组表达载体)可以是重组病毒载体，包括但不限于重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体或重组痘苗病毒载体。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。
本文所述的核酸构建物通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。或者，也可直接合成本文所述的核酸构建物。
本发明还提供包含本文任一实施方案中所述的核酸构建物的宿主细胞。宿主细胞既包括哺乳动物细胞，也包括生产哺乳动物细胞过程中使用到的各种细胞，如大肠杆菌细胞，以用于如提供本文所述的核酸构建物或载体。在某些实施方案中，本文提供一种含有本文所述的核酸构建物或载体的哺乳动物细胞，包括但不限于：T细胞、B细胞、CIK细胞、LAK细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、NK T细胞、γδT细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
药物组合物
本发明的药物组合物包含本文所述的核酸构建物或细胞和药学上可接受的辅料。本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的核酸构建物或细胞传送给动物 或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送康生物的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于转座系统或含有其的细胞给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PiggyBacS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。
其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含本文所述的核酸构建物或细胞的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述试剂。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。实现这些效果可以通过插入具有相应功能的外源基因实现的，所述相应功能的外源基因具有相应于具体用途的功能，例如治疗功能或者诱导功能。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的本文所述的核酸构建物或细胞。
本文所述组合物可与具有所述外源基因所实现功能相似或相应的功能的其他试剂联用。例如与治疗所述外源基因所治疗的疾病或病症的试剂联用。本领域技术人员 可确定其他试剂的给药剂量。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本文所述的核酸构建物或细胞所预防和治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本文所述的核酸构建物或细胞或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。本文所述的核酸构建物或细胞或其组合物也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。
方法和用途
本发明人在研究中发现，本文核酸构建物可以以可控的方式高效实现外源基因的基因组整合。当外源基因整合到基因组以后，能够有效终止PiggyBac转座酶的转录表达，同时能够发挥外源基因表达框绝缘子功能，减少整合的外源基因表达框对整合位点附近基因表达产生的影响。因此，本发明涉及将外源基因或其表达框整合到细胞基因组中的方法，包括将含有外源基因和任选的其启动子的本文任一实施方案所述的核酸构建物导入所述细胞，和任选的在PiggyBac转座酶将外源基因或其表达框整合到细胞基因组的条件下孵育所述细胞。本发明还提供上述方法获得的基因组中整合有外源基因或其表达框的细胞。
将核酸构建物引入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。示例性的物理或化学方法包括：包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、显微注射、粒子轰击、微注射、基因枪转化、电穿孔、胶体分散系统、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。将核酸构建物引入宿主细胞的生物学方法包括病毒介导的转化，特别是逆转录病毒载体。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。可利用本领域中已知的技术将和选择的核酸序列插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。用于病毒包装的试剂为本领域所周知，如常规的慢病毒载体系统包括pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的干扰质粒。
本发明还提供本文任一实施方案所述的核酸构建物或宿主细胞在制备或作为药 物、试剂或工具中的用途，所述药物、试剂或工具用于将外源基因表达框整合到靶细胞基因组中，或用于基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导或分化。在一个或多个实施方案中，所述靶细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于选自T细胞、B细胞、CIK细胞、LAK细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、NK T细胞、γδT细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
示例性实施方案
项目1、一种核酸构建物，其包含以下元件或由其组成：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列，
优选地，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：转座酶编码序列、控制该转座酶表达的启动子、多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因，
优选地，所述转座酶编码序列、所述控制该转座酶表达的启动子、所述5’UTR和所述第二polyA序列中的任一种或多种在所述转座子3’末端重复序列和所述转座子5’末端重复序列之间的区域以外。
项目2、如项目1所述的核酸构建物，其包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，
优选地，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因。
项目3、如项目2所述的核酸构建物，其特征在于，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，或
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，或
所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
项目4、如项目1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有选自以下的一项或多项特征：
所述转座酶的表达框的方向与外源基因的表达框的方向相同或相反，
所述转座酶的表达框的方向与转座子3’末端重复序列和转座子5’末端重复序列之间的序列的方向相同或相反，
所述转座子5’末端重复序列与所述转座子3’末端重复序列的位置能够互换，
所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列，
所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列，
所述增强子选自：CMV增强子序列、SV40增强子、人ε球蛋白5’HS2增强子、鸡β球蛋白基因5’HS4增强子，
所述转座酶为PiggyBac转座酶，
所述5’UTR选自C3基因、ORM1基因、HPX基因、FGA基因、AGXT基因、ASL基因、APOA2基因、ALB基因的5’UTR，
所述启动子选自：CMV启动子、miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子、YB_TATA启动子、EF1α启动子、SV40启动子、UbiquitinB启动子、CAG启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子，
所述转座酶编码序列含有或者可操作地连接单拷贝或者多拷贝的核定位信号编码序列。
项目5、如项目1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有选自以下的一项或多项特征：
所述转座子3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
所述转座子5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，
所述多克隆插入位点的序列如SEQ ID NO:2所示，
所述第一polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示，
所述第二polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示，
所述增强子序列如SEQ ID NO:4、26-28中任一所示，
所述绝缘子序列如SEQ ID NO:5或15所示，
所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；优选地，所述PiggyBac转座酶的编码序列如SEQ ID NO:7所示，
所述5’UTR序列如SEQ ID NO:8、17-24中任一所示，
所述启动子的序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:37-42中任一项所示；
所述核定位信号为c-myc核定位信号；优选地，所述核定位信号具有SEQ ID NO:35所示的序列。
项目6、如项目1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，
所述核酸构建物包含SEQ ID NO:10或14所示序列，或
所述核酸构建物是重组载体，优选地，所述核酸构建物是重组克隆载体或重组表达载体。
项目7、一种宿主细胞，包含
(1)项目1-6中任一项所述的核酸构建物，和/或
(2)项目1-6中任一项所述的核酸构建物的转座子3’末端重复序列与转座子5’末端重复序列之间的序列，
优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，
更优选地，所述宿主细胞选自T细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
项目8、一种药物组合物，包含项目1-6中任一项所述的核酸构建物或项目8所述的宿主细胞以及药学上可接受的辅料。
项目9、项目1-6中任一项所述的核酸构建物或项目7所述的宿主细胞在制备药物、试剂或工具中的用途或作为药物、试剂或工具的用途，所述药物、试剂或工具用于将外源基因表达框整合到靶细胞基因组中，或用于基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导或分化，
优选地，所述靶细胞为哺乳动物细胞，
更优选地，所述靶细胞选自免疫细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞，
进一步更优选地，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、CIK细胞、LAK细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、NK T细胞和γδT细胞中的任一种或多种。
项目10、一种将外源基因或其表达框整合到细胞基因组中的方法，包括将含有外源基因和任选的其启动子的项目1-6中任一项所述的核酸构建物导入所述细胞，和任选的在转座酶将外源基因或其表达框整合到细胞基因组的条件下孵育所述细胞，所 述外源基因和任选的其启动子位于所述核酸构建物的多克隆插入位点中，
优选地，所述转座酶是PiggyBac转座酶。
本发明的优点：
1)本发明转座子载体系统具有多重调控元件，多层次调控PiggyBac的表达及其介导的外源基因整合。本文所用的驱动PiggyBac转座酶表达的启动子降低了表达强度且减少了DNA长度。同时引入增强子元件，在完整质粒状态，瞬时增强转座酶的表达，发挥PiggyBac转座酶的切割与整合功能；当外源基因表达框从完整质粒上被切开后，增强子失去对启动子的增强作用，实现PiggyBac转座酶的高效开启与关闭，使转座酶水平在短时间表达达到峰值后降低，介导外源基因完成整合的同时大幅减少细胞毒性；
2)在启动子下游加上5’UTR序列，与增强子元件相配合瞬时提升转座酶的表达强度，使PiggyBac酶表达强度足够高，提高整体整合效率。如下实施例所示，本发明转座子载体系统的整合效率有非常显著的提升；
3)PiggyBac表达框采用具有转录终止作用的绝缘子序列，外源基因整合发生前能有效终止转录，表达转座酶基因；当外源基因整合到基因组以后，具有转录终止作用的绝缘子序列的缺失能够有效终止PiggyBac转座酶的转录表达。同时，具有转录终止作用的绝缘子序列与外源基因表达框一起整合到基因组中以后绝缘子还能阻隔外源基因的表达对基因组中邻近区域的影响，减少整合的外源基因表达框对整合位点附近基因表达产生的影响；
4)本发明转座子载体系统在基因组中插入位点较少，且基因内插入位点少，对基因组稳定性影响较小；
5)在mRNA水平对基因表达谱影响较小。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例中所用细胞系均购自ATCC。
实施例
实施例1，载体的构建
pKB20：按顺序依次将PiggyBac转座子3’末端重复序列(3’ITR)(SEQ ID NO:1)、多克隆位点(SEQ ID NO:2)、bGH polyA信号序列(SEQ ID NO:3)、增强子基序序列(SEQ ID NO:4)、具有转录终止功能的绝缘子序列(C2转录停顿位点，SEQ ID NO:5)、PiggyBac转座子5’末端重复序列(5’ITR)(SEQ ID NO:6)的反向互补序列、PiggyBac转座酶编码序列(SEQ ID NO:7)的反向互补序列、5’UTR序列(SEQ ID NO:8)的反向互补序列和miniCMV启动子序列(SEQ ID NO:9)的反向互补序列，拼接成一段长序列(SEQ ID NO:10)，委托上海捷瑞生物科技有限公司合成，并在两端分别加入AgeI与AscI酶切位点，装入pUC57(购自上海捷瑞生物)，命名pKB20。质粒示意图见图1A。
pKB20-EGFP：在pKB20的多克隆位点的XbaI与EcoRI位点间插入带有NFAT基序的EF1A启动子序列(SEQ ID NO:11)，在EcoRI和SalI位点之间插入EGFP编码序列(SEQ ID NO:12)，命名为pKB20-EGFP，带有NFAT基序的EF1A启动子序列与EGFP编码序列委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。
pKB205：按顺序依次将PiggyBac转座子3’末端重复序列(3’ITR)(SEQ ID NO:1)、多克隆位点MCS(SEQ ID NO:2)、bGH polyA信号序列(SEQ ID NO:3)、增强子基序序列(SEQ ID NO:4)、具有转录终止功能的绝缘子序列(C2转录停顿位点，SEQ ID NO:5)、PiggyBac转座子5’末端重复序列(5’ITR)(SEQ ID NO:6)、miniCMV启动子序列(SEQ ID NO:9)、5’UTR序列(SEQ ID NO:8)、PiggyBac转座酶编码序列(SEQ ID NO:7)和SV40 polyA信号序列(SEQ ID NO:13)拼接成一段长序列(SEQ ID NO:14)，委托上海捷瑞生物科技有限公司合成，并在两端分别加入AgeI与AscI酶切位点，装入pUC57(购自上海捷瑞生物)，命名pKB205。质粒示意图见图1B。
pKB205-EGFP：在pKB205的多克隆位点的XbaI与EcoRI位点间插入带有NFAT基序的EF1A启动子序列(SEQ ID NO:11)，在EcoRI和SalI位点之间插入EGFP编码序列(SEQ ID NO:12)，命名为pKB205-EGFP，带有NFAT基序的EF1A启动子序列与EGFP编码序列委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。
采用相同方法分别获得以下质粒：
pKB201-EGFP：pKB20-EGFP序列删除增强子基序序列获得；
pKB202-EGFP：pKB20-EGFP序列删除5’UTR序列获得；
pKB2003-EGFP：pKB20-EGFP序列删除增强子基序序列和5’UTR序列获得；
pKC20-EGFP：pKB20-EGFP序列删除miniCMV启动子序列、5’UTR序列、含 核定位信号的PiggyBac转座酶编码序列后获得；
pK201-PB：pKB20序列删除5’UTR、5’ITR、增强子基序、bGH polyA信号序列、多克隆位点和3’ITR，仅保留miniCMV、含核定位信号的PiggyBac转座酶编码序列和具有转录终止功能的绝缘子序列获得；
pKB20I1-EGFP：将pKB20-EGFP中的具有转录终止功能的绝缘子序列替换为人α2globin基因转录停顿位点(SEQ ID NO:15)后获得；
pKB20A1-EGFP：将pKB20-EGFP中的bGH polyA替换为SEQ ID NO:16后获得；
pKB20A2-EGFP：将pKB20-EGFP中的bGH polyA替换为SV40 polyA信号序列(SEQ ID NO:13)后获得；
pKB20U1-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为C3基因的5’UTR(SEQ ID NO:17)后获得；
pKB20U2-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为ORM1基因的5’UTR(SEQ ID NO:18)后获得；
pKB20U3-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为HPX基因的5’UTR(SEQ ID NO:19)后获得；
pKB20U4-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为FGA基因的5’UTR(SEQ ID NO:20)后获得；
pKB20U5-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为AGXT基因的5’UTR(SEQ ID NO:21)后获得；
pKB20U6-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为ASL基因的5’UTR(SEQ ID NO:22)后获得；
pKB20U7-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为APOA2基因的5’UTR(SEQ ID NO:23)后获得；
pKB20U8-EGFP：将pKB20-EGFP中的5’UTR序列替换为ALB基因的5’UTR(SEQ ID NO:24)后获得；
pKB20E1-EGFP：将pKB20-EGFP中的增强子基序序列替换为CMV增强子序列(SEQ ID NO:25)后获得；
pKB20E2-EGFP：将pKB20-EGFP中的增强子基序序列替换为SV40增强子序列(SEQ ID NO:26)后获得；
pKB20E3-EGFP：将pKB20-EGFP中的增强子基序序列替换为人ε-globin 5’HS2 增强子序列(SEQ ID NO:27)后获得；
pKB20E4-EGFP：将pKB20-EGFP中的增强子基序序列替换为鸡β-globin基因5’HS4增强子序列(SEQ ID NO:28)后获得。
pKB20P1-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为CMV53启动子(SEQ ID NO:37)后获得。
pKB20P2-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为miniSV40启动子(SEQ ID NO:38)后获得。
pKB20P3-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为miniTK启动子(SEQ ID NO:39)后获得。
pKB20P4-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为MLP启动子(SEQ ID NO:40)后获得。
pKB20P5-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为pJB42CAT5启动子(SEQ ID NO:41)后获得。
pKB20P6-EGFP：将pKB20-EGFP中的miniCMV序列替换为YB_TATA(SEQ ID NO:42)后获得。
实施例2，含EGFP表达框pKB载体在Jurkat细胞中的整合
准备5×10
6生长旺盛的低代数Jurkat细胞，通过Lonza2b-Nucleofector仪器，将质量均为5μg的pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP与pKC20-EGFP分别转染到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞长满后，按1:10的比例传代培养。在电转后的第7天、第10天、第14天荧光显微镜拍照观察；电转后第7天、第10天、第14天(3次传代后)式细胞仪检测EGFP阳性细胞的比例变化，未转染质粒的Jurkat细胞作为流式细胞检测的对照。电转全过程荧光显微镜观察细胞荧光强度。在电转后第5天、第7天、第10天、第14天分别进行活细胞计数，观察电转pKB载体对Jurkat细胞增殖的影响。
按1:10的比例稀释传代，非整合的质粒随着细胞的分裂，质粒很快丢失。3代(约13天)以后，绿色荧光阳性的细胞可以认为绿色荧光表达框已经稳定整合。通过流式检测绿色荧光阳性细胞比例，可确定整合的效率。
结果如图2-4所示。图2显示到电转后第10天，电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP的Jurkat细胞中仍可见大量高荧光亮度的细胞。电转了缺失PiggyBac转座酶表达框的pKC20-EGFP的Jurkat细胞已基本看不到荧光。表 明带有PiggyBac转座酶表达框的载体已经成功地将EGFP在Jurkat细胞中进行了基因组整合。而不包括PiggyBac转座酶表达框的载体不能有效地介导外源基因EGFP进行整合。
图3显示电转后第7天分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的Jurkat细胞的流式检测结果。结果显示，电转pKB20-EGFP的Jurkat细胞在第7天和第10天的阳性细胞比例都高达67％以上，在细胞培养3代后的第14天阳性率仍维持在65％的高水平。电转pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的细胞阳性率在第7天在48％左右，在培养3代后的第14天分别超过27％与26％。
图4显示，电转了包含PB转座酶表达框的质粒pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的Jurkat细胞与电转了不包含PB转座酶表达框的pKC20-EGFP的Jurkat细胞相比，在电转后第5、7、10、14天的活细胞数都没有显著差异。表明包含了PB转座酶表达框的导入不会对Jurkat细胞的增殖产生影响。
以上的结果表明pKB20-EGFP在电转Jurkat细胞后均有非常高的整合率和外源基因阳性表达率，pKB201-EGFP与pKB202-EGFP电转Jurkat细胞后也具有较高的整合率与外源基因阳性表达率，但低于pKB20-EGFP电转后的水平。并且pKB系列载体的整合对细胞的增殖基本不产生影响。
实施例3，pKB载体电转Jurkat细胞后PB转座酶表达时间曲线
取5×10
6生长旺盛的低代数Jurkat细胞，通过Lonza2b-Nucleofector仪器，将质量均为5μg的pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP分别转染到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，37℃、5％CO
2培养，电转后的第6、12、24、48、96小时及第15天收集细胞后提RNA，以β-actin为内参RT-PCR定量检测PB转座酶的表达水平，结果如图5所示。
图5显示，电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的Jurkat细胞中PB转座酶的表达水平均在6h到达高峰，随后开始显著下降。电转pKB20-EGFP和pKB201-EGFP的细胞在6h高峰时的PB转座酶表达水平明显高于电转pKB202-EGFP细胞的PB转座酶表达水平。其中电转pKB20-EGFP和pKB201-EGFP的细胞在24h时间点PB转座酶的表达水平急剧降低。所有细胞在96小时PB转座酶的表达水平均已降至很低，到第15天均已检测不到。
实施例4，含EGFP表达框pKB载体在K562细胞中的整合
准备5×10
6生长旺盛的低代数K562细胞，通过Lonza2b-Nucleofector仪器，将质量均为5μg的pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP与pKC20-EGFP分别转染到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞长满后，按1:10的比例传代培养。在电转后的第1天、第7天、第10天荧光显微镜拍照观察；电转后第10天、第14天(3次传代后)式细胞仪检测EGFP阳性细胞的比例变化，未转染质粒的K562细胞作为流式细胞检测的对照。电转全过程荧光显微镜观察细胞荧光强度。在电转后第5天、第7天、第10天、第14天分别进行活细胞计数，观察电转pKB载体对K562细胞增殖的影响。
按1:10的比例稀释传代，非整合的质粒随着细胞的分裂，质粒很快丢失。3代(约13天)以后，绿色荧光阳性的细胞可以认为绿色荧光表达框已经稳定整合。通过流式检测绿色荧光阳性细胞比例，可确定整合的效率。
结果如图6-9所示。图6显示到电转后第10天，电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP的K562细胞中仍可见大量高荧光亮度的细胞。电转了缺失PiggyBac转座酶表达框的pKC20-EGFP的K562细胞已基本看不到高荧光亮度的细胞。表明带有PiggyBac转座酶表达框的载体已经成功地将EGFP在K562细胞中进行了基因组整合。而不包括PiggyBac转座酶表达框的载体不能有效地介导外源基因EGFP进行整合。
图7显示电转了包含PB转座酶表达框的质粒pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的细胞与电转了不包含PB转座酶表达框的pKC20-EGFP的细胞相比，在电转后第5、7、10、14天的活细胞数都没有显著差异。表明包含了PB转座酶表达框的导入不会对K562细胞的增殖产生影响。
图8显示电转后第10天和第14天分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的细胞的流式检测结果。结果显示，电转pKB20-EGFP和pKB201-EGFP的细胞在第10天的细胞荧光阳性率分别超过75％和73％，电转后第14天(培养超过3代)的荧光阳性率均仍然维持在70％以上，表现出非常高的整合效率。电转pKB202-EGFP的细胞在电转后第10天的荧光阳性率也接近70％，并且在电转后第14天(培养超过3代)的荧光阳性率也仍然维持在接近70％的水平。
图9显示在电转后的第10-14天，电转了pKB20-EGFP和pKB201-EGFP载体的K562细胞荧光阳性率变化不大，均在70％以上，接近75％；电转pKB202-EGFP载体的K562细胞荧光阳性率在电转后的第10-14天之间下降也不明显，略低于70％。
以上的结果表明pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP在电转K562 细胞后均有非常高的整合率和外源基因阳性表达率。
实施例5，含EGFP表达框pKB载体在原代T细胞中的整合
准备四组新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)，每组5×10
6个，用Lonza Nucleofector-2b电转仪分别将将质量均为5μg的pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGFP电转到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，电转后将细胞置于AIM-V培养基中置37℃、5％CO
2孵箱培养。6小时后转移至含30ng/mL抗CD3抗体、3000IU/mL IL-2(购自Novoprotein)的6孔板中，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞长满后，按1:10的比例稀释传代，分别在电转后的第1、7和10天对电转pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP和pKC20-EGFP的细胞荧光显微镜下观察并拍照，在电转后第7、10和14天对电转pKB20-EGFP、pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的细胞进行流式检测，结果如图10-11所示。
图10显示，到电转后第10天，电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP、pKB202-EGFP的T细胞中仍可见大量高荧光亮度的细胞。电转了缺失PiggyBac转座酶表达框的pKC20-EGFP的T细胞已基本看不到高荧光亮度的细胞。表明带有PiggyBac转座酶表达框的载体已经成功地将EGFP在T细胞中进行了基因组整合。而不包括PiggyBac转座酶表达框的载体不能有效地介导外源基因EGFP进行整合。
图11显示电转后第7-14天分别电转了pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP的T细胞的流式检测结果。结果显示，电转了pKB20-EGFP的T细胞在第7天的细胞阳性率达到接近74％，在电转后的第14天(培养3代)仍然维持在接近72％。电转pKB201-EGFP和pKB202-EGFP的T细胞在电转后第7天的阳性率也都高达近70％，在电转后第14天(培养3代)阳性率仍分别维持在66％和62％以上。
以上的结果表明pKB20-EGFP、pKB201-EGFP与pKB202-EGFP在电转原代T细胞后均有非常高的整合率和外源基因阳性表达率。
实施例6，双质粒PB转座系统电转Jurkat细胞后整合效率检测
准备1×10
7生长旺盛的低代数Jurkat细胞，分为A、B两组，每组5×10
6个细胞。分别准备4μg的pK201-PB+3μg的pKC20-EGFP混合液与3μg的pK201-PB+4μg的pKC20-EGFP的混合液，通过Lonza2b-Nucleofector仪器分别电转到A、B两组细胞的细胞核中(按仪器操作说明书进行)，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞 长满后，按1:10的比例传代培养。在电转后的第7天、第10天、第14天荧光显微镜拍照观察；电转后第7天、第10天、第14天(培养3代后)流式细胞仪检测EGFP阳性细胞的比例变化，未转染质粒的Jurkat细胞作为流式细胞检测的对照。
结果如图12所示。结果显示，电转4μg的pK201-PB+3μg的pKC20-EGFP的Jurkat细胞在电转后第7天细胞阳性率超过43％，在电转后第14天(培养3代后)的细胞阳性率降低至13.31％。类似地，电转3μg的pK201-PB+4μg的pKC20-EGFP的Jurkat细胞在电转后第7天细胞阳性率超过52％，在电转后第14天(培养3代后)的细胞阳性率降低至10.57％。
上述结果表明，分别表达PB转座酶和外源基因的双载体转座系统在Jurkat细胞中的整合效率远低于前述单载体pKB系统的整合效率。
实施例7，双质粒PB转座系统电转原代T细胞后整合效率检测
准备5×10
6个新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)，准备4μg的pK201-PB+3μg的pKC20-EGFP混合液，用Lonza Nucleofector-2b电转仪电转到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，电转后将细胞置于AIM-V培养基中置37℃、5％CO
2孵箱培养。6小时后转移至含30ng/mL抗CD3抗体、3000IU/mL IL-2(购自Novoprotein)的6孔板中，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞长满后，按1:10的比例稀释传代，分别在电转后的第7和14天对细胞进行流式检测。
结果如图13所示。结果显示，电转4μg的pK201-PB+3μg的pKC20-EGFP的原代细胞在电转后第7天细胞阳性率为16.20％，在电转后第14天(培养3代后)的细胞阳性率降低至15.34％。
上述结果表明，分别表达PB转座酶和外源基因的双载体转座系统在原代T细胞中的整合效率明显低于前述单载体pKB系统的整合效率。
实施例8，质粒用量减少的pKB载体电转Jurkat细胞后整合效率检测
准备5×10
6生长旺盛的低代数Jurkat细胞，准备3μg的pKB20-EGFP质粒，通过Lonza2b-Nucleofector仪器电转到细胞核中(按仪器操作说明书进行)，置37℃、5％CO
2孵箱培养。待细胞长满后，按1:10的比例传代培养。电转后第7天、第10天、第14天(培养3代后)流式细胞仪检测EGFP阳性细胞的比例变化，未转染质粒的Jurkat细胞作为流式细胞检测的对照。
结果如图14所示。结果显示，电转3μg pKB20-EGFP质粒的Jurkat细胞在电 转后第7天细胞阳性率超过66％，在电转后第14天(培养3代后)的细胞阳性率仍保持在接近63％，与实施例2中用6μg pKB20-EGFP质粒电转Jurkat细胞后14天的细胞阳性率接近。
上述结果表明，在实施例2的基础上将电转所用的pKB20-EGFP质粒用量减半后，pKB载体系统在细胞中的整合效率基本不变，说明本发明的pKB载体系统能够在减少DNA量的情况下实现同等效果的整合效率，极大地有利于电转中降低DNA用量进而减少DNA对T细胞产生的毒性以及降低电转后细胞中的残留质粒DNA。
实施例9，细胞内pKB载体残留质粒拷贝数检测
根据实施例2和4的方法，分别对Jurkat细胞和K562电转5μg的pKB20-EGFP，在电转后第10、14和20天分别收获细胞；根据实施例8的方法，对Jurkat细胞电转3μg的pKB20-EGFP，均按仪器操作说明书进行，在电转后第10、12和14天分别收获细胞；根据实施例5的方法，对新鲜PBMC电转5μg的pKB20-EGFP，在电转后的第10、12和14天分别收获细胞。所有操作均重复3次。使用Taqman探针荧光定量PCR法对含有PB转座酶表达框的上述所有收获的细胞进行不同时间点的残留质粒量检测：
1)使用含有PB转座酶表达框的pKB20-EGFP质粒作为标准品，使用含内参基因Actin的质粒作为内参标准品，分别制备10倍梯度稀释的标准品；
2)提取电转pKB20-EGFP后指定天数的细胞总DNA，作为检测PB转座酶基因和Actin基因的样品；
3)配置PCR反应体系，对待检测样品分别进行PB转座酶基因和内参Actin基因扩增；对PB基因梯度稀释标准品和Actin基因梯度稀释标准品进行扩增，准备制作PB基因和Actin基因各自的标准曲线。扩增PB基因与扩增Actin基因的引物、探针序列及反应体系分别如下所示：
PB基因扩增：
PB-F：5’ggacgagatctacgccttct(SEQ ID NO:29)
PB-R：5’ctcatcacgctcacgtacac(SEQ ID NO:30)
PB-探针：5’tgcgcacggcggtcatcacc(SEQ ID NO:31)
Actin基因扩增：
Actin-F：5’gggacctgactgactacctc(SEQ ID NO:32)
Actin-R：5’aatgtcacgcacgatttccc(SEQ ID NO:33)
Actin-探针：5’caccgagcgcggctacagct(SEQ ID NO:34)
表1：探针荧光定量PCR反应体系
4)实时荧光定量PCR对待检测样品及标准品进行扩增反应，反应体系如表1所示，反应程序为1、50℃2min；2、95℃10min；3、95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。制作标准曲线，根据标准曲线计算质粒残留量。拷贝数计算公式为PB拷贝数/Actin拷贝数*2。
结果如图15所示。电转质粒用量为5μg的正常用量情况下，细胞内的残留质粒的拷贝数随着时间急剧降低，在细胞培养至电转后第14天(3代以后)，平均每个Jurkat细胞中的残留质粒拷贝数已小于10，平均每个K562细胞和原代T细胞内的残留质粒拷贝数已小于5；培养至电转后第20天时，Jurkat细胞和K562细胞中平均每个细胞中的残留质粒拷贝数已经小于1。当电转质粒的用量减少为3μg时，电转后Jurkat细胞内残留的质粒含量与电转5μg质粒相比有了进一步的明显下降，在第10天时平均每个细胞内的质粒拷贝数即已低于10，而到第14天拷贝数已不到1。
以上结果表明本发明的载体在充分发挥其基因组整合功能的同时在宿主细胞中的残留水平非常低。同时结合实施例8的结果也表明，本发明的pKB系列载体能够在保证电转后高整合效率的前提下减少质粒DNA的用量，进而进一步减少电转后质粒DNA在细胞内的残留。
实施例10，pKB2003-EGFP载体电转后在细胞中的整合
按上述实施例2和实施例4记载的方法，分别对Jurkat细胞与K562细胞电转pKB2003-EGFP质粒，电转后第7、10、14天流式检测细胞阳性率。结果如图16显 示。电转pKB2003-EGFP的Jurkat细胞在第7天和第10天的阳性细胞比例分别达到49％和48％以上，在细胞培养3代后的第14天阳性率仍维持在接近48％的高水平。电转pKB2003-EGFP的K562细胞在第7天和第10天的阳性细胞比例都达到接近70％，在细胞培养3代后的第14天阳性率仍维持在超过66％的高水平。
以上结果表明，pKB2003载体能够在细胞中高效整合并表达外源基因。
实施例11，调控原件序列替换的pKB系列载体电转后在细胞中的整合
分别按实施例2、实施例4和实施例5记载的方法，将电转中质粒的用量降至3μg，分别对Jurkat细胞、K562细胞和来自健康人血液的PBMC电转pKB20I1-EGFP、pKB20A1-EGFP、pKB20A2-EGFP、pKB20U1-EGFP、pKB20U2-EGFP、pKB20U3-EGFP、pKB20U4-EGFP、pKB20U5-EGFP、pKB20U6-EGFP、pKB20U7-EGFP、pKB20U8-EGFP、pKB20E1-EGFP、pKB20E2-EGFP、pKB20E3-EGFP、pKB20E4-EGFP、pKB20P1-EGFP、pKB20P2-EGFP、pKB20P3-EGFP、pKB20P4-EGFP、pKB20P5-EGFP和pKB20P6-EGFP质粒，电转后第14天流式检测细胞阳性率，结果如表2所示。
表2调控原件序列替换的pKB系列载体在不同细胞的整合率
| Jurkat | K562 | 原代T细胞 | |
| pKB20I1-EGFP | 62.33％ | 70.43％ | 69.65％ |
| pKB20A1-EGFP | 64.02％ | 72.33％ | 72.55％ |
| pKB20A2-EGFP | 68.58％ | 69.27％ | 70.64％ |
| pKB20U1-EGFP | 70.05％ | 68.89％ | 68.25％ |
| pKB20U2-EGFP | 66.51％ | 70.97％ | 71.36％ |
| pKB20U3-EGFP | 62.11％ | 73.29％ | 72.01％ |
| pKB20U4-EGFP | 57.43％ | 71.82％ | 70.13％ |
| pKB20U5-EGFP | 58.27％ | 67.44％ | 69.81％ |
| pKB20U6-EGFP | 61.89％ | 69.49％ | 67.07％ |
| pKB20U7-EGFP | 59.65％ | 72.93％ | 69.12％ |
| pKB20U8-EGFP | 63.43％ | 72.01％ | 71.79％ |
| pKB20E1-EGFP | 62.72％ | 66.95％ | 65.23％ |
| pKB20E2-EGFP | 58.55％ | 68.39％ | 69.97％ |
| pKB20E3-EGFP | 69.79％ | 69.28％ | 72.17％ |
| pKB20E4-EGFP | 71.37％ | 71.03％ | 70.02％ |
| pKB20P1-EGFP | 66.75％ | 72.16％ | 70.69％ |
| pKB20P2-EGFP | 65.31％ | 70.06％ | 70.75％ |
| pKB20P3-EGFP | 70.03％ | 68.24％ | 71.53％ |
| pKB20P4-EGFP | 59.93％ | 69.14％ | 68.90％ |
| pKB20P5-EGFP | 65.47％ | 67.98％ | 69.74％ |
| pKB20P6-EGFP | 71.01％ | 72.09％ | 60.58％ |
表2结果显示，上述调控原件序列替换的pKB系列质粒载体均能够高效整合到不同细胞的基因组中，与pKB20-EGFP在上述各类细胞中的整合率处于同一水平。
实施例12，pKB205-EGFP载体电转原代T细胞后整合效率检测
按实施例5记载的方法，将电转中质粒的用量降至3μg，对来自健康人血液的PBMC电转pKB205-EGFP，电转后第7天和第14天流式检测细胞阳性率。
结果如图17所示。电转了pKB205-EGFP的T细胞在第7天的细胞阳性率超过42％，在电转后的第14天(培养3代)仍然维持在36％以上。说明pKB205-EGFP载体在电转原代T细胞后有较高的整合率和外源基因阳性表达率。
实施例13，pKB载体在Jurkat细胞和K562细胞中的整合位点分析
分别准备Jurkat细胞与K562细胞各两份，分别按照实施例2和实施例4记载的方法对两种细胞电转pKB20-EGFP质粒，电转后培养14天，收集细胞提取基因组DNA，委托晶能生物技术(上海)有限公司进行全基因组测序，分析EGFP在基因组上的插入位点分布情况。结果如图18-21和表3所示。图18、19、20和21分别为K562样本1、K562样本2、Jurkat样本1和Jurkat样本2中pKB20载体介导的基因组整合位点示意图。
表3 Jurkat和K562细胞中pKB20载体介导的整合位点位置分类统计
图18-21和表3中的结果显示，由本发明pKB20载体介导的外源基因细胞基因组整合主要集中发生在基因间区域和内含子区域，在外显子区和基因表达调控相关区域(如3’UTR)中整合位点较少。这表明由pKB20载体介导的外源基因在细胞基因组上的整合对细胞自身基因表达的影响非常小。
实施例14，pKB载体在Jurkat细胞与K562细胞中整合后mRNA表达谱分析
按上述实施例2和实施例4记载的方法，分别对Jurkat细胞与K562细胞电转pKB20-EGFP质粒，质粒用量4μg。电转后14天收获细胞进行mRNA测序与表达谱分析，并与未电转质粒的Jurkat细胞与K562细胞的mRNA表达谱进行比较。K562与Jurkat均送2份样本进行分析。
测序与分析结果显示，与各自未电转质粒的对照细胞相比，电转pKB20-EGFP后pKB20整合位点的相邻基因mRNA表达变化不大，相关基因差异表达情况如表4-7所示。这表明本发明pKB载体在基因组上的整合对细胞基因组的稳定性和基因表达谱的影响较小。
表4 K562样本1整合位点相邻基因的差异表达情况
| 相关基因名称 | 插入位点位置 | 是否差异表达 |
| DENND1B；C1orf53 | 基因间 | 否 |
| GNPAT；EXOC8 | 基因间 | 否 |
| ELK4 | 基因上游 | 表达下调 |
| MTRNR2L5；ZWINT | 基因间 | 否 |
| LPXN | 基因下游 | 否 |
| CCDC179；MIR8054 | 基因间 | 否 |
| LINC01995；ATP11B | 基因间 | 否 |
| LINC01267 | 基因上游 | 否 |
| NFKB1 | 基因下游 | 否 |
| LCORL；SLIT2 | 基因下游 | 否 |
| LINC01378；LINC02264 | 基因间 | 否 |
| LINC01378；LINC02264 | 基因间 | 否 |
| ATP10B | 基因下游 | 否 |
| CRHBP；AGGF1 | 基因间 | 否 |
| CRHBP；AGGF1 | 基因间 | 否 |
| TULP1；FKBP5 | 基因间 | 否 |
| ADGB | 基因下游 | 否 |
| LOC105374972；NRSN1 | 基因间 | 否 |
| LMX1B；ZBTB43 | 基因间 | 否 |
| PCDH11X；MIR4454 | 基因间 | 否 |
表5 K562样本2整合位点相邻基因的差异表达情况
| 相关基因名称 | 插入位点位置 | 是否差异表达 |
| TSPAN2 | 基因上游 | 否 |
| KHDRBS1 | 基因下游 | 否 |
| LINC00900；LOC101929011 | 基因间 | 否 |
| LINC01309；DAOA-AS1 | 基因间 | 否 |
| KIF2B；TOM1L1 | 基因间 | 否 |
| MIB1；GATA6-AS1 | 基因间 | 否 |
| TWSG1；RALBP1 | 基因间 | 否 |
| MCM5；RASD2 | 基因间 | 否 |
| MIR4465；NMBR | 基因间 | 否 |
| FNDC1；LOC102724053 | 基因间 | 否 |
| MGC4859；NDUFA4 | 基因间 | 否 |
| STOM；GGTA1P | 基因间 | 否 |
| FAM9A；FAM9B | 基因间 | 否 |
表6 Jurkat样本1整合位点相邻基因的差异表达情况
| 相关基因名称 | 插入位点位置 | 是否差异表达 |
| TMEM167B | 基因上游 | 否 |
| LOC441666 | 基因上游 | 否 |
| LINC01831；LOC100287010 | 基因上游 | 否 |
| PLSCR5；LINC02010 | 基因间 | 否 |
| MIR7641-2；KIAA1211 | 基因间 | 否 |
| CD83 | 基因上游 | 否 |
| LINC00972；GRM3 | 基因间 | 否 |
| STC1；ADAM28 | 基因间 | 否 |
| GPR174；ITM2A | 基因间 | 否 |
| NLGN4Y；NONE | 基因间 | 否 |
表7 Jurkat样本2整合位点相邻基因的差异表达情况
| 相关基因名称 | 插入位点位置 | 是否差异表达 |
| SFRP5；LINC00866 | 基因间 | 否 |
| LINC00558；LINC00458 | 基因间 | 否 |
| LINC01551；PRKD1 | 基因间 | 否 |
| EGLN3；SPTSSA | 基因间 | 否 |
| NFATC1；LOC284241 | 基因间 | 否 |
| IPO5P1；ZNF91 | 基因间 | 否 |
| AP2S1；ARHGAP35 | 基因间 | 否 |
实施例15，pKB20-HER2CAR载体及HER2CAR-T细胞的制备
在pKB20的多克隆位点的XbaI与EcoRI位点间插入带有NFAT基序的EF1A启动子序列(SEQ ID NO:11)，在EcoRI和SalI位点之间插入HER2CAR的编码序列(SEQ ID NO:43)，命名为pKB20-HER2CAR，带有NFAT基序的EF1A启动子序列与HER2CAR的编码序列委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。
按以下步骤用pKB20-HER2CAR载体对从外周血中分离的PBMC进行电转，制备靶向HER2的CAR-T细胞，所用PBMC购自AllCells公司，来自健康成年人外周血。
1)将悬浮细胞收集到50ml离心管中，1200rmp，离心3min；
2)弃上清，加入生理盐水重悬，1200rmp，离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤，细胞计数；
3)取2个1.5ml离心管，每管加入5×10
6个细胞，1200rmp，离心3min；
4)弃上清，取电转试剂盒(购买于Lonza公司)，加入18μL的solution I试剂和82l的solution II试剂，第1管加入5μg pKB20空载质粒用作对照，第2管加入5μg pKB20-HER2CAR质粒；
5)将离心管中混合有质粒的细胞悬液转移至电转杯中，放入电转仪，选取程序T020，进行电击；
6)使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好AIM-V培液的十二孔板中(含2％FBS的AIM-V培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养；同时用含有5μg/mL HER2胞外区抗原(义翘神州10004-H08H)和5μg/mL CD28抗体(ThermoFisher 14-0281-82)的混合液包被6孔板2个孔，每孔加入1mL，放置6孔板于37℃孵育。
7)6小时后，将电转后在37℃，5％CO2培养箱培养的细胞转入用HER2胞外区抗原和CD28抗体包被的六孔板中，并加入终浓度为100IU/mL IL-2，补加培液直3ml，培养4～5天后，观察T细胞的生长情况，将激活后的细胞转入含2％FBS的AIM-V培液继续培养至所需量，获得HER2CAR-T细胞；转入pKB20空载的细胞为作为对照的Mock-T细胞。
实施例16，HER2CAR-T细胞中CAR表达阳性细胞的检测
1)收集实施例15制备的HER2CAR-T细胞1×10
6个，1000rpm，离心3min；
2)弃上清，各加入生理盐水重悬细胞，1000rpm，离心3min；
3)弃上清，各加入100μL生理盐水重悬细胞，每管各加1μL生物素标记的HER2抗原(购自恺佧生物货号：HER-HM402)，4℃孵育30分钟；
4)各加入适量生理盐水，1000rpm，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
5)各加入100μL生理盐水重悬细胞，加1μL PE标记的链霉亲和素(购自ThermoFisher货号：S20982)，混匀，4℃孵育30min；
6)各加入适量生理盐水，1000rpm，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
7)用400μL生理盐水重悬，上流式细胞仪检测。
结果如图22所示，有高达93.41％的细胞显示为PE阳性，表明通过pKB20-HER2CAR质粒电转PBMC所制备获得的HER2CAR-T细胞中CAR表达阳性的细胞所占的比例在90％以上。
实施例17，HER2-CAR-T的细胞杀伤功能测试
应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例15获得的HER2CAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人卵巢癌细胞SKOV-3(购买于美国菌种保藏中心ATCC，HER2表达阳性)，按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养18h后，分别加入对照细胞Mock-T和效应细胞HER2CAR-T，每孔50μL，HER2CAR-T分别设置1:1、2:1、4:1三个效靶比，Mock-T设置效靶比为4:1，效靶比的设置均按活细胞总数计算，开始共培养，超过60h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图23所示，对照Mock-T细胞组的杀伤曲线与SKOV-3肿瘤细胞曲线的变化趋势接近，表明Mock-T细胞对SKOV-3细胞的杀伤效果较小。HER2CAR-T在1:1、2:1、4:1三个效靶比下对SKOV-3细胞的杀伤效果均十分明显，且杀伤效果随着效靶比的提升也有明显提升。
实施例18，pKB20-NY-ESO-1-TCR载体及NY-ESO-1 TCR-T细胞的制备
pKB20-NY-ESO-1-TCR载体的构建：
合成编码识别NY-ESO-1抗原肽SLLMWITQC(HLA-*02:01)的TCR的α链和β链的基因DNA序列，两者通过编码P2A肽段的DNA序列链接，所拼接成的序列如SEQ ID NO:44所示。再在SEQ ID NO:44的3’端通过编码P2A肽段的DNA连接编码EGFP的DNA序列，获得共价连接EGFP阅读框的NY-ESO-1-TCR基因，所得到的序列如SEQ ID NO:45所示。在pKB20的多克隆位点的XbaI与EcoRI位点间插入带有NFAT基序的EF1A启动子序列(SEQ ID NO:11)，在EcoRI和SalI位点之间插入共价连接EGFP阅读框的NY-ESO-1-TCR基因的编码序列(SEQ ID NO:45)，命名为pKB20-NY-ESO-1-TCR，带有NFAT基序的EF1A启动子序列与共价连接EGFP阅读框的NY-ESO-1-TCR基因的编码序列委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。
NY-ESO-1 TCR-T细胞的制备：
用含有5μg/ml的抗CD3抗体(ThermoFisher 14-0037-82)和5μg/ml的抗CD28抗体(ThermoFisher 14-0281-82)的包被液包被六孔板室温2-4小时，吸去包被液后用生理盐水洗涤孔板1-3次，加入含2％FBS AIM-V培养基待用；人外周血PBMC(HLA-*02:01，购买自ALLCELLS)37℃水浴复苏，将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；再将洗涤后的初始T细胞转移至盛有待用培养基的抗体包被孔中，37℃，5％CO2培养3～4天后进行后续实验。
电转制备表达NY-ESO-1 TCR-T细胞，步骤如下
1)预先将AIM-V培养基加入12孔板的2孔内，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO
2预热1小时；
2)按下表8进行每孔单次用量的电转液配比，配制2孔：
表8
| 100μL Nucleocuvette TM Strip(μL) | |
| Nucleofector TM溶液的体积 | 82 |
| 电转补充溶液 | 18 |
3)取获得的活化T细胞至2个EP管内，每个EP管内加入5×10
6个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；
4)向2)中配置好的2个孔电转液体系分别加入质粒pKB20-NY-ESO-1-TCR和pKB20-EGFP载体各4μg，随后室温静置30min以内；
5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬的2管活化T细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector
TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；
6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO
2培养，培养1h后加入化合物G150(购自MedChemExpress)至终浓度为5μM，随后继续培养13天，期间根据细胞增殖情况进行传代，13天后对各电转样品的细胞数量和细胞成活率进行检测，分别制得NY-ESO-1 TCR-T细胞和Mock-T细 胞。
实施例19，NY-ESO-1 TCR-T细胞NY-ESO-1 TCR表达阳性细胞的检测
1)收集实施例18制备的NY-ESO-1 TCR-T细胞1×10
6个，1000rpm，离心3min；
2)弃上清，各加入生理盐水重悬细胞，1000rpm，离心3min；
3)上流式细胞仪检测。
结果如图24所示，EGFP表达阳性的细胞比例为37.57％。NY-ESO-1 TCR的α链和β链的基因DNA序列以及EGFP的编码DNA序列三者间通过P2A肽段编码序列连接，EGFP表达阳性的细胞即可间接反映NY-ESO-1 TCR基因的表达。可以推测NY-ESO-1 TCR表达阳性的细胞比例在37％左右。
实施例20，NY-ESO-1 TCR-T的细胞杀伤功能测试
应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例18获得的NY-ESO-1 TCR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人恶性黑色素瘤细胞系A375(购买于美国菌种保藏中心ATCC，NY-ESO-1表达阳性)，按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养18h后，观察细胞指数，当细胞指数为1时，分别加入对照细胞Mock-T和效应细胞NY-ESO-1 TCR-T，每孔50μL，NY-ESO-1TCR-T设置0.25:1和0.5:1两个效靶比，Mock-T设置效靶比为0.5:1，效靶比的设置均按NY-ESO-1 TCR表达阳性细胞数计算，开始步骤3共培养，超过70h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图25所示，对照Mock-T细胞组的杀伤曲线与A375肿瘤细胞曲线基本重叠，表明Mock-T细胞对A375细胞的基本没有杀伤效果。NY-ESO-1 TCR-T在0.25:1和0.5:1两个效靶比下对A375细胞的杀伤效果均十分明显，且杀伤效果随着效靶比的提升也有明显提升。
对比例1，含EGFP表达框pNB载体在K562细胞中的整合
按照中国专利CN105154473B说明书第15页实施例1和说明书第16页实施例2记载的方法，分别构建pNB载体和pNB328-EGFP。按本申请实施例4记载的方法，用pNB328-EGFP通过电转法制备稳定整合表达EGFP的K562，电转后第14天(培养3代)流式检测EGFP表达阳性的细胞。
结果如图26所示，电转后14天EGFP表达阳性的K562细胞比例为45.54％。
对比例2，含EGFP表达框pNB载体在原代T细胞中的整合
按本申请实施例5记载的方法，用pNB328-EGFP通过电转法制备稳定整合表达EGFP的原代T细胞，电转后第14天(细胞培养3代)流式检测EGFP表达阳性的细胞。电转所用PBMC与实施例5所用PBMC为同一批PBMC。电转后14天(培养3代)流式检测EGFP表达阳性的细胞。
结果如图27所示，电转后14天EGFP表达阳性的T细胞比例为34.60％。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
- 一种核酸构建物，其包含以下元件或由其组成：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列，优选地，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：转座酶编码序列、控制该转座酶表达的启动子、多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因，优选地，所述转座酶编码序列、所述控制该转座酶表达的启动子、所述5’UTR和所述第二polyA序列中的任一种或多种在所述转座子3’末端重复序列和所述转座子5’末端重复序列之间的区域以外。
- 如权利要求1所述的核酸构建物，其包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，优选地，所述核酸构建物还包含选自以下的一种或多种元件：多克隆插入位点、增强子、5’UTR、第二polyA序列和感兴趣的外源基因。
- 如权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第 一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列、5’UTR以及控制该转座酶表达的启动子，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、转座酶编码序列和第二polyA序列，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，或所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、增强子、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列，或所述核酸构建物依次包含：转座子3’末端重复序列、增强子、具有转录终止功能的绝缘子序列、多克隆插入位点、第一polyA序列、转座子5’末端重复序列、控制转座酶表达的启动子、5’UTR、转座酶编码序列和第二polyA序列。
- 如权利要求1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有选自以下的一项或多项特征：所述转座酶的表达框的方向与外源基因的表达框的方向相同或相反，所述转座酶的表达框的方向与转座子3’末端重复序列和转座子5’末端重复序列之间的序列的方向相同或相反，所述转座子5’末端重复序列与所述转座子3’末端重复序列的位置能够互换，所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列，所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列，所述增强子选自：CMV增强子序列、SV40增强子、人ε球蛋白5’HS2增强子、鸡β球蛋白基因5’HS4增强子，所述转座酶为PiggyBac转座酶，所述5’UTR选自C3基因、ORM1基因、HPX基因、FGA基因、AGXT基因、ASL基因、APOA2基因、ALB基因的5’UTR，所述启动子选自：CMV启动子、miniCMV启动子、CMV53启动子、miniSV40启动子、miniTK启动子、MLP启动子、pJB42CAT5启动子、YB_TATA启动子、EF1α启动子、SV40启动子、UbiquitinB启动子、CAG启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子，所述转座酶编码序列含有或者可操作地连接单拷贝或者多拷贝的核定位信号编码序列。
- 如权利要求1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有选自以下的一项或多项特征：所述转座子3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述转座子5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述多克隆插入位点的序列如SEQ ID NO:2所示，所述第一polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示，所述第二polyA序列如SEQ ID NO:3、13或16所示，所述增强子序列如SEQ ID NO:4、26-28中任一所示，所述绝缘子序列如SEQ ID NO:5或15所示，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；优选地，所述PiggyBac转座酶的编码序列如SEQ ID NO:7所示，所述5’UTR序列如SEQ ID NO:8、17-24中任一所示，所述启动子的序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:37-42中任一项所示；所述核定位信号为c-myc核定位信号；优选地，所述核定位信号具有SEQ ID NO:35所示的序列。
- 如权利要求1-3中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含SEQ ID NO:10或14所示序列，或所述核酸构建物是重组载体，优选地，所述核酸构建物是重组克隆载体或重组表达载体。
- 一种宿主细胞，包含(1)权利要求1-6中任一项所述的核酸构建物，和/或(2)权利要求1-6中任一项所述的核酸构建物的转座子3’末端重复序列与转座子5’末端重复序列之间的序列，优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述宿主细胞选自T细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞。
- 一种药物组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的核酸构建物或权利要求8所述的宿主细胞以及药学上可接受的辅料。
- 权利要求1-6中任一项所述的核酸构建物或权利要求7所述的宿主细胞在制备药物、试剂或工具中的用途或作为药物、试剂或工具的用途，所述药物、试剂或工具用于将外源基因表达框整合到靶细胞基因组中，或用于基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导或分化，优选地，所述靶细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述靶细胞选自免疫细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞和CHO细胞，进一步更优选地，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、CIK细胞、LAK细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、NK T细胞和γδT细胞中的任一种或多种。
- 一种将外源基因或其表达框整合到细胞基因组中的方法，包括将含有外源基因和任选的其启动子的权利要求1-6中任一项所述的核酸构建物导入所述细胞，和任选的在转座酶将外源基因或其表达框整合到细胞基因组的条件下孵育所述细胞，所述外源基因和任选的其启动子位于所述核酸构建物的多克隆插入位点中，优选地，所述转座酶是PiggyBac转座酶。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011085981.6A CN114317600A (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 |
| CN2020110859816 | 2020-10-12 | ||
| PCT/CN2021/123191 WO2022078310A1 (zh) | 2020-10-12 | 2021-10-12 | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116490217A true CN116490217A (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=81032834
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011085981.6A Pending CN114317600A (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 |
| CN202180069727.3A Pending CN116490217A (zh) | 2020-10-12 | 2021-10-12 | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011085981.6A Pending CN114317600A (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230383268A1 (zh) |
| EP (1) | EP4227414A1 (zh) |
| JP (1) | JP2023548957A (zh) |
| KR (1) | KR20230117726A (zh) |
| CN (2) | CN114317600A (zh) |
| WO (1) | WO2022078310A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143944A (zh) | 2021-11-17 | 2023-05-23 | 上海君赛生物科技有限公司 | 含gpi锚定区的膜表面蛋白 |
| CN116836301A (zh) * | 2022-07-08 | 2023-10-03 | 上海君赛生物科技有限公司 | 基于TGF-beta抗体的陷阱受体 |
| CN115927400A (zh) * | 2022-08-11 | 2023-04-07 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种含口蹄疫病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法和应用 |
| CN116327796B (zh) * | 2023-03-21 | 2024-02-02 | 无锡市第二人民医院 | YTHDF1调控LINC00900 m6A甲基化对胶质瘤干细胞生长和自我更新的影响 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7527966B2 (en) * | 2002-06-26 | 2009-05-05 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
| CN102943092B (zh) * | 2012-11-20 | 2014-12-10 | 西北农林科技大学 | 一种通用型PiggyBac转座子转基因载体及其制备方法 |
| ES2937052T3 (es) * | 2015-09-16 | 2023-03-23 | T Curx Gmbh | Sistema mejorado de transposón para la administración de genes |
| CN105154473B (zh) | 2015-09-30 | 2019-03-01 | 上海细胞治疗研究院 | 一种高效安全的转座子整合系统及其用途 |
| CN107523549A (zh) * | 2016-06-20 | 2017-12-29 | 上海细胞治疗研究院 | 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途 |
| WO2019046815A1 (en) | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Poseida Therapeutics, Inc. | TRANSPOSON SYSTEM AND METHODS OF USE |
-
2020
- 2020-10-12 CN CN202011085981.6A patent/CN114317600A/zh active Pending
-
2021
- 2021-10-12 US US18/248,865 patent/US20230383268A1/en active Pending
- 2021-10-12 EP EP21879354.5A patent/EP4227414A1/en active Pending
- 2021-10-12 KR KR1020237016093A patent/KR20230117726A/ko unknown
- 2021-10-12 WO PCT/CN2021/123191 patent/WO2022078310A1/zh active Application Filing
- 2021-10-12 JP JP2023546379A patent/JP2023548957A/ja active Pending
- 2021-10-12 CN CN202180069727.3A patent/CN116490217A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022078310A1 (zh) | 2022-04-21 |
| CN114317600A (zh) | 2022-04-12 |
| US20230383268A1 (en) | 2023-11-30 |
| JP2023548957A (ja) | 2023-11-21 |
| EP4227414A1 (en) | 2023-08-16 |
| KR20230117726A (ko) | 2023-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116490217A (zh) | 新型PiggyBac转座子系统及其用途 | |
| US20180265890A1 (en) | Efficient and safe transposon integration system and use thereof | |
| CN111278972B (zh) | 用于细胞遗传修饰的非整合型dna载体 | |
| CN101883845B (zh) | 工程树突细胞及其在癌症治疗中的应用 | |
| CN109890408A (zh) | 新表位疫苗组合物及其使用方法 | |
| US20160235787A1 (en) | Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells | |
| CN111205361B (zh) | 白介素21蛋白(il21)突变体及其应用 | |
| CN105481984B (zh) | 一种高效介导外源基因整合的转座酶及其用途 | |
| US20170218036A1 (en) | Innate immune system modification for anticancer therapy | |
| US20230383275A1 (en) | Sgrna targeting aqp1 rna, and vector and use thereof | |
| CN112940105B (zh) | HLA-A11限制性乙型肝炎病毒HBc141-151表位肽的T细胞受体及其应用 | |
| CN115806626B (zh) | 一种基于csf1的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用 | |
| CN111607006B (zh) | 武装靶向cxcr2配体的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
| CN115477704A (zh) | 一种基于lox1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用 | |
| EP4183872A1 (en) | Immunotherapy method of targeted chemokine and cytokine delivery by mesenchymal stem cell | |
| WO2022166771A1 (zh) | 3'utr的构建方法和应用 | |
| CN111358959B (zh) | Roquin1蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤的药物中的应用 | |
| CN109748974B (zh) | 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用 | |
| WO2022053050A1 (zh) | 能破坏细胞的氨基酸序列及相关核苷酸序列和相关的应用 | |
| CN116744951A (zh) | 一种包含溶瘤病毒的组合物及其在肿瘤治疗中的应用 | |
| CN113005090A (zh) | 共表达趋化因子和共刺激分子的dc细胞及其应用 | |
| CN117534767A (zh) | 靶向cldn6嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40092527 Country of ref document: HK |