CN101883845B - 工程树突细胞及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于治疗学领域。更具体地说，本发明提供了制备体外工程树突细胞的方法，该细胞在存在活化配体的条件下受基因表达调节系统的控制可以条件性地表达白细胞介素-12(IL-12)，及其在动物，其中包括人，体内用于治疗目的的应用。

Description

工程树突细胞及其在癌症治疗中的应用
发明背景
发明领域
本发明涉及用于癌症治疗的基因治疗领域。在一个实施方式中，本发明涉及条件性表达白细胞介素12(IL-12)的树突细胞的工程构建以及细胞的治疗应用。在另一实施方式中，本发明涉及条件性表达白细胞介素12(IL-12)和/或干扰素α(IFN-α)的树突细胞的工程构建以及细胞的治疗应用。
背景
本文所引用的各种专利、专利申请和出版物所公开的内容都已完整纳入本文作为参考。但是，本文任何参考文献的引用都不应被解释为承认这个参考文献可用作本发明的“在先领域”。
白细胞介素12(IL-12)是I型细胞因子家族的一个成员，参与多种生物学过程，其中包括而不限于保护性免疫反应和抑制肿瘤形成(Abdi等，2006；Adorini，1999；Adorini，2001；Adorini等，2002；Adorini等，1996；Akhtar等，2004；Akiyama等，2000；Al-Mohanna等，2002；Aliberti等，1996；Allavena等，1994；AlIi和Khar，2004；Alzona等，1996；Amemiya等，2006；Araujo等，2001；Arulanandam等，1999；Athie等，2000；Athie-Morales等，2004；Bertagnolli等，1992；Bhardwaj等，l 996；Biedermann等，2006；Brunda和Gately，1994；Buchanan等，1995；Romani等，1997；Rothe等，1996；Satoskar等，2000；Schopf等，1999；Thomas等，2000；Tsung等，1997；Wolf等，1994；Yuminamochi等，2007)。越来越多的证据表明IL-12是控制人类疾病(例如，癌症)的有希望的靶位。
基于IL-12对1型抗肿瘤NK细胞、CD4+T和CD8+T细胞的有效支持活性，尽管IL-12作为癌症治疗因子依然是有希望的(Trinchieri，2003)，但是已经报道的重组人IL-12(rhIL-12)在患者体内的毒性(Atkins等，1997)以及有限的可用于临床的GMP级rhIL-12来源都限制了以IL-12为基础的治疗方案的实施。因此，基因治疗方法代表更安全、更可行的治疗选择好像更合理。确实，I期临床研究发现肿瘤内或肿瘤旁注射以重组病毒(Sangro等，2004；Triozzi等，2005)或质粒(Heinzerling等，2005)为基础的IL-12cDNA，或者IL-12基因经过修饰的自身成纤维细胞(Kang等，2001)是安全的，而且能够被良好耐受。
但是，接受过这些基因治疗的黑色素瘤患者或其他多种癌症患者体内所发生的客观临床反应是罕见、多变和瞬时的，并且大多局限于治疗部位(Heinzerling等，2005；Kang等，2001；Sangro等，2004；Triozzi等，2005)。研究发现，在肿瘤部分或全部消失的病例中，肿瘤浸润性淋巴细胞出现的频率增加(Heinzerling等，2005；Sangro等，2004)，循环中的肿瘤特异性CD8+T细胞水平升高(Heinzerling等，2005)，这些结果与这些患者体内的抗原特异性T细胞的交叉激活效应增强相一致。
另外，还有几个剩余的问题需要解决，例如，以DC为基础的IL-12基因治疗相关的意外毒性以及瘤内给药后治疗性DC.IL-12迁移中潜在的IL-12依赖性的局限性。而且，与转导的DC产生IL-12的时效性有关的其他问题对于疗效来说是最重要的(Murphy等，2005)。
作为天然而受控的IL-12的来源，树突细胞(DC)能够最有效地交叉激活特异性T细胞(Berard等，2000)，因此，最近所报道的以DC为基础的IL-12基因治疗所获得的良好临床前疗效引起了人们的极大兴趣(Satoh等，2002；Tatsumi等，2003；Yamanaka等，2002)。例如，研究显示瘤内(i.t.)注射经过改造的可产生IL-12p70的DC(通过重组腺病毒感染)可使小鼠模型体内的广谱反应性的肿瘤特异性CD8+T细胞群的交叉激活显著增强，同时伴随着肿瘤被排斥(Tatsumi等，2003)。由于以前所使用的重组腺病毒编码CMV启动子控制下的mIL-12(rAd.cIL12，(Tatsumi等，2003))，经过改造的DC以组成型的方式产生IL-12，因而这个细胞因子早期在肿瘤损伤部位内产生的免疫学影响以及晚期在肿瘤引流淋巴结内产生的免疫学影响无法形成相应的治疗效果。因此，现在依然需要构建出能条件性表达IL-12的树突细胞。本发明提供了一种有前景的方法，可通过使用这种细胞获得疗效。
发明概述
本发明提供了一种重组载体，该载体编码具有IL-12功能的蛋白质，其表达受条件启动子的控制。在一个实施方式中，载体是编码IL-12p70的腺病毒载体，通过提供可溶性小分子配体如二酰基肼，例如RG-115819，RG-115830或RG-115932，能够条件性地活化控制该基因表达的启动子。该载体可以使DC受控制地表达IL-12(rAD.RheoIL12)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的载体，该载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在另一个实施方式中，本发明提供了一种条件性表达具有IL-12和/或IFN-α功能的蛋白质的载体，该载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸或编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
例如，本发明提供了一种条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的载体，该载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。本发明还提供了一种条件性表达具有IL-12和/或IFN-α功能的蛋白质的载体，该载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸和/或编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
本发明还提供了通过用条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的重组载体，例如，rAd.RhwoIL-12，修饰DC来制备条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的DC细胞群的方法。在另一实施方式中，本发明提供了通过用条件性表达具有IL-12和/或IFN-α功能的蛋白质的重组载体修饰DC来制备条件性表达具有IL-12和/或IFN-α功能的蛋白质的DC细胞群的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了制备条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的树突细胞群的方法，该方法包括通过将包含编码基因开关的多核苷酸的载体导入到所述树突细胞内来修饰至少一部分树突细胞，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在另一个实施方式中，本发明提供了制备条件性表达具有IL-12和或IFN-α功能的蛋白质的树突细胞群的方法，该方法包括通过将包含编码基因开关的多核苷酸的载体导入到所述树突细胞内来修饰至少一部分树突细胞，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，和/或编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
例如，本发明提供了制备条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的树突细胞群的方法，该方法包括通过将包含编码基因开关的多核苷酸的载体导入到所述树突细胞内来修饰至少一部分树突细胞，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。本发明提供了制备条件性表达具有IL-12和/或IFN-α功能的蛋白质的树突细胞群的方法，该方法包括通过将包含编码基因开关的多核苷酸的载体导入到所述树突细胞内来修饰至少一部分树突细胞，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，和或一个编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
本发明还提供了通过条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的重组载体，例如，rAd.RheoIL-12载体，的修饰能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的DC细胞群。研究发现，rAd.RheoIL-12感染的DC只有在提供了活化配体后才能够提高其IL-12的表达水平。另一个实施方式提供了通过条件性表达具有IL-12功能和/或IFN-α功能的蛋白质的重组载体的修饰能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质的DC细胞群。可用的配体包括而不限于RG-115830、RG-115932、RG-115819、RSL1以及其他二酰基肼。
在一个实施方式中，本发明提供了包含载体的体外工程树突细胞，其中的载体包含编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在另一个实施方式中，本发明提供了包含载体的体外工程树突细胞，其中的载体包含编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，和/或编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
例如，本发明提供了包含载体的体外工程树突细胞，其中的载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。本发明提供了包含载体的体外工程树突细胞，其中的载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，，和/或编码具有IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
本发明还提供了一种包含树突细胞群的药物组合物，其中树突细胞群通过条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的重组载体，例如，rAd.RheoIL-12载体，的修饰能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质。在另一实施方式中，本发明提供了一种包含树突细胞群的药物组合物，其中树突细胞群通过条件性表达具有IL-12功能和/或IFN-α功能的蛋白质的重组载体的修饰能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质
本发明还提供了癌症如黑色素瘤或胶质瘤的治疗方法。研究证明，当以重组cDNA载体的方式进行IL-12基因治疗时可在动物模型体内产生抗肿瘤效应(Faure等，1998；Sangro等，2005)，但是如果使用基因修饰的DC效果更好(Satoh等，2002；Svane等，1999；Tatsumi等，2003；Yamanaka等，2002)。然而到目前为止，使用质粒或病毒载体进行的IL-12基因治疗I期临床实验还未在癌症患者中取得可持续的客观的临床反应(Heinzerling等，2005；Kang等，2001；Sangro等，2004；Triozzi等，2005)。本文所描述的以DC为基础的IL-12基因治疗提供了一种有前景的治疗方式。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括(a)通过瘤内注射将体外工程树突细胞群注射到肿瘤微环境中，其中所述的树突细胞包含载体，该载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，以及(b)给予所述哺乳动物有效量的能够活化配体依赖性转录因子的配体；从而诱导具有IL-12功能的蛋白质表达并治疗所述的肿瘤。
例如，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括步骤：
(a)体外改造树突细胞使其条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质；
(b)通过瘤内注射将所述的体外工程树突细胞注射到肿瘤微环境中；以及
(c)给予所述哺乳动物有效量的活化配体；
从而诱导具有IL-12功能的蛋白质表达并治疗所述的肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括(a)通过瘤内注射将体外工程树突细胞群注射到肿瘤微环境中，其中所述的树突细胞包含载体，该载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一个操作性连接于启动子的转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个配体依赖性转录因子，以及(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质和/或IFN-α功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，以及(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体；从而诱导具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质表达并治疗所述的肿瘤。
例如，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括步骤；
(a)体外改造树突细胞使其条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质；
(b)通过瘤内注射将所述的体外工程树突细胞注射到肿瘤微环境中；以及
(c)给予所述哺乳动物有效量的活化配体；
从而诱导具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质表达并治疗所述的肿瘤。
本发明还提供了用于测定以工程DC为基础的治疗疗效的方法，该方法包括在开始治疗前测定患者体内的IFN-γ的表达水平或活性，从而得到一个对照水平，然后给予经过改造能够条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的DC和有效量的活化配体，进而测定IFN-γ的表达水平从而得到一个试验水平，通过比较对照水平与试验水平来确定治疗方案是否有效。
在一个实施方式中，本发明提供了测定以体外工程树突细胞为基础的治疗方案在患者体内的疗效的方法，该方法包括：
(a)在给予体外工程树突细胞前测定从需要该治疗的所述患者获得的第一生物样品中的干扰素γ的表达水平或活性水平或者表达水平和活性水平，从而得到一个对照水平；
(b)给予需要该治疗的患者体外改造的能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的树突细胞；
(c)给予需要该治疗的患者有效量的活化配体；
(d)在给予体外工程树突细胞和活化配体后测定从需要该治疗的所述患者获得的第二生物样品中的IFN-γ的表达水平或活性水平或者表达水平和活性水平，从而得到一个试验水平；以及
(e)比较IFN-γ的对照水平和试验水平，其中IFN-γ的表达、活性或者二者的试验水平相对于对照水平升高则说明治疗方案在需要该治疗的所述患者体内是有效的.
在另一实施方式中，本发明提供了诱导树突细胞条件性地表达具有白细胞介素12功能的蛋白质的方法，该方法包括：(1)给予需要该治疗的哺乳动物本发明的有效量的体外工程树突细胞群；以及(2)给予需要该治疗的哺乳动物有效量的能活化配体依赖性转录因子的配体.
在前期临床研究中对以前进行的BALB/c小鼠CMS4肉瘤模型上开展的研究做了扩展，结果发现瘤内注射预先感染Ad.cIL-12(组成型表达)的同系骨髓来源的DC可产生有效的肿瘤排斥(Tatsumi等，2003)。排斥与系统性CD8+T细胞介导的抗CMS4肿瘤免疫相关(Tatsumi等，2003)。
附图详述
图1显示的是载体rAd.RheoIL12的结构，其中E1和E3区已被删除，治疗系统(RTS)-IL-12元件取代了E1区。标记为“IL-12”的框代表IL-12p40和IL-12p35编码序列，二者由IRES分开。
图2A-2C显示的是在RG-115830存在的情况下条件性表达IL-12蛋白的工程DC。
图3A：显示的是工程DC注射到黑色素瘤微环境后24小时(h)内将RG-115830腹膜内注射到已建立7天的携带B16皮下肿瘤的C57B1/6小鼠体内所引起的肿瘤消退效应。3B-3C：肿瘤消退效应只发生在DC注射后1-5天给予RG-115830时，而DC注射后1-2天或1-3天给予RG-115830未出现肿瘤消退。
图4显示的是DC注射后24小时内腹膜内注射活化配体肿瘤和肿瘤引流淋巴结内的工程DC存活时间延长，而在48小时注射存活的DC细胞少，72小时注射没有存活的DC。
图5A显示的是如果在注射工程DC后24小时内给予活化配体工程DC将明显促进外周抗B16CD8+T细胞的活化。图5B显示的是以前黑色素瘤已被治愈的无肿瘤小鼠在45天(B16初次接种后)时从新接种相关的B16黑色素瘤细胞或MC38结肠癌细胞，所有小鼠都产生了抗B16肿瘤细胞的特异性保护效应，但是却不能产生抗MC38结肠癌细胞的保护效应。
图6显示的是通过腹膜内或口服给予配体所诱导的治疗效应。
图7显示的是小鼠存活率的Kaplan-Meier曲线，代表给小鼠胶质瘤(GL261)瘤内注射树突细胞后的结果，其中树突细胞用编码IL-12和/或IFN-α的多核苷酸转导，该核苷酸受RTS的控制。图中的缩写词如下：Ad-IFNa代表组成型表达IFNα的腺病毒载体；Ad-RTS-IFNa代表编码受RTS控制的IFN-α的腺病毒载体；Ad-RTS-IFNa无配体代表包含RTS和IFN-α的腺病毒载体，其中没有活化配体存在；Ad-IFNa/IL-12代表用编码IFN-α和IL-12的腺病毒载体转导的DC；以及Ad-RTS-IFNa/IL-12代表了编码RTS控制下的IFN-α和IL-12的两个腺病毒载体的DC。
图8显示的是腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12的图谱。
图9显示的是以不同的MOI和不同的病毒吸附持续时间转导腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12后人树突细胞所产生的IL-12。以不同的MOI和不同的病毒吸附持续时间将腺病毒导入人DC后的结果表明以500的MOI使病毒吸附3小时可以有效转导这些细胞。活化药物(“AD”或“活化配体”)可诱导这些转导的人树突细胞表达IL-12。
图10显示的是包含不同IL-12的腺病毒载体的效应比较。SP1-RheoIL-12突变株是包含Rheo开关的最有效突变株。Sp1-RheoIL-12与oldRheoIL-12的不同之处在于前者用RAPAd载体骨架(ViraQuest)代替了AdEasy-1载体骨架。同样，TTR-RheoIL-12与oldRheoIL-12的不同之处在于前者一个位于Gal4结合位点下游的TTR微小启动子，取代了合成的微小启动子和Sp1结合位点，载体骨架是RAPAd(ViraQuest)。如图10所示，Sp1-RheoIL-12与oldRheoIL-12相似，但是比TTR-RheoIL-12能更有效地缩小B16黑色素瘤的大小。
图11显示的是曾经用包含重组腺病毒Rheo开关可诱导IL-12的树突细胞处理的小鼠再次接种B16黑色素瘤细胞后没有形成肿瘤。这说明当B16免疫小鼠在首次接种B16细胞后45天再次接种可以阻止B16黑色素瘤生长达25天。小鼠树突细胞来源于B6小鼠的骨髓，在含rmIL-4和rmGM-CSF的完全培养基(RPMI-1640，10％FBS)中培养7天。然后按照厂家的说明书(MB公司(Miltenyi Biotech))用特异性的MACS磁珠分离CD11c阳性树突细胞，在将10E6DC注射到已建立9天的皮下B16黑色素瘤内之前(每组5只小鼠，肿瘤位于右腹部)24小时以100MOI的rAd.IL-12(RheoIL-12对SP1对TTR)感染DC。在DC注射后的0-4天内小鼠用或不用每日腹膜内注射活化配体RG-115830处理(30mg/kg，溶于50μl DMSO)。每3-4天测量一次肿瘤尺寸，利用正交直径计算，记录为平方毫米(mm2)。为了评价与治疗相关的保护作用的特异性，所有无肿瘤动物都在初次接种B16肿瘤后45天在左腹部再次接种10E5B16黑色素瘤细胞，在右腹部接种MC38结肠癌细胞。MC38肿瘤形成了而B16肿瘤没有形成。
图12显示的是注射到B16肿瘤内的不同树突细胞数(10E5，10E6，10E7)和不同配体给予时间(6天或13天)之间的比较，以及B16黑色素瘤小鼠模型内产生的肿瘤消退效应。在25天期间，每日给予配体，连续13天，结合10E7树突细胞在诱导肿瘤消退效应方面是最有效的。
图13显示的是本文所述的治疗与消耗引起的动物体重下降无关。消耗和体重下降通常与高水平的干扰素-γ和INF-α相关，大家都知道二者的表达上调是对IL-12的反应。
图14显示的是曾经用包含重组腺病毒Rheo开关可诱导IL-12的树突细胞和活化配体RG-115932处理的小鼠再次接种B16黑色素瘤细胞后没有形成肿瘤。在5只同系B6小鼠右腹部皮下注射B16黑色素瘤细胞后7天可形成B16黑色素瘤。在第7天时，以105、106或107的剂量瘤内(i.t.)注射DC.SP1-IL-12(骨髓来源的DC，用SP1最佳开关以100MOI感染)。在注射DC的那一天通过腹膜内注射开始给予RG-115932(然后每日注射，持续6天或13天)。每个队列包含5只动物，每3-4天测量一次肿瘤生长情况，报告为平均尺寸(根据正交测量值计算mm2)。在测量肿瘤的同时测定每只动物的体重(图13)。在第50天时(初次接种B16肿瘤后)，经过任何治疗而未发生疾病的所有动物都再次接种肿瘤细胞，在原始肿瘤的对侧(左腹部)接种105B16黑色素瘤细胞，在右腹部接种105MC38结肠癌细胞。每3-4天测量一次肿瘤生长情况，比较无免疫(未处理)动物所产生的肿瘤生长抑制效应(参见图12)。因此，图14显示的是当B16免疫小鼠再次接种B16细胞时B16黑色素瘤的生长可被抑制达24天。图14还显示B16无免疫小鼠没有获得保护作用而避免肿瘤的形成，正如MC38免疫小鼠和MC38无免疫小鼠一样。MC38是本领域熟知的结肠癌。这说明通过将含重组腺病毒可诱导IL-12的树突细胞注射到原始B16肿瘤内可诱导产生特异性免疫反应。
图15显示的是转导Ad-RTS-mIL-12的小鼠树突细胞内的活化药物(RG-115932)剂量依赖性的IL-12表达情况。
图16显示的是转导Ad-RTS-mIL-12的HT1080细胞内RG-115932存在与否所导致的mIL-12表达的开/关反应。
图17显示的是在存在或缺乏活化药物(AD)的条件下通过瘤内注射腺病毒转导的DC进行免疫诱导的CD8+T细胞反应所对应的抗肿瘤效应。
图18显示的是三个志愿者转导腺病毒载体后其人DC内诱导产生的人IL-12，其中腺病毒载体编码受RTS控制的人IL-12。
序列详述
SEQ ID NO：1是野生型小鼠IL-12p35基因的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是野生型小鼠IL-12p40基因的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是野生型人IL-12p35基因的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是野生型人IL-12p40基因的全长核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是野生型小鼠IL-12p35蛋白的全长多肽序列。
SEQ ID NO：6是野生型小鼠IL-12p40蛋白的全长氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是野生型人IL-12p35蛋白的全长氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是野生型人IL-12p40蛋白的全长氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是果蝇属内发现的蜕皮激素反应元件的DNA序列。
SEQ DD NO：10是黑腹果蝇内发现的蜕皮激素反应元件的DNA序列。
SEQ ID NO：11是黑腹果蝇内发现的蜕皮激素反应元件的DNA序列。
SEQ ID NO：12是归巢内切核酸酶(HE)内的I-Scel限制性酶切位点。
SEQ ID NO：13包含人IL-12编码序列的腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)的DNA序列。
干扰素α(IFN-α)的氨基酸序列可在公共数据库中找到，检索号是AAA52724，该序列已纳入本文作为参考。还可参见Capon等，MoI.Cell.Biol.5，768-779(1985)。
发明详述
除非另外定义，本文所用的本领域的所有术语、符号和其他科学术语或专有名词都与本发明所属领域的技术人员所理解的常用意义相同。在某些情况下，为了澄清和/或为了便于参考和理解，本文以通常理解的意思定义了术语，本文的这种定义的内容不应被理解为必然意味着与本领域通常所理解的有实质差别。分子生物学术语和/或方法和/或方案通常所理解的定义可在Rieger等，《经典遗传学和分子遗传性词典》(Glossary of Genetics：Classical andMolecular)，第5版，纽约SV出版社(Springer-Verlag：New York)，1991；Lewin，《基因V》(Genes V)，牛津大学出版社：纽约，1994；Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)以及Ausubel等，《当代分子生物学手册》(Current Protocols inMolecular Biology)(1994)中找到。使用商品化试剂盒和/或试剂过程中用到的方法通常按照厂家的指导和/或说明书和/或参数执行，除非另外说明。
本发明所用的术语“游离的”用于定义已从其原始环境(其天然存在的环境)中提取出来的生物学材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如，以天然状态存在于植物或动物内的多核苷酸不是游离的，但是当同一多核苷酸从其天然存在的临近核酸中分离出来后就被认为是“游离的”。
术语“纯化的”用于生物学材料时不要求该材料以绝对纯的形式存在，没有其他化合物的存在。它是一个相对的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交互使用，是指以单链形式或双链螺旋形式存在的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子)的磷酸酯聚合物形式或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。也可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA。术语核酸分子，尤其是DNA或RNA分子只是指分子的一级和二级结构，并不局限于任何特定的三级形式。因此，这个术语包括线性或环状DNA分子(例如，限制性酶切片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中存在的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，可以根据常规延DNA的非转录链(即，包含与mRNA同源的序列的那条链)从5’到3’方向描述本文的序列。“重组DNA分子”是指经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包括而不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成的DNA和半合成的DNA。
术语“片段”应用于核苷酸序列时是指相对于参考核酸长度缩短的核苷酸序列，在其共有部分包含与参考核酸一致的核苷酸序列。本发明的这种核酸片段在适当的时候可以包含在更大的多核苷酸内，是其组成部分。这种片段包含长度范围从本发明核酸的至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多连续核苷酸的寡核苷酸，或者说由这些连续核苷酸组成。
在本文中，“游离核酸片段”是指RNA或DNA的聚合物，单链或双链，还可以包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的游离核酸片段可包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段。
“基因”是指包含核苷酸的编码功能性分子的多核苷酸，其中包括通过转录(例如，生物活性RNA)或转录和翻译(例如，多肽)产生的功能性分子。术语“基因”包含cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特异性RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其中包括前端的(5’非编码序列)和后端的(3’非编码序列)调节序列。“天然基因”是指包含其自身调节序列的自然界中存在的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，其中包含自然界中不存在的调节序列和/或编码序列。相应的，嵌合基因可包含不同来源的调节序列和编码序列，或者同一来源的调节序列和编码序列，但是其排列方式与自然界中存在的方式不同。嵌合基因可包含不同来源的编码序列和/或不同来源的调节序列。“内源基因”是指处于生物体基因组的天然位置上的天然基因。“外源基因”是指正常情况下宿主生物体内不存在但是通过基因转移被导入到宿主生物体内的基因。外源基因包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。“转基因”是指已通过转化程序导入到基因组内的基因。例如，白细胞介素-12(IL-12)基因编码IL-12蛋白。IL-12是35-kD亚单位(p35)和40-kD亚单位(p40)的异源二聚体，两个亚单位以二硫键相连形成完整的功能性IL-12p70。IL-12基因编码p35和p40两个亚单位。
“异源DNA”是指存在于细胞或细胞的染色体内非天然位置的DNA。异源DNA还包括对于细胞来说是异源的基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
当核酸分子的一条链能在合适的温度和溶液离子强度条件下与其他核酸分子复性时则说明该核酸分子可与另一核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA杂交。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，在Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，(1989)中有描述，特别是其中的11章和表11.1。温度和离子强度决定了杂交的“严格程度”。
可以通过调整严格条件来筛选适度相似的片段，例如亲缘关系较远的生物体来源的同源序列，与高度相似的片段杂交，如可复制亲缘关系较近的生物体来源的功能性酶的基因。在初筛同源核酸时，可使用Tm为55℃的相应的低严格杂交条件，例如，5X SSC，0.1％SDS，0.25％乳以及无甲酰胺；或30％甲酰胺，5X SSC，0.5％SDS。中等严格的杂交条件对应于较高的Tm，例如40％甲酰胺和5X或6X SSC。高严格杂交条件对应于最高的Tm，例如50％甲酰胺、5X或6X SSC。
杂交需要含互补序列的两个核酸，尽管杂交的严格程度不同，碱基之间发生错配是有可能的。术语“互补的”用于描述能够杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA来说，腺苷与胸苷互补，胞苷和鸟苷互补。相应的，本发明还包括与本文所公开的或所使用的完整序列以及那些实质相似的核酸序列互补的游离核酸片段。
在本发明的一个实施方式中，通过采用杂交条件和利用上面所述的条件来检测多核苷酸，其中杂交条件包括在Tm为55℃的杂交步骤。在其他实施方式中，Tm为60℃、63℃或65℃。
杂交后的洗涤也决定了杂交条件的严格程度。一套杂交条件采用了一系列的洗涤，以6X SSC、0.5％SDS室温洗涤15分钟开始，然后利用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃洗涤30分钟，共洗涤两次。一套优选的严格条件采用了较高的洗涤温度，其中洗涤条件与上述条件一样，只是最后用0.2X SSC、0.5％SDS洗涤30分钟的两步在60℃下进行。另一套优选的高严格条件最后两步洗涤用的是65℃，0.1X SSC，0.1％SDS。
核酸杂交的合适严格条件根据核酸的长度和互补程度而定，这些变量是本领域所熟知的。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越高，包含这些序列的核酸杂合子所需要的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)以如下顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合子来说，已有计算Tm的公式(参见Sambrook等，同上，9.50-0.51)，对于较短的核酸，如寡核苷酸，的杂交来说，错配的位置更重要，寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
在本发明的一个实施方式中，检测多核苷酸所用的杂交条件包括低于500mM的盐、至少37℃的杂交步骤和2X SSPE、至少63℃的洗涤步骤。在另一实施方式中，杂交条件包括低于200mM的盐和至少37℃的杂交步骤。在另一实施方式中，杂交条件包括杂交步骤和洗涤步骤都采用2X SSPE和63℃。
在另一实施方式中，可杂交的核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交的核酸的优选最小长度为至少约15个核苷酸；例如，至少约20个核苷酸；例如，至少约30个核苷酸。另外，技术人员会认识到温度和洗涤溶液盐浓度跟根据某些因素如探针的长度进行调整。
术语“探针”是指能与互补单链靶核酸进行碱基配对形成双链分子的单链核酸分子。
在本文中，术语“寡核苷酸”是指可与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的短核酸。寡核苷酸可被标记，例如用32P-核苷酸或已共价连接上标记物如生物素的核苷酸。标记的寡核苷酸可作为探针用于检测是否存在核酸。寡核苷酸(一条链或两条链都被标记)可用做PCR引物，用于克隆全长核酸或其片段、DNA测序、或用于检测核酸是否存在。寡核苷酸还能用于和DNA分子形成三螺旋。一般而言，寡核苷酸可通过合成来制备，优选用核酸合成仪。相应的，寡核苷酸可用非天然的磷酸酯类似物键来制备，例如硫酯键等。
“引物”是指可与靶核酸序列杂交形成双链核酸区的寡核苷酸，其中的双链核酸区可作为合适条件下进行DNA合成的起始位点。这种引物可用于聚合酶链式反应或DNA测序。
“聚合酶链式反应”可以缩写为PCR，是指一种体外酶催化扩增特异性核酸序列的方法。PCR包括一系列的重复温度循环，每一循环包括三个阶段：模板核酸变性分离出靶分子链，单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸复性，以及DNA聚合酶催化复性的引物延伸。PCR提供了一种检测靶分子是否存在的方法，在定量或半定量条件下可以确定核酸起始材料内靶分子的相对量。
“反转录聚合酶链式反应”可以缩写为RT-PCR，是指一种从RNA分子体外酶催化合成靶cDNA分子，然后酶催化扩增上述靶cDNA分子内的特异性核酸序列的方法。RT-PCR也提供了一种检测靶分子是否存在的方法，在定量或半定量条件下可以确定核酸起始材料内靶分子的相对量。
DNA“编码序列”是指编码多肽的双链DNA序列，将该序列置于合适的调节序列的控制之下可以在体外或体内的细胞内将该序列转录并翻译成多肽。“合适的调节序列”是指位于编码序列上游(5’非编码区)、编码序列内或下游(3’非编码区)的核苷酸序列，该序列可影响相关编码序列的转录、RNA处理或稳定性、或者翻译。调节序列包括启动子、翻译先导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA处理位点、效应子结合位点和茎环结构。编码序列的边界是由5’端(氨基端)的起始密码子和3’端(羧基端)的翻译终止密码子决定的。编码序列可包括而不限于原核序列、mRNA来源的cDNA、基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。如果编码序列要在原核细胞内表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
“开放读框”可缩写成ORP，是指包含翻译起始信号或起始密码子如ATG或AUG、终止密码子以及可翻译成多肽序列的核酸序列，DNA、cDNA或RNA。
术语“头-对-头”在本文中用于描述两个多核苷酸序列方向的相互关系。当一个多核苷酸编码链的5’端与另一多核苷酸编码链的5’端相邻从而一个多核苷酸的转录逐渐远离另一个多核苷酸的5’端时说明这两个多核苷酸处于头-对-头方向。术语“头-对-头”可以缩写成(5′)-对-(5′)，也可以用符号(←→)或(3′←5′5′→3′)表示。
术语“尾-对-尾”在本文中用于描述两个多核苷酸序列方向的相互关系。当一个多核苷酸编码链的3’端与另一多核苷酸编码链的3’端相邻从而一个多核苷酸的转录朝向另一个多核苷酸时说明这两个多核苷酸处于头-对-头方向。术语“尾-对-尾”可以缩写成(3′)-对-(3′)，也可以用符号(→←)或(5′→3′3′←5′)表示。
术语“头-对-尾”在本文中用于描述两个多核苷酸序列方向的相互关系。当一个多核苷酸编码链的5’端与另一多核苷酸编码链的3’端相邻从而一个多核苷酸的转录与另一个多核苷酸以同一个方向进行时说明这两个多核苷酸处于头-对-尾方向。术语“头-对-尾”可以缩写成(5′)-对-(3′)，也可以用符号(→→)或(5′→3′5′→3′)表示。
术语“下游”是指位于参考序列3’端的核苷酸序列。更具体地说，下游核苷酸序列通常指转录起始位点后面的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“上游”是指位于参考序列5’端的核苷酸序列。更具体地说，上游核苷酸序列通常指位于编码序列或转录起始位点5’一侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起始位点的上游。
术语“限制性内切酶”和“限制性酶”可交互使用，是指能与双链DNA内的特异性序列结合并将其切开的酶。
“同源重组”是指外源DNA序列往另一个DNA分子内的插入，例如，载体往染色体内的插入。优选的是，载体可靶向性地插入到同源重组特异性的染色体位点内。为了特异性同源重组，载体可包含与染色体序列同源的足够长的区以便于载体与染色体的互补结合并插入到染色体内。同源区越长，序列相似程度越高，同源重组的效率越高。
本领域已知的几种方法可用于扩增本发明的多核苷酸。一旦建立了合适的宿主系统和培养条件，就能够扩增和定量制备重组表达载体。在本文中，可以使用的表达载体包括而不限于下列载体或其衍生物：人或动物病毒如疫苗病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ噬菌体，以及质粒和粘粒DNA载体，还有很多就不一一列举了。
“载体”是指用于克隆核酸或将核酸转移到宿主细胞内的任何工具。载体可以是复制子，可以连接于另一个DNA片段上以复制其连接的片段。“复制子”是指能作为DNA复制的自主单位发挥功能的任何遗传元件(例如，质粒，噬菌体，粘粒，染色体，病毒)，即，能在其自身控制下复制。术语“载体”包括用于将核酸导入到体外或体内细胞内的病毒和非病毒载体。本领域熟知的许多载体都可用于操作核酸、在基因内插入反应元件和启动子等。可能的载体包括，例如，质粒或经过修饰的病毒，例如噬菌体如λ噬菌体衍生物，或者质粒如pBR322或pUC质粒衍生物，或者Bluescript载体。可用于本发明的载体的其他例子有WO 2007/038276所描述的UltraVectorTM Production System(IntrexonCorp.，Blacksburg，VA)。例如，通过将合适的DNA片段连接于选择出的具有互补黏性末端的载体内可以完成反应元件和启动子相应的DNA片段向合适载体内的插入。另外，DNA分子的末端可通过酶催化修饰，或者通过在DNA末端连接核苷酸序列(连接子)形成任何位点。这种载体经过改造后可包含可筛选的标记物基因，标记物基因可用于筛选标记物已插入到细胞基因组内的细胞。这种标记物可用于鉴定和/或筛选已插入标记物基因并表达标记物基因所编码蛋白的宿主细胞。
病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已被广泛地用于将基因导入到细胞以及活体动物体内。可用的病毒载体包括而不限于逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、疫苗病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、腺病毒、双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物以及生物聚合物。除了核酸以外，载体还可以包含一个或多个调节区、和/或用于筛选、检测和监测核酸转移结果的筛选标记物(其转移的目的组织，表达持续时间等)。
术语“质粒”是指一种染色体外元件，通常携带非细胞中央代谢物部分的基因，常见的是以环状双链DNA的形式存在。这种元件可以是来源于任何资源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性、环状或超螺旋单链或双链DNA或RNA，其中已有多个核苷酸序列被连接或重组到独特构建体内，该构建体能将启动子片段和编码目的基因产物的具有合适3’非翻译序列的DNA序列导入到细胞内。
“克隆载体”是指“复制子”，是能连续复制的一个单位长度的核酸，优选DNA，包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，可以连接上另一个核酸片段以复制所连接的片段。克隆载体能在一种类型的细胞内复制，而在另一种细胞内表达(“穿梭载体”)。克隆载体可包含一个或多个用于筛选含载体的细胞的序列和/或一个或多个用于插入目的序列的多克隆位点。
术语“表达载体”是指设计出的能在转化到细胞内后表达所插入的核酸序列的载体、质粒或转移工具。被克隆的基因，即插入的核酸序列，通常位于控制元件如启动子、微小启动子、增强子等的控制之下。用于启动核酸在目的宿主细胞内表达的起始控制区或启动子有很多，也是本领域技术人员所熟知的。事实上，能驱动这些基因表达的任何启动子都可用于表达载体，其中包括而不限于病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成的启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、致病性或疾病相关启动子、发育特异性启动子、可诱导启动子、光调节启动子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TP1、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母内表达)；AOX1启动子(用于在毕赤酵母内表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、let、trp、1PL、1PR、T7、tac和trc启动子(用于在大肠杆菌内表达)；光调节的-、种子特异性的-、花粉特异性-、子房特异性的-花椰菜花叶病毒35S、CMV 35S微小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、茎特异性的、根特异性的、壳多糖酶、应激可诱导的、水稳东格兽球状病毒、植物超级启动子、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露氨酸合成酶、胆脂碱合成酶、泛素、玉米醇溶蛋白和花青苷启动子(用于在植物细胞内表达)；本领域熟知的动物和哺乳动物启动子，其中包括而不限于SV40早期(SV40e)启动子区、Rous肉瘤病毒3’长末端重复序列所含的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSC)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子和转录控制区的调节序列、普遍存在的启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝的启动子(结蛋白、神经纤丝、角蛋白、GFAP等)、治疗性基因的启动子(MDR、CFTR或VIII型因子等)、致病性或疾病相关启动子以及具有组织特异性并被用于转基因动物的启动子，如在胰腺腺泡细胞内有活性的弹性蛋白I基因控制区；在胰腺β细胞内有活性的胰岛素基因控制区、在淋巴细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区、在睾丸、乳腺、淋巴细胞和肥大细胞内有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区；在肝脏内有活性的白蛋白基因、Apo AI和Apo AII控制区、在肝脏内有活性的甲胎蛋白基因控制区、在肝脏内有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区、在髓系细胞内有活性的β球蛋白基因控制区、在脑的少突胶质细胞内有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区、在骨骼肌内有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区以及在下丘脑内有活性的促性腺激素释放激素基因控制区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白的启动子等。另外，还可以通过添加增强子或调节序列等来修饰这些表达序列。
利用本领域熟知的方法可以将载体导入到期望的宿主细胞内，例如，转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、钙磷酸盐沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白(参见，例如，Wu等，J.Biol.Chem.267：963(1992)；Wu等，J.Biol.Chem.265：14621(1988)；以及Hartmut等，加拿大专利申请No.2,012,311)。
本发明的多核苷酸还可以通过脂质转染导入到体内。在过去十年中，利用脂质体体外包裹和转染核酸得到了越来越多的应用。用于减少脂质体介导的转染所遇到的困难和危险而设计出的合成阳离子脂质可被用于制备体内转染标记物编码基因所用的脂质体(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：8027(1988)；以及Ulmer等，Science 259：1745(1993))。使用阳离子脂质可促进带负电荷的核酸的包裹，还能增强与带负电荷的细胞膜融合(Feigner等，Science 337：387(1989))。可用于转移核酸的优选脂质化合物在WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127中有描述。利用脂质转染将异源基因导入到体内的特定器官具有某些实际的优点。脂质体靶向性地导入到特定细胞内就代表了这种优点的一个方面。具有细胞异质性的组织如胰腺、肝脏、肾和脑特别优选直接转染到特定类型的细胞内。脂质可以化学偶联到其他分子上以达到靶向性的目的(Mackey等，1988，同上)。靶向性的肽如激素或神经递质以及蛋白质如抗体或非肽分子可以化学偶联到脂质体上。
其他分子也可用于促进核酸在体内的转染，如阳离子寡肽(例如，WO95/21931)、DNA结合蛋白来源的肽(例如，WO96/25508)或阳离子聚合物(例如，WO95/21931)。
以裸DNA质粒的形式将载体导入到体内也是可能的(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。受体介导的DNA转移方法也可以使用(Curiel等，Hum.Gene Ther.5：147(1992)以及Wu等，J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
术语“转染”是指外源或异源RNA或DNA被细胞摄取。细胞已经是被外源或异源RNA或DNA“转染的”是指这种RNA或DNA已被导入到细胞内。细胞已经是倍外源或异源RNA或DNA“转化的”是指转染的RNA或DNA引起了细胞表型的变化。转化RNA或DNA可整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA内。
“转化”是指核酸片段转移到宿主有机体的基因组内，产生遗传稳定性的遗传。包含转化核酸片段的宿主有机体被称为“转基因”或“重组”或“转化”有机体。
另外，包含本发明的多核苷酸的重组载体可含一个或多个在宿主细胞内复制所需的起始位点、标记物或可筛选标记物，其中多核苷酸的扩增或表达是可见的。
术语“可筛选标记物”是指一种能根据标记物基因的效应进行筛选的鉴定因子，通常是抗生素或化学耐药基因，即对抗生素耐受、对除草剂耐受，生色标记物、酶、荧光标记物等，其中标记物基因所产生的效应可用于追踪目的核酸的遗传性和/或鉴定已遗传了目的核酸细胞或有机体。本领域熟知并已应用的可筛选标记物基因的例子包括：可产生氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、氨苯磺胺等耐药性的基因；以及可作为表型标记物的基因，即，花青素调节基因、异戊烯基转移酶基因等。
术语“报告基因”是指编码鉴定因子的核酸，根据报告基因的效应可以鉴定鉴定因子，其中报告基因的效应可用于追踪目的核酸的遗传性、鉴定已遗传了目的核酸细胞或有机体和/或测定基因表达的诱导或转录。本领域熟知并已应用的报告基因的例子包括：荧光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可筛选标记物基因也可被认为是报告基因。
“启动子”和“启动子序列”可交互使用，是指能控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来说，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以是来源于天然基因的完整启动子，或者由天然存在的不同启动子来源的不同元件组成，甚至可以包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞内、或者在不同发育阶段、或者对不同环境或生理条件作出反应而表达。可使基因在大多数类型的细胞内在大多数时间内表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。可使基因在特定类型的细胞内表达的启动子通常被称为“细胞特异性几点钟”或“组织特异性启动子”。可使基因在发育或细胞分化的特定阶段表达的启动子通常被称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。可诱导或促使基因在细胞暴露于能诱导启动子的因子、生物分子、化合物、配体、光等的情况下或用上述因素处理时才表达的启动子通常被称为“可诱导启动子”或“可调节启动子”。还应当认识到的是，由于大多数情况下调节序列的确切边界并未完全定义清楚，因此不同长度的DNA片段可能具有相似的启动子活性。
启动子序列的3’端通常毗邻转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸，包含启动背景以上可检测水平的转录所必须的最低数目的碱基或元件。在启动子序列内可发现转录起始位点(例如，通过核酸酶S1作图可以很方便地定义)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合区(共有序列)。
编码序列在细胞内的转录和翻译控制序列的“控制之下”是指RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，后者再经过反式RNA剪接(如果编码序列包含内含子)，然后翻译成编码序列编码的蛋白质。
“转录和翻译控制序列”是指DNA条件序列，例如启动子、增强子、终止子等，用于编码序列在宿主细胞内的表达。在真核细胞内，聚腺苷酸化信号是控制序列。
术语“反应元件”是指一个或多个顺式作用DNA元件，通过与转录因子的DNA结合区相互作用介导在启动子上的反应。这个DNA元件可以在其序列内重复出现(完整的或不完整的)，或者包含由不同数目的核苷酸分开的序列基序或半位点。半位点可以相似或相同，以同向或反向重复方式或者以单个半位点、相邻半位点串联成多聚体的方式排列。反应元件可包含分离自不同有机体的微小启动子，根据细胞或有机体的性质反应元件可插入其中。转录因子的DNA结合区在存在或不存在配体的情况下可与反应元件的DNA序列结合，在该反应元件的调节下启动或抑制下游基因的转录。天然脱皮激素受体反应元件的DNA序列的例子包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：9(参见Cherbas等，Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一个或多个隔离核苷酸(SEQ ID NO：10)参见D′Avino等，MoI.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；以及GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：11)(参见Antoniewski等，MoI.Cell Biol.14：4465(1994))。
术语“操作性相连的”是指一个核苷酸片段上的核酸序列之间相连从而一个序列的功能可受其他序列的影响。例如，启动子操作性连接于编码序列上是指启动子可影响该编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制之下)。编码序列可以正义或反义方向与调节序列操作性连接。
在本文中，术语“表达”是指核酸或多核苷酸来源的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还可指mRNA翻译成蛋白质或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指能被插入到核酸或多核苷酸特异性限制性酶切位点内的或通过同源重组插入到核酸或多核苷酸内的DNA片段。DNA片段包含编码目的多肽的多核苷酸，所设计的盒和限制性酶切位点可确保盒插入到正确的阅读框架内以便于转录和表达。“转化盒”是指编码目的多肽的多核苷酸的特殊载体，除了多核苷酸外，该载体还包含促使特定宿主细胞转化的元件。本发明的盒、表达盒、基因表达盒和转化盒还包含能增强编码目的多肽的多核苷酸在宿主细胞内的表达的元件。这些元件包括而不限于：启动子、微小启动子、增强子、反应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
在本发明中，术语“基因开关”是指启动子相关的反应元件与配体依赖性转录因子系统的组合，在存在一种或多种配体的情况下，转录因子系统可调节有反应元件和启动子掺入的基因的表达。术语“编码基因开关的多核苷酸”是指启动子相关的反应元件与编码配体依赖性转录因子系统的多核苷酸的组合，在存在一种或多种配体的情况下，转录因子系统可调节有反应元件和启动子掺入的基因的表达。
术语“以蜕皮激素受体为基础的”与基因开关相联系时是指包含天然的或合成的蜕皮激素受体配体结合区的至少一个功能部分的基因开关，该基因开关可在配体与蜕皮激素受体配体结合区结合时调节基因的表达。蜕皮激素反应性系统的例子在美国专利号7,091,038和6,258,603中有描述。在一个实施方式中，系统是治疗系统(RTS)，该系统包含两个融合蛋白：突变的蜕皮激素受体(EcR)的DEF区与Gal4DNA结合区的融合蛋白以及嵌合的RXR的EF区与VP 16转录活化区的融合蛋白，在如图1所示的组成型启动子的控制下表达。
术语“调节”是指诱导、降低或抑制核酸或基因的表啊，导致蛋白质或多肽合成的相应诱导、降低或抑制。
本发明的多核苷酸或载体还可以包含至少一个适于驱动基因在宿主细胞内表达的启动子。
可用于本发明的实施方式中的增强子包括而不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
终止控制区，即终止子或聚腺苷酸化序列还可以来源于优选宿主天然的各种基因。可选的是，终止位点是非必须的，但是，如果包含终止位点是最优选的。在本发明的一个实施方式中，终止控制区可包含或来源于合成的序列、合成的聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”是指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]识别序列和编码能影响mRNA处理或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号的常见特征是可影响多聚腺苷酸片段向mRNA前体3’末端的添加。
“调节区”是指可调节二级核酸序列表达的核酸序列。调节区可包含天然负责表达特定核酸的序列(同源区)或者包含负责表达不同蛋白或者合成蛋白的不同来源的序列(异源区)。更具体地说，序列可以是原核、真核或病毒基因的序列，或者是以特异性或非特异性方式以及以可诱导的或非可诱导的方式刺激或抑制基因转录的衍生序列。调节区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和引导多肽进入靶细胞的分泌通道的信号序列。
“异源”来源的调节区是指与被表达的核酸非天然相关的调节区。在异源调节区内包含不同物种来源的调节区、不同基因来源的调节区、杂合的调节序列以及自然界中不存在的由本领域的技术人员设计出的调节序列。
“RNA转录子”是指RNA聚合酶催化转录DNA序列得到的产物。当RNA转录子是DNA序列的高度互补拷贝时它被称为初级转录子，RNA转录子也可以是初级转录子经过转录后加工形成的RNA序列，被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指不含内含子的能被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指来自于mRNA的并与mRNA互补的双链DNA。“正义”RNA是指包含mRNA的RNA转录子，因此能被细胞翻译成蛋白质。“反义RNA”是指与靶初级转录子或mRNA的全长或部分互补的RNA转录子，可阻断靶基因的表达。反义RNA的互补性可位于特定基因转录子的任何部分，即，在5’非编码序列、3’非编码序列或编码序列。“功能性RNA”是指反义RNA、核糖体RNA或不能被翻译但是对细胞过程有影响的其他RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可交互使用，是指由共价连接的氨基酸残基组成的聚合物。
“游离多肽”、“游离肽”或“游离蛋白质”是指基本不含在其天然状态下与其相关的那些化合物(例如，其他蛋白或多肽、核酸、糖类、脂质)的多肽或蛋白质。“游离的”并不意味着不包括与其他化合物形成的人工的或合成的混合物，或者不存在不干扰其生物学活性的杂质，例如，杂质可因纯化不完全、添加稳定剂或向药学上可接受的制剂中添加化合物而存在。
“取代突变多肽”或“取代突变体”可以被理解为包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的氨基酸取代的突变多肽。取代突变多肽可以只包含一个野生型或天然氨基酸取代，被称为“点突变”或“单点突变”多肽。另外，取代突变多肽还可以包含两个或多个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的两个或多个氨基酸取代。根据本发明，包含取代突变的H组核受体配体结合区多肽包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然H组核受体配体结合区多肽的氨基酸取代。
当取代突变多肽包含两个或多个野生型或天然氨基酸的取代时，这个取代可包括等数目的野生型或天然氨基酸因取代而产生的缺失，即，两个野生型或天然氨基酸被两个非野生型或非天然的氨基酸取代，或者不同数目的野生型氨基酸因取代而产生的缺失，即，两个野生型氨基酸被一个非野生型氨基酸取代(取代+缺失突变)，或者两个野生型氨基酸被三个非野生型氨基酸取代(取代+插入突变)。
取代突变体可用缩写命名系统描述以显示参考多肽序列内被取代的氨基酸残基及其编号以及新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个(20th)氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写成“x20z”，其中“x”是被取代的氨基酸，“20”是氨基酸残基的位置或在多肽内的编号，以及“z”是新取代的氨基酸。因此，被缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体是指在多肽第20位上的谷氨酸(在本领域中通常被缩写为“E”或“Glu”)被丙氨酸残基(在本领域中通常被缩写为“A”或“Ala”)。
取代突变体可利用本领域熟知的任何诱变技术制备，其中包括而不限于体外位点定向诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.255：6551(1978)；Zoller等，DNA 5：479(1984)；Oliphant等，Gene 44：117(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.ScL USA 83：710(1986))，使用连接子(Pharmacia)，限制性内切酶消化/片段缺失和取代、PCR介导的/寡核苷酸定向诱变等。以PCR为基础的技术优选用于位点定向诱变(参见Higuchi，1989，“利用PCR改造DNA”(″UsingPCR to Engineer DNA″)，《PCR技术：原理及在DNA扩增中的应用》(PCRTechnology：Principles and Applications for DNA Amplification)，H.Erlich编辑，Stockton Press，第6章，61-70页)。
术语“片段”在用于多肽时是指其氨基酸序列比参考多肽短的多肽，在这些参考多肽的完整序列上包含与其一致的氨基酸序列。在合适的情况下，这种片段可包含在较大的多肽内，成为较大多肽的一部分。本发明的这种片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、300或更多个氨基酸。
多肽或蛋白质的“突变体”是指衍生自多肽或氨基酸的任何类似物、片段、衍生物或突变体，它保留了多肽或蛋白质的至少一种生物特性。自然界中存在着多肽或蛋白质的不同突变体。这些突变体可以是等位基因突变，其特征是编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列不同，或者包含不同的剪接或翻译后修饰。本领域的技术人员能够制备具有单个或多个氨基酸取代、缺失、插入或替代的突变体。这些突变体包括如下种类：(a)一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸取代的突变体，(b)一个或多个氨基酸被添加到多肽或蛋白质内的突变体，(c)一个或多个氨基酸含有取代基的突变体，以及(d)多肽或蛋白质与其他多肽如血清白蛋白融合的突变体。获得这些突变的技术是本领域具有普通技能的人员所熟知的，其中包括遗传学的(抑制、缺失、突变等)、化学的和酶学的技术。在一个实施方式中，突变多肽包含至少约14个氨基酸。
术语“同源性“是指两个多核苷酸或两个多肽基序之间的百分一致性。一个基序和另一个基序之间的序列一致性可通过本领域熟知的技术确定。例如，可以将序列信息排列在一起通过直接比较两个多肽之间序列信息并利用已有的计算机程序确定同源性。另外，可以在适合同源区之间形成稳定双螺旋的条件下使多核苷酸杂交然后利用单链特异性的核酸酶消化并确定被消化片段的大小来确定同源性。
在本文中，在所有语法形式和拼写变化中术语“同源的”是指拥有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，其中包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质和来自不同物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell 50：667(1987))。这种蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性，这反映在其较高的序列一致性程度上。但是，在通常的应用中，当术语“同源的”用副词如“高度地”修饰时是指序列一致性但没有共同的进化起源。
相应的，在所有语法形式中，术语“序列一致性”是指具有或不具有共同进化起源的核酸或蛋白质氨基酸序列之间的一致性或相似性程度(参见Reeck等，Cell 50：667(1987))。在一个实施方式中，当DNA序列给定长度上的核苷酸配对率在至少约50％(例如，至少约75％、90％或95％)时可以说两个DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。基本同源的序列可以通过比较序列来鉴推测性地确定多肽或核酸序列与已知蛋白或基因同源需要10个或更多个连续的氨基酸序列或30或更多个核苷酸序列。另外，对于核苷酸序列来说，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如，DNA杂交)和分离(例如，细菌克隆或噬菌体斑)的原位杂交)方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可作为PCR扩增引物用于获取包含该引物的特定核酸片段。相应的，核苷酸序列的“实质部分”包含足够长的序列用于特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
本领域所熟知的术语“百分一致性”是指通过比较序列所确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“一致性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列亲缘关系远近程度，如通过这种序列的字符串之间的匹配来确定。利用已知的方法可以很容易地计算“一致性”和“相似性”，其中包括而不限于如下书籍所描述的那些方法：《计算机分子生物学》(Computational Molecular Biology)(Lesk，A.M.编辑)，牛津大学出版社，纽约(1988)；生物计算：信息学和基因组工程》(Biocomputing：Informatics andGenome Projects)(Smith，D.W.编辑)，学术出版社，纽约(1993)；《序列数据的计算机分析》第I部分(Computer Analysis of Sequence Data)(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，新泽西(1994)；分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)(von Heinje，G.编辑)学术出版社(1987)；以及《序列分析引物》(SequenceAnalysis Primer)(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，Stockton出版社，纽约(1991)。确定一致性的优选方法能够给出被测序列之间的最佳匹配。确定一致性和相似性的方法已被编纂在公开的计算机程序中。序列比对和百分一致性的计算可用序列分析软件完成，如LASERGENE生物信息学计算包的Megalign程序(DNA之星公司(DNASTAR Inc.)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)。序列的多重比对可用Clustal比对算法完成(Higgins等，CABIOS.5：151(1989))，使用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。利用Clustal方法进行配对比对可选择如下默认参数：KTUPLE 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。
术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机定，利用序列数据库中已有的标准软件，或者DNA杂交实验，例如，在为该特定系统确定的严格条件下。确定合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，同上)。
在本文中，“基本相似的”是指其中有一个或多个核苷酸碱基的改变并导致一个或多个氨基酸被取代，但是未影响DNA序列所编码蛋白质的功能特性的核酸片段。“基本相似的”还指其中有一个或多个核苷酸碱基的改变但不影响核酸片段通过反义或共抑制技术介导基因表达发生变化的能力的核酸片段。“基本相似的”还指本发明的核酸片段上的修饰如缺失或插入一个或多个核苷酸碱基，但是这种修饰不会对得到的转录子的功能特性产生实质影响。因此，应当理解，本发明所包含的序列要比列举的特殊序列的例子要多。每一种打算进行的修饰都可以通过本领域的常规技术完成，同时保留编码产物的生物学活性。
另外，技术人员应当认识到，本发明所包含的基本一致的序列还可以通过其在严格条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，先用2X SSC、0.1％SDS然后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤)与本文所列举的序列杂交的能力来定义。本发明的基本相似的核酸片段是那些DNA序列与本文所报道的核酸片段的DNA序列有至少约70％、80％、90％或95％一致性的核酸片段。
当约40％以上的氨基酸是一致的或60％以上的氨基酸是相似的(功能一致的)时则说明两个氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选的是，相似的或同源的序列可通过比对来鉴定，例如，利用GCG(Genetics ComputerGroup，《GCG软件包程序手册》(Program Manual for the GCG Package)，7版，Madison，Wisconsin)pileup程序。
术语“相应的”用在本文中是指相似的或同源的序列，无论其在被测定相似性或同源性的分子内的准确位置相同或不同。因此，术语“相应的”是指序列相似性，并不代表氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“实质部分”包括最够长的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列用于推测性地鉴定该多肽或基因，通过本领域技术人员手工评价或利用算法如BLAST(局部序列比对基本检索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)；Altschul等，J.MoI.Biol.215：403(1993)，网址：ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/)通过计算机自动序列比较和鉴定。一般而言，为了算法或软件程序。“序列分析软件”可以是已经商品化的或独立开发的。经典的序列分析软件包括而不限于GCG程序包(Wisconsin Package，9.0版，GeneticsComputer Group(GCG)，麦迪逊，威斯康星州)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403(1990))，和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715USA)。在本申请的上下文中，应当清楚序列分析软件用于分析时得到的分析结果是基于参考程序的“默认值”得出的，除非另外说明。在本文中，“默认值”是指在软件安装时最初加载到软件上的任何数值或参数。
“化学合成的”与DNA序列相关时是指核苷酸组分是在体外装配的。人工化学合成DNA可利用已建立的方法完成，自动化学合成可利用多种商用机器中的一种完成。相应的，根据反映宿主密码子偏好的最优核苷酸序列可以对基因进行改造以获得最佳的基因表达。技术人员知道如果使用宿主偏爱的密码子就可能获得成功的基因表达。优选密码子可根据已有序列信息的宿主细胞来源的基因检测结果来确定。
在本文中，如下情况下两个或多个独立运作的基因调节系统可被称为是“正交的”：a)每一个给定的系统被其各自的特定浓度的配体调节，导致该系统的基因表达水平出现可检测的改变，以及b)这种改变与细胞、组织或有机体内同时运作的所有其他系统的表达所发生的改变相比有统计学意义上的差异，无论实际的调节是同时发生的或者是先后发生的。优选的是，每一种独立运作的基因调节系统的调节都能影响基因的表达，基因表达水平比细胞、组织或有机体内所有运作的其他系统至少高2倍，例如，至少高5倍、10倍、100倍或500倍。比较理想的是，每一种给定系统被其各自的配体在所选择的浓度下调节可以使该系统的基因表达水平发生可测量的改变，而在细胞、组织或有机体内运作的所有其他系统的表达不产生可测量的改变。在这种情况下，多重可诱导基因调节系统被称为是“完全正交的”。可用的正交配体和以正交配体为基础的基因表达系统在US 2002/0110861A中有描述。
术语“外源基因”是指对于对象来说基因是外源的，也就是说，该基因通过转化过程被导入到对象内，是内源性突变基因的未突变版本或内源性未突变基因的突变版本。转化的方法对本发明来说不是关键的因素，可以是适合于对象的本领域技术人员熟知的任何方法。外源基因可以是天然的或合成的基因，以DNA或RNA的形式被导入到对象内，通过DNA中间体如通过反转录酶发挥功能。这种基因可被导入到靶细胞内，直接导入到对象内或者通过将转化细胞转移到对象内间接导入。
术语“治疗性产物”是指能在表达这种产物的宿主细胞内发挥有益功能的治疗性多肽或治疗性多核苷酸。治疗性多肽包括而不限于长度小到3个氨基酸的肽、单链或多链蛋白质以及融合蛋白。治疗性多核苷酸包括而不限于反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶以及RNA外部引导序列。治疗性产物可包含天然序列、合成序列或天然序列和合成序列的组合物。
术语“蜕皮激素受体复合物”通常是指包含核受体家族至少两个成员，蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门蛋白(“USP”)，的异源二聚体蛋白复合物(参见Yao等，Nature 366：476(1993))；Yao等，Cell 71：63(1992))。功能性EcR复合物还可以包含其他蛋白，如嗜免疫剂。蛋白质核受体家族的其他成员，被称为转录因子(如DHR38、βFTZ-1或其他昆虫同源物)，还可以是EcR和/或USP的配体依赖性的或非依赖性的伴侣。EcR复合物还可以是EcR蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同源物维甲酸X受体(“RXR”)的异源二聚体，或USP和RXR的嵌合体。术语EcR复合物还包括EcR蛋白或USP的同源二聚体复合物。
EcR复合物可通过有活性的蜕皮素或非甾体配体结合到复合物的一个蛋白上而活化，其中包括EcR，但是也不排除复合物的其他蛋白。在本文中，术语“配体”在用于以EcR为基础的基因开关时是指能够活化基因开关从而刺激其编码的多肽表达的可溶性小分子。配体的例子包括而不限于蜕皮素，如蜕皮激素、20-羟基蜕皮酮、松甾酮A、幕黎甾酮等，9-顺式维甲酸，维甲酸的合成类似物，N，N′-二酰肼，如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028和5,378,726以及已公开的美国专利申请号2005/0209283和2006/0020146所描述的那些；如已公开的美国专利申请号2004/0171651所描述的噁二唑啉；二苯甲酰烷基氰基肼类(dibenzoylalkyl cyanohydrazine)如欧洲专利申请号461,809所描述的那些；N-烷基-N，N′-二芳酰基肼如美国专利申请号5,225,443所公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼如欧洲专利申请号234,994所公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N′-芳酰基肼如美国专利申请号4,985,461所公开的那些；氨基酮(amidoketone)如已公开的美国专利申请号2004/0049037所描述的那些；以及其他类似的材料，其中包括3，5-二叔丁酰基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕甙、羟固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐(ECHS)、7-酮胆固醇-3-硫酸盐、法尼醇、胆汁酸、1，1-双磷酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼的例子包括RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)，RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)以及RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见2008年5月29日提交的美国专利申请12/155,111和2008年5月29日提交的PCT/US2008/006757所描述的可用于实现本发明的其他二酰基肼。
EcR复合物包括作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员所共有的特征是存在氨基端活化区(“TA”)、DNA结合区(“DBD”)和配体结合区(“LBD”)，它们中间被铰链区分开。该家族的某些成员可能在LBD的羧基端还含有另一个活化区。DBD的特征是存在两个半胱氨酸锌指，二者之间是两个氨基酸基序，P-盒以及D-盒，决定了蜕皮激素反应元件的特异性。这些区可以是天然的，也可以是经过修饰的，或者是异源受体蛋白不同区的嵌合体。
组成外源基因、反应元件和EcR复合物的DNA序列可以被插入到古细菌，原核细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或其他肠道细菌，或真核细胞如植物或动物细胞内。但是，由于基因所表达的许多蛋白在细菌内无法正确加工，因此优选用真核细胞。细胞可以是单细胞或多细胞有机体的形式。外源基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可以RNA分子的形式插入，优选以功能性病毒RNA如烟草花叶病毒的形式。在真核细胞中，脊椎动物细胞有优选的，因为它们天然缺乏能对本发明的EcR配体产生反应的分子。因此，它们对本发明的配体是“实质不敏感的”。因而，可用于本发明的配体对转化细胞或有机体整体的生理效应或其他效应可忽略不计。因此，细胞可生长和表达目的产物，基本不受配体本身的影响。
EcR配体在与EcR复合物一起使用时，后者反过来会结合到与外源基因(例如，IL-12)相连的反应元件上，这样就为外源基因表达的外部时序调节提供了方式。各种组分互相结合的顺序，即，配体与受体复合物的结合以及受体复合物和反应元件的结合，不是关键因素。一般来说，外源基因表达的调节是对EcR复合物与特异性的控制或调节DNA元件的结合所作出的反应。EcR蛋白与核受体家族的其他成员一样也包含至少三个区，活化区、DNA结合区和配体结合区。这个受体与核受体家族的一个亚群一样，也包含还未完全清楚的负责异源二聚化特性的区。在USP或RXR蛋白异源二聚化后，配体与EcR蛋白配体结合区的结合可使异源二聚化蛋白的DNA结合区与活化形式的反应元件结合，从而导致外源基因的表达或抑制。这种机制并不排除配体与EcR或USP结合从而形成活化同源二聚体复合物(例如，EcR+EcR或USP+USP)的可能性。在一个实施方式中，一个或多个受体区可以被改变以形成嵌合的基因开关。一般来说，可从与其他区不同的来源中选择三个区中的一个或多个，这样在所选择的宿主细胞内嵌合受体在活化活性、配体的互补结合以及特异性反应元件的识别方面可以达到最佳化。另外，反应元件本身也可以被修饰或者用其他DNA结合蛋白如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988)或大肠杆菌的LexA蛋白((参见Brent等，Cell 43：129(1985))的反应元件来取代以适应嵌合的EcR复合物。嵌合系统的另外一个优点是可以根据想要达到的最终结果来选择启动子以驱动外源基因。这种双重控制在基因治疗领域是特别重要的，尤其是产生细胞毒性蛋白时，因为表达的时效性以及产生表达的细胞都是可控的。当与合适启动子操作性相连的外源基因被导入到对象的细胞内时，外源基因的表达可因本发明的配体的存在而受控制。启动子可以是组成型、可诱导调节的，或者是组织特异性的(即，只在特定类型的细胞内表达)或有机体某些发育阶段特异性的。
许多编码多种多肽如转录因子和受体蛋白的基因组和cDNA核酸序列是本领域熟知的。本领域的技术人员可以得到几乎所有已知基因的核酸序列信息，从公共库或发表该序列的研究所直接获得核酸分子，或者利用常规方法制备分子。参见，例如，下文有关序列检索号的描述。
基因开关可以是能够通过添加或去除特异性配体来调节基因表达的任何基因开关系统。在一个实施方式中，基因开关是一种基因表达水平依赖于配体存在水平的基因开关。可用于本发明的基因开关的配体依赖性转录因子的例子包括而不限于可被其各自配体活化的核受体超家族的成员(例如，糖皮质激素、雌激素、孕激素、维甲酸、蜕皮激素、及其类似物和模拟物)和能被四环素活化的rTTA。在本发明的一个方面，基因开关是以EcR为基础的基因开关。这种系统的例子包括而不限于如下文献所描述的系统美国专利号6,258,603、7,045,315，已公开的美国专利申请号2006/0014711、2007/0161086和已公开的国际专利申请号WO 01/70816。嵌合蜕皮激素受体系统的例子在美国专利号7,091,038、已公开的美国专利申请号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416以及已公开的国际专利申请号WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO 2005/108617中有描述。非甾体类蜕皮激素激动剂调节的系统的例子是哺乳动物可诱导的表达系统(Mammalian Inducible Expression System)(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA))。
在一个实施方式中，编码基因开关的多核苷酸包含编码启动子控制下的配体依赖性转录因子的单个转录因子序列。转录因子序列可编码配体依赖性转录因子，该转录因子是天然的或人工的转录因子。人工的转录因子是天然序列已发生改变的转录因子，例如，通过序列突变或不同转录因子来源的区的组合。在一个实施方式中，转录因子包含H组核受体配体结合区(LBD)。在一个实施方式中，H组核受体LBD来源于EcR、普遍存在的受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、维甲酸X受体相互作用蛋白-15、肝脏X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝脏X受体、肝脏X受体α、法呢醇受体(farnesoid Xreceptor)、受体相互作用蛋白14或法尼醇受体。在另一实施方式中，H组核受体LBD来源于蜕皮激素受体。
EcR和其他H组核受体是核受体超家族的成员，在该超家族内所有成员所具有的共同特征是存在氨基端活化区(TD)、DNA结合区(DBD)以及被铰链区从DBD分开的LBD。在本文中，术语“DNA结合区”包含DNA结合蛋白的最小多肽序列，一直到全长DNA结合蛋白，只要DNA结合区能发挥与特定反应元件相关的功能即可。核受体超家族成员的另一特征是存在4个或5个区：A/B、C、D、E，某些成员还存在F(参见US 4,981,784和Evans，Science240：889(1988))。“A/B”区对应于活化区，“C”区对应于DNA结合区，“D”对应于铰链区，以及“E”对应于配体结合区。该家族的某些成员在LBD的羧基端还有另一个活化区，对应于“F”。
DBD的特征是存在两个半胱氨酸锌指，二者之间是两个氨基酸基序，P-盒以及D-盒，决定了蜕皮激素反应元件的特异性。这些区可以是天然的，也可以是经过修饰的，或者是异源受体蛋白不同区的嵌合体。与一组核受体家族一样，EcR还包含负责异源二聚化特性的还未完全清楚的区。由于核受体的区是天然的模块，因此LBD、DBD和TD之间可交换。
在另一实施方式中，转录因子包含TD、可识别外源基因相关的反应元件的DBD以及H组核受体LBD，其中外源基因的表达可被调节。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在其他实施方式中，编码基因开关的多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成蛋白复合物，行使配体依赖性转录因子的功能，即，以“双开关”或“双杂合子”为基础的基因开关。第一和第二启动子可相同，也可不同。
编码基因开关的多核苷酸还可包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中第一转录因子序列和第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成蛋白复合物，行使配体依赖性转录因子的功能，即，“单基因开关”。第一转录因子序列和第二转录因子序列可通过内部核糖体进入位点相连，例如，EMCV IRES。
在一个实施方式中，第一转录因子序列所编码的多肽包含TD、可识别外源基因相关的反应元件的DBD以及H组核受体LBD，其中外源基因的表达可被调节，第二转录因子序列所编码的转录因子包含选自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD、超气门蛋白LBD和包含两个多肽片段的嵌合LBD的核受体LBD，其中第一多肽片段来自脊椎动物RXR LBD，第二多肽片段来自另一种脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD或超气门蛋白LBD。
在另一实施方式中，基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，其中第一多肽包含核受体LBD和可识别其表达被调节的外源基因相关的反应元件的DBD，第二多肽包含TD和核受体LBD，其中一个核受体LBD是H组核受体LBD。在一个优选实施方式中，第一多肽基本不含TD，第二多肽基本不含DBD。在本发明中，“基本不含”是指蛋白质不含足以提供活化或结合活性的序列区。
在本发明的另一方面，第一转录因子序列所编码的蛋白质包含异源二聚体伴侣和TD，第二转录因子序列所编码的蛋白质包含DBD和LBD。
当只有一个核受体LBD是H组LBD时，其他核受体LBD可以来源于能和H组LBD形成二聚体的任何其他核受体。例如，当H组核受体LBD是EcRLBD时，其他核受体LBD“伴侣”可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包含至少两个选自脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP的不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体(参见WO 01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合区还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或其他修饰。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR LBD来源于人、小家鼠、褐家鼠、原鸡、家猪、蛙(光滑爪蟾(Xenopus laevis))、斑马鱼(鮐(Danio rerio))、海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，无脊椎动物RXR配体结合区来自于蝗虫(飞蝗(Locusta migratoria))超气门多肽(“LmUSP”)、虱(美洲壁虱(Amblyommaamericanum))RXR同源物1(“AmaRXR1”)，虱(美洲壁虱(Amblyommaamericanum))RXR同源物2(“AmaRXR2”)，招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)，甲虫(大黄粉虫(Tenebrio molitor))RXR同源物(“TmRXR”)，蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)，蚜虫(烟蚜(Myzus persicae))RXR同源物(“MpRXR”)，或非双翅类/非鳞翅类RXR同源物。
在一个实施方式中，嵌合RXR LBD包含选自脊椎动物RXR多肽片段、无脊椎动物RXR多肽片段以及非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物RXR同源物多肽片段的至少两个多肽片段。可用于本发明的嵌合RXR配体包含至少两个不同物种的RXR多肽片段，或者当物种相同时，两个或多个多肽片段可来源于RXR多肽片段的两个或多个不同亚型。
在一个实施方式中，嵌合RXR配体结合区包含至少一个脊椎动物RXR多肽片段和一个无脊椎动物RXR多肽片段。
在另一实施方式中，嵌合RXR配体结合区包含至少一个脊椎动物RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物RXR同源物多肽片段。
配体在与核受体LBD结合时，后者反过来会结合到与外源基因相连的反应元件上，这样就为外源基因表达的外部时序调节提供了方式。本发明的各种组分彼此结合的机制或顺序，即，例如，配体与LBD、DBD与反应元件、TD与启动子的结合等，不是关键因素。
在一个特殊例子中，配体与H组核受体LBD及其核受体LBD伴侣的结合可启动外源基因的表达。这个机制并不排除配体与H组核受体(GHNR)或其伴侣结合并形成有活性的同源二聚体复合物的可能性(例如GHNR+GHNR，或伴侣+伴侣)。优选的是，一个或多个受体区可发生改变形成杂合基因开关。一般来说，可从与其他区不同的来源中选择DBD、LBD和TD三个区中的一个或多个，这样在所选择的宿主细胞或有机体内杂合基因及其产生的杂合蛋白在活化活性、配体的互补结合以及特异性反应元件的识别方面可以达到最佳化。另外，反应元件本身也可以被修饰或者用其他DNA结合蛋白如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988)或大肠杆菌的LexA蛋白((参见Brent等，Cell 43：129(1985))或合成的反应元件来取代以适应杂合受体，其中合成的反应元件是与蛋白靶向性相互作用特异性的，蛋白的设计、修饰和筛选就是为了这种特异性相互作用(参见，例如，Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：3616(1997))。
功能性EcR复合物还可以包含其他蛋白，如嗜免疫剂。被称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)的蛋白质核受体家族的其他成员还可以是配体依赖性的或非依赖性的EcR、USP和/或RXR的伴侣。另外，也可能需要其他辅因子，如通常被称作辅激活因子的蛋白质(也被称作适配子或介导子(mediator))。这些蛋白不以序列特异性的方式与DNA结合，也不参与基础转录。它们可能是通过各种机制发挥对转录活化的效应，其中包括刺激活化因子的DNA结合，通过影响染色质的结构或者通过介导活化因子与起始复合物的相互作用。这种辅激活因子的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70，SRC-1/NCoA-1、TEF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIBl/RACS/pCIP以及泛宿主性辅激活因子C反应元件B结合蛋白CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。另外，通常被称作辅阻遏物的蛋白质辅因子(也被称作抑制子、沉默子或沉默介导子)可能是在缺乏配体时有效抑制转录活化所需要的。现有的证据表明配体的结合可改变受体的构型，导致辅阻遏物的释放和上述辅激活因子的补充，从而消除其沉默活性。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，MoI Endocrinol.70：1167(1996))。这些辅因子可以是细胞或有机体内源性的，或者是作为转基因添加的，以被调节或不被调节的方式表达。
外源基因与包含至少一个反应元件的启动子操作性连接，该反应元件可被基因开关所编码的配体依赖性转录因子DBD识别。在一个实施方式中，启动子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个反应元件的拷贝。包含理想反应元件的启动子可以是天然启动子，或利用本领域熟知的技术制备的人工启动子，例如一个或多个反应元件操作性连接于微小启动子上。
为了将多核苷酸导入到细胞内，可以使用载体。载体可以是，例如，质粒载体或单链或双链RNA或DNA载体。这种载体可利用大家熟知的用于将DNA和RNA导入到细胞内的技术导入到细胞内。病毒载体可以是复制完整型的或复制缺陷型的。对于后者来说，病毒扩增通常只能在补充性的宿主细胞内增殖。在本文中，“宿主细胞”或“宿主”用于描述本发明的能够携带一个或多个本发明的多核苷酸的细胞。
因此，载体至少要包含本发明的多核苷酸。载体的其他组分可以包括而不限于可筛选标记物、染色质修饰区、驱动载体可能包含的其他多肽表达的其他启动子、基因组整合位点、重组位点以及分子插入支点。载体可包含任意数目的这些附加元件，位于多核苷酸内或位于多核苷酸之外，这样可以根据所要达到的治疗方法的特殊目的对载体进行设计。
在本发明的一个实施方式中，被导入到细胞内的载体还包含“可筛选标记物基因”，这说明该基因在表达时本发明的基因开关构建体已被整合到宿主细胞的基因组内。在这种方式中，筛选基因可以是基因组整合的正性标记物。虽然可筛选标记物基因不是本发明方法的关键因素，但是可筛选标记物基因的存在使实施者能够筛选载体构建体已经被整合到细胞基因组内的活细胞群。因此，本发明的某些实施方式包含筛选载体已被成功整合的细胞的步骤。在本文中，术语“筛选”或其变体在与细胞连用时是指用于选择具有特殊基因构成或表型的细胞已知方法。经典的方法包括而不限于在有抗生素如G418、新霉素和氨苄青霉素存在的条件下培养细胞。可筛选标记物基因的其他例子包括而不限于能赋予二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸耐药性的基因。其他筛选方法包括而不限于可使用胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或腺嘌呤核酸核糖转移酶作为筛选试剂的可筛选标记物基因。因此包含载体构建体的细胞能够耐受培养基中的抗生素，其中载体构建体包含抗生素耐药基因。同样道理，不包含载体构建体的细胞不能够耐受培养基中的抗生素，其中载体构建体包含抗生素耐药基因。
在本文中，“染色质修饰区”(CMD)是指能与各种维持和/或改变染色质结构相关的蛋白质相互作用的核苷酸序列，例如，但不限于，DNA绝缘子。参见Ciavatta等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.，103：9958(2006)。CMD的例子包括而不限于鸡β-球蛋白绝缘子和鸡超敏位点4(cHS4)。在一个或多个基因元件(即，启动子，编码序列和3’调节区)之间使用不同的CMD序列，例如，有利于使用不同的CMD DNA序列作为“负同源臂”与各种微生物组合，或者利用体外重组技术使基因元件在已有的多基因和单基因穿梭载体之间“交换”。染色质修饰区的其他例子是本领域熟知的，或者很容易被鉴定。
可用于本发明的特殊载体是编码蛋白质或多核苷酸的表达载体。一般来说，这种载体包含顺式作用控制区，可有效地控制与其操作性相连的需要被表达的多核苷酸在宿主内的表达。合适的反式作用因子可由宿主提供、由补充载体提供或由载体本身在导入到宿主内时提供。
有许多表达载体可用于表达蛋白质或多核苷酸。这种载体包括染色体型的、游离型的和病毒来源的载体，例如，来源于细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件、病毒如腺相关病毒、慢病毒、杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒如SV40、疫苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒来源的载体，以及上述组合来源的载体，如来源于质粒和噬菌体基因元件的那些载体，如粘粒和嗜菌粒。所有这些载体都可用于与本发明的这个方面相关的表达。一般来说，适于在宿主内存活、繁殖或表达多核苷酸或蛋白质的任何载体都可用于这个方面的表达。
表达载体内的多核苷酸序列可与合适的表达控制序列操作性连接，其中包括，例如，指导mRNA转录的启动子。有代表性的其他启动子包括而不限于组成型启动子和组织特异性启动子或可诱导启动子。组成型真核细胞启动子的例子包括而不限于小鼠I型金属硫蛋白基因的启动子(Hamer等，J.MoI.Appl.Gen.1：273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 37：355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290：304(1981))；以及疫苗病毒启动子。可用于驱动蛋白质或多核苷酸表达的启动子的其他例子包括而不限于组织特异性启动子和特殊蛋白质的其他内源性启动子，如白蛋白启动子(肝细胞)、胰岛素原启动子(胰岛素β细胞)等。总之，表达构建体可包含用于转录、起始和终止的位点以及位于转录区的用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的成熟转录子的编码区可包含位于起始位置的翻译起始密码子AUG和位于被翻译多肽末端合适位置的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
另外，构建体可包含能调节以及促使表达的控制区。一般来说，这种区的功能是控制转录，例如阻遏物结合位点和增强子等。
真核细胞载体的例子包括而不限于斯图特基因公司(Stratagene)的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；爱美沙生物技术制药公司(Amersham Pharmacia Biotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；以及克隆技术公司(Clontech)的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito和pCMV-EGFP。还有其他许多载体都是大家所熟知的，并且已经商品化。
已公开的美国专利申请号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246以及已公开的国际转录申请号WO 2005/040336和WO 2005/116231中描述了特别有用的载体，其中包含用于快速插入和删除基因程序元件的分子插入支点。这种载体的一个例子是Ultra VectorTM Production System(弗吉尼亚州布莱克斯堡应氏公司(Intrexon Corp.，Blacksburg，VA))，如WO 2007/038276所述。在本文中，“基因程序”是包含启动子(P)、表达序列(E)和3’调节序列(3)的基因元件的组合，因此，“PE3”是一个基因程序。基因程序内的元件可以很容易地在基因程序的每一个元件两侧的分子支点之间交换。在本文中，分子支点被定义为包含以线性方式排列的至少两个非可变的稀有或非常见限制性酶切位点的多核苷酸。在一个实施方式中，分子支点包含至少三个以线性方式排列的非可变的稀有或非常见限制性酶切位点。一般来说，任何一个分子支点都不包含同一个基因程序内的任何其他分子支点所具有的稀有或非常见限制性酶切位点。一个给定限制性内切酶所作用的区域超过6个核苷酸的同源序列被称为“稀有”限制性酶切位点。但是，还有一些6bp的限制性酶切位点，根据统计预测，其发生的概率更小，这些位点和裂解它们的限制性内切酶被称为“非常见”限制性酶切位点。稀有或非常见限制性内切酶的例子包括而不限于AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、MIu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiWI、Sfo I、SgrAI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、FIp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I和Sse8781 I。
载体还可包含被称为归巢核酸内切酶(HE)的第二类限制性内切酶使用的限制性酶切位点。HE酶具有很大的不对称限制性酶切位点(12-40个碱基对)，其限制性酶切位点在自然界中很少见。例如，被I-Scel的HE有一个18bp的限制性酶切位点(5’TAGGGAT AAC AGGGTAAT3′(SEQ ID NO：12))，据预测随机序列中每7×1010个碱基对才可能出现一次。这种发生率等同于比哺乳动物基因组大20倍的基因组内才只有一个这样的位点。如果在克隆载体质粒的合适位置插入HE位点，HE位点的稀有性质将大大增加遗传工程学家切割基因程序但不会破坏基因程序完整性的可能性。
筛选用于在宿主细胞内表达的合适载体和启动子的方法是大家熟知的程序，构建载体、导入宿主以及在宿主内表达所需要的技术也是本领域的常规技术。
多核苷酸向细胞内的导入可以是瞬时转染、稳定转染，或者是载体的位点特异性插入。载体向宿主细胞内的瞬时和稳定转染可通过钙磷酸盐沉淀、二乙胺乙基葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。这种方法在许多实验室标准操作手册中都有描述，如Davis等，《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)(1986)；Keown等，1990，《酶学方法》(Methods Enzymol.)185：527-37；Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社，N.Y。这些稳定转染方法可使载体随机插入到细胞基因组内。另外，载体的拷贝数和方向通常也是随机的。
在本发明的一个实施方式中，载体被插入到基因组内的生物中性位点。生物中性位点是指基因组内多核苷酸的插入对细胞的功能即使有影响也是很小的位点。生物中性位点可利用现有的生物信息学方法分析。许多生物中性位点是本领域熟知的，例如，ROSA等价基因座。其他生物中性位点可利用本领域熟知的常规技术鉴定。基因插入位点的特征分析可利用本领域熟知的方法完成。在将载体导入到细胞内时，为了控制多核苷酸的插入位置、拷贝数和/或方向，可选择位点特异性的插入方法。位点特异性的插入方法是本领域熟知的，其中包括而不限于同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然，如果位点特异性插入方法可用于本发明的方法，载体可能包含对这种位点特异性插入有辅助作用的元件，例如，但是不限于，同源重组。例如，载体可包含1、2、3、4或更多个基因组整合位点(GISs)。在本文中，“基因组整合位点”被定义为核苷酸序列与细胞内基因组的一部分序列一致或基本一致从而可以使载体插入到基因组内的载体部分。更具体地说，载体可包含至少位于多核苷酸两侧的两个基因组插入位点。当然，GIS也可以位于其他元件两侧，甚至载体内的所有元件的两侧。
在另一实施方式中，位点特异性插入可通过重组酶位点特异性基因插入方法完成。简言之，细菌重组酶，例如，但不限于，PhiC31整合酶可作为人类基因组内的“假”重组位点。这些假重组位点可作为重组酶行使位点特异性插入的靶位。重组酶位点特异性基因插入方法可见于Thyagarajan等，MoI.Cell Biol.21：3926(2001)的描述。重组酶及其相应的可用于重组酶位点特异性基因插入的位点的其他例子包括而不限于丝氨酸重组酶如R4和TP901-1以及WO2006/083253所描述的重组酶。
在另一个实施方式中，载体可包含化学抗性基因，例如，多药耐药基因mdr1、二氢叶酸还原酶或O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶。化学抗性基因可位于组成型(例如，CMV)或可诱导的(例如，)启动子的控制之下。在这个实施方式中，如果想在保护对象内的被修饰细胞的同时治疗对象的疾病，临床医生可以使用化疗药物破坏生病的细胞，同时可保护被修饰细胞被药物破坏，因为这些细胞表达合适的化学抗性基因，可以继续用于治疗、减缓或预防疾病或失调。通过将化学抗性基因置于可诱导启动子的控制之下，可以避免化学抗性基因发生不必要的表达，同时在需要继续治疗时还可以利用。如果被修饰细胞本身是生病的，那么可通过诱导下文所述的致命多肽的表达将其破坏。
本发明的方法可通过将编码基因开关和外源基因的多核苷酸导入到对象的细胞内来执行。用于将多核苷酸导入到细胞内的本领域已知的任何方法都可以使用，例如上面所描述的那些。
当多核苷酸被导入到体外的细胞时，可通过本领域熟知的任何技术从对象中获取细胞，其中包括而不限于生物活检、刮削碎屑以及通过手术取组织。分离出的细胞可培养足够长的时间以便于将多核苷酸导入到细胞内，例如，2、4、6、8、12、18、24、36、48小时或更长。短期培养原代细胞的方法是本领域熟知的。例如，可在培养板(例如，微孔板)贴壁或悬浮培养细胞。
在用于体外治疗方法时，可从对象分离细胞并在适于将多核苷酸导入到细胞内的条件下培养细胞。多核苷酸导入到细胞内后，可孵育细胞足够长的时间以使配体依赖性转录因子表达，例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、24小时或更长时间。在多核苷酸导入到细胞后的某些时间点(在配体依赖性转录因子达到有意义的表达水平前或后)，再将细胞回输到对象体内。回输可通过本领域熟知的任何方法完成，例如，通过静脉注射或直接注射到组织或腔隙内。在一个实施方式中，可在细胞回输到对象体内前检测细胞内是否存在多核苷酸。在另一实施方式中，可筛选包含多核苷酸的细胞(例如，根据多核苷酸内的可筛选标记物是否存在来筛选)，只有那些包含多核苷酸的细胞才被回输到对象体内。细胞被回输到对象体内后，给予对象配体以诱导治疗性多肽或治疗性多核苷酸表达。在另一个实施方式中，可在细胞回输给对象前将配体添加给细胞，这样治疗性多肽或治疗性多核苷酸就可在细胞回输前表达。配体可通过任何合适的方法给予，系统给药(例如，口服、静脉注射)或局部给药(例如，腹膜内注射、鞘内注射、心室内给药或直接注射到细胞需要回输的组织或器官内，例如，通过瘤内注射)。对于每一种类型的细胞和疾病或失调来说，给予配体的最佳时间点通过常规技术就可以确定。
本发明的体内治疗方法包括将多核苷酸直接导入到对象体内的细胞内。可通过系统给药或局部给药(例如，在疾病或失调的发病部位)的方式将多核苷酸导入到对象体内。多核苷酸导入到对象体内后，可给予配体以诱导治疗性多肽或治疗性多核苷酸的表达。配体可通过任何合适的方法给予，系统给药(例如，口服、静脉注射)或局部给药(例如，腹膜内注射、鞘内注射、心室内给药或直接注射到细胞需要回输的组织或器官内，例如，通过瘤内注射)。对于每一种类型的细胞和疾病或失调来说，给予配体的最佳时间点通过常规技术就可以确定。
对于体内应用来说，本文所述的配体可用药学上可接受的载体制成制剂，例如，溶液、悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂或可注射的组合物。药物组合物中配体所占重量百分比可从0.01％到99％。组合物可以是单次剂量或多次剂量的形式。任何特定药物组合物中的配体含量要依据有效剂量来定，即，能产生理想的基因表达或抑制水平所需的剂量。
给予药用制剂的合适途径包括口服给药、直肠给药、局部给药(包括表皮吸收、含服和舌下含服)、阴道内给药、胃肠外途径给药(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内、瘤内和硬膜外注射)以及通过鼻胃管给药。本领域的技术人员应当理解的是，优选的给药途径要根据被治疗的疾病来定，并且可因某些因素的变化而变化，如受者的状况。
在本文中，术语“rAD.RheoIL 12”是指包含治疗系统(RTS)基因开关控制下的IL-12基因的腺病毒多核苷酸，该载体在有活化配体存在的情况下可以生成IL-12蛋白。
在本文中，术语“IL-12p70”是指IL-12蛋白，其天然形式含有两个亚单位，通常被称作p40和p35。术语IL-12p70包括含有IL-12两个亚单位(p40和p35)的融合蛋白，其中融合蛋白的两个亚单位之间可包含连接子氨基酸。
在本文中，术语“具有IL-12功能的蛋白质”是指具有人IL-12任何生物活性的至少20％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的蛋白质。IL-12的升活性是本领域熟知的，其中包括而不限于诱导天然细胞分化成Th1细胞，刺激T生长和发挥功能，诱导T细胞和自然杀伤细胞(NK)分泌干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，降低IL-4介导的对IFN-γ的抑制作用，增强NK细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞的细胞毒活性，刺激IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达以及抗血管形成活性。术语“具有IL-12功能的蛋白质”包括野生型IL-12序列的突变体，其中野生型IL-12序列已被一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代所改变，以及具有IL-12的一种或多种生物活性的非IL-12蛋白。
在本文中，术语“rAd.cIL12”是指包含组成型启动子控制下的IL-12基因的腺病毒多核苷酸受控载体。
在本文中，术语“活化”是指基因开关的细胞活性可检测水平的升高，导致目的基因的表达(例如，IL-12蛋白)。
在本文中，术语疾病的“治疗”是指为了缓解疾病的症状或体征而执行的方案，可能包括给予哺乳动物(人或非人哺乳动物)一种或多种药物或体外工程细胞。因此，“治疗”并不必然局限于达到症状或体征的完全缓解，不要求治愈，尤其包括只对对象产生边际效应的方案。
在本文中，“免疫细胞”包括树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)。
在本文中，术语“树突细胞”和“DC”可交互使用。
在本文中，术语“治疗支持细胞”(TSC)是指用本发明的载体修饰(例如，转染)的细胞，该细胞可将具有免疫调节功能的一种或多种蛋白以及，可选的，具有IL-12功能的蛋白运送到肿瘤微环境中。这种TSC包括而不限于干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞。
在本文中，术语“体外工程树突细胞”或“体外工程树突细胞群”或“体外工程DC”或“工程树突细胞群”或“表达IL-12的DC”或“DC.RheoIL12”是指条件性表达基因开关控制下的IL-12的树突细胞，该基因开关可被活化配体活化。
在本文中，术语“体外工程TSC”或“体外工程TSC群”或“工程TSC群”或“表达免疫调节因子的TSC”或“表达IL-12的TSC”是指治疗支持细胞，例如，干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞，这些细胞在基因开关被活化配体活化时可条件性地表达基因开关控制下的免疫调节因子和/或IL-12。
在本文中，术语“MOI”或“感染复数”是指在一个特殊实验中感染单个细胞的腺病毒粒子(例如，重组腺病毒或对照腺病毒)平均数。
在本文中，术语“肿瘤”是指体内或体外的所有良性或恶性细胞增生和增殖，无论是癌前病变细胞或癌细胞和/或组织。
可根据本发明进行治疗的癌症的例子包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌，非小细胞肺癌、头或颈癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌，前列腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾脏细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、绒毛膜癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性红细胞增多症、原发血小板增多症、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、原发巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等。
本发明提供了经过改造能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的DC及其在癌症或肿瘤或二者中的应用和/或应用。能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的体外工程DC与IL-12蛋白的组成型生产相比是一种安全的改良。另外，对IL-12表达时间及表达水平的控制能力可以更有效地控制治疗的效果。因此，体外工程DC可制备成药物组合物，作为治疗药物用于人或非人有机体癌症或肿瘤的治疗。另外，体外工程DC群或其亚群可作为载体用于将IL-12蛋白产物条件性地转移到人或非人有机体体内的特殊区域(正常组织，癌或肿瘤)。工程树突细胞还可以条件性地表达IFN-α。所利用的树突细胞可以是自身的或非自身的树突细胞。树突细胞可分离自骨髓或外周血。对于人类患者来说，树突细胞群可通过白细胞去除术分离，其中可将白细胞组分分离出来，并将其他血液组分回输到患者体内。
本发明还提供了除DC以外的经过改造能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的免疫细胞及其在癌症或肿瘤或二者中的应用和/或应用，如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)。DC以外的能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的体外工程免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)与IL-12蛋白的组成型生产相比是一种安全的改良。另外，对IL-12表达时间及表达水平的控制能力可以更有效地控制治疗的效果。因此，DC以外的体外工程免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)可制备成药物组合物，作为治疗药物用于人或非人有机体癌症或肿瘤的治疗。另外，DC以外的体外工程免疫细胞群如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)或其亚群可作为载体用于将IL-12蛋白产物条件性地转移到人或非人有机体体内的特殊区域(正常组织，癌或肿瘤)。DC以外的工程免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)还可以条件性地表达IFN-α。所利用的免疫细胞可以是自身的或非自身的免疫细胞。免疫细胞可分离自骨髓或外周血。对于人类患者来说，免疫细胞群可通过白细胞去除术分离，其中可将白细胞组分分离出来，并将其他血液组分回输到患者体内。
在另一实施方式中，树突细胞可通过用本发明的载体转染人造血干细胞并诱导转染的干细胞分化成树突细胞来制备，其中本发明的载体可表达具有IL-12功能的蛋白质。参见美国专利6,734,014。
在一个实施方式中，编码基因开关的核酸腺病毒载体(rAd.RheoIL12)，其中VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被EMCV内部核糖体进入位点(IRES)分开，被插入到腺病毒穿梭载体内，受人泛素C启动子的控制。被IRES序列分开的IL-12p40和p35亚单位的编码序列被插入到泛素C启动子的上游，被置于合成的可诱导启动子的控制之下。
在另一实施方式中，本发明提供了携带两个融合蛋白转录单位(VP16-RXR和Gal4-EcR)和可诱导IL-12亚单位的穿梭载体，其中可诱导IL-12亚单位已经在大肠杆菌BJ5183细胞内与腺病毒骨架(AdEasy1)重组。在证明了重组克隆以后，可在XL10-Gold细胞内扩增rAd.RheoIL12基因组的质粒并从中纯化质粒，将质粒骨架消化下来以后通过转染到HEK 293细胞内进行病毒包装。
在一个特殊实施方式中，得到的初级病毒储存夜可通过再次感染HEK 293细胞进行扩增，然后通过氯化铯密度梯度离心进行纯化。
在一个实施方式中，IL-12基因是野生型IL-12基因序列。在另一个实施方式中，IL-12基因是经过修饰的基因序列，例如，嵌合序列或已用优选密码子进行修饰的序列。
在一个实施方式中，IL-12基因是人野生型IL-12序列。在另一个实施方式中，序列与野生型人IL-12序列至少有85％的一致性，例如，与野生型人IL-12具有至少90％、95％或99％的一致性。在另一实施方式中，IL-12基因序列编码人IL-12多肽。在另一实施方式中，基因编码的多肽与野生型人IL-12至少具有85％的一致性，例如，与野生型人IL-12具有至少90％、95％或99％的一致性。
在一个实施方式中，IL-12基因是野生型小鼠IL-12序列。在另一个实施方式中，序列与野生型小鼠IL-12序列至少有85％的一致性，例如，与野生型小鼠IL-12具有至少90％、95％或99％的一致性。在另一实施方式中，IL-12基因序列编码小鼠IL-12多肽。在另一实施方式中，基因编码的多肽与野生型小鼠IL-12至少具有85％的一致性，例如，与野生型小鼠IL-12具有至少90％、95％或99％的一致性。
本发明提供了能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的体外工程DC的制备方法，该方法包括步骤：(a)通过将载体导入到所述DC内来修饰至少一部分DC，例如，骨髓来源的DC，从而制备出能够治疗或预防疾病的所述体外工程DC群，其中载体包含基因开关，该基因开关包含编码具有IL-12功能的蛋白质的核酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了能够条件性表达具有IL-12功能的蛋白质的除DC或TSC之外的体外工程免疫细胞群，如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)，的制备方法，该方法包括步骤：(a)通过将载体导入到除DC或TSC之外的所述免疫细胞内来修饰至少一部分免疫细胞，从而制备出能够治疗或预防疾病的除DC或TSC之外的所述体外工程免疫细胞群群，其中载体包含基因开关，该基因开关包含编码具有IL-12功能的蛋白质的核酸序列。
在其他实施方式中，本发明提供了分离和富集除DC或TSC之外的免疫细胞的方法。DC可分离自人、小鼠或其他哺乳动物的骨髓。树突细胞可分离自人、小鼠或其他哺乳动物的血液。对于人类患者来说，树突细胞群可通过本领域熟知的白细胞去除术分离，其中可将白细胞组分分离出来，并将其他血液组分回输到患者体内。在一个实施方式中，按照以前描述的方法(Tatsumi等，2003)从小鼠骨髓分离DC。简言之，野生型或EGFP Tg小鼠骨髓(BM)在添加1000单位/ml重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和重组mIL-4(新泽西州制备技术公司(Peprotech，Rocky Hill，NJ))的条件培养基(CM)内培养，在37℃、5％CO2的湿润孵育箱中培养7天。然后分离CD11c+DC，例如，利用特异性MACSTM磁珠按照厂家的说明书操作(加州MB公司(MiltenyiBiotec，Aubum，CA))。根据形态学和CD11b、CD40、CD80和I类、II类MHC抗原的表达情况分析，以这种方式制备出的CD11c+DC纯度可到达95％以上。
本发明的一个实施方式提供了能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的工程DC，这种DC适于作为基因治疗方法用于人或非人有机体的癌症或肿瘤或二者的治疗。本发明的另一实施方式提供了能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质的工程DC，这种DC适于作为基因治疗方法用于人或非人有机体的癌症或肿瘤或二者的治疗。
在一个实施方式中，本发明提供了包含基因开关的工程DC。
在另一个实施方式中，本发明包括治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括给予有效量的二酰基肼配体。
在另一个实施方式中，本发明包括治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括给予有效量的RG-115830或RG-115932。
在另一个实施方式中，本发明包括试剂盒，该试剂盒包含经过改造含有基因开关的树突细胞以及包含能活化基因开关的配体。
在另一个实施方式中，本发明包括试剂盒，该试剂盒包含经过改造含有基因开关的树突细胞以及含有RG-115830或RG-115932的组合物。
在另一实施方式中，本发明提供了包含蜕皮激素受体至少一部分的工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了包含以蜕皮激素受体为基础的基因开关的工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞。在另一实施方式中，本发明提供了包含RheoSwitch的工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了包含工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞以及能调节基因开关的配体的试剂盒，其中工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞包含基因开关。在另一实施方式中，试剂盒还包含二酰基肼。在另一实施方式中，试剂盒还包含RG-115830或RG-115932。
在一个实施方式中，本发明提供了工程DC群。培养7天的DC不进行处理，或者用组成型启动子控制的编码小鼠IL-12p70的重组腺病毒载体(rAd.cIL12)或可诱导启动子控制的编码小鼠IL-12p70的重组腺病毒载体(rAd.RheoIL12)感染，或者用对照空载体腺病毒载体(rAdψ5)感染，用不同的感染复数(MOI)感染。48小时后，收获感染的DC并分析表型或利用特异性ELISA试剂盒(加州圣地亚哥BDP公司(BD-PharMingen，San Diego，CA))分析IL-12p70的表达情况，较低的检测水平为62.5pg/ml。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含载体如DNA载体的体外工程DC群、除DC或TSC之外的免疫细胞群，其中载体包含能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质的基因开关，以及还包含活化配体。在另一个实施方式中，本发明提供了包含载体如DNA载体的体外工程DC群、除DC或TSC之外的免疫细胞群，其中载体包含能条件性地表达具有IL-12功能的蛋白质和/或具有IFN-α功能的蛋白质的基因开关，以及还包含活化配体。
在另外一个实施方式中，本发明提供了治疗癌症如黑色素瘤或胶质瘤的方法，该方法包括给予患者工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞，然后给予所述患者活化配体，例如RG-115919、RG-115830或RG-115932。患者可以是癌症人类患者或动物。治疗方法以及产品、工程细胞、试剂盒和配体已用于人的治疗和兽医治疗。因此，产品和方法可以考虑用于人和动物。
本发明证明在DC(被称为DC.RheoIL12)、除DC或TSC之外的免疫细胞内条件性表达IL-12蛋白能够克服早期IL-12在肿瘤损伤部位内的免疫学影响以及晚期在肿瘤引流淋巴结内的免疫学影响，后者利用常规的基因治疗方案无法获得治疗效果。本发明还发现给予工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞后IL-12的表达时相对成功治疗癌症来说是关键的。
本发明的一个方面提供了适于给予人或非人动物的药物组合物，其中包含能条件性表达具有IL-12功能的蛋白质或条件性表达IL-12和/或IFN-α的体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞。本发明还提供了包含活化配体如RG-115830或RG-115932的组合物，其中组合物适于通过腹膜内、口服或皮下给药。
在本文的特殊实施方式中，本发明提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括：
a.将上述体外工程DC通过瘤内注射给予哺乳动物；以及
b.给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体。
例如，本发明提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括以如下顺序排列的步骤：
a.提供体外工程DC；
b.通过瘤内注射给予哺乳动物所述的体外工程DC；以及
c.给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括：
a.将除树突细胞之外的上述体外工程免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)或治疗支持细胞通过瘤内注射给予哺乳动物；以及
b.给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体。
在一个实施方式中，体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞可给予一次。在另一个实施方式中，体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞可给予一次以上，如果单次给药被证明是安全的并且能被良好耐受，多次注射可能会对患者有利。再次治疗的标准是患者的疾病稳定或显示出病情改善的临床(即，CT扫描显示肿瘤被抑制，血清化学指标、尿液分析结果、血液学指标、生命体征、肿瘤直径缩小等)或主观(例如，ECOG状态改善等)信号。再次治疗开在初次治疗后1、2、3、或4周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月、或1、2、3、4或5年后开始。
多剂量转基因治疗的效果和安全性可通过针刺抽吸肿瘤及其相关引流淋巴结的活检组织样品来评价。可在再次治疗期间的-12天到-7天以及14天时收集组织样品来分析IL-12转基因在体内的表达以及细胞免疫反应。活检组织样品可用标准显微镜和免疫组化技术分析以评价T细胞浸润到肿瘤和引流淋巴结内的情况。利用适当设计的引物也可以对RNA进行RT-PCR。在再次治疗期间的-12到-7天、8天和14天可采集血液分析血清内细胞因子的表达模式。血清内细胞因子的表达模式可用于确定其他细胞因子的表达是否受hIL-12转基因治疗的影响。利用Luminex进行多重细胞因子检测可用于分析血清中的IL-12、INF-γ、IP-10以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10。
在一个实施方式中，活化配体和体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞基本同时给予，例如，在给予细胞之前或之后的一小时内。在另一个实施方式中，活化配体在给予体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞之后约24小时或24小时之内给予。在另一个实施方式中，活化配体在给予体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞之后约48小时或48小时之内给予。在另一个实施方式中，配体是RG-115932。在另一个实施方式中，配体的给药剂量约为1-50mg/kg/天。在另一个实施方式中，配体的给药剂量约为30mg/kg/天。在另一个实施方式中，配体每日给药，持续5-28天。在另一个实施方式中，配体每日给药，持续14天。在另一个实施方式中，给予约1x106-1x108个细胞。在另一个实施方式中，给予约5x107个细胞。
为了证明IL-12介导的基因治疗的有效性，可以使用条件性IL-12cDNA表达系统，该系统可使人们在瘤内注射的不同时间点开启DC.RheoIL12细胞分泌IL-12。根据从侵袭性B16黑色素瘤C57BL/6小鼠模型得到的结果，可得出如下结论：1)DC.RheoIL12分泌的IL-12水平在存在活化配体的情况下升高，但在没有配体时IL-12分泌水平不升高；2)如果在DC注射后的24小时内给予RG-115830，以瘤内注射DC.RheoIL12为基础的治疗与以瘤内注射DC.cIL12为基础的治疗一样有效(在提供配体期间的后几个时间点RG-115830治疗无效)；3)DC内表达的IL-12可延长肿瘤微环境内的这些细胞的存活期，与较高数量的迁移到肿瘤引流淋巴结内的瘤内注射的DC有关；以及4)与治疗效果相关的最强免疫是治疗交叉启动的肿瘤特异性CD8+T细胞的水平，而不是滞留在肿瘤微环境内的注射的DC数量。总之，这些数据说明以DC.IL12为基础的治疗是有可能成功的，因为这些细胞对1型CD8+T效应细胞的输入(交叉启动)有积极影响，但是对后期的输出事件没有影响，如注射的DC介导的抗肿瘤T细胞向肿瘤微环境内的积聚等。
在瘤内注射前，可用因子处理细胞(免疫细胞或TSC)以刺激这些细胞的活性。例如，细胞可用共刺激分子如正性共刺激分子处理，其中包括OX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHT或ICOS-L，或者用负性共刺激分子处理，例如抗-CTLA4、抗-PD-L1、或抗-PD-L2抗体。例如，细胞(例如，DC，免疫细胞或TSC)可与表达一种或多种共刺激分子的细胞共孵育，例如，表达CD40配体分子的J588淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，细胞(免疫细胞或TSC)可用计数免疫抑制分子(耐受抑制因子)处理，例如，抗TGF-β抗体(用于抑制微环境内的TGF信号传导)、抗IL-10抗体、TGF-βRII DN(抑制基因修饰细胞内的TGF信号传导)、IL-10R DN、dnFADD(抑制细胞内的细胞死亡通路)、抗-SOCS1抗体、siRNA或诱饵(抑制细胞内的抑制性细胞因子信号传导)、或抗-TGF-α抗体。
DC和其他抗原提呈细胞产生的IL-12可作用于CD4+和CD8+T细胞，诱导它们分别呈现Th1或Tc1表型。因此，有可能通过测定患者生物样品内的Th1/Tc1型细胞因子IFN-γ的表达水平或活性来确定IL-12对细胞群的效应。
为了本发明的目的，本发明提供了确定以体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞为基础的治疗方案在癌症患者体内的效应的方法，该方法包括：
a.在给予体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞之前，测定来自于人类患者的第一生物样品内的干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平或活性水平或二者，得到一个对照水平；
b.通过瘤内注射给予所述患者体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞；
c.给予所述患者有效量的活化配体；
d.在给予所述活化配体后的某个时间点，测定来自于所述患者的第二生物样品内的IFN-γ的表达水平或活性水平或二者，得到一个试验水平的数据；以及
e.比较IFN-γ的对照水平和试验水平，其中数据显示试验水平的IFN-γ的表达水平、活性水平或二者与对照水平相比升高则说明治疗方案在所述患者体内是有效的。
在一个实施方式中，本发明提供了确定以除DC或TSC之外的体外工程免疫细胞为基础的治疗方案在癌症患者体内的效应的方法，该方法包括：
a.在给予除DC或TSC之外的体外工程免疫细胞之前，测定来自于人类患者的第一生物样品内的干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平或活性水平或二者，得到一个对照水平；
b.通过瘤内注射给予所述患者除DC或TSC之外的体外工程免疫细胞；
c.给予所述患者有效量的活化配体；
d.在给予所述活化配体后的某个时间点，测定来自于所述患者的第二生物样品内的IFN-γ的表达水平或活性水平或二者，得到一个试验水平的数据；以及
e.比较IFN-γ的对照水平和试验水平，其中数据显示试验水平的IFN-γ的表达水平、活性水平或二者与对照水平相比升高则说明治疗方案在所述患者体内是有效的。
术语“对象”是指完整的昆虫、植物或动物。可以预期的是，当对象是真菌或酵母时配体也同样能发挥作用。术语“对象”可以是期望对其进行诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物包括而不限于人、家畜、牲口、动物园动物如熊、体育动物、宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、母牛；灵长类动物如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和老虎；马科动物如马、驴和斑马；食用动物如母牛、猪和绵羊；有蹄类动物如鹿和长颈鹿；啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方式中，动物是人。
术语“动物”将包括单个“动物”以及群体“动物”，包含哺乳动物和鸟以及鱼、爬行动物和两栖动物。术语动物还包含模型动物，例如疾病模型动物。在某些实施方式中，术语动物包括经济上的或其他方面的贵重动物，例如，昂贵的种畜、比赛动物、观赏动物、传家动物、稀有或濒危动物或伴侣动物。更具体地说，哺乳动物可以是人、肉食动物或伴侣动物。
在本文中，有此需要的“哺乳动物”是指期望对其进行治疗的哺乳动物，即，缩小肿瘤或根除肿瘤。
本发明的方法依据的是瘤内注射的树突细胞从肿瘤微环境中捕获肿瘤抗原并刺激引流淋巴结内的T细胞发育成肿瘤特异性的T细胞反应。因此，在进行瘤内注射时DC应处于高胞吞活性阶段以达到最佳的治疗效果。研究证明通过用GM-CSF和IL-4处理CD14+单核细胞约6-7天而得到的未成熟DC具有未成熟表型和高胞吞率(Cella等，1999；Gilboan，2007)。DC的成熟与胞吞活性的抑制有关。研究证实IL-12可作用于未成熟DC并产生信号刺激成熟诱导因子表达(Nagayama等，2000)。因此，通过使用RTS有可能优化对人的治疗结果，通过延迟转导的DC表达IL-12直到它们被注射到肿瘤内。由于组成型表达系统缺乏时序调控表达的能力，因此其产生的IL-12的自分泌作用及其导致的成熟过程是无法控制的(Mazzolini等，2005)。另外，本发明通过检测受控基因表达系统在人类对象体内的表现可以发现该系统在其他人类基因治疗领域的应用。
虽然不希望被理论束缚，但是可以预期的是，本发明将支持瘤内注射体外工程DC、除DC或TSC之外的免疫细胞为基础的基因治疗方法用于临床，焦点集中于以客观的临床反应作为主要研究终点，交叉激活的抗肿瘤CD8+T细胞(产生FN-γ)作为次要研究终点。数据显示开启和关闭IL-12在体内表达的能力为提高安全性和控制治疗增加了砝码，其中通过给予配体可控制IL-12表达的时序性和水平，并且预期IL-12表达的时序性是本方法的疗效的关键所在。
本发明还支持能条件性表达目的基因的体外工程细胞作为有效治疗人类疾病的创新方法在治疗方面的应用。
在本文所引用的任何参考文献的教义或提示与说明书发生矛盾时，为了本发明的目的，将以后者为重。
现在将在下面的实施例中描述本发明方法的特殊实施方式，提供实施例的目的在于说明，并不意味着限制本发明的范围。
实施例
实施例1
DC.RheoIL12在体外响应配体RG-115830条件性产生高水平的IL-12p70
1.1材料和方法
1.1.1小鼠
6-8周龄雌性C57BL/6野生型和C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFPTg小鼠购自缅因州杰克逊实验室(Jackson Laboratory，(Bar Harbor，ME)，在小隔离笼内饲养。按照正确饲养和使用实验动物的说明来处理动物。
1.1.2细胞系
与C57BL/6小鼠同系的B16黑色素瘤和EL-4胸腺瘤H-2b细胞系在以前已有报道(Itoh等，1994)。细胞系用CM培养基(RPMI1640，添加10％热灭活胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10mM L-谷氨酰胺；所有试剂均购自加州因维曲根公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))培养，增湿孵育箱、5％CO2和37℃。
1.1.3树突细胞(DC)的制备
按照以前描述的方法(Tatsumi等，2003)从小鼠骨髓中制备DC。简言之，野生型或EGFP Tg小鼠BM用添加1000单位/ml重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和重组Mil-4(新泽西州制备技术公司(Peprotech，Rocky Hill，NJ))的CM培养，在37℃、5％CO2增湿孵育箱中培养7天，然后利用特异性MACSTM磁珠按照厂家的说明书操作(加州MB公司(Miltenyi Biotec，Auburn，CA))分离CD11c+DC。根据形态学和CD11b、CD40、CD80和I类、II类MHC抗原的表达情况分析，以这种方式制备出的CD11c+DC纯度可到达95％以上。
1.1.4病毒载体
对照腺病毒载体rAd.ψ5和编码CMV启动子控制之下的mIL-12的rAd.cIL12(Tatsumi等，2003)由匹兹堡大学癌症研究所的载体核心设施制备和提供。
rAd.RheoIL12载体通过如下方法制备。VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被EMCV内部核糖体进入位点(IRES)分开，被插入到腺病毒穿梭载体内，受人泛素C启动子的控制。随后，被IRES序列分开的IL-12p40和p35亚单位的编码序列被插入到泛素C启动子的上游，被置于合成的可诱导启动子的控制之下(参见图1)。表达两个融合蛋白(VP-16RXR对Gal4-EcR)，分别受强度不同的两个启动子控制，的系统的表现表明，较高的VP16-RXR对Gal4-EcR比例可以得到最佳效果。因此，将VP-16RXR置于IRES上游而将Ga1-4EcR置于IRES下游比相反的设计效果更好。
携带两个融合蛋白转录单位和可诱导IL-12亚单位的穿梭载体在大肠杆菌BJ5183细胞内与腺病毒骨架(AdEasy1，加州斯图特基因公司(stratagene，LaJolla，CA))重组。证明是重组克隆以后用XL10-Gold细胞扩增携带rAd.RheoIL12基因组的质粒并纯化，切去质粒骨架后通过转染HEK 293细胞包装病毒。
得到的初级病毒储存夜可通过再次感染HEK 293细胞进行扩增，然后通过氯化铯密度梯度离心进行纯化。
1.1.5ELISA
培养7天的DC不进行处理，或者用组成型启动子控制的编码小鼠IL-12p70的重组腺病毒载体(rAd.cIL12)或可诱导启动子控制的编码小鼠IL-12p70的重组腺病毒载体(rAd.RheoIL12)感染，或者用对照空载体腺病毒载体rAdψ5感染，用不同的感染复数(MOI)感染。在感染后的不同时间点(0-48小时)，收获DC并在缺乏或存在活化配体(10-200μg/ml)的条件下继续培养24小时，然后通过特异性ELISA试剂盒(加州圣地亚哥BDP公司；检测下限＝62.5pg/ml)分析IL-12p70的分泌情况。在某些例子中，为了区分条件性细胞因子生成的严格程度，转染rAd.RheoIL12的DC(即DC.RheolL12)先用活化配体预处理，然后将配体洗掉，在对照培养基内继续培养24小时，进而分析IL-12p70的分泌情况。另外，在48小时后，收获感染的DC，利用ELISA试剂盒(加州圣地亚哥BDP公司)分析IL-12p70的分泌情况，检测下限为62.5pg/ml。
1.1.6流式细胞术
为了分析腺病毒感染的DC的表型，使用PE-或FITC-连接的抗小鼠细胞表面分子(CD11b、CD11c、CD40、CD54、CD80、CD86、H-2Kd、I-Ad(均购自加州BDP公司))的mAb和适当的同种型对照抗体染色，然后利用FACscan(加州圣约瑟BD公司(Becton Dickinson，San Jose，CA))流式细胞仪进行流式细胞检测分析。
1.2结果
1.2.1感染Rheo-IL12的小鼠骨髓DC在体外用配体处理时可条件性地表达高水平的IL-12p70。
来源于C57BL/6(B6)小鼠BM的DC用rmIL-4和rmGM-CSF培养7天，然后不进行任何处理，或者用不同MOI的对照rAd.ψ5、rAd.cIL-12(编码组成型CMV启动子控制下的mIL-12p70)或rAd.RheoIL12(编码IL-12p70，受小分子配体RG-115830反应性的条件性启动子的控制)感染。感染后48小时，在缺乏或存在RG-115830的条件下继续培养24小时，此时收获培养上清，通过ELISA定量检测IL-12p70的表达水平。如图2A所示，未感染的对照DC或Ad.ψ5感染的DC在缺乏或存在外源药物的条件下其表达的IL-12p70水平与感染rAd.cIL12的DC(DC.cIL12)相比没有升高。感染rAd.RheoIL-12的DC(DC.RheoIL12)只有在用RG-115830处理时才分泌IL-12p70(参见图2A和2B)。根据“十字交叉”实验的结果，感染的DC在用MOI 100感染并用50-200μg/ml RG-115830处理时才能分泌最高水平的IL-12p70(图2A)。将RG-115830提供给DC.RheoIL12的时间推迟到48小时，与在0小时时间点添加该配体相比，IL-12p70的表达水平没有明显下降(图2B)。最后，去除配体可快速静默DC.RheolL12(已被配体活化)继续在体外生成水平升高的IL-12p70的能力(图2C)。
实施例2
通过瘤内注射将体外工程树突细胞注射到动物体内
2.1方法和材料
2.1.1B16肿瘤模型
在第0天B6小鼠右腹部皮下注射1x105B16黑色素瘤细胞。在第7天时肿瘤可达约20-30mm2，小鼠瘤内注射PBS，或者注射用总体积50μl PBS悬浮的1x106对照DC或腺病毒转导的(MOI＝100)的DC。在注射后的0、24或48小时，再给小鼠腹膜内注射200μg RG-115830(溶于50μl DMSO中)或DMSO载体对照。从开始注射RG-115830起，小鼠总共接受连续5次该剂量的RG-115830腹膜内注射，每日一次。在另外的实验中，配体注射开始于DC注射的那一天，然后在DC注射后1、3或5天时终止，以观察IL-12p70转基因启动被提前终止是否会降低该方法的疗效。对于所有实验组来说，每3天或4天测量一次肿瘤大小，根据用游标卡尺测量的最大垂直直径来确定肿瘤的大小，记录为mm2。数据表示为平均肿瘤面积±SD。所有队列均包含5只小鼠。
在带标识的实验中，治疗后无肿瘤的动物(45天)再次接种B16黑色素瘤细胞(左腹部注射105细胞，即，原来接种B 16的部位的对侧)和MC38结肠癌细胞(在右腹部注射105细胞)以确定这些小鼠是否存在记忆免疫及其特异性。所有数据都表示为平均肿瘤面积±SD。所有动物队列均包含5只小鼠。
为了评价注射的DC的命运和功能，在第7天时从C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFP Tg小鼠骨髓中分离CD11c+DC。EGFP+CD11c+DC不进行感染或者用上述重组腺病毒感染。感染后48小时，收获1x106对照DC或病毒感染的DC，用PBS洗涤，然后注射到已在同系B 16小鼠体内建立7天的肿瘤损伤部位。DC注射后3天，切除肿瘤和腹股沟引流淋巴结(LN)，用2％低聚甲醛(溶于PBS中)固定1小时，然后冷冻保存在用PBS配置的30％蔗糖中，进而冷冻在液氮冷却的异戊烷中进行休克处理。制备5微米冷冻切片，用2mg/ml Hoechst 33258(密苏里州圣路易斯SA公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))复染3分钟。经过洗涤的切片包埋在Gelvatol(密苏里州圣路易斯MC公司(Monsanto Chemical Co.，St.Louis，MO))上，用配备有冷却电荷耦合装置彩色照相机的Olympus BX51显微镜观察。
2.1.2评价抗B16黑色素瘤的特异性CD8+T细胞反应
接种肿瘤25天后，每组取两只处理的小鼠，通过磁珠细胞分选(MACSTM；MB公司(Miltenyi Biotec))从小鼠脾脏分离CD8+T细胞，使其纯度达到95％以上，细胞再与1x104经照射的(10,000雷德)B16或EL-4肿瘤细胞共培养(1x105/孔)。孵育48小时后收集培养上清，利用检测下限为31.5pg/ml的商用ELISA(加州BDP公司)分析IFN-γ的释放。数据表示为三个复孔的平均值±SD。
2.1.3统计学分析
包含3组或3组以上的所有实验都先用单因素或双因素ANOVA分析，其中各组的处理方法是完全随机分配的。如果得到的P值小于0.05，那么特定配对比较用T检验进行分析，按照需要对不等方差进行Welch校正。检查数据的分布特性，需要时做适当转化。脾细胞来源的T细胞所分泌的IFN-γ用精确克鲁斯卡尔-瓦斯利检验进行分析。如果克鲁斯卡尔-瓦斯利检验的P值小于0.05，则用Wilcoxon检验进行先验比较。治疗性单肿瘤接种小鼠治疗模型的分析用混合线性模型完成。数据转化成对数形式，估计鼠内协方差，调整固定治疗效应用于随机小鼠效应。单个时间点上的配对比较的原始P值通过自助重采样进行调整。肿瘤排斥率拟合成广义线性模型(用二项式连接)，插入治疗组、观察天数及其相互作用。
2.2结果
2.2.1通过瘤内注射单独给予DC.cIL12或者在给予DC.RheoIL12的同时腹膜内注射RG-115830可促使通过皮下注射建立的B16黑色素瘤损伤消退
B16黑色素瘤细胞(1x105)腹膜内注射到同系H-2b B6小鼠的左腹部，使其形成肿瘤。在第7天时，小鼠随机分配到不同队列中，每个队列包含5只动物，一个队列的肿瘤平均大小约为20-30mm2。然后将PBS或溶于50μl PBS内的106DC(提前48小时用rAd.ψ5、rAd.cIL12或rAd.RheoIL12感染)。在注射DC的同时(即，治疗的第1天)或注射DC后的24或48小时(即，治疗的第2天)动物腹膜内注射DMSO或RG-115830(溶于DMSO中)。如图3A和3B所示，单独用RG-115830处理或者在缺乏RG-115830的情况下用DC.RheoIL12处理都无法产生治疗效应。与此明显不同的是，用DCcIL-12或DC.RheoIL-12+RG-115830处理(DC注射后24小时内提供，配体共注射5天)的肿瘤在随后的3周内尺寸缩小。根据肿瘤大小测量结果来看，这些治疗方法是有统计学差别的，在这些动物中每一只动物都产生了100％(5只鼠中的5只)的肿瘤消退率。令人感兴趣的是，如果在瘤内注射DC后延迟48小时(在该时间点，该因子也能在体外有效地促进DC.RheoIL-12分泌IL-12p70，参见图2B)再给予RG-115830，以DC.RheoIL12为基础的治疗也能产生微小的肿瘤生长抑制率(10天后的所有时间点p＜0.05)，但是所有动物的肿瘤都在发展，并且到30天时需要处死(图3A)。这说明在主要的早期时间点瘤内注射DC.IL12进行治疗的疗效主要依赖IL-12p70的产生(据推测大概发生在肿瘤损伤部位和/或引流淋巴结内)。
其他实验都给予活化配体(RG-115830)，分别在DC注射后的1、3或5天给予注射DC.RheolL-12的小鼠(图3B-3C)。这些实验的结果表明较早终止给予配体会影响瘤内注射DC.RheolL-12所产生的抗肿瘤效应，如果在给予基因修饰的DC后约5天或更长时间内不给小鼠提供配体则肿瘤生长抑制效应有限或消失。这些结果与图2B和2C所提供的数据一致，证明给该模型注射DC.RheolL-12所产生的治疗效果是受调节的(配体依赖性的)。另外，综合分析发现，图3所描述的结果证明，与瘤内注射DC.RheoIL12相关的最佳抗黑色素瘤效应来自于B16肿瘤内注射DC后1-5天期间所提供的配体。
2.2.2条件性DC.RheoIL12治疗的延迟活化是无效的，因为注射的DC明显无法在体内存活
我们以前的报道(Tatsumi等，2003)证明了IL-12基因插入DC可使这些细胞在注射到肿瘤微环境后存活期延长，并且能增强这些细胞交叉活化抗肿瘤CD8+T细胞的能力，据推测可以诱导循环中的效应T细胞进入体内的肿瘤微环境。因此，下一步要做的是证明DC注射后48小时开始的DC-RheoIL12治疗(通过腹膜内注射RG-115830)无效是否是因为DC无法在肿瘤微环境中存活，这些细胞是否无法进入肿瘤引流LN和/或特异性CD8+T细胞是否无法因治疗而被交叉激活。图3A所描述的实验是结果的概述，每个队列2只小鼠，瘤内注射DC后72小时处死，但是EGFP Tg(H-2b)小鼠是例外，用作制备DC的骨髓来源。切除肿瘤和LN，制作组织切片，通过荧光显微镜分析EGFP+DC。每个队列中剩余的3只动物饲养到25天，然后处死，分离其脾细胞用于分析B16-特异性的CD8+T细胞反应。
如图4所述，瘤内注射后72小时EGFP+DC在肿瘤或LN内的溶解能力严格依赖于体内注射这些细胞后24-48小时内IL-12转基因的活化。在B16损伤内很容易观察到EGFP+DC.cIL12和DC.RheoIL12，但是在瘤内注射DC.cIL12或DC.RheoIL12的小鼠的引流LN内较少见到这些细胞(如果在注射DC后0或24小时提供RG-115830)。在用对照(未感染的)DC或DC.RheoIL12(其中RG-115830的给予延迟到DC注射后48小时)处理的动物的组织内很少或无法检测到EGFP+DC。在DC.RheoIL12处理的小鼠来源的组织中，0小时和24小时提供RG-115830相比较，较早提供活化药物可以在肿瘤(p＝0.001)和引流LN(p＝0.02)内观察到更多EGFP+DC。
2.2.3注射DC.RheoIL12的疗效与特异性CD8+T细胞的诱导和持续性的
抗肿瘤免疫有关
由于注射的DC的活力明显依赖于配体注射的时间，因此我们推测，在0小时时间点接受RG-115830活化的DC.RheoIL12的小鼠体内特异性CD8+T细胞的交叉激活程度要超过后来的时间点。令人感兴趣的是，在0小时(DC.RheoIL-12，d1-d5)与48小时(DC.RheoIL-12，d3-d7)DC.RheoIL-12队列比较时确实观察到了这种现象，但是当0小时与24小时(DC.RheoIL-12+L，d2-d6)DC.RheoIL12队列比较时没有发生这种情况(图5A)。抗相关B16与不相关EL-4肿瘤靶位的体外CD8+T细胞反应(IFN-γ分泌)确实是一样的，这些队列中每一队列的水平都与DC.cIL12处理小鼠所检测到的水平相似。总之，这些CD8+T细胞反应模式看起来与治疗效果直接相关(图3A)。与图5A一样，因IFN-γ分泌所产生的针对特异性B16肿瘤细胞和不相关的MC38细胞的脾T细胞反应也与治疗结果相关。
为了证明有效的以DC.RheolL12为基础的治疗是否与持续性的抗肿瘤免疫的出现有关，在45天时(初次接种B16后)无肿瘤动物再次接种相关的B16黑色素瘤细胞或不相关的MC38结肠癌细胞。如图5B所示，以前的黑色素瘤已被治愈的所有小鼠都产生了抗B16肿瘤细胞的特异性保护作用，而MC38肿瘤损伤呈进行性地生长。这说明本发明的树突细胞有更高的安全性，对治疗措施有潜在的控制能力(对于二者来说，可以通过给予配体来控制IL-12表达的时序性和水平)。
实施例3
配体给药途径/给药剂量对疗效影响的比较
3.1方法和材料
在同系B6小鼠右腹部皮下注射B16黑色素瘤细胞，7天后可形成B16黑色素瘤。在第7天，瘤内(i.t.)注射106DC.SP1-IL-12(通过图10的比较被鉴定为最佳基因开关)。在DC注射的当天，通过腹腔注射，在Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)内口服灌胃或通过任意进食含药物饲料给动物提供活化配基(RG-115830)(以及每日给药，持续6天)。每个队列含5只动物，每3-4天测量一次肿瘤生长情况，记录为平均大小(根据正交测量结果计算出mm2)。
每一队列的处理方法见下表：
 队列#   处理方法
  1   对照，无DC，无配体
  2   对照，无DC，腹膜内注射配体，50mg/kg/天(最大剂量)
  3   对照，无DC，任意进食饲料(45mg/kg/天)
  4   对照，无DC，口服灌胃，30mg/kg/天
  5   DC.SP1-IL-12，无配体
  6   DC.SP1-IL-12，腹膜内注射，1mg/kg/天
  7   DC.SP1-IL-12，腹膜内注射，3mg/kg/天
  8   DC.SP1-IL-12，腹膜内注射，10mg/kg/天
  9   DC.SP1-IL-12，腹膜内注射，30mg/kg/天
  10   DC.SP1-IL-12，腹膜内注射，50mg/kg/天
  11   DC.SP1-IL-12，任意进食饲料(45mg/kg/天)
  12   DC.SP1-IL-12，口服灌胃，30mg/kg/天
3.2结果
结果显示，单独给予配体不论任何剂量或通过任何途径都对B16的生长没有影响(图6)。DC-SP1瘤内注射治疗可有效控制B16的生长，但是只是在给予配体时，不论何种给药途径，给予配体后都能产生一定程度的疗效。通过腹膜内注射配体进行DC-SP1瘤内注射治疗可产生明显的配体剂量-肿瘤抑制反应关系，配体剂量大于30mg/kg/天时可产生最佳抗肿瘤效应。进行DC-SP1瘤内注射治疗时给予30mg/kg/天的配体，无论是通过腹膜内注射、口服灌胃或者食物混合给予配体所产生的疗效相同。但是将配体混合在食物中来提供，即使较高的剂量其产生的疗效也有某种程度的下降。由于只有R对映异构体(RG-115932)能够活化RTS，因此任意进食包含消旋混合物的饲料也只能提供20-22.5mg/kg/天的活性对映异构体。在这方面，通过食物接受消旋对映异构体混合物AD(即，～20-22.5mg/kg/天活性消旋对映异构体RG-115932)的动物所出现的肿瘤抑制效应与腹膜内注射纯RG-115932所产生的剂量反应是一样的，其中通过食物给药队列的抗肿瘤效应处于腹膜内注射10和30mg/kg/天RG-115932剂量组所产生的效应之间。这些数据说明通过口服给予配体可以有效诱导出治疗效应。配体可以通过口服给药将减轻患者的治疗负担。
这种活化药物依赖性的效应与下列因素有关：91)转基因在肿瘤和DLN内的表达情况，(2)Ad-DC在肿瘤微环境中存活期延长，(3)AdDC向DLN内的迁移以及在其中的存活时间，以及(4)抗B16CD8+T的诱导。
图10显示的是含IL-12的不同腺病毒载体的疗效比较。在包含Rheoswitch开关的突变体中，SP1-RheoIL-12突变体是最有效的。SP1-RheoIL-12与oldRheoIL-12的区别在于载体骨架(OldRheoIL-12的骨架是AdEasyl载体，Spl-RheoIL-12载体的骨架是ViraQuest的RAPAd载体)。TTR-RheoIL-12与oldRheoIL-12的区别在于前者包含一个位于Gal4反应元件下游的TTR微小启动子。如图10所述，SP1-RheoIL-12比TTR-RheoIL-12能更有效地降低B16黑色素瘤的大小。
图11显示的是，以前用包含重组腺病毒Rheoswitch可诱导IL-12的树突细胞(DC-SP1-RheoIL-12)治疗的小鼠重新接种肿瘤细胞后未形成B16黑色素瘤。这说明当B16免疫小鼠在首次接种B16细胞后45天再次接种，B16黑色素瘤的生长被抑制最多可达25天。小鼠树突细胞来源于B6小鼠的骨髓，在包含rmIL-4和rmGM-CSF的完全培养基(RPMI-1640，10％FBS)中培养7天。然后利用特异性MACS磁珠按照厂家(MB公司Miltenyi Biotech)的说明书分离CDD11c阳性树突细胞，以100MOI的rAd.IL-12(RheoIL-12对SP1对TTR)感染，24小时后注射106DC到已建立9天的皮下B16黑色素瘤内(每组5只小鼠，肿瘤位于右腹部)。在DC注射后的0-4天，小鼠不进行治疗或者用每日腹膜内注射活化配体RG-115830(30mg/kg，溶于50微升DMSO中)进行治疗。每3-4天测一次肿瘤大小，根据正交直径计算，记录为mm2。为了评价治疗相关的保护作用的特异性，在初次接种B16肿瘤后的第45天在所有无瘤小鼠的左腹部再次接种105B16黑色素瘤细胞，在右腹部再次接种MC38结肠癌细胞。MC38肿瘤可形成，但是B16肿瘤没有形成。
图12显示的是B16黑色素瘤小鼠模型中注射到B16肿瘤内的不同树突细胞(DC-SP1-RheoIL-12)数(105、106、107)与配体给药持续时间(6天，13天)所产生的肿瘤抑制效应比较。图12显示的是注射到肿瘤内的转导的DC数与AD给药持续时间(腹膜内注射，30mg/kg/天)与肿瘤生长的抑制相关。荷瘤小鼠单次瘤内注射剂量为105、106、和107的AdDC，并且从注射107细胞的那天开始每日腹膜内注射单次剂量为30mg/kg/天的活化配体，持续6天或13天。另外，活化配体提供13天与提供6天相比所观察到的肿瘤生长抑制效应更明显。配体(RG-115932)注射13天与107树突细胞的组合可在25天的期间内产生肿瘤消退效应。这说明与体外转到的DC在注射到肿瘤内后只能存活数天的看法相反，表达RTS控制下的IL-12的AdDC很可能在注射到肿瘤内后1周以上还能保持完整，甚至在注射后13天还能存活并对活化配体产生反应。单独的活化配体(无AdDC)对肿瘤生长没有影响。
在一个与图12相似的实验中，活化配体通过口服灌胃给药，持续9天和12天。本实验评价了混合在Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)中的不同剂量的活化配体口服制剂所产生的抗肿瘤剂量反应。可以观察到剂量依赖性的抗肿瘤效应，口服12天50mg/kg/天的动物产生了最大反应。在所有被检测的剂量中，用活化配体处理13天确实比处理9天更有效。这说明DC在体内存活并持续分泌IL-12至少9到12天(在肿瘤微环境或淋巴器官内)对获得最佳疗效是至关重要的。
图13显示的是本文所述的治疗与消耗导致的动物体重不幸下降无关。消耗和体重下降通常与高水平的干扰素γ和INF-α相关，大家都知道二者的表达上调是对IL-12的反应。
在5只同系B6小鼠右腹部皮下注射B16黑色素瘤细胞，7天后可形成肿瘤。在第7天时，瘤内(i.t.)注射剂量为10E5、10E6或10E7的DC.SP1-IL-12(骨髓来源的DC，用SP1最佳开关以100MOI感染)。在注射DC的那一天通过腹膜内注射开始给予RG-115932(然后每日注射，持续6天或13天)。每个队列包含5只动物，每3-4天测量一次肿瘤大小，报告为平均尺寸(根据正交测量值计算mm2)。在测量肿瘤的同时测定每只动物的体重(图13)。在第50天时(初次接种B16肿瘤后)，经过任何治疗而未发生疾病的所有动物都再次接种肿瘤细胞，在原始肿瘤的对侧(左腹部)接种105B16黑色素瘤细胞，在右腹部接种105MC38结肠癌细胞。每3-4天测量一次肿瘤生长情况，比较无免疫(未处理)动物所产生的肿瘤生长抑制效应(参见图12)。
图14显示的是，以前用包含重组腺病毒Rheoswitch可诱导IL-12的树突细胞和活化配体RG-115932治疗的小鼠重新接种肿瘤细胞后未形成B16黑色素瘤。因此，图14显示的是当B16免疫小鼠再次接种B16细胞时B16黑色素瘤的生长可被抑制达24天。图14还显示B16无免疫小鼠没有获得保护作用而避免肿瘤的形成，正如MC38免疫小鼠和MC38无免疫小鼠一样。MC38是本领域熟知的结肠癌。这说明通过将含重组腺病毒可诱导IL-12的树突细胞注射到原始B16肿瘤内可诱导产生特异性免疫反应。
由CD14+细胞分化而成的DC具有未成熟表型，不产生可检测水平的IL-12(Cella等，1999)。图15显示，通过用GM-CSF和IL-4处理骨髓细胞7天然后通过CD11c+筛选而制备出的小鼠DC在用包含RTS控制下的IL-12的腺病毒载体转导后也缺乏可检测水平的IL-12表达。转导的细胞用不同剂量的活化药物(RG-115932)处理后可以剂量依赖性的方式产生IL-12。
据报道，腺病毒转导可通过五位体-整合素相互作用诱导DC发生某种程度的成熟，其中五位体-整合素相互作用可通过NFkB活化通路导致TNF-α分泌。文献报道，TNF-α的自分泌作用是DC的成熟诱导信号(Philpott等，2004)。使用较短的腺病毒转导时间(2-3小时)并选择最低水平的MOI有望限制这种早期成熟效应。
实施例4
在这个实施例中，树突细胞分离自骨髓，用图7所述的腺病毒构建体转导，携带同系颅内GL261胶质瘤的小鼠瘤内注射工程树突细胞，并腹膜内注射RG-115830。图7显示的是将转导多聚腺苷酸的树突细胞瘤内注射到小鼠颅内胶质瘤GL261后的结果，其中多核苷酸编码IL-12和/或IFN-α，二者受RTS控制或者缺乏RTS。数据显示，与IFN-α单独表达相比，通过RG-115830配体诱导RTS活化而产生的配体诱导的IFN-α和IL-12表达在50天时可使GL261胶质瘤小鼠存活率提高75％。另外，提供RheoSwitch和配体的对照组存活率升高。
实施例5
III期和IV期黑色素瘤患者瘤内注射腺病毒转导的自身树突细胞的安全性、耐受性、转基因功能和免疫学效应通过如下面所描述的方法进行评价，其中自身树突细胞通过改造表达受RTS控制的hIL-12。
包含III期和IV期黑色素瘤研究对象的研究分四个队列(组)进行，每个对象都接受单次瘤内注射(注射到黑色素瘤内)的腺病毒转导的自身(重新植入到其来源的同一对象体内)树突细胞(DC)，剂量为5x107，同时每日口服活化药物(活化配体)，其中树突细胞经过改造后表达人白细胞介素12(hIL-12)。本研究将注射体外转导腺病毒载体(细胞从对象体内取出后)的树突细胞，其中载体可诱导地表达人IL-12。通过口服活化药物(RG-115932)使RTS活化，可以使注射的DC“打开”(诱导)IL-12的生成。通过物理检查(包括ECOG体能状况)、生命体征检测、血清化学检测、尿液分析、血液学检测、不良事件“副作用”以及对腺病毒、RTS组分和活化药物产生的抗体和细胞免疫反应评价安全性和耐受性。为了评估进展情况，需要测定口服单次剂量活化药物后的稳态药代动力学/ADME及其主要代谢物，分析靶肿瘤、引流淋巴结和外周循环活检组织内的hIL-12水平和细胞免疫反应水平(T细胞)。
例如，将16例III期和IV黑色素瘤患者分成4个队列，其中队列1和队列2各有3位患者，队列3和队列4有5位患者。所有患者都接受单次剂量为5x107的自身DC瘤内注射，该DC转导了编码受RTS控制的人IL-12的腺病毒载体。患者在第1天DC注射前约3小时开始口服第一次单次剂量的活化药物(队列1：0.01mg/kg，队列2：0.1mg/kg，队列3：1.0mg/kg，队列4：3mg/kg)，然后持续13天。符合再次治疗标准的合格患者再注射转导腺病毒的自身树突细胞，并每日口服活化药物(每日一次)，共14次。在注射体外工程树突细胞后的一个月内评价队列1内所有患者的安全性、耐受性和树突细胞功能，然后这些患者将接受更高剂量的活化药物。对于所有患者来说，安全性评价都将从开始注射工程树突细胞算起持续3个月，如果有可能的话将随访期延长至6个月以检测患者的安全性，是否观察到毒性反应或者患者又接受了树突细胞注射。
本研究证明了单次或多次瘤内注射腺病毒转导的自身树突细胞结合口服活化药物在黑色素瘤患者体内的安全性和耐受性。本研究提供了口服活化药物的稳态药代动力学/ADME。本研究通过测定靶肿瘤和/或引流淋巴结内的腺病毒转导的自身树突细胞的hIL-12表达水平证明了RTS在患者体内的功能，其中hIL-12的表达是对通过口服活化药物而活化RTS所产生的反应。另外，本研究还证明了腺病毒转导的自身树突细胞的免疫学效应，该效应表现在口服活化药物后靶肿瘤、引流淋巴结和外周循环中的细胞系免疫反应。
黑色素瘤被选择为模型癌症(用于RTS)是因为III和IV期患者没有可行的治疗方案，研究证明黑色素瘤可对免疫治疗产生反应，尤其在实体瘤中间，以及黑色素瘤易于进行瘤内注射和组织活检。本研究所纳入的患者患有不可切除的III期或IV期黑色素瘤，直径最小0.5cm，有不同数目的淋巴结被累及，正在发生转移或有远端转移。
5.1.包含RheoSwitch治疗系统Therapeutic System和hIL-12的腺病毒的制备
重组DNA通过体外腺病毒载体转导被转移到树突细胞(DC)内。重组DNA用于瘤内注射的未成熟树突细胞表达人IL-12(p70)，IL-12可使肿瘤微环境中的DC存活并刺激其成熟，导致这些细胞随后迁移到引流淋巴结内。这将导致T辅助细胞向Th1型T细胞定向分化，并且通过与肿瘤抗原的交叉激活而活化肿瘤特异性的细胞毒T细胞。
以重组腺病毒载体的形式提供重组DNA可使人IL-12在治疗系统(RTS)的控制下表达。RTS包含受人泛素C启动子控制的双顺反子信使RNA，编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4DNA结合区(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)蜕皮激素受体DEF区的融合蛋白。在另一个实施方式中，RTS包含受人泛素C启动子控制的双顺反子信使RNA，编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4DNA结合区(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾蜕皮激素受体DEF区的融合蛋白。VP16-RXR是HSV-VP16转录活化区和人和洋槐序列来源的嵌合RXR EF区的融合蛋白。这些Gal4-EcR和VP16-RXR序列被EMCV来源的内部核糖体进入位点(IRES)分开。当Gal4-EcR与小分子药物(RG-115932)结合时这两个融合蛋白二聚化，激活Gal4反应性启动子启动hIL-12的转录，该启动子包含6个Gal4结合位点和一个合成的微小启动子。上述RTS转录单位位于hIL-12转录单位下游。这个完整的RTS-hIL12表达盒被插入到腺病毒5基因组的位点内，该位点上的E1区已被删除。腺病毒骨架还缺乏E3基因。腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12的图谱显示在图8中。
除了病毒载体序列以外，本研究所用的重组腺病毒载体还包含下列典型调节元件：人泛素C启动子，来源于EMCV的内部核糖体进入位点，包含6个拷贝的Gal4结合位点、3个拷贝的SP-1结合位点和一个合成微小启动子序列的可诱导启动子，SV40聚腺苷酸化位点，以及来源于人α-球蛋白基因的转录终止序列。应当清楚的是，其他调节元件作为替代也可以使用。
通过如下方式已制备出典型的重组腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12。被EMCV-IRES(内部核糖体进入位点)分开的受体融合蛋白VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被插入到腺病毒穿梭载体内，置于人泛素C启动子(组成型启动子)控制之下。然后将IRES分开的hIL-12的p40和p35亚单位编码序列插入到泛素C启动子和受体序列的上游，置于包含6个拷贝Gal4结合位点的可诱导合成启动子的控制之下。穿梭载体包含血清型5腺病毒序列，长度从左侧末端到图谱单位16(mu16)，该序列上的E1序列被删除，由RTS和IL-12序列(RTS-hIL-12)取代。通过瞬时转染HT-1080细胞并测定活化药物依赖性的IL-12表达情况来评价携带RTS-hIL-12的穿梭载体。然后通过共转染HEK293细胞使穿梭载体与腺病毒骨架重组，得到重组腺病毒Ad-RTS-hIL-12。腺病毒骨架包含基因组左侧末端mu0到9.2的序列缺失和E3基因序列缺失。穿梭载体和腺病毒骨架包含mu9.2到mu16之间的重叠序列以便于二者之间发生重组形成重组腺病毒载体。由于重组腺病毒载体缺乏E1和E3区，因此病毒在正常哺乳动物细胞内是复制缺陷型的。但是，病毒可在包含腺病毒5E1区因而能提供反向E1功能的HEK 293细胞内复制。
通过如下方式已制备出典型的重组腺病毒载体。将线性化的穿梭载体和腺病毒骨架共转染到HEK 293细胞内，其中穿梭载体携带用于可诱导表达人IL-12的DNA元件。穿梭载体和病毒骨架的重叠序列之间发生同源重组，形成重组腺病毒，并且在HEK293细胞内被包装成病毒颗粒。HEK293细胞可在含胎牛血清的DMEM中生长。
用于本研究的病毒通过CsCl密度梯度离心纯化。重组腺病毒经过两轮噬斑纯化，通过在特征完全清楚的主细胞库来源的HEK293细胞内扩增，可利用得到的种子库生产主病毒库(MVB)。MVB经过了严格的cGMP/GLP放行试验，其中包括增殖性腺病毒(RCA)、无菌、支原体、外来病毒、逆转录病毒、人病毒HIV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、EBV、B19、CMV、HHV-6、7和8、牛和猪病毒、完整载体测序以及通过在人细胞系内进行AD诱导的IL-12表达而完成的功能检测。
来自于MVB的病毒可用于在cGMP设施中生产纯化的病毒，然后再次经历释放试验，其中包括鉴定、RCA、无菌、支原体、外来病毒、病毒颗粒-感染单位比例、宿主细胞DNA、内毒素和蛋白质污染、以及通过在人细胞系内进行AD诱导的IL-12表达而完成的功能检测。
6.2.用包含hIL-12转基因和治疗系统(RTS)的腺病毒转导自身树突细胞
来源于人类对象的树突细胞体外转导后注射到肿瘤内。在转导病毒前对DC的特征进行鉴定，其中包括活力、纯度(一般80％以上的细胞具有DC表型)、无菌、支原体和内毒素检测。转导病毒后，重复洗涤细胞以去除未吸附的病毒。最后一次洗涤的上清液通过PCR检测其中的病毒残留量。由于DC是在体外经过腺病毒载体(非整合病毒)转导的，DC注射到瘤内以及随后迁移到引流淋巴结内的生命周期较短，因此预计病毒不会插入到任何非靶细胞内。腺病毒转导DC所用的方法预计可以达到80-90％的转导效率，被认为是非常高效的。
通过白细胞去除术收获PBMC：对象在UPCI门诊部的成分输血室接受90-120分钟的标准白细胞去除术。白细胞去除过程包括从一个手臂的静脉抽取血液；血液通过离心(细胞分离机)，其中血液组分被分开，去除一种一个或多个组分；以及将其余血液组分回输回对象同一手臂或另一手臂的静脉。在血液通过细胞分离装置进行处理的过程中，任何时候抽取的血液都不要超过对象血液总体积的15％。在细胞分离机中，血液被分离成血浆、血小板、白细胞和红细胞。去除白细胞(WBC)并将其他所有组分回输到对象的循环中。每次进行该过程时要使用两个外周静脉血管。如果无法做到，也可以使用中央静脉血管。必须由医生决定对象是否能够进行白细胞去除术，在进行该过程前需对患者的生命体征进行常规筛查(包括血压)。
处理：收集以后白细胞血袋人工送到CPL，立即通过ELUTRATM离心淘洗进行处理。这是一种经过临床验证的闭合系统。回收单核细胞成分，检测完回收率和细胞活力后转移到Aastrom盒用IL-4和GM-CSF培养6天。所有处理和洗涤过程都必须在无菌条件下进行。
初始接种：回收自一个白细胞血袋的单核细胞通过台盼蓝染色计数以确定活细胞数。利用流式细胞术分析单核细胞的纯度。单核细胞以5-10x106细胞/mL的浓度重悬于无血清、无抗生素CellGenix培养基中，按照SOP-CPL-0166添加1,000IU/mL的IL-4和1,000IU/mL的GM-CSF，放置到Aastrom盒中。按照盒式接种的要求，使用50ml的最小加载体积和最低细胞数。
培养：Aastrom盒放置在细胞复制系统(Replicell System)的孵育箱中，这是一种完全闭合的符合cGMP要求的自动培养装置，可用于未成熟DC的制备。
收获未成熟DC：在第6天，从孵育箱中取出Aastrom盒，收获未成熟DC。通过1500rpm离心回收细胞，用CellGenix培养基洗涤，台盼蓝染色后计数，检查细胞的形态和表型特征。
活力：台盼蓝染色后利用血细胞计数器进行细胞计数，从而确定细胞的活力。一般来说，收获的细胞中95％以上都是活细胞，即，不含台盼蓝染料。如果活力低于70％，则废弃未成熟DC。
表型分析：培养出的细胞加载到血细胞计数器上，显微镜下观察并计数，利用台盼蓝染色进行初步的细胞分类计数(DC对淋巴细胞)。通过流式细胞仪检测确认细胞分类计数结果，对DC和淋巴细胞设门，将高前向角和高侧向散射特性作为未成熟DC的判定标准。一般来说，未成熟DC中80％以上的细胞具有树突细胞形态和DC表型。
IL-12p70效能测定：研究证明，成熟DC(mDC)能够自发地或在用CD40L活化时生成IL-12p70，无论是否添加先天免疫信号(如LPS)。最近建立了一种检测IL-12p70生成的标准化分析方法，可用于分析小样品或各种条件下制备的大批量DC疫苗。目前所用的效能测定方法包括两步，第一步包括应答DC与稳定转染人CD40配体基因的J588淋巴瘤细胞共孵育，后者作为刺激细胞。第二步包括利用Luminex系统检测这些共培养物上清液中用J588/CD40L+/-LPS刺激的DC所分泌的IL-12p70水平。这种效能测定方法的批间CV为18.5％(n＝30)，动态范围较宽，这有利于评价IL-12p70产生水平相差巨大的不同DC产品。利用该方法检测了13个正常供者的单核细胞制备出的DC产物，结果显示其正常范围是8-999pg/mL，均值为270pg/mL。
树突细胞的生产和放行标准
每一批体外工程树突细胞都有检测是否存在微生物污染(需氧菌和厌氧菌，真菌和支原体)以及内毒素，并且要进行表型和功能鉴定。所有要被注射到对象体内的树突细胞都必须是新鲜的，没有经过冻存。
DC的质量保证试验：按照上述方法制备的DC需要进行无菌性、活力、纯度、效能和稳定性检测。要建立细胞产品的放行标准并严格遵守。
活力：通过培养制备出的细胞加载到血细胞计数器上通过显微镜观察进行技术，利用台盼蓝染料染色来获得分类计数(DC对淋巴细胞)。该计数可用于计算被测培养物内的活细胞百分数。符合放行标准的细胞要求活力超过70％(通过台盼蓝染色计数确定)，并且至少有70％的细胞表达单核细胞来源的DC标记物HLA-DR和CD86。检测分析也可使用其他标记物如用于评价DC成熟状况的CD83和CCR7，以及用于评价淋巴细胞污染的CD3和CD19。
纯度：细胞用FITC和PE标记的mAb染色，利用双色流式细胞检测方法确定经过形态学鉴定的DC群是否表达DC特异性的表面抗原并且不表达单核细胞和T、B细胞抗原。在用于疫苗制备时，生产出的DC必须表达HLA-DR和CD86，并且一定不表达CD3、CD19或CD14。细胞只有表达CD83+和CCR7+才被认为是mDC。
效能：为了确定DC的效能，我们按照上述方法测定其生成IL-12P70的能力。
无菌性：利用BD培克特克系统(马里兰州BD公司(Becton Dickinson Co.，Sparks，MD))在匹兹堡大学医学中心微生物实验室对DC进行细菌(需氧菌和厌氧菌)和真菌培养。14天后可获得微生物培养的最终结果。在放行用于疫苗的DC前，需要进行革兰氏染色并且微生物检测必须阴性。
支原体IMCPL检测使用Gen-Probe支原体组织培养快速检测系统(加州GP公司(Gen-Probe，Inc.San Diego，CA))，该系统是基于核酸杂交技术设计的。内毒素检测用鲎变形细胞溶解产物加热原试验(Limulus Amoebocyte LysatePyrogen Plus assay)(马里兰州BW公司(Bio Whittaker，Inc.，Walkerville，MD))完成。内毒素检测的对象是不同时间点收获的细胞培养物，在放行终产品之前完成。内毒素的可接受水平为＜5EU/kg体重。未转导的和已转导的树突细胞将冻存起来用于以后的分析。
预计所有转导细胞都将表达转基因。超过80％的DC有望被转导。产物是有生物学活性的，因为转基因中包含天然编码序列。注射到肿瘤内的病毒转导的DC具有未成熟DC表型，在成熟之前不表达IL-12，因此在这个阶段，IL-12的表达大部分来自于转基因。由于IL-12转基因的表达可被小分子活化药物RG-115932以剂量依赖性的方式诱导，因为我们可以将转导DC内的转基因表达控制在理想的水平上。用于输注给人类患者的一小部分转导DC可用于检测活化配体依赖性的IL-12体外诱导表达情况。通过灵敏度为4ng/ml的ELISA可分析IL-12的表达水平。
小鼠体内肿瘤模型与人体研究类似，其中用与人类研究所采用的方法相同的方法处理携带皮下黑色素瘤(B16)的小鼠，即，注射腺病毒转导的DC并诱导小鼠IL-12转基因。观察到肿瘤消退效应后，再次接种同一肿瘤细胞不会导致肿瘤生长，说明出现了系统性的肿瘤免疫。
据预测，研究计划所用载体转导的细胞经过体外诱导IL-12表达后，根据ELISA检测结果，在24小时内，每10个细胞可产出约500ng IL-12。在黑色素瘤小鼠模型的临床前研究中，瘤内注射106或更多转导的DC是有效的。但是，据估计，能产生疗效的瘤内注射所需要的量可能在该数值以下，因此可将注射5x107转导DC当作起点以确定需要更低或更高的量。
例如，在体外，用携带IL-12基因的重组腺病毒载体转导的人和小鼠细胞系以及原代树突细胞可以剂量依赖性的方式对活化药物产生反应而表达IL-12。
以不同的MOI和不同的病毒吸附时间将腺病毒转导到人DC内，结果显示以500MOI转导并使病毒吸附3小时可有效转导这些细胞。活化药物可诱导这些转导的人DC表达IL-12(图9)。
为了用上述黑色素瘤小鼠模型进行体内试验，C57/BL6小鼠皮下注射B16细胞使其形成肿瘤。瘤内注射腺病毒载体转导的DC，其中腺病毒载体携带RTS控制下的小鼠IL-12基因，并且给予小鼠活化配体，结果可诱导出肿瘤特异性的系统免疫。治疗的结果是肿瘤消退。50天后治愈的小鼠再次接种B16细胞，结果显示B16细胞不能形成肿瘤。这种肿瘤免疫的诱导产生依赖于活化药物的给予以及由此而导致的注射的转导DC表达IL-12。腹膜内注射和口服活化药物都有效。参见图11和图14.
6.3.活化药物制剂
本文所用的活化药物可以制备成下列任何一种形式的制剂：
(1)100％Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)；
(2)李斯特灵调味Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)(Listerine flavoredLabrasol)(美国LP公司(Latitude Pharmaceuticals Inc.，USA))，其中包含(a)甲醇，(b)麝香草酚，(c)桉叶脑，(d)，阿斯帕坦，(e)糊精钠，(f)柠檬酸，(g)胡椒薄荷香料，(h)乳膏香料，(i)labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)；
(3)二辛酸/癸酸丙二醇酯(Miglyol 812)和磷脂(phospholipon 90G)(美国LP公司)；或者
(4)二辛酸/癸酸丙二醇酯(Miglyol 812)，磷脂(phospholipon 90G)和维生素E生育酚聚乙二醇琥珀酸盐(美国LP公司)。
6.4.给药
虽然可以设想出各种浓度和特殊方案，但是一个治疗患者的例子包括患者瘤内注射转导的自身树突细胞(AdDC)，浓度为5x107，混悬于无菌盐水中，树突细胞经过改造可表达hIL-12(人白细胞介素12)，其表达受RTS控制，并结合口服活化药物(RG-115932)。
6.4.1.初次治疗
第1天住院人类患者就诊：在第1天，进行基线物理检查(包括生命体征，体重和ECOG状况)。收集尿液并采集血样用于基线血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。瘤内注射体外工程树突细胞前约3小时，所有患者都在餐后立刻口服活化药物(队列1-0.01mg/kg，0.3mg/kg，1.0mg/kg和3mg/kg)。在第1天以规定的时间间隔(给药前，注射AD后0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血样用于分析单次剂量活化药物的药代动力学及其主要代谢物。每位患者都接受腺病毒转导的自身树突细胞的瘤内注射，浓度为5x107细胞，该细胞经过改造可表达受RTS控制的hIL-12。2-14天住院人类患者就诊：从第2天到第14天，所有患者都在餐后立即服用活化药物。从第2天到第14天，每天检查生命体征并记录不良事件。在4天±24小时时，从约50％的患者体内提取肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。在第8天，称量体重。在8天±24小时时，从第4天未做组织活检的患者体内提取肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。在4天±24小时和8天±24小时时，抽取患者血样用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。另外还测定细胞因子表达模式以确定其他细胞因子的表达是否受hIL-12转基因治疗的影响。在第8天，收集尿液并抽取血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在第8天以规定的时间间隔(给药前，注射AD后0.5、1、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血样用于分析活化药物的稳态药代动力学/ADME及其主要代谢物。
14天住院人类患者接诊：在第14天，所有患者都在餐后立即服用活化药物。所有患者都接受物理检查(包括生命体征，身高，体重和ECOG状况)。在14天±24小时时，收集尿液并抽取患者血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在14天±24小时时，抽取患者血样用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。另外还测定细胞因子表达模式以确定其他细胞因子的表达是否受影响。
在进行特定入院人类患者和出院人类患者就诊时抽取患者的血样用于测定抗腺病毒和RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。采集血样用于基线血清细胞因子表达模式分析。AdVeGFP感染性阻断类型试验用于检测抗腺病毒载体的抗体反应(Gambotto，Robins等，2004)。抗RTS组分的抗体反应通过蛋白质印迹和/或ELISA检测，使用患者来源的血清和表达载体产生的RTS蛋白。另外，多重细胞因子检测将用Luminex完成，测定血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
细胞免疫反应分析需要约50-60ml血液，从中分离CD4和CD8T细胞亚群。分离出的T细胞与转导空Adv载体、AdV-RTS或AdV-RTS-hIL-12载体的自身树突细胞混合，利用ELISPOT方法测定AdV和RTS来源的抗原活化的T细胞所产生的INF-γ，如果这些T细胞产生的话。同样的方法用于分析肿瘤细胞和/或表达共有黑色素瘤抗原的DC，以检测对肿瘤的早期反应。根据需要也可进行其他检测。
在14天±24时，从所有具有可用组织的患者体内提出肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。记录不良事件。完成14天的过程以后，所有患者都出院，并被要求在约3周后返回进行一个月的出院人类患者随访就诊。
提早终止就诊：如果患者无法完成入院治疗期，可以在出诊所前进行提早终止就诊程度。所有患者都接受物理检查(包括生命体征，身高，体重和ECOG状况)。收集尿液并抽取血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。抽取患者血样用于分析上述抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。另外还要按照上述方法测定细胞因子表达模式以确定其他细胞因子的表达是否受影响。从所有具有可用组织的患者体内提出肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。记录不良事件。完成1提早终止接诊程序以后，所有患者都出院，并被要求在约3周后返回进行一个月的出院人类患者随访就诊。
1-4个月的随访就诊：在第1到第4个月的随访期间收集不良事件。在第1、2和3个月的随访中，进行随访物理检查(包括生命体征、体重和ECOG状况)。在第1、2和3个月就诊时收集尿液并抽取血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在第1个月和第3个月就诊时抽取患者血样用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。在第1个月就诊时抽取血样用于测定血清细胞因子表达模式。在一个月就诊时从具有可用组织的患者体内提出肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。在第2个月和第4个月就诊时进行CT/PET扫描以评价疾病的整体进展或消退状况。
第5到第6个月的随访接诊：如果在第3个月或第4个月时观察到了药物相关的毒性，就要进行第5个月到地6个月的随访就诊。患者的安全性在第5个月期间通过诊所工作人员给每一位患者打电话来监测，在第6个月通过出院人类患者就诊来监测。如果药物相关的毒性在第5个月时还有发生或者持续存在，那么研究者应当严肃对待，认为是不稳定的或者需要进一步评价的警示；诊所的工作人员不仅要给患者打电话，而且要要求患者到诊所就诊。在第6个月的就诊中，要进行随访物理检查(包括生命体征、体重和ECOG状况)。收集尿液并抽取血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在第6个月就诊时抽取患者血样用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。在第6个月就诊时进行CT/PET扫描以评价疾病的整体进展或消退状况。
活化药物给药及停药标准：如果确定了一个给定剂量水平的剂量限制性毒性(DLT；即，按照CTCAE v3.0的标准，队列1中一个组的3位患者中共有2位以上出现大于3级的毒性)，那么下一组的3位患者将给予相同剂量的活化药物。如果下一剂量组的1位或多位患者出现DLT，则终止剂量升级，下一个较低剂量被认为是最大耐受剂量(MTD)，否则恢复剂量升级知道MTD达到10mg/kg的最大剂量(无论哪个最先发生)。
队列1每一组的患者都要进行安全性、耐受性和转基因功能评价，一直持续到AdDC注射后1个月，然后再给予患者下一个最高剂量的活化药物。
根据CTCAE v3.0的标准，如果患者所产生的3级以上的毒性被认为可能或确定与试验药物治疗有关，那么终止给予该患者活化药物，患者将进入提早终止就诊程序。
研究终止标准：根据CTCAE v3.0的标准，如果一个队列中70％以上的患者所产生的3级以上的毒性被认为可能或确定与试验药物治疗有关，那么终止给予所有患者活化药物，所有患者将进入提早终止就诊程序。
调查研究试验用药方案：在本临床研究中将评价两种调查研究用药方案的组合的安全性、耐受性、转基因功能和免疫学效应。小分子活化药物以口服溶液的形式给药，给药剂量为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg和10.0mg/kg，研究对象为III期或IV期黑色素瘤患者，口服，每日一次，连续14天，同时结合单次瘤内注射腺病毒转导的自身树突细胞，浓度为5x107，该细胞经过改造后表达hIL-12。对于患者来说，一个可选方案是再次瘤内注射AdDC并结合连续14天的活化药物治疗。
6.5.安全性评价与转基因功能和免疫学效应评价
对不同时间点收获的细胞培养物和放行前的终产品进行内毒素检测。内毒素的可接受水平为＜5EU/kg体重。未转导的和已转导的树突细胞冻存起来用于以后的分析。
安全性评价：在临床试验及12个月的随访期间，单次瘤内注射腺病毒转导的树突细胞组合口服活化药物的安全性通过物理检查、生命体征测量、血清化学分析、尿液分析、血液学分析、不良事件以及对腺病毒和RTS组分的抗体及细胞免疫反应检测来评价。妊娠试验在经过筛选有可能怀孕的女性体内进行。获取患者在筛选时以及再次治疗期0天时的合并用药方案列表，用于确定合并用药方案和潜在的不良事件之间是否存在相关性。在筛选期以及首次入院治疗期间(26天)，从患者体内采集总量约89茶匙(439ml)的血液加白细胞采集物。在再次入院治疗期间(26天，拒上次入院就诊5-6周)，从患者体内采集总量约75茶匙(370ml)的血液加白细胞采集物。在出院随访期间(第1-6个月)，从患者体内采集总量约46茶匙(227ml)的血液加白细胞采集物。
物理检查：在特定的入院和出院就诊时进行全面的物理检查(包括ECOG状况)。同时在筛查就诊时记录每一位患者的用药史和人口统计数据。
生命体征：在预定的物理检查中包括检查每一位患者的生命体征，但是所有入院和出院就诊都要检查生命体征。生命体征包括血压、脉搏、体温和呼吸。在特定的就诊中还将测量体重和身高。在给予活化药物的前两个小时每小时记录一次生命体征(身高和体重减少)，以后每8小时记录一次。
血液化学：在特定的入院和出院就诊时抽取每一位患者的随机非禁食血样，分离出血清用于血清化学分析。随后的血清学检测包括：AST(天冬氨酸转氨酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、LAP(亮氨酸氨肽酶)、碱性磷酸酶、肌酐、总胆红素、总蛋白、血尿素氮、总胆固醇、血糖和电解质。
尿液分析：在特定的入院和出院就诊时收集每一位患者的随机中流尿液，并对其进行检测。随后进行如下检测：颜色和外观描述、比重、pH、尿糖、酮体、蛋白质、红细胞和白细胞数以及皮洛鲁亚(pyroluria)。
血液学：在特定的入院和出院就诊时抽取每一位患者的随机非禁食血样，随后进行如下血液学检测：完整血细胞计数(CBC)，其中包括白细胞计数、白细胞分类计数、红细胞计数，红细胞压积，血红蛋白，红细胞指数和血小板计数。另外还测定PTT(部分凝血致活酶时间)和PT(凝血酶原时间)。
不良事件：NCI常见不良反应评价标准(CTCAE3.0版本)用于评价临床研究以及3-6个月随访期间的毒性。不良事件/经历是指与使用检测品(药物，生物制品或装置)有联系的任何反应、副作用或其他不幸的事件(体征、症状、实验室数据的变化)，无论事件是否被认为与检测品相关。严重不良事件/经历是指可导致下列任一结果的不良事件或经历：死亡，威胁生命的不良经历，先天异常/出生缺陷，入院人类患者住院或已住院患者住院期延长，或者持续的或明显的残疾或功能不全。经过适当的医学诊断后，证明会危害患者或者需要采取医学或手术干预措施才能防止上面所列结果之一发生时，不会导致死亡的、威胁生命的或需要住院的重要医学事件/经历也被认为是严重不良经历。
不良事件分级如下：1级(轻微的)，2级(中度的)，3级(严重的)，4级(威胁生命的或致残的)，5级(不良事件相关的死亡)。不良事件与试验药物之间的关系可根据临床诊断和如下定义确定：
a.确定相关的不良事件是指试验药物给药时间与不良事件有合理的先后关系，符合试验药物的已知反应模式，如果处理方法得当停止使用试验药物后不良反应好转(positive dechallenge)，再次给药后不良反应又发生(positiverechallenge)，并且用患者临床状态的已知特征或其他治疗无法给出合理解释，
b.很可能相关的不良事件是指试验药物给药时间与不良事件有合理的先后关系，符合试验药物的已知反应模式，如果处理方法得当停止使用试验药物后不良反应好转，并且用患者临床状态的已知特征或其他治疗无法给出合理解释，
c.可能相关的不良事件是指试验药物给药时间与不良事件有合理的先后关系，符合试验药物的已知反应模式，但是也可能是由患者的临床状态或其他治疗引起的，
d.不相关的不良事件是指有足够的信息证明不良事件的发生原因与试验药物无关。可利用下述两个或多个变量来判断不相关的不良事件：1.不良事件与试验药物给药时间没有合理的先后关系，2.用患者的临床状态或其他治疗可以很容易地解释不良事件的发生原因，3.减少给药剂量或停止治疗后不良事件未缓和(假设在观察期内不良事件应该缓和)。
在患者被纳入到临床试验后所观察到的或报告的不良事件应当被记录。入组时就有的症状如果发生恶化应当被记录为不良事件。不良事件将根据试验就诊时志愿受试者的症状、临床观察和评价来确定。在每一次入院和出院就诊时，入组患者都将被问及与不良事件有关的志愿者信息，问题是非引导性的，如“你感觉怎么样？”。实验室检测数值的变化如果被认为有临床意义以及如果需要改变临床治疗方案或治疗措施如开始进行治疗，则该变化将被记录为不良事件。
抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应：在特定的入院和出院就诊时抽取患者的血样用于评价抗腺病毒和RTS组分及肿瘤抗原的潜在抗体和细胞免疫反应。AdVeGFP感染性封闭类型试验用于检测抗腺病毒的抗体反应(Nwanegbo等，2004)。抗RTS组分的抗体反应用患者的血清通过蛋白质印迹和/或ELISA来分析。另外，通过Luminex进行多重细胞因子检测用于分析血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10、以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
细胞免疫反应分析需要约50-60ml血液，从中分离CD4和CD8T细胞亚群。分离出的T细胞与转导空Adv载体、AdV-RTS或AdV-RTS-hIL-12载体的自身树突细胞混合，利用ELISPOT方法测定AdV和RTS来源的抗原活化的T细胞所产生的INF-γ，如果这些T细胞产生的话。同样的方法用于分析肿瘤细胞和/或表达共有黑色素瘤抗原的DC，以检测对肿瘤的早期免疫反应。根据需要也可进行其他检测。
妊娠试验：在筛选就诊时以及再次治疗的首次入院就诊之前对有生育能力的女性进行尿液妊娠试验。在初次治疗以及所有再次治疗期间，给予活化药物之前至少72、48、24或12小时进行该项检测。如果尿液妊娠试验阳性，那么进行血清妊娠试验进一步确认。如果确认已经怀孕，那么患者将不被允许参加临床试验或者继续纳入再次治疗期。妊娠试验可根据需要进行多次。
合并用药问询：在筛选时或者再次治疗期的首次入院就诊之前，将要求所有患者提供合并用药列表以确定临床试验期间以及随访期内合并用药与不良事件之间任何可能的关系。
再次治疗的标准：如果患者耐受在先的AdDC接种，未发生有限的不良反应，并且疾病未恶化或者再次治疗时症状有可能减轻，则该患者将被考虑进行再次治疗。根据主要研究者和治疗医师的意见，再次瘤内注射AdDC合并连续给予14天的活化药物(队列1的最大耐受剂量)可能会产生临床疗效，如果患者满足如下标准则可对患者进行再次治疗：
1.未出现最大容许毒性，
2.患者的病情稳定或者显现出临床的或客观的症状改善迹象，以及
3.未产生抗治疗系统的腺病毒组分的抗体或细胞免疫反应。
转基因功能和免疫学效应的评价：在筛查期间(-12天到-7天)、临床试验的第4、8和14天、以及随访的第1个月(参见表3-5)收集肿瘤及其相关引流淋巴结的针刺或切除活检组织用于评价体内的hIL-12转基因表达水平和细胞免疫反应。在再次治疗期的-12天到-7天以及第14天，利用细针穿刺抽取肿瘤及其相关引流淋巴结的活检组织用于评价体内的hIL-12转基因表达水平和细胞免疫反应。利用标准光学显微镜和免疫组化技术检测活检组织以评价进入到肿瘤和引流淋巴结内的T细胞浸润情况。活检组织切片由不清楚研究对象背景的病理学家制作。为了区分肿瘤和引流淋巴结内内源性的IL-12表达水平和DC诱导的IL-12表达水平，将利用合适的引物对RNA进行RT-PCR。在筛查时、临床试验的第4、8和14天、随访的第1个月、以及再次治疗期的-12天到-7天、第8天和第14天(参见表3-5)，抽取血样用于血清细胞因子表达模式分析。通过分析血清细胞因子表达模式可以确定其他细胞因子的表达是否受hIL-12转基因治疗的影响。通过Luminex进行多重细胞因子检测用于分析血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10、以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
活化药物的单次给药剂量和稳态药代动力学：在临床试验的第一天，以特定的时间间隔(给药前、上午给药后的0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血样用于评价单次给药剂量的药代动力学，在临床试验的第8天抽取血样用于测定活化药物的稳态药代动力学/ADME及其主要代谢物。利用HPLC分析血浆以获得活化药物及主要代谢物的下列稳态药代动力学终点：Cmax(最大血浆观测浓度)，Tmax(达到最大血浆观测浓度的时间)，Ctrough(最小血浆观测浓度，计算为0小时和24小时浓度平均值)，C24h(24小时时的血浆浓度)，AUC24h(0-24小时的血浆浓度-时间曲线下面积)，Ke(表观消除速率)和T112(表观半衰期)。
应当理解的是，上述实施方式和实施例并不意味着从任何方面对本发明的范围进行限制，本文所附权利要求将包含所有实施方式和实施例，无论本文是否加以描述。
参考文献
Abdi K.等，(2006).IL-12p75分泌的T细胞调控(T-cell control of IL-12p75production).Scand J Immunol 64：83-92。
Adorini，L，(1999).白细胞介素-12，Th1介导的自身免疫疾病的关键细胞因子(Interleukin-12，a key cytokine in Th 1-mediated autoimmune diseases).CellMoI Life Sci 55：1610-25。
Adorini，L.，(2001).白细胞介素12和自身免疫性糖尿病(Interleukin 12 andautoimmune diabetes).Nat Genet 27：131-2。
Adorini，L.等，(2002).认识自身免疫学糖尿病：来自小鼠模型的感知(Understanding autoimmune diabetes：insights from mouse models).Trends MoIMed 8：31-8。
Adorini，L.等，(1996).IL-12在Th1细胞介导的自身免疫疾病发病机制中的作用(The role of IL-12in the pathogenesis of ThI cell-mediated autoimmunediseases).Ann N YAcad Sci 795：208-15。
Akhtar，N.等，(2004).白细胞介素-12抑制新型血管发生犬血管肉瘤异种移植模型中肿瘤的生长(Interleukin-12 inhibits tumor growth in a novelangiogenesis canine hemangiosarcoma xenograft model).Neoplasia 6：106-16。
Akiyama，Y等，(2000).利用经过基因修饰可产生细胞因子的树突细胞增强抗B16黑色素瘤的抗肿瘤免疫(Enhancement of antitumor immunity againstB16 melanoma tumor using genetically modified dendritic cells to producecytokines).Gene Ther 7：2113-21。
Al-Mohanna，F等，(2002).IL-12依赖性的核转录因子-κB活化可导致人中性粒细胞从新合成和释放IL-8及TNF-α(IL-12-dependent nuclearfactor-kappaB activation leads to de novo synthesis and release of IL-8 and TNF-αin human neutrophils).J Leukoc Biol 72：995-1002。
Aliberti，JC等，(1996).白细胞介素-12介导小鼠对克鲁兹锥虫的耐受性，小鼠巨噬细胞对活锥鞭毛体反应而产生IL-12(Interleukin-12 mediates resistanceto Trypanosoma cruzi in mice and is produced by murine macrophages in responseto live trypomastigotes).Infect Immun 64：1961-7。
Allavena，P等，(1994).白细胞介素-12是自然杀伤细胞的趋化剂，刺激自然杀伤细胞与血管内皮细胞相互作用(Interleukin-12 is chemotactic for naturalkiller cells and stimulates their interaction with vascular endothelium).Blood84：2261-8。
AlIi，R.S.和Khar，A.(2004).成熟树突细胞分泌的白细胞介素-12介导NK细胞功能的活化(Interleukin-12 secreted by mature dendritic cells mediatesactivation of NK cell function).FEBS Lett 559：71-6。
Alzona，M等，(1996).白细胞介素12通过靶向活化CD30+T细胞诱导γ干扰素生成(Interleukin-12 activates interferon-gamma production by targetedactivation of CD30+T cells).Ann N Y Acad Sci 795：127-36。
Amemiya，K等，(2006).白细胞介素-12诱导对鼻疽伯克霍尔德氏菌的Th1样反应并在BALB/c小鼠体内产生有限的保护作用(Interleukin-12 induces aTh1-like response to Burkholderia mallei and limited protection in BALB/c mice).Vaccine 24：1413-20。
Anderson，R.D等，(2000).Ad-RTS-hIL-1。一种快速制备重组腺病毒载体的简单方法(Ad-RTS-hIL-1.A simple method for the rapid generation ofrecombinant adenovirus vectors).Gene Therapy，4，1034-1038。
Araujo，MI等，(2001).白细胞介素-12可促使共转染曼森血吸虫和鼠弓形虫的小鼠发生病理性的肝脏变化和死亡(Interleukin-12 promotes pathologic liverchanges and death in mice coinfected with Schistosoma mansoni and Toxoplasmagondii).Infect Immun 69：1454-62。
Arthur，FF等，(1997).人树突细胞基因转移方法比较(A comparison of genetransfer methods in human dendritic cells).Cancer Gene Therapy，4，17-25。
Arulanandam，BP等，(1999).IL-12是有效的新生儿疫苗佐剂(IL-12 is apotent neonatal vaccine adjuvant).Eur J Immunol 29：256-64。
Athie，MV等，(2000).IL-12通过磷脂酰肌醇3激酶和Ras非依赖性的信号转导通路特异性地调节诶STAT4(IL-12 selectively regulates STAT4 viaphosphatidyl inositol 3-kinase and Ras-independent signal transduction pathways).Eur J Immunol 30：1425-34。
Athie-Morales，V等，(2004).持续的IL-12信号是Th1发育所必须的(Sustained IL-12 signaling is required for Th1 development).J Immunol 172：61-9。
Atkins，MB等，(1999).高剂量重组白细胞介素2治疗转移的黑色素瘤患者：1985到1993年期间治疗的270例患者资料分析(High-dose recombinantinterleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma：analysis of 270 patientstreated between 1985 and 1993).J Clin Oncol；17：2105-2116。
Atkins，MB等，(1997).静脉注射重组人白细胞介素12治疗晚期恶性肿瘤患者的I期临床评价(Phase I evaluation of intravenous recombinant humaninterleukin 12 in patients with advanced malignancies).Clin Cancer Res 3：409-17。
Balch，CM等，(2001).美国癌症分期系统联合委员会对皮肤黑色素瘤分期的最终版本(Final version of the American joint committee on cancer stagingsystem for cutaneous melanoma).Journal of Clinical Oncology，19：3635-3648，2001。
Berard，F等，(2000).利用负载同种死黑色素瘤细胞的树突细胞交叉激活抗黑色素瘤抗原的天然CD8T细胞(Cross-priming of naive CD8 T cells againstmelanoma antigens using dendritic cells loaded with killed allogeneic melanomacells).J Exp Med 192：1535-44。
Bertagnolli，MM等，(1992).IL-12促进活化的T淋巴细胞发生抗原依赖性的增殖(IL-12 augments antigen-dependent proliferation of activated Tlymphocytes).J Immunol 149：3778-83。
Bhardwaj，N等，(1996).IL-12结合树突细胞增强体外抗病毒CD8+CTL反应(IL-12 in conjunction with dendritic cells enhances antiviral CD8+CTLresponses in vitro).J CHn Invest 98：715-22。
Biedermann，T等，(2006).IL-12引导人Th2细胞的皮肤归巢(IL-12 instructsskin homing of human Th2cells).J Immunol 111：3763-70。
Brunda，MJ，and Gately，MK。(1994).白细胞介素-12的抗肿瘤活性(Antitumor activity of interleukin-12).Clin Immunol Immunopathol 71：253-5。
Buchanan，JM等，(1995).白细胞介素12可改变小鼠抗鸡蛋白溶菌酶的同种型限制性抗体反应(Interleukin 12 alters the isotype-restricted antibodyresponse of mice to hen eggwhite lysozyme).Int Immunol 7：1519-28。
Butterfield，L等，(2003).以树突细胞为基础的恶性黑色素瘤免疫治疗中的与临床反应相关的决定簇扩散(Determinant spreading associated with clinicalresponse in dendritic cell-based immunotherapy for malignant melanoma).ClinicalCancer Research，9，998-1008。
Cella M，等，(1999)双链RNA诱导的树突细胞的成熟、活化和保护作用(Maturation，Activation，and Protection of Dendritic Cells Induced by Doublestranded RNA).J.Exp.Med。189，821-829。
Chada，S等，(2003).以细胞因子为基础的和以趋化因子为基础的癌症基因治疗(Cytokine-and chemokine-based gene therapy for cancer).Curr Opin MotTher，5：463-474。
Faure，F等，(1998).肿瘤特异性免疫反应：目前的体外分析方法可能不能反映体内的免疫状态(Tumor-specific immune response：current in vitro analysesmay not reflect the in vivo immune status).Crit Rev Immunol 18：77-86。
Gambotto，Robins等。2004
Gilboa，E。(2007).以DC为基础的临床疫苗(DC-based Clinical Vaccines).J.Clinic.Invest.117：1195-1203。
Gogas，H等，(2006).用干扰素治疗黑色素瘤期间产生的自身免疫的预后意义(Prognostic significance of autoimmunity during treatment of melanoma withinterferon).New England Journal of Medicine，354，709-718。
Heinzerling，L等，(2005).转移黑色素瘤患者瘤内注射编码人白细胞介素12的DNA：临床疗效(Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin12 into patients with metastatic melanoma：clinical efficacy).Hum Gene Ther16：35-48。
Itoh，T等，(1994).组织学意义上不同的肿瘤，黑色素瘤和肉瘤，所共有的小鼠肿瘤相关肽表位，可被H-2Kb分子提呈并被CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞识别，的部分纯化(Partial purification of murine tumor-associated peptide epitopescommon to histologically distinct tumors，melanoma and sarcoma，that arepresented by H-2Kb molecules and recognized by CD8+tumor-infiltratinglymphocytes).J Immunol 153：1202-15。
Kaka，KS等，(2008).树突细胞成熟和产生IL-12的能力可作为功能标志(Using Dendritic Cell Maturation and IL-12 PRoducing Capacity as Markers ofFunctin)；A Cautionay Tale。J.Immunother，31(4)：359-
Kalinski，P等，(2005).癌症免疫治疗中天然杀伤细胞-树突细胞的交叉作用(Natural killer-dendritic cell cross-talk in cancer immunotherapy).ExpertOpinion Biological Therapy，1303-1315。
Kang，WK等，(2001).通过瘤旁注射转到的自身成纤维细胞进行癌症的白细胞介素12基因治疗：I期临床研究结果(Interleukin 12 gene therapy of cancerby peritumoral injection of transduced autologous fibroblasts：outcome of a phase Istudy).Hum Gene Ther 12：671-84。
Karzenowski，D等，(2005).利用蜕皮激素受体可诱导地控制转基因的表达：具有高度敏感性、高效表达和长度缩短的基因开关(Inducible control oftransgene expression with ecdysone receptor：gene switches with high sensitivity，robust expression，and reduced size).Biotechniques 39，191-192。
Kikuchi，T。(2006).用于治疗性免疫的经过遗传修饰的树突细胞(Genetically modified dendritic cells for therapeutic immunity).Journal ofExperimental Medicine，208，1-8。
Kumar，P和Katakam A。(2007).System：可被小分子配体诱导的高度敏感的以蜕皮激素受体为基础的基因调节系统。《基因转移：DNA和RNA的转移和表达》b Friedmann T和Rossi J编辑，冷泉港实验室出版社(System：a highly sensitive ecdysone receptor-based gene regulationsystem induced by synthetic small-molecule ligands。In Gene Transfer：Delivery andExpression of DNA and RNA b Ed。Friedmann，T and Rossi，J，Cold Spring HarborLaboratory Press)，643-651。
Liu，Y等，(2002).腺病毒白细胞介素12原位基因转移可在胶质瘤内产生强烈而持续时间较长的细胞毒性(In situ adenoviral interleukin 12 gene transferconfers potent and long-lasting cytotoxic in glioma).Cancer Gene Therapy，9，9-15。
Mazzolini，G等，(2005).转移肠胃癌患者瘤内注射经过重组腺病毒改造可分泌白细胞介素12的树突细胞(Intratumoral injection of dendritic cellsengineered to secrete interleukin-12 by recombinant adenovirus in patients withmetastic gastrointestinal carcinomas).Journal of Clinical Oncology，23，999-1010。
Murphy，A等，(2005).诱导肿瘤免疫的基因修饰策略(Gene modificationstrategies to induce tumor immunity).Immunity，22，409-414。
Nagayama，H等，(2000).人外周血单核细胞来源的树突细胞的IL-12反应性和IL-12受体的表达水平(IL-12 Responsiveness and Expression of IL-12Receptor in Human Peripheral Blood Monocyte-derived Dendritic Cells).J.Immunol。165：59-66。
Nwanegbo E等，(2004).冈比亚、南非和美国成人人群中抗腺病毒血清型5和35的中和抗体的发生率(Prevalence of neutralizing antibodies to adenoviralserotypes 5and 35 in the adult populations of The Gambia，South Africa，and theUnited States).Clinical Diagnostic Lab Immunology。March，11(2)，351-357。
Palli，SR等，(2003).改良的以蜕皮激素受体为基础的可诱导基因调节系统(Improved ecdysone receptor-based inducible gene regulation system).EuropeanJournal of Biochemistry，270，1308-1315。
Philpott，NJ等，(2004).腺病毒通过PI3激酶介导的TNF-α诱导通路诱导树突细胞成熟(Adenovirus-induced maturation of Dendritic Cells through a PI3kinase-mediated TNF-αinduction pathway).PNAS 101，6200-6205。
Ranieri，E等，(1999).编码EB病毒潜在膜蛋白的腺病毒转导的树突细胞：一种疫苗新形式(Dendritic cells transduced with an adenovirus vector encodingepstein-barr virus latent membrane protein 2B：a new modality for vaccination).Journal of Virology，73，10416-10425。
Ribas，A等，(2002).利用基因修饰的树突细胞进行的癌症免疫治疗(Cancerimmunotherapy using gene-modified dendritic cells).Cancer Gene Therapy，2，57-78。
Romani，N等，(1994).人血液中的处于增殖状态的树突细胞祖细胞(Proliferating dendritic cell progenitors in human blood).Journal of ExperimentalMedicine，180，83-93。
Romani L等，(1997).感染性疾病中的白细胞介素-12(Interleukin-12 ininfectious diseases).Clin Microbiol Rev 10：611-36。
Rothe，H等，(1996).白细胞介素-12基因的表达可加速环磷酰胺对自身免疫性疾病产生疗效(Interleukin-12 gene expression mediates the acceleratingeffect of cyclophosphamide in autoimmune disease).Ann N Y Acad Sci 795：397-9。
Sangro，B等，(2004).瘤内注射编码白细胞介素12的腺病毒用于治疗晚期消化系统肿瘤的I期临床试验(Phase I trial of intratumoral injection of anadenovirus encoding interleukin-12 for advanced digestive tumors).J Clin Oncol22：1389-97。
Sangro，B等，(2005).以白细胞介素12为基础的癌症基因治疗(Genetherapy of cancer based on interleukin 12).Curr Gene Ther 5：573-81。
Satoh，Y等，(2002).局部注射IL-12转染的树突细胞可在小鼠肝脏内诱导产生抗结肠腺癌的抗肿瘤免疫反应(Local administration of IL-12-transfecteddendritic cells induces antitumor immune responses to colon adenocarcinoma in theliver in mice).J Exp Ther Oncol 2：337-49。
Satoskar，AR等，(2000).IL-12基因缺陷的C57BL/6小鼠对杜氏利什曼原虫易感但是肝脏免疫病理学减轻(IL-12 gene-deficient C57BL/6 mice aresusceptible to Leishmania donovani but have diminished hepatic immunopathology).Eur J Immunol 30：834-9。
Schopf，LR等，(1999).在存在现有感染所产生的Th2型反应的情况下白细胞介素12能够诱导抗原特异性的Th1型反应(Interleukin-12 is capable ofgenerating an antigen-specific Th1-type response in the presence of an ongoinginfection-driven Th2-type response).Infect Immunol：2166-71。
Spatz，M。，等，(2000).感染个体体内的抗单纯疱疹I型调节蛋白ICP8和VP16的免疫反应(Immune response to the Herpes Simplex Type I regulatoryProteins ICP8 and VP 16in Infected Persons).J.Med.Virol.62，29-36。
Svane，IM等，(1999).细胞毒T淋巴细胞在肿瘤的预防和免疫监视中的作用-来自正常和免疫缺陷小鼠的结果(The role of cytotoxic T-lymphocytes in theprevention and immune surveillance of tumors-lessons from normal andimmunodeficient mice).Med Oncol 16：223-38。
Tang，HL和Cyster，JG，(1999).树突细胞成熟过程中趋化因子的表达上调和对活化T细胞的吸引(Chemokine up-regulation and activated T cell attractionby maturing dendritic cells).Science，284，819-822。
Tatsumi，T等，(2003).瘤内注射经过改造可分泌白细胞介素(IL)-12和IL-18的树突细胞可有效治疗局部和远端疾病，并且产生广谱反应性的Tc1型免疫(Intratumoral delivery of dendritic cells engineered to secrete both interleukin(IL)-12 and IL-18 effectively treats local and distant disease in association withbroadly reactive TcI-type immunity).Cancer Res 63：6378-86。
Thomas，GR等，(2000).通过表达CD80共刺激分子和干扰素γ可增强口腔鳞状细胞癌小鼠新模型内的IL-12和IL-2诱导的肿瘤抑制作用(IL-12-andIL-2-induced tumor regression in a new murine model of oral squamous-cellcarcinoma is promoted by expression of the CD80 co-stimulatory molecule andinterferon-gamma).Int J Cancer 86：368-74。
Trinchieri，G。(2003).白细胞介素-12和先天性耐受及获得性免疫调节(Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity).NatRev Immunol 3：133-46。
Triozzi，PL等，(2005).黑色素瘤转移瘤患者瘤内注射表达B7.1和白细胞介素12的重组金丝雀痘病毒的I期临床研究(Phase I study of the intratumoraladministration of recombinant canarypox viruses expressing B7.1 and interleukin12 in patients with metastatic melanoma).Clin Cancer Res 11：4168-75。
Tsugawa，T等，(2004).将干扰素基因和DC先后转移到颅内胶质瘤内可增强有效的抗肿瘤反应(Sequential delivery of interferon-gene and DCs tointracranial gliomas promotes an effective anti-tumor response).Gene Therapy，11，1551-1558。
Tsung，K等，(1997).IL-12诱导T辅助细胞1介导的抗肿瘤免疫反应(IL-12induces T helper 1-directed antitumor response).J Immunol 158：3359-65。
Vujanovic，L等，(2006).负载有肿瘤抗原来源的肽或重组蛋白的IL-12p70和IL-18基因修饰的树突细胞可在体外有效刺激正常供者和黑色素瘤患者来源的特异性1型CD4(+)T细胞反应(IL-12p70 and IL-18gene-modified dendriticcells loaded with tumor antigen-derived peptides or recombinant protein effectivelystimulate specific Type-1CD4(+)T-cell responses from normal donors andmelanoma patients in vitro).Cancer Gene Therapy，13，798-805。
Wigginton，JM和Wiltrout，RH(2002).IL-12/IL-2细胞因子组合疗法治疗实体肿瘤：从实验室到临床(IL-12/IL-2combination cytokine therapy for solidtumours：translation from bench to bedside).Expert Opin Biol Ther，2：513-524。
Wolf，SF等，(1994).白细胞介素12：免疫功能的关键调节因子(Interleukin12：a key modulator of immune function).Stem Cells 12：154-68。
Yamanaka，R等，(2002).经过遗传改造可产生森林病毒介导的白细胞介素-12的树突细胞能够明显增强小鼠脑肿瘤模型的抗肿瘤免疫反应(Markedenhancement of antitumor immune responses in mouse brain tumor models bygenetically modified dendritic cells producing Semliki Forest virus-mediatedinterleukin-12).J Neurosurg 97：611-8。
Yuminamochi，E等，(2007).白细胞介素-12和干扰素-γ介导的天然杀伤细胞可被姬松茸活化(Interleukin-12-and interferon-gamma-mediated naturalkiller cell activation by Agaricus blazei Murill).Immunology。
序列表
<110>英特瑞克斯顿股份有限公司(Intrexon Corporation)
     匹兹堡大学联邦系统高等教育(University of Pittsburgh-Of the Commonwealth System
of Higher Education
       J.M.布劳格林(Braughler，J.Mark)
       P.库马(Kumar，Prasanna)
       W.J.斯托库斯(Storkus，Walter J.)
       冈田秀穗(Okada，Hideho)
<120>工程树突细胞及其在癌症治疗中的应用
<130>2584.007PC0A
<150>US 61/019,089
<151>2008-01-04
<150>US 60/991,807
<151>2007-12-03
<150>US 60/990,689
<151>2007-11-28
<150>US 60/990,167
<151>2007-11-26
<150>US 60/979,480
<151>2007-10-12
<150>US 60/979,485
<151>2007-10-12
<150>US 60/978,509
<151>2007-10-09
<150>US 60/978,394
<151>2007-10-08
<150>US 60/978,224
<151>2007-10-08
<160>13
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>648
<212>DNA
<213>小鼠属(Mus sp.)
<220>
<223>IL-12p35
<400>1
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120
ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180
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tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300
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cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga              648
<210>2
<211>1008
<212>DNA
<213>小鼠属(Mus sp.)
<220>
<223>IL-12p40
<400>2
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<210>3
<211>660
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>IL-12p35
<400>3
atgtgtccag cgcgcagcct cctccttgtg gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt 60
ttggccagaa acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 120
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gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360
gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420
atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480
gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540
tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600
gctttcagaa ttcgggcagt gactattgac agagtgacga gctatctgaa tgcttcctaa 660
<210>4
<211>987
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>IL-12p40
<400>4
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttag                                     987
<210>5
<211>215
<212>PRT
<213>小鼠属(Mus sp.)
<220>
<223>IL-12p35
<400>5
Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg
            20                  25                  30
Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val
        35                  40                  45
Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp
    50                  55                  60
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr
65                  70                  75                  80
Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg
                85                  90                  95
Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
        115                 120                 125
Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His
    130                 135                 140
Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp
145                 150                 155                 160
Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys
                165                 170                 175
Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys
            180                 185                 190
Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val
        195                 200                 205
Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
    210                 215
<210>6
<211>335
<212>PRT
<213>小鼠属(Mus sp.)
<220>
<223>IL-12p40
<400>6
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
        20                  25                  30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
    35                  40                  45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50                  55                  60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65                  70                  75                  80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
                85                  90                  95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
            100                 105                 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
        115                 120                 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
    130                 135                 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
                165                 170                 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
            180                 185                 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
    210                 215                 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
                245                 250                 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
            260                 265                 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
        275                 280                 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
    290                 295                 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
                325                 330                 335
<210>7
<211>219
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>IL-12p35
<400>7
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
            20                  25                  30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
        35                  40                  45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
    50                  55                  60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
                85                  90                  95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
            100                 105                 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
        115                 120                 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
    130                 135                 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145                 150                 155                 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
                165                 170                 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
            180                 185                 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
        195                 200                 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
    210                 215
<210>8
<211>328
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>IL-12p40
<400>8
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1               5                   10                  15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
            20                  25                  30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
        35                  40                  45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
    50                  55                  60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65                  70                  75                  80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
                85                  90                  95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
            100                 105                 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
        115                 120                 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
    130                 135                 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
            180                 185                 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
        195                 200                 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
    210                 215                 220
Set Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225                 230                 235                 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
                245                 250                 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
            260                 265                 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
        275                 280                 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
    290                 295                 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305                 310                 315                 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
                325
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮激素受体反应元件
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n is a，c，t，g，或or t
<400>9
rrggttcant gacacyy                                                       17
<210>10
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮激素受体反应元件
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n is a，c，g，或t
<400>10
aggtcanagg tca                                                       13
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮激素受体反应元件
<400>11
gggttgaatg aattt                                                     15
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的I-SceI归巢内切核酸酶限制位点
<400>12
tagggataac agggtaat                                                  18
<210>13
<211>37323
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)
<400>13
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt     60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt    120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg    180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag    240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga    300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggagatccg    360
gtaccggcgc gcgcgccgtt tggccgcctc gagtctagag atccggtgag tattaggcgc    420
gcaccaggtg ccgcaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt    480
gtgaatcgat agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag    540
caaaataggc tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgataatgca    600
ggtcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag    660
cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg    720
agactcttcg aaggaagagg ggcggggtcg atcgaccccg cccctcttcc ttcgaaggaa    780
gaggggcggg gtcgaagacc tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgagct    840
catcttcctg tagatcacgc gtgccaccat gggtcaccag cagttggtca tctcttggtt     900
ttccctggtt tttctggcat ctcccctcgt ggccatatgg gaactgaaga aagatgttta     960
tgtcgtagaa ttggattggt atccggatgc ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga    1020
cacccctgaa gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc    1080
tggcaaaacc ctgaccatcc aagtcaaaga gtttggagat gctggccagt acacctgtca    1140
caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat    1200
ttggtccact gatattttaa aggaccagaa agaacccaaa aataagacct ttctaagatg    1260
cgaggccaag aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa tcagtactga    1320
tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg    1380
agctgctaca ctctctgcag agagagtcag aggggacaac aaggagtatg agtactcagt    1440
ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc tgctgaggag agtctgccca ttgaggtcat    1500
ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct tcatcaggga    1560
catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag ccattaaaga attctcggca    1620
ggtggaggtc agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct acttctccct    1680
gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag caagagagaa aagaaagata gagtcttcac    1740
ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca    1800
ggaccgctac tatagctcat cttggagcga atgggcatct gtgccctgca gttaggttgg    1860
gcgagctcga attcattgat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc tcgggatccg    1920
aattccgccc cccccccccc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag    1980
gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga    2040
gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg    2100
ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt    2160
gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca    2220
ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc    2280
agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat    2340
tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc    2400
ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga    2460
accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatgggt    2520
ccagcgcgca gcctcctcct tgtggctacc ctggtcctcc tggaccacct cagtttggcc    2580
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa    2640
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac    2700
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg    2760
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc    2820
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg    2880
tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat    2940
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt    3000
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc    3060
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc    3120
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaacgtacg    3180
tcgacatcga gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca    3240
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca    3300
tcaatgtatc ttatcatgtc tgggcgcgcc ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg    3360
cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc    3420
ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag    3480
aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg    3540
ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg    3600
agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac    3660
agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc    3720
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gccgcctcat ccgctttttt gggggcgccc ggggaggcgg cggcgacggg gacggggacg  28020
acacgtcctc catggttggg ggacgtcgcg ccgcaccgcg tccgcgctcg ggggtggttt  28080
cgcgctgctc ctcttcccga ctggccattt ccttctccta taggcagaaa aagatcatgg  28140
agtcagtcga gaagaaggac agcctaaccg ccccctctga gttcgccacc accgcctcca  28200
ccgatgccgc caacgcgcct accaccttcc ccgtcgaggc acccccgctt gaggaggagg  28260
aagtgattat cgagcaggac ccaggttttg taagcgaaga cgacgaggac cgctcagtac  28320
caacagagga taaaaagcaa gaccaggaca acgcagaggc aaacgaggaa caagtcgggc  28380
ggggggacga aaggcatggc gactacctag atgtgggaga cgacgtgctg ttgaagcatc  28440
tgcagcgcca gtgcgccatt atctgcgacg cgttgcaaga gcgcagcgat gtgcccctcg  28500
ccatagcgga tgtcagcctt gcctacgaac gccacctatt ctcaccgcgc gtacccccca  28560
aacgccaaga aaacggcaca tgcgagccca acccgcgcct caacttctac cccgtatttg  28620
ccgtgccaga ggtgcttgcc acctatcaca tctttttcca aaactgcaag atacccctat  28680
cctgccgtgc caaccgcagc cgagcggaca agcagctggc cttgcggcag ggcgctgtca  28740
tacctgatat cgcctcgctc aacgaagtgc caaaaatctt tgagggtctt ggacgcgacg  28800
agaagcgcgc ggcaaacgct ctgcaacagg aaaacagcga aaatgaaagt cactctggag  28860
tgttggtgga actcgagggt gacaacgcgc gcctagccgt actaaaacgc agcatcgagg  28920
tcacccactt tgcctacccg gcacttaacc taccccccaa ggtcatgagc acagtcatga  28980
gtgagctgat cgtgcgccgt gcgcagcccc tggagaggga tgcaaatttg caagaacaaa  29040
cagaggaggg cctacccgca gttggcgacg agcagctagc gcgctggctt caaacgcgcg  29100
agcctgccga cttggaggag cgacgcaaac taatgatggc cgcagtgctc gttaccgtgg  29160
agcttgagtg catgcagcgg ttctttgctg acccggagat gcagcgcaag ctagaggaaa  29220
cattgcacta cacctttcga cagggctacg tacgccaggc ctgcaagatc tccaacgtgg  29280
agctctgcaa cctggtctcc taccttggaa ttttgcacga aaaccgcctt gggcaaaacg  29340
tgcttcattc cacgctcaag ggcgaggcgc gccgcgacta cgtccgcgac tgcgtttact  29400
tatttctatg ctacacctgg cagacggcca tgggcgtttg gcagcagtgc ttggaggagt  29460
gcaacctcaa ggagctgcag aaactgctaa agcaaaactt gaaggaccta tggacggcct  29520
tcaacgagcg ctccgtggcc gcgcacctgg cggacatcat tttccccgaa cgcctgctta  29580
aaaccctgca acagggtctg ccagacttca ccagtcaaag catgttgcag aactttagga  29640
actttatcct agagcgctca ggaatcttgc ccgccacctg ctgtgcactt cctagcgact  29700
ttgtgcccat taagtaccgc gaatgccctc cgccgctttg gggccactgc taccttctgc  29760
agctagccaa ctaccttgcc taccactctg acataatgga agacgtgagc ggtgacggtc  29820
tactggagtg tcactgtcgc tgcaacctat gcaccccgca ccgctccctg gtttgcaatt  29880
cgcagctgct taacgaaagt caaattatcg gtacctttga gctgcagggt ccctcgcctg  29940
acgaaaagtc cgcggctccg gggttgaaac tcactccggg gctgtggacg tcggcttacc  30000
ttcgcaaatt tgtacctgag gactaccacg cccacgagat taggttctac gaagaccaat  30060
cccgcccgcc taatgcggag cttaccgcct gcgtcattac ccagggccac attcttggcc  30120
aattgcaagc catcaacaaa gcccgccaag agtttctgct acgaaaggga cggggggttt  30180
acttggaccc ccagtccggc gaggagctca acccaatccc cccgccgccg cagccctatc  30240
agcagcagcc gcgggccctt gcttcccagg atggcaccca aaaagaagct gcagctgccg  30300
ccgccaccca cggacgagga ggaatactgg gacagtcagg cagaggaggt tttggacgag  30360
gaggaggagg acatgatgga agactgggag agcctagacg aggaagcttc cgaggtcgaa  30420
gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg gtcgcattcc cctcgccggc gccccagaaa  30480
tcggcaaccg gttccagcat ggctacaacc tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc  30540
gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc actggaacca gggccggtaa gtccaagcag  30600
ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag cgccaaggct accgctcatg gcgcgggcac  30660
aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc  30720
tttcttctct accatcacgg cgtggccttc ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat  30780
ctctacagcc catactgcac cggcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca cacagaagca  30840
aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg cggcagcagc  30900
aggaggagga gcgctgcgtc tggcgcccaa cgaacccgta tcgacccgcg agcttagaaa  30960
caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc aggggccaag aacaagagct  31020
gaaaataaaa aacaggtctc tgcgatccct cacccgcagc tgcctgtatc acaaaagcga  31080
agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc ggaggctctc ttcagtaaat actgcgcgct  31140
gactcttaag gactagtttc gcgccctttc tcaaatttaa gcgcgaaaac tacgtcatct  31200
ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt tgtcagcgcc attatgagca aggaaattcc  31260
cacgccctac atgtggagtt accagccaca aatgggactt gcggctggag ctgcccaaga  31320
ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc gggtcaacgg  31380
aatacgcgcc caccgaaacc gaattctcct ggaacaggcg gctattacca ccacacctcg  31440
taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa gtcccgctcc  31500
caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta actcaggggc  31560
gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta taactcacct  31620
gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct cgcttggtct  31680
ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgc tcttcattca cgcctcgtca  31740
ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca ttggaactct  31800
gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg gacctcccgg  31860
ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg cggacggcta  31920
cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg tccactgtcg  31980
ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat tgcccgagga  32040
tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc ttgcccgtag  32100
cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag cgggacaggg gaccctgtgt  32160
tctcactgtg atttgcaact gtcctaaccc tggattacat caagatctta ttccctttaa  32220
ctaataaaaa aaaataataa agcatcactt acttaaaatc agttagcaaa tttctgtcca  32280
gtttattcag cagcacctcc ttgccctcct cccagctctg gtattgcagc ttcctcctgg  32340
ctgcaaactt tctccacaat ctaaatggaa tgtcagtttc ctcctgttcc tgtccatccg  32400
cacccactat cttcatgttg ttgcagatga agcgcgcaag accgtctgaa gataccttca  32460
accccgtgta tccatatgac acggaaaccg gtcctccaac tgtgcctttt cttactcctc  32520
cctttgtatc ccccaatggg tttcaagaga gtccccctgg ggtactctct ttgcgcctat  32580
ccgaacctct agttacctcc aatggcatgc ttgcgctcaa aatgggcaac ggcctctctc  32640
tggacgaggc cggcaacctt acctcccaaa atgtaaccac tgtgagccca cctctcaaaa  32700
aaaccaagtc aaacataaac ctggaaatat ctgcacccct cacagttacc tcagaagccc  32760
taactgtggc tgccgccgca cctctaatgg tcgcgggcaa cacactcacc atgcaatcac  32820
aggccccgct aaccgtgcac gactccaaac ttagcattgc cacccaagga cccctcacag  32880
tgtcagaagg aaagctagcc ctgcaaacat caggccccct caccaccacc gatagcagta  32940
cccttactat cactgcctca ccccctctaa ctactgccac tggtagcttg ggcattgact  33000
tgaaagagcc catttataca caaaatggaa aactaggact aaagtacggg gctcctttgc  33060
atgtaacaga cgacctaaac actttgaccg tagcaactgg tccaggtgtg actattaata  33120
atacttcctt gcaaactaaa gttactggag ccttgggttt tgattcacaa ggcaatatgc  33180
aacttaatgt agcaggagga ctaaggattg attctcaaaa cagacgcctt atacttgatg  33240
ttagttatcc gtttgatgct caaaaccaac taaatctaag actaggacag ggccctcttt  33300
ttataaactc agcccacaac ttggatatta actacaacaa aggcctttac ttgtttacag  33360
cttcaaacaa ttccaaaaag cttgaggtta acctaagcac tgccaagggg ttgatgtttg  33420
acgctacagc catagccatt aatgcaggag atgggcttga atttggttca cctaatgcac  33480
caaacacaaa tcccctcaaa acaaaaattg gccatggcct agaatttgat tcaaacaagg  33540
ctatggttcc taaactagga actggcctta gttttgacag cacaggtgcc attacagtag  33600
gaaacaaaaa taatgataag ctaactttgt ggaccacacc agctccatct cctaactgta  33660
gactaaatgc agagaaagat gctaaactca ctttggtctt aacaaaatgt ggcagtcaaa  33720
tacttgctac agtttcagtt ttggctgtta aaggcagttt ggctccaata tctggaacag  33780
ttcaaagtgc tcatcttatt ataagatttg acgaaaatgg agtgctacta aacaattcct  33840
tcctggaccc agaatattgg aactttagaa atggagatct tactgaaggc acagcctata  33900
caaacgctgt tggatttatg cctaacctat cagcttatcc aaaatctcac ggtaaaactg  33960
ccaaaagtaa cattgtcagt caagtttact taaacggaga caaaactaaa cctgtaacac  34020
taaccattac actaaacggt acacaggaaa caggagacac aactccaagt gcatactcta  34080
tgtcattttc atgggactgg tctggccaca actacattaa tgaaatattt gccacatcct  34140
cttacacttt ttcatacatt gcccaagaat aaagaatcgt ttgtgttatg tttcaacgtg  34200
tttatttttc aattgcagaa aatttcaagt catttttcat tcagtagtat agccccacca  34260
ccacatagct tatacagatc accgtacctt aatcaaactc acagaaccct agtattcaac  34320
ctgccacctc cctcccaaca cacagagtac acagtccttt ctccccggct ggccttaaaa  34380
agcatcatat catgggtaac agacatattc ttaggtgtta tattccacac ggtttcctgt  34440
cgagccaaac gctcatcagt gatattaata aactccccgg gcagctcact taagttcatg  34500
tcgctgtcca gctgctgagc cacaggctgc tgtccaactt gcggttgctt aacgggcggc  34560
gaaggagaag tccacgccta catgggggta gagtcataat cgtgcatcag gatagggcgg  34620
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aacatggcag tggtctcctc agcgatgatt cgcaccgccc gcagcataag gcgccttgtc  34740
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accacaatat tgttcaaaat cccacagtgc aaggcgctgt atccaaagct catggcgggg  34860
accacagaac ccacgtggcc atcataccac aagcgcaggt agattaagtg gcgacccctc  34920
ataaacacgc tggacataaa cattacctct tttggcatgt tgtaattcac cacctcccgg  34980
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aggagcggga agagctggaa gaaccatgtt ttttttttta ttccaaaaga ttatccaaaa  35760
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gcccccatag gaggtataac aaaattaata ggagagaaaa acacataaac acctgaaaaa  36840
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atg                                                                37323

Claims (48)

1.体外工程树突细胞群在制备哺乳动物肿瘤治疗药物中的应用，所述树突细胞包含条件性表达具有白细胞介素-12(IL-12)功能的蛋白质的载体，所述载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含：
(1)至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子；以及
(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，
所述编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸所编码的多肽与野生型人IL-12具有至少95％的一致性；和
所述配体在给予所述体外工程树突细胞之后48小时内每日给药，持续5-28天。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是良性肿瘤。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是黑色素瘤。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性黑色素瘤皮肤癌。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞被给予有此需要的哺乳动物。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还给予所述哺乳动物有效量的能活化配体依赖性转录因子的配体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述配体选自3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼、(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼、和3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述配体是氨基酮或二唑啉。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述配体通过瘤内、口服、腹膜内或皮下给药。
11.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述配体在给予所述体外工程树突细胞之前1小时内给药，或之后1小时内给药。
12.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述配体在给予所述体外工程树突细胞之后24小时内给药。
13.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗可降低肿瘤的生长。
14.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗可抑制肿瘤的生长。
15.体外工程树突细胞用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于测定体外工程树突细胞为基础的治疗方案在患者体内的疗效的方法，该方法包括：
(a)在给予体外工程树突细胞前测定从需要该治疗的所述患者获得的第一生物样品中的干扰素γ的表达水平或活性水平或者表达水平和活性水平，从而得到一个对照水平；
(b)给予需要该治疗的患者体外工程树突细胞，所述树突细胞包含条件性表达具有白细胞介素-12(IL-12)功能的蛋白质的载体，所述载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含：
(1)至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子；以及
(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连；
(c)给予需要该治疗的患者有效量的活化配体，所述配体在给予所述体外工程树突细胞之后48小时内每日给药，持续5-28天；
(d)在给予体外工程树突细胞和活化配体后测定从需要该治疗的所述患者获得的第二生物样品中的IFN-γ的表达水平或活性水平或者表达水平和活性水平，从而得到一个试验水平；以及
(e)比较IFN-γ的对照水平和试验水平，其中IFN-γ的表达、活性或者二者的试验水平相对于对照水平升高则说明治疗方案在需要该治疗的所述患者体内是有效的。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述需要该治疗的患者是人类患者。
17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述患者是癌症患者。.
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述癌症患者是黑色素瘤患者。
19.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述IFN-γ的表达水平通过ELISA测定。
20.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115932或RG-115830。
22.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述配体是氨基酮或噁二唑啉。
23.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述配体通过瘤内、口服、腹膜内或皮下给药。
24.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述配体在给予所述的体外工程树突细胞之后1小时内给药。
25.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述配体在给予所述的体外工程树突细胞之后24小时内给药。
26.体外工程树突细胞群在制备用于诱导树突细胞条件性地表达具有白细胞介素-12(IL-12)功能的蛋白质的药物中的应用，
所述树突细胞包含条件性表达具有白细胞介素-12(IL-12)功能的蛋白质的载体，所述载体包含一个编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含：
(1)至少一个转录因子序列，其中所述的至少一个转录因子序列编码一个操作性连接于启动子的配体依赖性转录因子；以及
(2)一个编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与能被所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连；
所述编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸所编码的多肽与野生型人IL-12具有至少95％的一致性；和
所述配体在给予所述体外工程树突细胞之后48小时内每日给药，持续5-28天。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞给予有此需要的哺乳动物。
28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，还给予所述的哺乳动物有效量的可活化配体依赖性转录因子的配体。
29.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物患有肿瘤。
30.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞通过瘤内、腹膜内或皮下给药。
31.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是良性肿瘤。
32.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤。
33.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是黑色素瘤。
34.如权利要求33所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性黑色素瘤皮肤癌。
35.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞是人树突细胞。
36.如权利要求35所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞是骨髓树突细胞。
37.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞群包含至少107个细胞。
38.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述体外工程树突细胞群包含至少5x107个细胞。
39.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述配体选自3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼、(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼、和3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼。
40.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述配体是氨基酮或二唑啉。
41.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述配体通过瘤内、口服、腹膜内或皮下给药。
42.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述配体在给予所述的体外工程树突细胞之前1小时内给药，或之后1小时内给药。
43.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述配体在给予所述的体外工程树突细胞之后24小时内给药。
44.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述药物降低有此需要的所述哺乳动物体内肿瘤的生长。
45.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述药物抑制有此需要的所述哺乳动物体内肿瘤的生长。
46.如权利要求1或26所述的应用，其特征在于，所述编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸所编码的多肽与野生型人IL-12具有至少99％的一致性。
47.如权利要求1或26所述的应用，其特征在于，所述编码具有IL-12功能的蛋白质的多核苷酸所编码的多肽与野生型人IL-12一致。
48.如权利要求1或26所述的应用，其特征在于，所述IL-12的功能选自：诱导天然细胞分化成Th1细胞，刺激T生长和发挥功能，诱导T细胞和自然杀伤细胞(NK)分泌干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，降低IL-4介导的对IFN-γ的抑制作用，增强NK细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞的细胞毒活性，刺激IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达以及抗血管形成活性。
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101835908A (zh) * 2007-08-23 2010-09-15 英特瑞克斯顿股份有限公司 诊断疾病的方法和组合物
MX2010003371A (es) * 2007-09-28 2010-05-05 Intrexon Corp Constructos interruptores genicos terapeuticos y biorreactores para la expresion de moleculas bioterapeuticas y usos de los mismos.
CA2702058A1 (en) * 2007-10-08 2009-04-16 Intrexon Corporation Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer
AU2009302804B2 (en) * 2008-10-08 2015-07-02 Intrexon Corporation Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof
JP5855018B2 (ja) 2010-02-10 2016-02-09 イミュニカム アーベー 腫瘍細胞増殖を阻害するための改善された組成物
TWI688395B (zh) * 2010-03-23 2020-03-21 英翠克頌公司 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
WO2011127129A1 (en) * 2010-04-06 2011-10-13 Holaday John W Methods of treating cancer
CN102026031B (zh) * 2010-12-28 2013-09-04 张朝晖 一种机顶盒
CN102174479B (zh) * 2011-03-02 2013-04-03 北京锤特生物科技有限公司 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用
WO2012122025A2 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
MX350158B (es) 2011-09-08 2017-08-28 Intrexon Corp Diacilhidrazina cristalina y sus usos.
CA2850575C (en) * 2011-10-11 2020-12-15 Universitat Zurich Prorektorat Mnw Combination medicament comprising il-12 and an agent for blockade of t-cell inhibitory molecules for tumour therapy
US11951157B2 (en) 2011-10-11 2024-04-09 Universitat Zurich Methods of treating malignant tumour with IL-12 and anti-PD-1 antibody
WO2013148649A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of survivin antagonists in polyomavirus-related disease
CA2956399A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Cb Therapeutics, Inc. Anti-pd-l1 antibodies
BR112017006203A2 (pt) * 2014-09-30 2018-05-02 Intervet International B.V. anticorpos isolado, caninizado e monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, peptídeo antigênico isolado, proteína de fusão, composição farmacêutica, e, método de aumento da atividade de uma célula imune.
US20190062394A1 (en) 2015-10-10 2019-02-28 Intrexon Corporation Improved Therapeutic Control of Proteolytically Sensitive, Destabilized Forms of Interleukin-12
BR112018009645A2 (pt) 2015-11-11 2018-11-13 Intrexon Corp composições e métodos para a expressão de vários polipeptídeos biologicamente ativos a partir de um único vetor para tratamento de condições cardíacas e outras patologias
AU2017279548A1 (en) 2016-06-08 2018-12-13 Precigen, Inc. Cd33 specific chimeric antigen receptors
UY37343A (es) 2016-07-25 2018-02-28 Intrexon Corp Control del fenotipo en plantas
AU2018207281A1 (en) 2017-01-10 2019-07-18 Intrexon Corporation Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
CN110475566A (zh) 2017-02-02 2019-11-19 斯克里普斯研究学院 工程细胞和使用方法
EP3583113A4 (en) * 2017-02-17 2020-08-26 George Todaro USE OF TGF-ALPHA FOR TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS
RU2645957C1 (ru) * 2017-04-10 2018-02-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения лучевых повреждений мочевого пузыря
KR102557834B1 (ko) 2017-06-07 2023-07-21 프레시전 인코포레이티드 신규의 세포 태그의 발현
RU2663468C1 (ru) * 2017-09-25 2018-08-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы
KR20200128703A (ko) 2018-03-06 2020-11-16 프레시전 인코포레이티드 B형 간염 백신 및 이의 용도
JP7420751B2 (ja) * 2018-06-19 2024-01-23 エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド Ｉ型インターフェロン及びｃｄ４０－配位子を用いる腫瘍溶解性ウイルス又は抗原提示細胞媒介性癌治療
AU2019291861A1 (en) * 2018-06-27 2021-01-07 Precigen, Inc. In vivo controlled combination therapy for treatment of cancer
JP2022523564A (ja) 2019-03-04 2022-04-25 アイオーカレンツ， インコーポレイテッド 機械学習を使用するデータ圧縮および通信
WO2020206056A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Greenvenus Llc Peptides and methods of plant protection
CN110804594B (zh) * 2019-11-21 2020-11-20 启辰生生物科技(珠海)有限公司 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用
EP4061485A4 (en) * 2019-11-22 2023-12-20 Alaunos Therapeutics, Inc. METHODS OF TREATMENT OF GLIOBLASTOMA
IL310868A (en) * 2021-08-16 2024-04-01 Yale Univ Variants of interleukin-12 and methods of their use
CN114480280B (zh) * 2022-03-02 2023-09-29 中国科学院理化技术研究所 烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191659A1 (en) * 1998-05-05 2005-09-01 Richard Voellmy Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4985461A (en) * 1985-10-21 1991-01-15 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5117057A (en) * 1985-10-21 1992-05-26 Rohm And Haas Company Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines
FR2593630B1 (fr) 1986-01-27 1988-03-18 Maurice Francois Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran
US5225443A (en) * 1986-05-01 1993-07-06 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
CA2043775A1 (en) 1990-06-14 1991-12-15 Dat P. Le Dibenzoylakylcyanohydrazines
IL100643A (en) 1991-01-25 1996-10-31 Nippon Kayaku Kk History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient
US6013836A (en) * 1992-02-28 2000-01-11 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines
US5530028A (en) * 1992-11-23 1996-06-25 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5814618A (en) * 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US6652850B1 (en) * 1993-09-13 2003-11-25 Aventis Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
US5834441A (en) * 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
KR960703172A (ko) * 1993-11-18 1996-06-19 스티븐 제이. 멘토 조건적으로 치사적인 유전자를 활용하기 위한 조성물 및 방법(Compositions and methods for utilizing conditionally lethal genes)
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5573764A (en) * 1994-01-21 1996-11-12 Genetics Institute, Inc. Use of interleukin-12 to prevent graft versus host disease
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US6306649B1 (en) * 1995-06-27 2001-10-23 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Heterologous transcription factors
US7176186B1 (en) * 1997-09-16 2007-02-13 The University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization
US6734014B1 (en) 1996-02-08 2004-05-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells
US6723531B2 (en) * 1996-04-05 2004-04-20 The Salk Institute For Biological Studies Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
BR9709715A (pt) * 1996-06-14 1999-08-10 Bayer Ag Agonistas de interleucina-4 seletivos para células t
JP2001504690A (ja) * 1996-10-29 2001-04-10 バレンティス・インコーポレーテッド 遺伝子治療用の改変ステロイドホルモン及びそれらの使用法
ATE348155T1 (de) * 1996-11-20 2007-01-15 Introgen Therapeutics Inc Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren
US5972986A (en) * 1997-10-14 1999-10-26 G.D. Searle & Co. Method of using cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment and prevention of neoplasia
US6899870B1 (en) * 1998-03-11 2005-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery
US6342596B1 (en) * 1998-05-05 2002-01-29 Hsf Pharmaceuticals S.A. Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress
US6333318B1 (en) 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6258603B1 (en) 1998-06-17 2001-07-10 Rohm And Haas Company Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
AU6144499A (en) * 1998-09-15 2000-04-03 University Of Pittsburgh In situ injection of antigen-presenting cells with genetically enhanced cytokineexpression
HUP0201220A3 (en) * 1999-05-13 2004-07-28 Wyeth Holdings Corp Madison Adjuvant combination formulations
US6630324B1 (en) * 1999-07-29 2003-10-07 Baylor College Of Medicine Aldehyde reductase bidirectional promoter and its use
US6774226B1 (en) * 1999-11-30 2004-08-10 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
US20040033600A1 (en) * 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
EP1266015B1 (en) 2000-03-22 2006-08-30 RheoGene Holdings Inc. Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
RU2192263C2 (ru) * 2000-08-17 2002-11-10 Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова Способ лечения злокачественных опухолей головного мозга
TWI256305B (en) * 2000-08-18 2006-06-11 Pharmacia Corp Oral fast-melt pharmaceutical composition of a cyclooxygenase-2 inhibitor and process for preparing the same
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
AU2002247184B2 (en) 2001-02-20 2008-06-19 Intrexon Corporation Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid X receptor-based inducible gene expression system
JP4328094B2 (ja) 2001-02-20 2009-09-09 イントレクソン・コーポレイション 新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
JP4955905B2 (ja) * 2001-02-20 2012-06-20 イントレキソン コーポレーション キメラレチノイドｘ受容体および新規エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるそれらの使用
CA2349506C (en) * 2001-06-14 2009-12-08 Duke University A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia
US7375093B2 (en) * 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785871B2 (en) 2002-10-09 2010-08-31 Intrexon Corporation DNA cloning vector plasmids and methods for their use
US20080050808A1 (en) * 2002-10-09 2008-02-28 Reed Thomas D DNA modular cloning vector plasmids and methods for their use
WO2004044147A2 (en) * 2002-11-07 2004-05-27 Lung-Ji Chang Modified dendritic cells
GB0228465D0 (en) * 2002-12-06 2003-01-08 Univ Belfast A method of treating disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) * 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) * 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
WO2005044881A1 (ja) * 2003-11-07 2005-05-19 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 核酸分子送達用担体
US20050130306A1 (en) * 2003-12-10 2005-06-16 Richard Voellmy Viral vectors whose replication and, optionally, passenger gene are controlled by a gene switch activated by heat in the presence or absence of a small molecule regulator
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP2484772B1 (en) 2004-05-18 2016-08-17 Intrexon Corporation Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US7833754B2 (en) * 2006-01-13 2010-11-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IL-12 for expression in mammalian cell
CN104761466A (zh) * 2007-05-29 2015-07-08 英特拉克森公司 通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
MX2010003371A (es) * 2007-09-28 2010-05-05 Intrexon Corp Constructos interruptores genicos terapeuticos y biorreactores para la expresion de moleculas bioterapeuticas y usos de los mismos.
CA2702058A1 (en) * 2007-10-08 2009-04-16 Intrexon Corporation Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191659A1 (en) * 1998-05-05 2005-09-01 Richard Voellmy Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IL-12p70 and IL-18 gene-modified dendritic cells loaded with tumor antigen-derived peptides or recombinant protein effectively stimulate specific Type-1 CD4(+) T-cell responses from normal donors and melanoma patients in vitro;Vujanovic L et al.;《Cancer gene therapy》;20060428;第13卷(第8期);摘要 *
RheoSwitch therapeutic system-inducible recombinant AAV vectors for tightly regulated transgene expression;Karzenowshi et al.;《Molecular Therapy》;20061231;第13卷;S194 *
Vilaboa nuria et al..Regulatable gene expression systems for gene therapy.《Current gene therapy》.2006,第6卷(第4期),421-438. *

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Publication number Publication date
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