KR20100098600A - 가공된 수지상 세포 및 암의 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

가공된 수지상 세포 및 암의 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료제 분야를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간을 포함하는 동물에서 치료 목적으로 사용하기 위해 활성 리간드의 존재하에서 유전자 발현 조절 시스템의 조절하에 인터류킨-12(IL-12)를 조건부로 발현시키는 시험관내 가공된 수지상 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

가공된 수지상 세포 및 암의 치료를 위한 이의 용도{Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer}
본 발명은 암의 치료를 위한 유전자 치료요법 분야에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 인터류킨-12(IL-12)를 조건적으로 발현하는 수지상 세포의 가공 및 치료를 위한 당해 세포의 용도에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 인터류킨-12(IL-12) 및/또는 인터페론-알파(IFN-α)를 조건적으로 발현하는 수지상 세포의 가공 및 치료를 위한 당해 세포의 용도에 관한 것이다.
다양한 특허, 특허출원, 및 공보들이 본원에 인용되어 있으며, 이들 기술내용은 이들 전체가 참조로 인용되어 있다. 그러나, 본원에서 어떠한 참조문헌의 인용은, 이러한 참조물이 본원에 대한 "선행 기술"로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
인터류킨-12(IL-12)는 보호성 면역 반응 및 종양형성의 제어를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다수의 생물학적 과정에 기여하는데 관여하는 제I형 사이토킨 계열의 구성원이다(참조: Abdi et al, 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al, 2002; Adorini et al, 1996; Akhtar et al, 2004; Akiyama et al, 2000; Al-Mohanna et al, 2002; Aliberti et al, 1996; Allavena et al, 1994; AlIi and Khar, 2004; Alzona et al, 1996; Amemiya et al, 2006; Araujo et al, 2001; Arulanandam et al, 1999; Athie et al, 2000; Athie-Morales et al, 2004; Bertagnolli et al, 1992; Bhardwaj et al, 1996; Biedermann et al, 2006; Brunda and Gately, 1994; Buchanan et al, 1995; Romani et al, 1997; Rothe et al, 1996; Satoskar et al, 2000; Schopf et al, 1999; Thomas et al, 2000; Tsung et al, 1997; Wolf et al, 1994; Yuminamochi et al, 2007). 증가하는 증거들은, IL-12가 사람 질병(예: 암)을 제어하기 위한 촉망되는 표적일 수 있음을 제시한다.
IL-12가 제1형 항-종양 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 자체의 강력한 제어 활성을 기준으로 하는 암 치료제로서 촉망되고 있다는 사실(참조: Trinchieri, 2003)에도 불구하고, 환자에서 재조합 사람 IL-12(rhIL-12)의 보고된 독성(참조: Atkins et al, 1997)은, 임상 적용을 위한 GMP-등급 rhIL-12의 제한된 공급원과 함께 성공적인 IL-12-계의 치료학적 시도를 방지한다. 따라서, 유전자 치료요법 시도는 보다 안전하고, 보다 방어적인 치료 선택관을 나타낼 수 있음이 명백한 것으로 여겨진다. 게다가, 재조합 바이러스(참조: Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005) 또는 플라스미드-계 IL-12 cDNA(참조: Heinzerling et al, 2005), 또는 IL-12 유전자 변형된 자가 섬유모세포(참조: Kang et al, 2001)의 종양내 또는 종양 주변 전달을 시행하는 제I상 임상 시도는 안전하고 용인되는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 이들 유전자 치료요법을 제공받는 흑색종 또는 다양한 범위의 암종을 가진 환자에서의 실제 임상 반응은 드물며, 가변적이고, 일시적이며 치료 부위에 크게 중점을 두고 있다(참조: Heinzerling et al, 2005; Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005). 질병 해소가 부분적이거나 완전한 경우에, 종양-침윤 림프구의 증가된 빈도(참조: Heinzerling et al, 2005; Sangro et al, 2004) 및 순환하는 종양-특이적인 CD8+ T 세포의 증가된 수준(참조: Heinzerling et al, 2005)이, 이들 환자에서 항원-특이적인 T 세포의 개선된 교차-프라이밍(cross-priming)과 일치하여 주목되어 왔다.
또한, 몇 가지의 나머지 관심, 예를 들면, DC-계 IL-12 유전자 치료요법과 관련된 예상치않은 독성 및 종양내 투여 후 치료학적 DC.IL12 이주시 강력한 IL-12-의존적인 제한이 있다. 또한, 치료학적 효능에 있어 유전자도입된 DC에서 IL-12 생산의 시기에 관한 추가의 관심이 있다(참조: Murphy et al, 2005)
특이적인 T 세포의 교차-프라이밍은 IL-12의 천연의 그러나 조절된 공급원으로서 제공하는 수지상 세포(DC)에 의해 가장 잘 달성되므로(참조: Berard et al, 2000), DC-계 IL-12 유전자 치료요법의 우세한 전-임상 효능의 최근 보고는 큰 관심을 불러일으켰다(참조: Satoh et al, 2002; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002). 예를 들면, 가공된 DC를 종양내(i.t.) 주사하여 IL-12p70(재조합 아데노바이러스 감염을 통해)을 생산하는 것은 쥐 모델에서 종양 주사와 관련하여 광범위하게 반응성이고, 종양-특이적인 CD8+ T 세포 레퍼토리의 현저히 개선된 교차-프라이밍을 초래함이 밝혀졌다.(참조: Tatsumi et al, 2003). CMV-계 프로모터[rAd.cIL12, (참조: Tatsumi et al, 2003)] 하에서 mIL-12를 암호화하는 재조합 아데노바이러스의 선 사용으로, IL-12의 가공된 DC 생산은 구성적이었으며, 따라서, 종양 병변내 조기 및 종양-배출(draining) 림프절내 말기 당해 사이토킨의 면역학적 충격은 치료학적 이익과 관련하여 해결될 수 없었다. 따라서, IL-12의 조건화된 발현에 대해 가공된 DC에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 이러한 세포의 용도에 대한 촉망되는 치료학적 결과를 제공한다.
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본 발명은 조건화된 프로모터의 조절하에 IL-12의 작용을 가진 단백질을 암호화하는 재조합 벡터를 제공한다. 하나의 양태에서, 당해 벡터는 다이아실하이드라진, 예를 들면, RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932와 같은 가용성 소 분자 리간드의 제공으로 조건적으로 활성화될 수 있는 프로모터가 구동되지 않는 IL-12p70를 암호화하는 아데노바이러스 벡터이다. 당해 벡터는 DC(rAD.RheoIL12)로부터 IL-12의 발현의 조절을 허용한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 유전자 스위치(switch)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 적어도 하나의 전사 인자는 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다) 및 (2) 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는, 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다), 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키기 위한 벡터에 관한 것이다.
예를 들면, 본 발명은 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 당해 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동적으로 연결되고, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는, 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다), 및 (2) 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드[여기서, 당해 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동적으로 연결되고, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는, 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다], 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키기 위한 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 IL-12의 작용을 갖는 단백질, 예를 들면, rAd.RheoIL12를 조건적으로 발현하는 DC의 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 재조합 벡터를 사용하여 DC를 변형시킴으로써 IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 DC의 집단을 생산하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 상기 수지상 세포내로 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시킴으로써 수지상 세포의 적어도 일부를 변형시킴을 포함하여, IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 수지상 세포의 집단을 생산하는 방법, 및 상기 리간드-의존적인 전사에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 상기 수지상 세포내로 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시킴에 의해 수지상 세포의 적어도 일부를 변형시킴을 포함하여, IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 수지상 세포의 집단을 생산하는 방법, 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
예를 들면, 본 발명은 상기 수지상 세포내로 (1) 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열(여기서, 당해 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다)을 포함하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시킴으로써 수지상 세포의 적어도 일부를 변형시킴을 포함하여, IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 수지 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 수지상 세포내로 (1) 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시킴에 의해 수지상 세포의 적어도 일부를 변형시킴을 포함하여, IL-12 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 수지상 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 재조합 벡터, 예를 들면, rAd.RheoIL12 벡터를 사용하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하도록 변형시킨 DC 집단을 제공한다. rAd.RheoIL12로 감염된 DC는 활성화 리간드의 제공 후에만 IL-12의 상승된 수준을 생산한 것으로 밝혀졌다. 다른 양태는 IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 발현하도록 IL-12의 작용 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 재조합 벡터로 변형시킨 DC의 집단을 제공한다. 유용한 리간드는 RG-115830, RG-115932, RG-115819, RSL1, 및 다른 다이아실하이드라진을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명은 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관내에서 가공된 수지상 세포, 및 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 프로모터에 작동적으로 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관내 가공된 수지상 세포를 제공한다.
예를 들면, 본 발명은 유전자 스위치를 암호화하며, (1) 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열(여기서, 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관내 가공된 수지상 세포를 제공한다. 본 발명은 유전자 스위치를 암호화하며, (1) 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열(여기서, 당해 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관내 가공된 수지상 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 재조합 벡터, 예를 들면, rAd.RheoIL12 벡터를 사용하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하도록 변형시킨 DC의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 재조합 벡터를 사용하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하도록 변형시킨 DC의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 흑색종 종양 또는 신경아교종 종양과 같은 암의 치료를 제공한다. IL-12 유전자 치료요법은 재조합 cDNA 벡터로 적용되는 경우 동물 모델 연구에서 항-종양 효능이 입증(참조: Faure et al, 1998; Sangro et al, 2005)되어 있으나, 심지어 유전자-변형된 DC의 내용에도 적용되는 경우도 더욱 입증되어 있다(참조: Satoh et al, 2002; Svane et al, 1999; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002). 그러나, 지금까지, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 이식하는 IL-12 유전자 치료요법의 사람 제I상 시도는 암 셋팅에서 지속되는, 실제적인 임상 반응을 달성하는데 실패하였다(참조: Heinzerling et al, 2005; Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005). 본원에 기술된 DC-계 IL-12 유전자 치료요법(IFN-알파의 존재 또는 부재하에)은 촉망되는 치료학적 요법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 시험관내 가공된 수지상 세포의 집단을 종양 미세환경내로 종양내 투여하는 단계[여기서, 상기 수지상 세포는 (1) 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열(여기서, 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다)을 포함하는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다], 및 (b) 리간드-의존적인 전사 인자를 활성화하는, 유효량의 리간드를 상기 포유동물에 투여함으로써, IL-12의 작용을 갖는 단백질의 발현을 유도하고 상기 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 본 발명은
(a) 수지상 세포를 시험관내에서 가공하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 단계;
(b) 상기 시험관내 가공된 수지상 세포를 종양 미세환경에 종양내로 투여하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 투여함으로써 IL-12의 작용을 갖고 상기 종양을 치료하는 단백질의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 시험관내 가공된 수지상 세포의 집단을 종양 미세환경내로 종양내 투여하는 단계[여기서, 상기 수지상 세포는 (1) 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 인자(여기서, 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화한다)를 포함하는, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 상기 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화된 프로모터에 연결된 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다], 및 (b) 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여함으로써, IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질의 발현을 유도하고 상기 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 본 발명은
(a) 수지상 세포를 시험관내에서 가공하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 단계;
(b) 종양 미세환경으로 상기 시험관내 가공된 수지상 세포를 종양내 투여하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 투여함으로써 IL-12의 작용을 갖는 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 갖는 단백질의 발현을 유도하고 상기 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료요법의 개시 전에 환자에서 IFN-γ의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써 가공된 DC-계 치료요법의 효능을 측정한 후, IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하도록 가공된 DC의 투여한 다음 시험 수준을 생성하기 위한 IFN-γ의 발현 수준을 측정하고, 대조군 수준을 시험 수준과 비교하여 치료학적 섭생이 효과적인지를 측정함으로써 가공된 DC-계 치료요법의 효능을 측정하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은
(a) 시험관내 가공된 수지상 세포의 투여 전에 이를 필요로 하는 환자로부터 수득한 첫번째 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정함으로써 대조군 수준을 생성하는 단계;
(b) 시험관내 가공된 수지상 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현시키는 단계;
(c) 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
(d) 시험관내 가공된 DC 및 활성화된 리간드의 투여 후 상기 환자로부터 수득한 제2의 생물학적 샘플에서 IFN-γ의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정하는 단계; 및
(e) 대조군 수준을 IFN-γ의 시험 수준과 비교하는 단계(여기서, 대조군 수준에 대해 상대적인 IFN-γ의 발현, 활성 또는 이들 둘다의 시험 수준에 있어서의 증가는, 치료학적 섭생이 상기 환자에서 효과적임을 나타낸다)를 포함하여, 환자에서 시험관내 가공된 수지상 세포계 치료학적 섭생의 효능을 측정하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (1) 이를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 본 발명의 시험관내 가공된 수지상 세포의 집단을 투여하는 단계; 및 (2) 상기 포유동물에게 리간드-의존적인 전사 인자를 활성화시키는, 유효량의 리간드를 투여하는 단계를 포함하여, 수지상 세포에서 인터류킨-12(IL-12)의 작용을 갖는 단백질의 조건적 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
임상 시험에 앞서, BALB/c 마우스내 CMS4 육종 모델에서 수행된 앞서의 연구들을 연장하였으며, Ad.cIL12(구성적 발현)로 예비-감염된 동계의 종양내 전달은 효과적인 종양 거부를 초래하였다(참조:Tatsumi et al., 2003). 거부는 CMS4 종양에 대해 전신계적 CD8+ T 세포-면역원성과 연관된다(참조: Tatsumi et al, 2003).
서열의 간단한 설명
서열 1은 야생형 마우스 IL-12 p35 유전자의 완전한 길이의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 2는 야생형 마우스 IL-12 p40 유전자의 유전자의 완전한 길이의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 3은 야생형 사람 IL-12 p35 유전자의 완전한 길이의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 4는 야생형 사람 IL-12 p40 유전자의 완전한 길이의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 5는 야생형 마우스 IL-12 p35 단백질의 완전한 길이의 폴리펩타이드 서열이다.
서열 6은 야생형 마우스 IL-12 p40 단백질의 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 7은 야생형 사람 IL-12 p35 단백질의 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 8은 야생형 사람 IL-12 p40 단백질의 완전한 길이의 아미노산 서열이다.
서열 9는 드로소필라(Drosophila)에서 발견된 탈피호르몬 반응 요소에 대한 DNA 서열이다.
서열 10은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 발견된 탈피호르몬 반응 요소에 대한 DNA 서열이다.
서열 11은 드로소필라 멜라노가스터에서 발견된 에서 발견된 탈피호르몬 반응 요소에 대한 DNA 서열이다.
서열 12는 호밍 엔도뉴클레아제[homing endonuclease (HE)] 효소에서 I-SceI 제한 부위이다.
서열 13은 사람 IL-12 암호화 서열: Ad-RTS-hIL-12 (SP1-RheoIL-12)을 포함하는 아데노바이러스 벡터의 DNA 서열이다.
인터페론 알파(IFN-알파)의 아미노산 서열은 수탁번호 AAA52724로 공공의 데이타베이스로부터 입수가능하며, 이의 서열은 본원에 참조로 인용되어 있다[참조: Capon et al., Mol. Cell. Biol. 5, 768-779 (1985)].
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 당해 분야의 모든 용어, 주목 및 기타 과학 용어 또는 전문용어들은, 본 발명이 속한 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해된 의미를 갖는 용어들은 명확성 및/또는 용이한 참조와 이해를 위해 본원에 정의되어 있으며, 본원의 이러한 정의의 도입은 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 의미하는 것으로 필수적으로 의도되어서는 안된다. 분자 생물학 용어 및/또는 방법 및/또는 프로토콜의 일반적으로 이해되는 정의들은 문헌[참조: Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer- Verlag: New York, 1991; Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994)]에서 찾을 수 있다. 적절하게는, 상업적으로 시판되는 키트 및/또는 시약의 사용을 포함하는 과정은 달리 주목하지 않는 한, 제조업자의 안내 및/또는 프로토콜 및/또는 매개변수에 따라 수행된다.
본 발명의 목적을 위한 "분리된(isolated)"이란 용어는 원래의 환경(자연 상태에서 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)을 나타낸다. 예를 들면, 식물 또는 동물 내에서 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이 아니지만, 자연 상태로 존재하는 인접한 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "분리된" 것으로 간주된다.
생물학적 물질에 적용되는 "정제된"이란 용어는 당해 물질이 다른 화합물의 존재를 배제하고 절대 순도를 나타내는 형태로 존재할 것을 요구하지는 않는다. 이것은 다소 상대적인 정의이다.
"핵산", "핵산 분자", 올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 교대로 사용되고, 포스페이트 에스테르 고분자 형태의 리보뉴클레오티드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오티드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자") 또는 이들의 임의의 포스포에스테르 동족체, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 의미하며, 이들은 모두 단일 사슬 형태 또는 이중-사슬 헬릭스일 수 있다. 이중 사슬 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 헬릭스도 가능하다. 용어 핵산 분자 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하며, 이를 임의 특정 3차 형태로 한정하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들면, 제한효소 단편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중-사슬 DNA를 포함한다. 특정한 이중-사슬 DNA 분자의 구조를 논의함에 있어서, 서열은 통상의 관습에 따라 전사되지 않는 DNA의 사슬(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 사슬)을 따라 5'에서 3' 방향의 서열만으로 본원에서 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열에 적용된 "단편"이라는 용어는 기준(reference) 핵산에 비해 길이가 감소되고 공통 부분에 걸쳐서 상기 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편은 더 큰 폴리뉴클레오티드에 일성분으로 적절하게 포함될 수 있다. 이러한 단편은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1,000, 1,500, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "분리된 핵산 단편"은 합성, 비-자연형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 임의로 포함하는 단일- 또는 이중-사슬의 RNA 또는 DNA 중합체이다. DNA 고분자 형태의 분리된 핵산 단편은 하나 이상의 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 세그먼트(segment)를 포함할 수 있다.
"유전자"는 작용성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 작용성 분자에는 전사 단독(예: 생활성 RNA 종) 또는 전사와 번역(예: 폴리펩티드)에 의해 생성된 작용성 분자가 포함된다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한, "유전자"는 코딩 서열을 선행하거나(5' 비-코딩 서열) 뒤따르는(3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함하는 특정한 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 핵산 단편을 의미한다. "자연형 유전자"는 그 자신의 조절 서열을 가지며, 자연 상태에서 발견되는 유전자를 의미한다. "키메라(chimera) 유전자"는 자연형 유전자가 아닌 임의의 유전자를 의미하며, 함께 자연 상태에서 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원(source)으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연 상태에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 코딩 서열 및/또는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성(endogenous) 유전자"는 생명체의 게놈 내에 자연 상태로 위치하는 자연형 유전자를 의미한다. "외인성" 유전자 또는 "이종형(heterologous)" 유전자는 숙주 생명체 내에서 정상적으로는 발견되지 않으며, 유전자 전달에 의해 상기 숙주 생명체 내로 도입된 유전자를 의미한다. 외인성 유전자는 비-자연형 생명체 내로 삽입된 자연형 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "이식유전자(transgene)"는 형질전환(transformation) 방법에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다. 예를 들면, 인터류킨-12 (IL-12) 유전자는 IL-12 단백질을 코딩한다. IL-12는 35-kD 서브유닛(p35)과 40-kD 서브유닛(p40)이 이황화결합을 통해 연결되어 완전한 기능을 하는 IL-12p70로 만들어진 이종이형체이다.
"이종형 DNA"는 세포내, 또는 상기 세포의 염색체 부위에서 정상적으로는 존재하지 않는 DNA를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 이종형 DNA는 상기 세포에 대해 외인성인 유전자를 포함한다.
"게놈"이라는 용어는 염색체 뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는, 상기 핵산 분자의 단일 사슬 형태가 적절한 온도 및 용액의 이온 세기 조건하에서 다른 핵산 분자와 어닐링하는 경우, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 또 다른 핵산 분자와 "혼성화가능하다". 혼성화 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며, 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌에 예시되어 있다[참조: Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히 제11장 및 표 11.1]. 상기 온도 및 이온 세기 조건은 상기 혼성화의 "스트린전시(stringency)"를 결정한다.
스트린전시 조건은 연관성이 먼 생명체 유래의 상동성 서열과 같은 적절하게 유사한 단편, 또는 연관성이 밀접한 생명체 유래의 작용성 효소를 복제하는 유전자와 같은 매우 유사한 단편을 스크리닝(screening)하기 위해 조정될 수 있다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝의 경우, 55℃의 Tm에 해당하는 낮은 스트린전시 혼성화 조건은, 예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크(milk), 및 포름아미드 부재; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS를 사용할 수 있다. 적당한 스트린전시 혼성화 조건은 더 높은 Tm, 예를 들면, 40% 포름아미드 및 5x 또는 6x SCC에 해당한다. 높은 스트린전시 혼성화 조건은 가장 높은 Tm, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 해당한다.
혼성화는, 혼성화의 스트린전시에 따라 염기 사이의 불일치(mismatch)가 가능하기는 하지만, 상기 2개의 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다. "상보적"이란 용어는 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들면, DNA에 있어서 아데노신은 티민과 상보적이고, 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에서 개시되거나 또는 사용된 완전한 서열 뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열에 상보적인 분리된 핵산 단편도 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 Tm이 55℃인 혼성화 단계를 포함하고 전술한 조건을 이용하는 혼성화 조건을 사용함으로써 검출된다. 다른 양태에서, 상기 Tm은 60℃, 63℃ 또는 65℃이다.
또한, 혼성화 후 세척이 스트린전시 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 6X SSC, 0.5% SDS로 15분간으로 시작하여, 이후 45℃에서 2X SSC, 0.5% SDS로 30분간 반복하고, 이후 50℃에서 0.2X SSC, 0.5% SDS로 30분간 2회 반복하는 일련의 세척을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 스트린전시 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 이때 세척 조건은 0.2X SSC, 0.5% SDS에서 30분간 세척하는 최종 2회의 온도가 60℃로 증가되는 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 또 다른 바람직한 세트의 높은 스트린전시 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회 최종 세척을 사용한다.
핵산의 혼성화를 위한 적합한 스트린전시는 핵산의 길이 및 상보성 정도에 의존하며, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 다양하다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 및 상동성 정도가 클수록 이들 서열을 갖는 핵산의 혼성화를 위한 Tm 값은 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성(높은 Tm에 해당함)은 다음의 순서로 저하된다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 이상인 혼성화의 경우, Tm을 계산하기 위한 방정식이 유도되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화의 경우, 불일치 위치가 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 이의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 미만의 염 및 적어도 37℃에서의 혼성화 단계 및 2X SSPE, 적어도 63℃에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용함으로써 검출된다. 또 다른 양태에서, 상기 혼성화 조건은 상기 혼성화 단계에서 200 mM 미만의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 혼성화 조건은 상기 혼성화 및 세척 단계 모두에 대해 2X SSPE 및 63℃를 포함한다.
또 다른 양태에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 약 20 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 약 30 뉴클레오티드이다. 더욱이, 당업자는 상기 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브(probe)의 길이와 같은 인자에 따라 필요시 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
"프로브"란 용어는 상보적인 단일 사슬 표적 핵산과 염기쌍을 형성하여 이중-사슬 분자를 형성할 수 있는 단일-사슬 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자와 혼성화할 수 있는 짧은 핵산을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 32P-뉴클레오티드 또는 바이오틴과 같은 표지(label)가 공유적으로 접합되어 있는 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(하나 또는 양쪽 모두 표지될 수 있음)는 핵산의 전장(full length) 또는 단편을 클로닝하고 DNA 서열분석하거나, 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 헬릭스를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 합성에 의해 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연 발생 포스포에스테르 동족체 결합으로 제조될 수 있다.
"프라이머"는 표적 핵산 서열과 혼성화하여 적당한 조건하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 이중 사슬 핵산 영역을 생성하기 위해 표적 핵산 서열과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프라이머는 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 또는 DNA 서열분석에서 사용될 수 있다.
"폴리머라제 연쇄 반응"은 PCR로 약칭되며, 특이적 핵산 서열을 효소적으로 증폭하기 위한 시험관내 방법을 의미한다. PCR은 반복되는 일련의 온도 사이클을 포함하며, 각 사이클은 3가지 단계를 포함한다: 표적 분자의 사슬을 분리하기 위한 주형 핵산의 변성, 단일 사슬 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 주형 핵산의 어닐링, 및 DNA 폴리머라제에 의한 상기 어닐링된 프라이머(들)의 연장. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건하에서 핵산의 출발 풀(pool) 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
"역전사-폴리머라제 연쇄 반응"은 RT-PCR로 약칭되고, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 생산하기 위한 시험관내 방법을 의미하며, 이후 상기 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특이적 핵산 서열 또는 서열들을 전술한 바와 같이 효소적으로 증폭한다. 또한, RT-PCR은 상기 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 조절하에 놓여질 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 세포내에서 전사 및 폴리펩티드로 번역되는 이중-사슬 DNA 서열이다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 상기 연결된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 및 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열의 경계부는 상기 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 상기 3'(카복실) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 원핵생물 서열, mRNA 유래의 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열을 진핵생물 세포내에서 발현시킬 의도라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상 상기 코딩 서열의 3' 쪽에 위치할 것이다.
"개방 판독 프레임(open reading frame)"은 ORF로 약칭되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 출발 신호 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하고, 잠재적으로 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있는 DNA, cDNA 또는 RNA 핵산 서열의 길이를 의미한다.
본원에서, "머리-대-머리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 사슬의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5' 말단과 인접할 때 머리-대-머리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 멀어지게 된다. "머리-대-머리"라는 용어는 (5')-대-(5')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(←→) 또는 (3´←5'5'→3')으로 표시될 수 있다.
본원에서, "꼬리-대-꼬리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 사슬의 3' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3' 말단과 인접할 때 꼬리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드 방향으로 향하게 된다. "꼬리-대-꼬리"라는 용어는 (3')-대-(3')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→←) 또는 (5'→3'3'←5')으로 표시될 수 있다.
본원에서, "머리-대-꼬리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리노클레오티드의 코딩 사슬의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3' 말단과 인접할 때 머리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 것과 동일한 방향으로 진행하게 된다. "머리-대-꼬리"라는 용어는 (5')-대-(3')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→→) 또는 (5'→3'5'→3')으로 표시될 수 있다.
"하류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 개시점을 뒤따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 개시 부위의 하류에 위치한다.
"상류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 서열을 의미한다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열 또는 전사 개시점의 5'측 상에 위치한다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사 개시 부위의 상류에 위치한다.
"제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 이중 사슬 DNA 내의 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하고 그 내부를 절단하는 효소를 의미한다.
"상동성 재조합"은 외인성 DNA 서열의 다른 DNA 분자로의 삽입, 예를 들면, 벡터의 염색체로의 삽입을 의미한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 상동성 재조합을 위해 특정한 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적 상동성 재조합을 위하여, 상기 벡터는 상보적인 결합 및 상기 벡터의 염색체로의 삽입을 가능하게 하도록 상기 염색체 서열과 상동성인 충분히 긴 영역을 포함할 것이다. 상동성 영역이 더 길고 서열의 유사성 정도가 커질수록, 상동성 재조합 효율은 증가될 것이다.
당해 기술 분야에서 공지된 몇 가지 방법이 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 증식을 위해 사용될 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터는 다량으로 증식 및 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 몇가지 언급하면, 하기 벡터 및 이들의 유도체를 포함한다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 바큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
"벡터"는 핵산을 숙주 세포로 클로닝 및/또는 전달시키기 위한 임의의 비히클이다. 벡터는 다른 DNA 세그먼트가 부착되어 상기 부착된 세그먼트의 복제를 일으킬 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자발적 단위로 작동하는, 즉 그 자신의 조절하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)이다. "벡터"라는 용어는 상기 핵산을 시험관내, 생체외(ex vivo) 또는 생체내에서 세포내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 모두를 포함한다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 대다수의 벡터가 핵산을 조작하고, 반응 요소(response element) 및 프로모터를 유전자 등 내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 가능한 벡터는, 예를 들면, 플라스미드 또는, 예를 들면, 람다 유도체와 같은 박테리오파지를 포함하는 변형된 바이러스, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 포함한다. 본 발명에 유용한 벡터의 또 다른 예는, 국제공개공보 제WO 2007/038276호에 기재된 울트라벡터(UltraVectorTM) 생성 시스템(Intrexon Corp., Blacksburg, VA)이다. 예를 들면, 반응 요소 및 프로모터에 해당하는 DNA 단편을 적합한 벡터내로 삽입하는 것은 적당한 DNA 단편을 상보적인 점착성(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터내로 접합시킴으로써 달성될 수 있다. 또는, 상기 DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형되거나, 또는 뉴클레오티드 서열(링커)을 상기 DNA 말단 내로 접합시킴으로써 임의의 부위가 생성될 수 있다. 이러한 벡터는 선별 마커(marker) 유전자를 포함하도록 유전자 조작되어, 상기 마커가 세포 게놈 내로 삽입된 세포를 선별하도록 할 수 있다. 이러한 마커는 상기 마커에 의해 코딩되는 단백질이 삽입 및 발현되는 숙주 세포의 동정 및/또는 선별을 가능하게 한다.
바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 세포 뿐만 아니라 살아있는 동물 피검자에서의 다양한 종류의 유전자 전달 적용분야에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스, 바큘로바이러스, 백시니아, 헤르페스 심플렉스, 엡스테인-바, 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 카울리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생고분자(biopolymer)를 포함한다. 핵산 이외에, 벡터는 또한 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현 기간, 등)를 선별, 측정 및 모니터하기에 유용한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
"플라스미드"라는 용어는 염색체 이외의 요소를 나타내며, 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하고, 통상 원형의 이중-사슬 DNA 분자 형태이다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 자발적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 단일- 또는 이중-사슬 DNA 또는 RNA의 선형, 원형 또는 수퍼코일형이며, 다수의 뉴클레오티드 서열이 독특한 구조로 합류 또는 재결합되어 프로모터 단편 및 선별된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열을 적당한 3' 비번역 서열과 함께 세포내로 도입할 수 있다.
"클로닝 벡터"는 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 "레플리콘"을 의미하며, 이는 순차적으로 복제하고, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하며, 여기에 다른 핵산 세그먼트가 부착하여 부착된 세그먼트의 복제를 일으킨다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 타입에서는 복제하고, 다른 곳에서는 발현할 수 있다("셔틀 벡터"). 클로닝 벡터는 당해 벡터 및/또는 목적하는 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함하는 세포의 선별에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 숙주 내로 형질전환된 후에 삽입된 핵산 서열이 발현될 수 있도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 비히클을 의미한다. 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 통상 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 조절하에 놓여 있다. 목적하는 숙주 세포내에서 핵산을 발현시키기에 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 다수가 있으며, 당업자에게 친숙하다. 이러한 유전자를 발현시킬 수 있는 실질적으로 모든 프로모터가 본 발명에 적합하며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 구성적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 병인 및 질병 관련 프로모터, 발달 특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 빛 조절성 프로모터; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 알칼린 포스페이트 프로모터(사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOX1 프로모터(피키아(Pichia)에서의 발현에 유용함); β-락타마제, lac , ara , tet , trp , lP L , lP R , T7 , tac 및 trc 프로모터(대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 유용함); 빛 조절성-, 종자 특이적-, 화분 특이적-, 난소 특이적-, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S, CMV 35S 최소, 카사바 베인(cassava vein) 모자이크 바이러스(CsVMV), 클로로필 a/b 결합 단백질, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제, 줄기(shoot)-특이적, 뿌리 특이적, 키티나제, 스트레스 유도성, 쌀 퉁그로바실리폼(rice tungro bacilliform) 바이러스, 식물 수퍼-프로모터, 감자 루신 아미노펩티다제, 니트레이트 리덕타제, 만노파인 신타제, 노팔린 신타제, 유비퀴틴, 제인 단백질 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서의 발현에 유용함); 이로써 한정되는 것은 아니지만, SV40 초기(SV40e) 프로모터 영역, 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 3' 긴 말단 반복(LTR)에 포함되어 있는 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 프로모터 또는 주된 후기 프로모터(MLP), 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티민 키나제(TK) 프로모터, 바큘로바이러스 IE1 프로모터, 연장 인자(elongation factor) 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 조절 영역, 유비퀴터스 프로모터(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간체 필라멘트(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터, 치료학적 유전자(MDR, CFTR 또는 인자 Ⅷ 타입 등)의 프로모터, 병인 또는 질병 연관성-프로모터, 췌장 애시나(acinar) 세포에서 활성형인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역과 같이 조직 특이성을 나타내고 유전자이식 동물에서 이용되고 있는 프로모터를 포함하는 당해 기술분야에서 공지된 동물 및 포유동물 프로모터; 췌장 베타 세포에서 활성형인 인슐린 유전자 조절 영역, 임파구 세포에서 활성형인 유래된글로불린 유전자 조절 영역, 고환, 유방, 임파구 및 비만 세포(mast cell)에서 활성형인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역; 알부민 유전자, 간에서 활성형인 Apo AI 및 Apo AII 조절 영역, 간에서 활성형인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역, 간에서 활성형인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역, 골수 세포에서 활성형인 β-글로빈 유전자 조절 영역, 뇌의 올리고덴드로사이트 세포에서 활성형인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역, 골격근에서 활성형인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 및 시상하부에서 활성형인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역, 피루베이트 키나제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 소장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등을 포함한다. 또한, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
벡터는 당해 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염(transfection), 전기천공(electroporation), 미세주입(microinjection), 형질도입(transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 지질감염(lipofection)(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터에 의해 목적하는 숙주 세포내로 도입될 수 있다[참조: Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963(1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621(1988); 및 Hartmut 등의 캐나다 특허출원 제2,012,311호].
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 지질감염에 의해 생체내로 도입될 수 있다. 지난 수십년간, 시험관내에서 핵산을 캡슐화 및 형질감염시키기 위한 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀-매개성 형질감염과 관련된 어려움 및 위험성을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온성 지질이, 마커를 코딩하는 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포좀 제조에 사용될 수 있다[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413(1987); Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:8027(1988); and Ulmer et al., Science 259: 1745(1993)]. 양이온성 지질의 사용은 음전하를 갖는 핵산의 캡슐화를 촉진시키고, 또한 음전하를 갖는 세포막과의 융합을 촉진시킬 수 있다[참조: Felgner et al., Science 337:387(1989)]. 핵산의 전달을 위해 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물은 국제 공개특허공보 제WO95/18863호, 제WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기재되어 있다. 외인성(exogenous) 유전자를 생체내에서 특정한 기관 내로 도입하기 위해 지질감염을 사용하는 것은 몇 가지 실질적인 이점을 갖는다. 특정한 세포로 리포좀을 분자 표적화하는 것이 한가지 유익한 측면이다. 특정한 세포 타입으로 형질감염을 유도하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포가 이형성(heterogeneity)을 갖는 조직에 있어서는 특히 바람직하다는 것이 명확하다. 지질은 표적화를 목적으로 다른 분자와 화학적으로 커플링될 수 있다[참조: Mackey, et al., 1988, supra). 표적화된 펩티드, 예를 들면, 호르몬 또는 신경전달물질(neurotransmitter) 및 항체와 같은 단백질 또는 비-펩티드 분자는 리포좀과 화학적으로 커플링될 수 있다.
또한, 양이온성 올리고펩티드(예를 들면, WO95/21931), DNA 결합 단백질 유래의 펩티드(예를 들면, WO96/25508), 또는 양이온성 고분자(예를 들면, WO95/21931)와 같은 다른 분자들도 생체내에서의 핵산의 형질감염을 촉진하는데 유용하다.
또한, 네이키드(naked) DNA 플라스미드와 같은 벡터를 생체내로 도입하는 것도 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조). 수용체-매개된 DNA 전달 접근방법 또한 사용될 수 있다[참조: Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147(1992); 및 Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429(1987)].
"형질감염"이란 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA의 흡수를 의미한다. 세포는 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA가 세포의 내부로 도입될 때 이러한 RNA 또는 DNA에 의해 "형질감염" 되었다. 세포는 상기 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화를 나타낼 때 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA에 의해 "형질전환" 되었다. 형질전환된 RNA 또는 DNA는 염색체 DNA 내부로 삽입되어(공유적으로 결합됨) 세포의 게놈을 구성할 수 있다.
"형질전환"은 숙주 생명체의 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 의미하며, 결과적으로 유전적으로 안정하게 유전된다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생명체는 "유전자이식된" 또는 "재조합된" 또는 "형질전환된" 생명체로 불리운다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 이들의 증폭 또는 이들의 발현을 목적하는 세포성 숙주 내에서의 하나 이상의 복제 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
"선별용 마커"라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전적 성질을 추적하거나 및/또는 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 동정하기 위해 사용되는 상기 마커 유전자의 효과, 즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 발색성 마커, 효소, 형광 마커 등에 의해 선별될 수 있는, 통상 항생제 또는 화학 내성 유전자와 같은 동정 인자(identifying factor)를 의미한다. 당해 기술분야에서 공지되고 사용되는 선별용 마커 유전자의 예로는 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 비알랍포스(bialaphos) 제초제, 설폰아미드 등에 내성을 나타내는 유전자; 및 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전달 유전자 등과 같은 표현형 마커로 사용되는 유전자를 포함한다.
"리포터 유전자"라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전적 성질을 추적하거나, 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 동정하거나 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용되는 상기 리포터 유전자의 효과에 의해 동정될 수 있는 동정 인자를 코딩하는 핵산을 의미한다. 당해 기술분야에서 공지되고 사용되는 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제(Luc), 초록 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 또한, 선별 마커 유전자는 리포터 유전자로 간주될 수도 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 서로 교대로 사용될 수 있고, 코딩 서열 또는 작용성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 이들의 전체가 자연형 유전자로부터 유래되거나, 또는 자연 상태에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 이루어지거나, 또는 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 타입, 또는 상이한 발달 단계, 또는 상이한 환경적 또는 물리적 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 대부분의 시간에 대부분의 세포 타입에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "구성적 프로모터"로 불리운다. 특정한 세포 타입에서의 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 불리운다. 특정한 발달 단계 또는 세포 분화 단계에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 불리운다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드(ligand), 빛 등에 세포를 노출하거나 처리한 이후에 유도되거나 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터"로 불리운다. 추가로, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계부는 완전하게 정의되어 있지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 인식되어 있다.
상기 프로모터 서열은 통상 이의 3' 말단에 전사 개시 부위가 결합되어 있고, 상류(5' 방향)에는 배경(background) 이상으로 검출될 수 있는 레벨로 전사를 개시하기에 필요한 최소의 염기 또는 요소를 포함하도록 연장된다. 상기 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑에 의해 편리하게 정의됨) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 필요한 단백질 결합 도메인(공통(consensus) 서열)도 발견될 것이다.
코딩 서열은 RNA 폴리머라제가 상기 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 세포내에서 전사 및 번역 조절 서열의 "조절하에" 있으며, 이후 트랜스-RNA 스플라이싱(상기 코딩 서열이 인트론을 포함하는 경우)되고 상기 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역된다.
"전사 및 번역 조절 서열"은 숙주 세포내에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 신호는 조절 서열이다.
"반응 요소"("RE")라는 용어는, 전사 인자의 DNA-결합 도메인과의 상호작용을 통해 매개되는 프로모터에 대한 반응성을 부여하는 하나 이상의 시스(cis)-작용성 DNA 요소를 의미한다. 이 DNA 요소는 당해 서열이 (완전하거나 또는 불완전한) 팔린드롬성(palindromic)이거나, 또는 다양한 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 하프 부위로 이루어질 수 있다. 상기 하프 부위는 동일하거나 유사하며, 직접 또는 역상 반복으로 배열되거나, 또는 단일 하프 부위이거나, 또는 인접한 하프 부위가 직렬로 연결된 다합체(multimer)로 배열될 수 있다. 상기 반응 요소는 당해 반응 요소가 삽입되는 세포 또는 생명체의 성질에 따라 다른 생명체로부터 분리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재하에 반응 요소의 조절하에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하여 상기 반응 요소의 조절하에 있는 하류 유전자(들)의 전사를 개시 또는 억제한다. 자연형 엑디손(ecdysone) 수용체의 반응 요소에 대한 DNA 서열의 예로는 RRGG/TTCANTGAC/ACYY(서열번호 9)[참조: Cherbas L., et. al., Genes Dev. 5, 120(1991)]; AGGTCAN(n)AGGTCA, 여기서, N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드(서열번호 10)일 수 있다. [참조: D'Avino PP., et al., Mol, Cell, Endocrinol, 113, 1(1995)]; 및 GGGTTGAATGAATTT (서열번호 11)[참조: Antoniewski C., et al., Mol. Cell Biol. 14, 4465(1994)]를 포함한다.
"작동가능하게 연결된(operably linked)"의 용어는, 핵산 서열이 단일 핵산 단편과 연관되어 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받는다는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠수 있을 때(즉, 상기 코딩 서열이 상기 프로모터의 전사 조절하에 있을 때) 상기 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 코딩 서열은 조절 서열과 센스 또는 안티센스 방향으로 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는, "발현"이란 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래하는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 의미한다. 발현은 또한 단백질 또는 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 의미할 수도 있다.
"카세트(cassette)", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 상동성 재조합에 의해 특정한 제한효소 부위에서 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA 세그먼트를 의미한다. 상기 DNA 세그먼트는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 번역을 위해 상기 카세트가 적절한 판독 프레임 내에 삽입될 수 있도록 디자인된다. "형질전환 카세트"는, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 이외에 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 인자를 갖는 특정한 벡터를 의미한다. 또한, 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포내에서 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되도록 하는 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있다.
본 발명을 위해, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터에 연결된 반응 요소 및 리간드-의존성 전사 인자 기반 시스템의 조합을 의미하며, 상기 리간드-의존성 전사 인자 기반 시스템은 하나 이상의 리간드의 존재하에 반응 요소 및 프로모터가 도입되어 있는 유전자의 발현을 조절한다. "유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 프로모터와 연관된 반응 요소, 및 리간드-의존 전사 인자-기반 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합을 의미하며, 이는 하나 이상의 리간드 존재하에, 반응 요소 및 프로모터가 통합되어 있는 유전자의 발현을 조절한다.
유전자 스위치와 관련하여 "엑디손 수용체 기반"이라는 용어는 자연발생 또는 합성 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인의 적어도 작용성 부분을 포함하고 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인에 결합하는 리간드에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 유전자 스위치를 의미한다. 엑디손-반응 시스템은 미국 특허 제7,091,038호 및 6,258,603호에 기술되어 있다. 하나의 구체에에서, 상기 시스템은 두개의 융합 단백질, Gal4 DNA 결합 도메인과 융합된 돌연변이된 엑디손 수용체 (EcR)의 DEF 도메인 및 VP16 전사 활성 도메인과 융합된 키메라 RXR의 EF 도메인을 포함하고, 도 1에 도시된 바와 같은 구조 프로모터하에서 발현되는 RheoSwitch® 치료 시스템(RTS)이다.
"조절" 및 "조절하는"이란 용어는 핵산 또는 유전자의 발현을 유도, 감소 또는 억제하여, 결과적으로 단백질 또는 폴리펩티드 생산을 각각 유도, 감소 또는 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 변형된 세포에서 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 양태에서 사용될 수 있는 인핸서는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 연장 인자(elongation factor)-1(EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함한다.
종결 조절 영역, 즉 터미네이터 또는 폴리아데닐화 서열은 또한 바람직한 숙주에 대해 자연형인 다양한 유전자로부터 유래할 수 있다. 임의로, 종결 부위는 불필요할 수도 있지만, 포함시키는 것이 대부분 바람직하다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 종결 조절 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 바이러스 터미네이터 서열 등으로 구성되거나 또는 이들로부터 유도될 수 있다.
"3' 비-코딩 서열" 또는 "3' 비번역 영역(UTR)"이라는 용어는 코딩 서열의 하류(3´)에 위치하는 DNA 서열을 의미하며, 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 통상 mRNA 전구체(precursor)의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙(track)을 부가하는데 영향을 미침으로써 특정된다.
"조절 영역"은 2번째 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정한 핵산(상동성 영역)의 발현에 자연적으로 관여하는 서열을 포함할 수도 있거나, 상이한 단백질 또는 심지어 합성 단백질(이종형 영역)의 발현에 관여하는 상이한 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 원핵생물, 진핵생물, 또는 바이러스 유전자의 서열이거나, 또는 특이적인 또는 비-특이적인 방식 및 유도가능한 또는 비-유도가능한 방식으로 유전자의 전사를 자극 또는 억제하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이싱 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 및 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 서열을 포함한다.
"이종형 공급원" 유래의 조절 영역은 발현된 핵산과 자연적으로는 연관되지 않는 조절 영역이다. 상기 이종형 조절 영역에 속하는 것으로는 상이한 종 유래의 조절 영역, 상이한 유전자 유래의 조절 영역, 혼성화 조절 서열 및 자연적으로 존재하지 않지만 당업자에 의해 디자인된 조절 서열을 포함한다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사체로부터 발생하는 생성물을 나타낸다. 상기 RNA 전사체가 DNA 서열과 완전히 상보적인 복사본일 때는 1차 전사체로 불리우거나, 상기 1차 전사체의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 때는 성숙한 RNA로 불리운다. "메신저 RNA(mRNA)"는 인트론이 없으며, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 의미한다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이고 이로부터 유래된 이중-사슬 DNA를 의미한다. "센스" RNA는 상기 mRNA를 포함하는 RNA 전사체를 의미하며, 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부와 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 의미한다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정한 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열 또는 상기 코딩 서열에 존재할 수 있다. "작용성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 아직 번역되지 않은 것으로서 세포 작동에 영향을 미치는 다른 RNA를 의미한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 서로 교대로 사용되고, 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 중합체 화합물이다.
"분리된 폴리펩티드", "분리된 펩티드" 또는 "분리된 단백질"은 이의 자연 상태에서는 정상적으로 연결되어 있는 화합물들(예를 들면, 상이한 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 제거된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. "분리된"은 다른 화합물들과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 불순물의 존재를 배제하는 의미는 아니며, 상기 불순물은, 예를 들면, 불완전한 정제, 안정제의 첨가, 또는 약제학적으로 허용되는 제제로의 혼합으로 인해 존재할 수 있다.
"치환 돌연변이체 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이체"는 적어도 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 폴리펩티드로 치환된 것을 포함하는 돌연변이체 폴리펩티드를 의미하는 이해될 것이다. 치환 돌연변이체 폴리펩티드는 단지 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, "점 돌연변이체" 또는 "단일 점 돌연변이체" 폴리펩티드로서 언급될 수 있다. 또는, 치환 돌연변이체 폴리펩티드는 2개 이상의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 폴리펩티드에 대해 2개 이상의 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이체를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 적어도 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드에 대해 상이한 아미노산으로 치환된 것을 포함한다.
치환 돌연변이체 폴리펩티드가 2개 이상의 야생형 또는 자연발생 아미노산의 치환을 포함하는 경우, 이러한 치환은 치환을 위해 결실된 동수의 야생형 또는 자연발생 아미노산, 즉 2개의 비-야생형 또는 비-자연발생 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 또는 자연발생 아미노산을 포함하거나, 또는 치환을 위해 결실된 비동수의 야생형 아미노산, 즉 1개의 비야생형 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 아미노산(치환 + 결실 돌연변이) 또는 3개의 비야생형 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 아미노산(치환 + 삽입 돌연변이)을 포함할 수 있다.
치환 돌연변이체는 약칭 명명 시스템을 사용하여 기재함으로써 기준 폴리펩티드 서열 내에 치환된 아미노산 잔기와 수 및 새롭게 치환된 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 20번째(20th) 아미노산 잔기가 치환된 치환 돌연변이는 "x20z"로 약칭될 수 있고, 여기서 "x"는 치환되는 아미노산이고, "20"은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치 또는 번호이며, "z"는 새롭게 치환된 아미노산이다. 따라서, "E20A" 또는 "Glu20Ala"로 교대로 약칭된 치환 돌연변이체는 당해 돌연변이체가 폴리펩티드의 20번 위치에서 글루탐산(당해 분야에서 통상 "E" 또는 "Glu"로 약칭됨) 대신에 알라닌 잔기(당해 분야에서 통상 "A" 또는 "Ala"로 약칭됨)를 포함하는 것을 나타낸다.
치환 돌연변이체는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 돌연변이 유발 기술로 제조될 수 있으며, 여기에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시험관내 부위 지시된 돌연변이 유발[참조: Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551(1978); Zoller et al., DNA 3:479(1984); Oliphant et al., Gene 44:177(1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710(1986)], TABR 링커(Pharmacia)의 사용, 제한 엔도뉴클레아제 소화/단편 결실 및 치환, PCR-매개된/올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이 유발 등이 포함된다. PCR 기반 기술은 부위 지시된 돌연변이 유발이 바람직하다[참조: Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70].
폴리펩티드에 적용되는 "단편"이라는 용어는 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열보다 짧고 이들 기준 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 전체 부분에 걸쳐 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 단편은, 적합한 경우, 이들이 일부인 보다 큰 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 이러한 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, 300 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 유사체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체로서, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 보유하는 것을 의미한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 상이한 변이체는 자연 상태에서 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 상기 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열상의 차이에 의해 특정되는 대립 변이이거나, 또는 상이한 스플라이싱 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 교환을 갖는 변이체를 제조할 수 있다. 이들 변이체는 특히 (a) 하나 이상의 아미노산이 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 상기 폴리펩티드 또는 단백질에 부가된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체 및 (d) 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 또 다른 폴리펩티드와 융합된 변이체를 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적 및 효소적 기술을 포함하는 이들 변이체를 수득하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 한 가지 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함한다.
"상동성"이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 잔기 사이의 동질성 퍼센트(%)를 나타낸다. 하나의 잔기와 다른 잔기 유래의 서열 사이의 일치 정도는 해당 분야에서 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 배열하고 즉시 사용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 또는, 상동성은 상동성 영역 사이에 안정한 이중가닥(duplex)를 형성하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화시킨 후, 단일-사슬-특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고 소화된 단편의 크기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 모든 문법적인 형태 및 철자 변형에 있어서 "상동성"이란 용어는 수퍼패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼패밀리) 유래의 단백질 및 상이한 종(예를 들면, 미오신 경쇄 등) 유래의 상동성 단백질을 포함하는 "공통의 진화적 기원"을 갖고 있는 단백질들 간의 유연관계(relationship)를 나타낸다[참조: Reeck et al., Cell 50: 667(1987)]. 이러한 단백질들(및 이들의 코딩 유전자들)은 이들의 높은 서열 유사성 정도에 의해 반영된 바와 같이 서열 상동성이 있다. 그러나, 통상의 관행 및 본원에 있어서, "상동성" 이란 용어는 "고도"와 같은 부사어와 함께 한정될 때는 서열의 유사성을 의미하고 공통의 진화적인 기원을 의미하지 않을 수도 있다.
따라서, 모든 문법적인 형태에서 "서열 유사성"이란 용어는 공통의 진화적 기원을 갖거나 갖지 않을 수 있는 핵산 또는 단백질의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 일치 정도를 의미한다[참조: Reeck et al., Cell 50: 667(1987)]. 한 가지 양태에서, 2개의 DNA 서열은 적어도 약 50%(예를 들면, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 95%)의 뉴클레오티드가 정해진 길이의 DNA 서열에 걸쳐서 일치할 때 "실질적으로 상동성"이거나, 또는 "실질적으로 유사하다". 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 예를 들면, 특정한 시스템에 대해 정의되어 있는 엄격한 조건하에 서던 블롯(Southern blot) 실험으로 동정할 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 해당 분야의 기술 범위 이내이다[참조: Sambrook et al., 1989, supra].
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 발생하지만, 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 작용성 특성에는 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 생성 전사체의 작용성 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 본 발명은 특정한 예시적인 서열 이상을 포괄하는 것으로 이해된다. 제시된 변형 각각은, 코딩된 생성물의 생물학적 활성 유지의 결정과 같이, 해당 분야의 일상적인 기술 범위 이내이다.
더욱이, 당업자는 본 발명에 의해 포괄되는 실질적으로 유사한 서열은 또한 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS, 이어서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척)하에 본원에 예시된 서열과 혼성화할 수 있는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있음을 인지한다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 당해 DNA 서열이 본원에 기재된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 단편이다.
2개의 아미노산 서열은 약 40% 이상의 아미노산 서열이 동일하거나, 또는 60% 이상이 유사할 때(기능적으로 동일함) "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사하다". 바람직하게는, 상기 유사한 또는 상동성 서열은, 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램을 이용하여 배열함으로써 동정된다.
"대응하는"이란 용어는, 그 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 상이한, 유사하거나 상동성인 서열을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열의 배열은 스페이스(space)를 포함할 수도 있다. 따라서, "대응하는"이란 용어는 서열의 유사성을 의미하며, 아미노산 잔기 또
는 뉴클레오티드 염기의 수를 의미하는 것은 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분(substantial portion)"은, 당업자가 수동으로 서열을 평가하거나, 또는 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215: 403(1993); www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 이용가능함)와 같은 알고리즘을 이용한 동정에 의해 상기 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 동정하기 위하여 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 충분히 포함한다. 일반적으로, 공지된 단백질 또는 유전자에 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 동정하기 위해서는 10개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 서열 또는 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 20 내지 30개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열-의존성 유전자 동정(예를 들면, 서던 혼성화법) 및 분리(예를 들면, 박테리아 콜로니(colony) 또는 박테리오파지 플라크(plaque)의 인 시투(in situ) 혼성화법)에 사용될 수 있다. 또한, 12 내지 15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정한 핵산 단편을 수득하기 위한 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 상기 서열을 포함하는 핵산 단편을 구체적으로 동정 및/또는 분리하기 위한 서열을 충분히 포함한다.
"퍼센트 동일성(percent identity)"라는 용어는, 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 당해 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 상관관계이다. 종래 기술에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서 일련의 서열 사이의 일치에 의해 결정되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 연관성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기에 개시된 공지된 방법에 의해 즉시 계산될 수 있다[참조: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G. eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최적의 일치를 제공하기 위해 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 정리되어 있다. 서열의 배열 및 퍼센트 동일성의 계산은 LASERGENE 생명정보학 컴퓨팅 수트(suite)의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 서열의 다중 배열은 디폴트 파라미터(default parameter)(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)로 상기 클러스트 배열 방법(Higgins et al., CABIOS. 5:151(1989))을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 클러스트 방법을 이용한 페어와이즈(pairwise) 배열의 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5로 선택될 수 있다.
"서열 분석 소프트웨어"라는 용어는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 의미한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, GCG 수트 프로그램(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX [참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403(1990)] 및 DNASTAR [참조: DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA]를 포함한다. 본 발명의 문맥 내에서, 서열 분석 프로그램이 분석을 위해 사용될 때, 그 분석 결과는, 달리 특정하지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "디폴트 값"은 처음 시작할 때 당해 소프트웨어에 원래 부여된 임의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
DNA의 서열과 관련된 "화학적으로 합성된"은 당해 성분 뉴클레오티드가 시험관내에서 조립됨을 의미한다. DNA의 수동 화학적 합성은 잘 확립된 공정을 사용하여 달성할 수 있거나, 자동화 화학적 합성은 상업적으로 시판되는 다수의 기계 중의 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스를 반영하기 위해 뉴클레오티드 서열의 최적화에 근거한 최적 유전자 발현을 위해 맞춰질 수 있다. 당업자는, 코돈 사용이 숙주에게 호의적인 이들 코돈을 향해 바이어스되는 경우에 성공적인 유전자 발현이 가능함을 인지한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 입수할 수 있는 숙주 세포 유래의 유전자 검사를 기반으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 개개 작동성 유전자 조절 시스템은, (a) 선택된 농도에서 이의 각 리간드에 의해 주어진 시스템 각각의 조절이 당해 시스템의 유전자 발현의 정도에 있어서 측정가능한 변화를 발생시키고, (b) 당해 변화가, 실제 조절의 조절의 동시성 또는 연속성과 관련없이, 세포, 조직 또는 생물체에서 동시에 작동하는 모든 다른 시스템의 발현시의 변화보다 통계학적으로 유의한 차이가 있는 경우에 "직교"인 것으로 언급된다. 바람직하게는, 각각 개별적으로 작동성 유전자 조절 시스템의 조절은 세포, 조직 또는 생물체에서 유전자 발현을 모든 다른 작동성 시스템보다 적어도 2배, 예를 들면, 적어도 5배, 10배, 100배 또는 500배 더 변화시킨다. 실제로, 선택된 농도에서 이의 각 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절은 당해 시스템의 유전자의 변현 정도에 있어서 측정가능한 변화를 발생시키고, 세포, 조직 또는 생물체에서 작동성인 모든 다른 시스템에서는 측정가능한 변화가 없다. 이러한 경우, 다중 유도가능한 유전자 조절 시스템은 "완전 직교"인 것으로 언급된다. 유용한 직교 리간드 및 직교 수용체 기반 유전자 발현 시스템은 미국 공개특허 제US 2002/0110861 A호에 기재되어 있다.
"외인성 유전자"라는 용어는 피검자에 대해 이질성 유전자, 즉 형질전환 공정을 통해 피검자 내로 도입된 유전자, 내인성 돌연변이된 유전자의 비돌연변이 이형 또는 내인성 비돌연변이 유전자의 돌연변이 이형을 의미한다. 형질전환 방법은 본 발명에서 중요하지 않으며, 당업자에게 공지된 대상에 적합한 임의의 방법일 수 있다. 외인성 유전자는, 역전사 효소에 의한 것과 같이 DNA 중간체를 통해 작동할 수 있는 DNA 또는 RNA 형태로 피검자 내로 도입된 자연 또는 합성 유전자일 수 있다. 이러한 유전자는 표적 세포에 도입될 수 있고, 피검자 내로 직접 도입될 수 있거나, 형질전환된 세포를 피검자 내로 전달함으로써 간접적으로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 "치료학적 생성물"이라는 용어는 그러한 생성물이 발현되는 숙주 세포에 유리한 기능을 부여하는 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 치료학적 폴리펩티드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 3개 아미노산 길이와 같이 작은 펩티드, 단일- 또는 다중쇄 단백질 및 융합 단백질을 포함할 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소정 간접 RNA, 리보자임 및 RNA 외부 가이드 서열을 포함할 수 있다. 치료학적 생성물은 자연발생 서열, 합성 서열 또는 자연발생 서열과 합성 서열의 조합물을 포함할 수 있다.
"엑디손 수용체 복합체"라는 용어는 일반적으로 핵 수용체 부류의 적어도 2개 구성원, 즉 엑디손 수용체("EcR") 및 울트라스피라클("USP") 단백질을 갖는 이형이합체 단백질 복합체를 의미한다[참조: Yao et al, Nature 366:476 (1993); Yao et al, Cell 77:63 (1992)]. 기능적 EcR 복합체는 또한 추가의 단백질(들), 예를 들면, 이뮤노필린(immunophilin)을 포함할 수 있다. 전사 인자로서 공지된 핵 수용체 부류의 추가의 구성원(예; DHR38, betaFTZ-1 또는 곤충 동족체)는 EcR 및/또는 USP에 대한 리간드-의존성 또는 독립성 파트너일 수 있다. EcR 복합체는 또한 EcR 단백질의 이형이합체 및 울트라스피라클 단백질의 척추 동족체, 레틴산-X-수용체("RXR") 단백질 또는 USP 및 RXR의 키메라일 수 있다. EcR 복합체라는 용어는 또한 EcR 단백질 또는 USP의 동형이합체 복합체를 포함한다.
EcR 복합체는, EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지는 않는, 복합체 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비스테로이드 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, EcD 복합체 기반 유전자 스위치에 적용된 "리간드"라는 용어는 유전자 스위치를 활성화시켜 코딩된 폴리펩티드의 발현을 자극하는 능력을 갖는 소형 및 가용성 분자를 나타낸다. 리단드의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 엑디스테로이드(예: 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A 등), 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 동족체, N,N'-디아실하이드라진, 예를 들면, 미국 특허 제6,013,836호; 제5,117,057호; 제5,530,028호; 및 제5,378,726호 및 미국 공개특허출원 제2005/0209283호 및 제2006/0020146호에 기재된 것들; 미국 공개특허출원 제2004/0171651호에 기재된 옥사디아졸린; 유럽 특허출원 제461,809호에 기재된 것과 같은 디벤조일아킬 시아노하이드라진; 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것과 같은 N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진; 유럽 특허출원 제234,994호에 개시된 것과 같은 N-아실-N-알킬카보닐하이드라진; 미국 특허 제4,985,461호에 기재된 것과 같은 N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진; 미국 공개특허출원 제2004/0049037호에 기재된 것과 같은 아미도케톤; 및 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하파자이드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유충 호르몬 III 등을 포함하는 다른 유사한 물질을 포함한다. 본 발명에 유용한 디아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819 (3,5-디메틸-벤조산 N-(l-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), RG-115932 ((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG-115830 (3,5-디메틸-벤조산 N-(l-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)를 포함한다. [본 발명의 실시에 유용한 추가적인 디아실하이드라진에 ㄷ대해서는 2008년 5월 29일에 출원된 미국 특허출원 제12/155,111호 및 2008년 5월 29일에 출원된 PCT 특허출원 제PCT/US2008/006757호를 참조할 것].
EcR 복합체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하고, 여기서 모든 구성원은 아미노산-말단 전사활성화 도메인("TA"), DNA 결합 단백질("DBD"), 및 힌지 영역에 의해 분리되는 리간드 결합 도메인("LBD")를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 아단위의 존재를 특징으로 한다. 상기 패밀리의 일부 구성원은 또한 LBD의 카복시 말단측 위에 또 다른 전사활성화 도메인을 가질 수 있다. DBD는 2개의 아미노산 모티프, 즉 P-박스 및 D-박스 사이에 2개의 시스테인 아연 핑거의 존재를 특징으로 하고, 이들은 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 제공한다. 이들 도메인은 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 자연형, 변형 또는 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소 및 EcR 복합체를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포(예: 대장균, 바실루스 서브틸리스) 또는 기타 장내 세균, 또는 진핵 세포(예: 식물 또는 동물 세포) 내로 도입될 수 있다. 그러나, 당해 유전자에 의해 발현된 단백질의 다수는 세균에서 부정확하게 처리되기 때문에, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체의 형태로 존재할 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소 및 수용체 복합체의 뉴클레오티드 서열은 또한 RNA 분자로서 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스 등의 작용성 바이러스 RNA 형태로 도입될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추 세포가 바람직한데, 이는 EcR를 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 제공하는 분자를 자연적으로 결여하고 있기 때문이다. 결과적으로, 이들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 비감수성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포 또는 전체 생물체에 대하여 무시가능한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 세포는 성장하고, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는 목적하는 생성물을 발현할 수 있다.
EcR 리간드는, 외인성 유전자(예: IL-12)에 연결된 반응 요소에 또한 결합되는 EcR 복합체와 함께 사용되는 경우, 외인성 유전자의 발현을 외부적으로 일시 조절하는 수단을 제공한다. 다양한 성분들이 서로 결합하는 순서, 즉 리간드가 수용체 복합체에 결합하고 수용체 복합체가 반응 요소에 결합하는 순서는 중요하지 않다. 통상적으로, 외인성 유전자의 발현의 조절은 EcR 복합체, 특이적 제어 또는 조절된 DNA 요소의 결합에 대한 반응이다. 핵 수용체 부류의 다른 구성원과 같이 EcR 단백질은 적어도 3개의 도메인, 전사활성 도메인, DNA 결합 도메인, 및 리간드 결합 도메인을 보유한다. 이들 수용체는, 핵 수용체 부류의 서브세트와 같이, 이형이합체화 특성에 관여하는 확실히 정의되지 않은 영역을 보유한다. EcR 단백질의 리간드 결합 도메인에 대한 당해 리간드의 결합은, USP 또는 RXR 단백질과의 이형이합체화 후, 이형이합체화 단백질의 DNA 결합 도메인이 활성화 형태에 있는 반응 요소에 결합할 수 있게 하고, 이에 의해 외인성 유전자를 발현 또는 억제시킨다. 이러한 메카니즘은 EcR 또는 USP에 대한 리간드 결합의 가능성 및 활성 동형이합체 복합체(예: EcR+EcR 또는 USP+USP)의 생성 정보를 배제하는 것이 아니다. 한 가지 양태에서, 키메라 유전자 스위치를 생성하는 하나 이상의 수용체 도메인은 달라질 수 있다. 통상적으로, 3개 도메인 중의 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과는 상이한 공급원으로부터 선택되어 키메라 수용체가 전사활성화, 리간드의 상보적 결합 및 특이적 반응 요소의 인식을 위해 선택된 숙주 세포 또는 생물체에서 최적화된다. 또한, 반응 요소 자체는, 효모로부터의 GAL-4[참조: Sadowski et al, Nature 555:563 (1988)] 또는 대장균으로부터의 LexA 단백질[참조: Brent et al, Cell 43:729 (1985)]과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 변형 또는 치환되어 키메라 EcR 복합체를 수용할 수 있다. 키메라 시스템의 또 다른 잇점은 이들이 목적하는 최종 결과에 따라 외인성 유전자의 유도에 사용된 프로모터의 선택을 가능하게 한다는 점이다. 이러한 이중 조절은 유전자 치료 분야에서, 특히 세포독성 단백질이 생성되는 경우에 특히 중요한데, 이는 발현이 발생하는 세포 뿐만 아니라 발현 타이밍 둘 다가 조절될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자가 피검자의 세포 내로 도입되는 경우, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드의 존재에 의해 조절된다. 프로모터는 구성적으로 또는 유도가능하게 조절될 수 있거나, 조직 특이적(즉, 특정한 세포 타입에서만 발현됨) 또는 생물체의 특정한 발달 단계에 특이적일 수 있다.
다양한 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 게놈 및 cDNA 핵산 서열, 예를 들면, 전사 인자 및 리포터 유전자는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 당업자는 실질적으로 모든 공지된 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 접근하고, 공공 수탁기관, 즉 당해 서열을 공개한 단체로부터 직접 핵산 분자를 입수하거나, 통상의 방법을 사용하여 당해 분자를 제조할 수 있다. 상기 서열 등록 번호에 대한 기술에 대해서는 상기 문헌 참조.
유전자 스위치는 특수 리간드의 첨가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 특정의 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 하나의 양태에서, 유전자 스위치는, 유전자 발현 수준이 존재하는 리간드의 수준에 의존적인 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있는 리간드-의존적인 전사 인자의 예는 이들 각각의 리간드(예를 들면, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손 및 이의 유사체 및 모사체)에 의해 활성화된 다수의 핵 수용체 상과 및 테트라사이클린에 의해 활성화된 rTTA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 측면에서, 유전자 스위치는 EcR-계 유전자 스위치이다. 이러한 시스템의 에는 미국 특허 제6,258,603호, 제7,045,315호, 미국 특허 공개공보 제2006/0014711호, 제2007/0161086호 및 국제 공개공보 제WO 01/70816호에 기술된 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 키메라 탈피호르몬 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 특허 공개공보 제2002/0110861호, 제2004/0033600호, 제2004/0096942호, 제2005/0266457호 및 제2006/0100416호, 및 국제 공개공보 제WO 01/70816호, 제WO 02/066612호, 제WO 02/066613호, 제WO 02/066614호, 제WO 02/066615호, 제WO 02/29075호, 및 제WO 2005/108617호에 기술되어 있다. 비-스테로이드성 탈피호르몬 효능제-조절된 시스템의 예는 RheoSwitch® 포유동물 유도성 발현 시스템(제조원: New England Biolabs, 미국 메사츄세츠주 입스위치 소재)이다.
하나의 양태에서, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 조절하에 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 단일의 전사 인자 효소를 포함한다. 전사 인자 서열은 천연적으로 존재하거나 인공 전사 인자인 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화할 수 있다. 인공 전사 인자는, 전사 인자의 천연 서열이 예를 들면, 서열의 돌연변이 또는 상이한 전사 인자로부터의 도메인의 조합에 의해 변경되어진 것이다. 하나의 양태에서, 전사 인자는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인(LBD)을 포함한다. 하나의 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 EcR, 편재하는 수용체, 오르판 수용체 1, NER-1, 단백질과 같은 스테로이드 호르몬 수용체, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 또는 파르네솔 수용체로부터 기원한다. 다른 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 탈피호르몬 수용체로부터 기원한다.
EcR 및 기타 그룹 H 핵 수용체들은 다수의 핵 수용체 상과이며, 여기서, 모든 구성원들은 일반적으로 아미노-말단 전사활성(transactivation) 도메인(TD), DNA 결합 도메인(DBD), 및 DBD로부터 힌지 영역에 의해 분리된 LBD이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "DNA 결합 도메인"은, DNA 결합 도메인이 특수 반응 요소과 연합하기 위해 작용하는 한, DNA 결합 단백질의 전체 길이까지 DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 다수의 핵 수용체 상과는 또한 4개 또는 5개의 도메인의 존재에 의해 특성화된다: A/B, C, D, E, 및 일부 경우에 F[참조: 미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889 (1988)]. "A/B" 도메인은 전사활성 도메인에 상응하며, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하고, "D"는 힌지 영역에 상응하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 당해 계열의 일부 구성원은 또한 "F"에 상응하는 LBD의 카복시-말단 부위에서 다른 전사활성 도메인을 가질 수 있다.
DBD는 반응 요소들에 대해 특이성을 부여하는, 2개의 아미노산 모티프인, P-박스 및 D-박스사이에 2개의 시스테인 아연 핑거들의 존재로 특징화된다. 이들 도메인은 이종 수용체 단백질의 상이한 도메인의 천연의 것, 변형된 것 또는 키메라일 수 있다. 핵 수용체 게열의 아세트와 같은 EcR은 또한 이종이량체화 특성에 관여하는 거의 정의되지 않은 영역을 지닌다. 핵 수용체의 도메인이 천연적으로 모듈식이므로, LBD, DBD 및 TD를 상호교환할 수 있다.
다른 양태에서, 전사 인자는 TD, 발현이 조절되어야 하는 외인성 유전자와 연합된 반응 요소을 인지하는 DBD; 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 특정 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
다른 양태에서, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하에 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열에 의해 암호화된 단백질을 상호작용하여 리간드-의존적 전사 인자, 예를 들면, "이중 스위치"- 또는 "2개-하이브리드"-계 유전자 스위치로서 작용하는 단백질 복합체를 형성한다.
유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 하나의 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열에 의해 암호화된 단백질을 상호작용하여 리간드-의존적인 전사 인자, 예를 들면, "단일 유전자 스위치"로서 작용하는 단백질 복합체를 형성한다. 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열은 내부 리보솜 도입 부위, 예를 들면, EMCV IRES에 의해 연결될 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 TD, 발현이 조절되어야 하는 외인성 유전자와 연합된 반응 요소을 인지하는 DBD; 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하며, 제2 전사 인자 서열은 척추동물 RXR LBD, 비척추동물 RXR LBD, 초기문(ultraspiracle) 단백질 LBD, 및 2개의 폴리펩타이드 단편을 포함하는 키메라 LBD(여기서, 제1 폴리펩타이드 단편은 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 또는 초기문 단백질 LBD로부터 기원한다) 중에서 선택된 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 암호화한다.
다른 양태에서, 유전자 스위치는 핵 수용체 LBD 및 발현이 조절되어야 하는 외인성 유전자와 연합된 반응 요소을 인지하는 핵 수용체 DBD를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 전사 인자 서열, 및 TD 및 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 핵 수용체 LBD 중 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 바람직한 양태에서, 제1 폴리펩타이드는 실질적으로 TD를 함유하지 않으며 제2 폴리펩타이드는 실질적으로 DBD를 함유하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "실질적으로 함유하지 않는"은 문제의 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기 위해 문제의 도메인의 충분한 서열을 함유하지 않음을 의미한다.
본 발명의 다른 측면에서, 제1 전사 인자 서열은 이종이량체 파트너 및 TD를 포함하는 단백질을 암호화하며 제2 전사 인자는 DBD 및 LBD를 포함하는 단백질을 암호화한다.
단지 하나의 핵 수용체 LBD가 그룹 H LBD인 경우, 다른 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 함께 이량체를 형성하는 다른 어떠한 핵 수용체로부터 기원할 수 있다. 예를 들어, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD인 경우, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추동물 RXR, 비척추동물 RXR, 초기문 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 비척추동물 RXR, 및 USP 중에서 선택된 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩타이드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체일 수 있다(참조: 제WO 01/70816 A2호, 국제 특허출원 제PCT/US02/05235호 및 미국 특허출원 제2004/0096942 A1호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 또한 트렁케이션(truncation) 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 척추동물 RXR LBD는 사람 호모사피엔스, 마우스 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 랫트 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 돼지 수스 스크로파 도메스티카(Sus scrofa domestica), 개구리 제노푸스 래비스(Xenopus laevis), 제브라피쉬 다니오 레리오(zebrafish Danio rerio), 투니케이트 폴리안드로카르파 마사키엔시스(tunicate Polyandrocarpa misakiensis), 또는 젤리피쉬 트리페달리아 크리소포라(jellyfish Tripedalia cysophora) RXR로부터 기원한다.
하나의 양태에서, 비척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 로쿠스트 로쿠스타 미그라토리아 울트라스피라클(locust Locusta migratoria ultraspiracle) 폴리펩타이드("LmUSP"), 익소디드 진드기 암즐리옴마 아메리카눔(ixodid tick Amblyomma americanum) RXR 동족체 1("AmaRXRl"), 익소디드 진드기 아메리카늄 RXR 동족체 2 ("AmaRXR2"), 피들러 크랩 셀루카 푸길라터(fiddler crab Celuca pugilator) RXR 동족체("CpRXR"), 딱정벌리 테네브리오 몰리토르(beetle Tenebrio molitor) RXR 동족체("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라(honeybee Apis mellifera) RXR 동족체("AmRXR"), 아피스 미주스 페르시카에(aphid Myzus persicae) RXR 동족체로("MpRXR"), 또는 비-쌍시류/비-나비목 RXR 동족체로부터 기원한다.
하나의 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추동물 종 RXR 폴리펩타이드 단편, 비척추동물 종 RXR 폴리펩타이드 단편, 및 비-쌍시류/비-나비목 비척추동물 종 RXR 동족체 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2개의 상이한 종 RXR 폴리펩타이드 단편을 포함할 수 있거나, 종이 동일한 경우, 2개 이상의 폴리펩타이드 단편은 종 RXR 폴리펩타이드 단편 중 2개 이상의 상이한 동형으로부터 기원할 수 있다.
하나의 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩타이드 단편 및 하나의 비척추동물 종 RXR 폴리펩타이드 단편을 포함한다.
하나의 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩타이드 단편 및 하나의 비-쌍시류/비-나비목 비척추동물 종 RXR 동족체 폴리펩타이드 단편을 포함한다.
최종적으로 외인성 유전자에 연결된 반응 요소에 결합되는 핵 수용체(들)의 LBD와 조합되는 경우, 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부 일시적 조절을 제공한다. 본 발명의 각종 성분들이 서로 결합하는 결합 메카니즘 또는 순서, 즉, 예를 들면, LBD에 대한 리간드, 반응 요소에 대한 DBD, 프로모터에 대한 TD는 중요하지 않다.
특수 예에서, 그룹 H 핵 수용체의 LBD 및 이의 핵 수용체 LBD 파트너에 대한 리간드의 결합은 외인성 유전자의 발현을 가능하도록 한다. 이러한 메카니즘은 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 이의 파트너, 및 활성의 단독이량체 복합체(예를 들면, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)의 최종 형성에 대한 잠재력을 배제하지 않는다. 바람직하게, 하나 이상의 수용체 도메인은 하이브리드 유전자 스위치를 생성하면서 변한다. 통상적으로, 3개의 도메인, DBD, LBD, 및 TD 중 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과는 상이한 공급원으로부터 선택되어 하이브리드 유전자 및 수득되는 하이브리드 단백질이 전사활성 활성, 리간드의 상보적인 결합, 및 특수 반응 요소의 인지를 위한 선택된 숙주 세포 또는 유기체내에서 최적화된다. 또한, 반응 요소 자체는 효모로부터의 GAL-4 단백질[참조: Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)] 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 LexA 단백질[참조: Brent et al, Cell 43:129 (1985)], 또는 이러한 특수 상호작용을 위해 설계되고, 변형되며 선택된 단백질과 표적화된 상호작용에 대해 특이적인 합성 반응 요소[참조; 예를 들면, Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)]과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인에 대한 반응 요소으로 변형시키거나 치환시켜 하이브리드 수용체를 달성할 수 있다.
작용성 EcR 복합체는 또한 임뮤노필린과 같은 추가의 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자(예를 들면, DHR38 또는 베타FTZ-1)로서 공지된, 단백질의 핵 수용체 계열의 추가의 구성원들은 또한 EcR, USP, 및/또는 RXR에 대해 리간드 의존적이거나 독립적인 파트너일 수 있다. 또한, 공활성인자(또는 어댑터(adapter) 또는 매개인자로 명명됨)으로 일반적으로 공지된 단백질과 같은 다른 보조인자가 요구될 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열-특이적으로 결합하지 않으며 기본 전사에 관여되어 있지 않다. 이들은 활성인자의 DNA-결합의 자극을 포함하거나, 크로마틴 구조에 영향을 미치거나, 또는 활성인자-개시 복합체 상호작용을 매개함에 의한 각종 메카니즘을 통해 전사 활성화에 있어 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 보조활성인자의 예는 RIP 140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-I, TEF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIBl/RACS/pCIP 및 뒤섞인 보조인자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300[참조: Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)]를 포함한다. 또한, 일반적으로 보조억제인자(corepressor)로서 공지된 단백질 보조인자(또한 리프레서, 사일런서 또는 사일런싱 매개인자로서 공지됨)가 리간드의 부재하에 전사 활성화를 효과적으로 억제하는데 요구될 수 있다. 이들 보조억제인자는 리간드화되지 않은 EcR과 상호작용하여 반응 요소에서 활성을 무력화(silence)시킬 수 있다. 현재의 증거는, 리간드의 결합이 수용체의 구조를 변화시키며, 이것이 보조억제인자의 방출 및 상술한 보조활성인자의 보충을 초래함을 제안한다. 보조억제인자의 예는 N-CoR 및 SMRT[참조: Horwitz et al, Mol Endocrinol. 70:1167 (1996)]을 포함한다. 이들 보조인자들은 세포 또는 유기체내에서 내인성이거나 조절되거나 조절되지 않은 양식으로 발현된 트랜스겐(transgene)으로서 외인적으로 가해질 수 있다.
외인성 유전자는 유전자 스위치에 의해 암호화된 리간드-의존적인 전사 인자의 DBD에 의해 인지된 적어도 하나의 반응 요소을 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 하나의 양태에서, 프로모터는 반응 요소의 1, 2, 3, 4, 5,, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 카피를 포함한다. 목적한 반응 요소들을 포함하는 프로모터들은 당해 분야에 잘 공지된 기술, 예를 들면, 최소 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 반응 요소을 사용하여 생성된 인공 프로모터 또는 천연적으로 존재하는 프로모터일 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 세포내로 도입하기 위하여, 벡터를 사용할 수 있다. 당해 벡터는 예를 들면, 플라스미드 벡터 또는 일- 또는 이본쇄 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 세포내로 DNA 및 RNA를 도입시키기 위한 잘-공지된 기술에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 적격(replication competent)이거나 복제 결여일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 숙주 세포를 보완하는 경우에만 일어날 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지닌 본 발명의 세포를 의미하는데 사용된다.
따라서, 최소한, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하여야 한다. 벡터의 다른 성분들은 선택성 마커, 크로마틴 변형 도메인, 벡터상에 또한 존재할 수 있는 다른 폴리펩타이드의 발현을 구동하는 추가의 프로모터[예를 들면, 치사(lethal) 폴리펩타이드], 게놈성 통합 부위, 재조합 부위, 및 분자 삽입 피봇(pivot)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 벡터들은 목적한 치료학적 방법의 특수 목적으로 작제되도록 다수의 이들 추가의 성분들을 폴리뉴클레오티드 내부에 또는 외부에 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 세포내로 도입된 벡터는 또한 발현되는 경우 본 발명의 유전자 스위치 작제물이 숙주 세포의 게놈내로 통합되어 있음을 나타내는 "선택성 마커 유전자"를 포함한다. 이러한 방식으로, 선택인자 유전자는 게놈 통합을 위한 포지티브 마커일 수 있다. 본 발명의 방법에 중요하지는 않지만, 선택성 마커 유전자의 존재는, 숙련가가 벡터 작제물이 세포의 게놈내로 통합되는 경우 생 세포의 집단을 위해 선택하도록 한다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 벡터가 성공적으로 통합되는 세포를 선택함을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "선택하다" 또는 이의 변형은, 세포와 함께 사용되는 경우, 특수 유전자 제품 또는 표현형을 가진 세포를 선택하기 위한 표준의, 잘-공지된 방법을 의미하는 것으로 의도된다. 대표적인 방법은 G418, 네오마이신 및 암피실린과 같은 항생제의 존재하에서 세포를 배양함을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 선택성 마커 유전자의 다른 예는 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이드로마이신 또는 마이코페놀산에 내성을 부여하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 선택의 다른 방법은 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제의 선택제로서의 용도를 허용하는 선택성 마커 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이후 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 작제물을 포함하는 세포는 배양물 속에서 항생제에 견딜 수 있다. 유사하게, 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하지 않는 벡터 작제물을 포함하는 세포는 배양물 속에서 항생제를 견딜 수 없다.
본원에 사용된 것으로서, "크로마틴 변형 도메인"(CMD)은 DNA 인슐레이터(insulator)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 크로마틴 구조를 유지하고/하거나 변경하는 것과 관련된 각종 단백질과 상호작용하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다[참조: Ciavatta et al, Proc. Nat 1 Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006). CMD의 예는 닭 β-글로불린 인슐레이터 및 닭 고감도 부위 4(cHS4)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 유전자 프로그램(예를 들면, 프로모터, 암호화 서열 및 3' 조절 영역)사이의 상이한 CMD 서열의 사용은 예를 들면 존재하는 다수유전자(multigenic) 및 단일유전자(monogenic) 셔틀 벡터사이의 "스왑(swap)" 유전자 프로그램에 대한 각종 미생물 또는 시험관내 리컴바이너링 기술(recombineering technology)와 함께 "미니 상동성 암(mini homology arm)"과 같은 차등적인 CMD DNA 서열의 사용을 촉진시킬 수 있다. 크로마틴 변형 도메인의 다른 예는 당해 분야에 공지되어 있거나 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 특수 벡터는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 이러한 벡터는 발현시킬 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주내 발현에 효과적인 시스-작용 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스-작용 인자는 숙주에 의해 공급되거나, 보완 벡터에 의해 공급되거나 숙주내로 도입시 벡터 자체에 의해 공급된다.
매우 다양한 발현 벡터를 사용하여 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 에피소옴 및 바이러스-기원 벡터, 예를 들면, 세균 플라스미드로부터, 박테리오파지로부터, 효모 에피소옴으로부터, 효모 염색체 성분으로부터, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, SV40과 같은 파포바 바이러스, 박시니아 바이러스, 아데노바이러스, 포울 폭스 바이러스, 슈도라비스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 기원한 벡터, 및 플라스미드 및 코스미드 및 파지미드와 같은 박테리오파지 유전 성분으로부터 기원한 것들과 같은 이들의 조합으로부터 기원한 벡터를 포함한다. 일반적으로, 숙주내에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 유지하거나, 증식시키거나 발현하는데 적합한 어떠한 벡터도 이와 관련하여 발현에 사용할 수 있다.
발현 벡터내 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 프로모터를 포함하는 적절한 발현 조절 서열(들)에 작동적으로 연결되어 mRNA 전사를 지시할 수 있다. 대표적인 추가의 프로모터는 구성적 프로모터 및 조직 특이적인 또는 유도성 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구성적 진핵 프로모터의 예는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자[참조: Hamer et al, J. MoI. Appl. Gen. 1:273 (1982)]; 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터[참조: McKnight, Cell 37:355 (1982)]; SV40 얼리 프로모터[참조: Benoist et al., Nature 290:304 (1981)]; 및 박시니아 바이러스 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동시키는데 사용될 수 있는 프로모터의 추가의 예는 조직-특이적인 프로모터(간세포), 프로인슐린 프로모터(췌장 베타 세포) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 발현 작제물은 전사, 개시 및 종결용 부위, 및 전사된 영역내에 해독용 리보솜 결합 부위를 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 성숙한 전사체의 암호화 부분은 해독될 폴리펩타이드의 말단에 적절히 위치한 개시 및 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)에서 해독 개시 AUG를 포함할 수 있다.
또한, 작제물은 발현을 조절하고, 발생시키는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 이러한 영역은 다른 것들 중에서 제어인자 결합 부위 및 인핸서와 같이 전사를 조절함으로써 작동할 것이다.
진핵세포 벡터의 예는 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(Stratagene으로부터 입수 가능); pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Amersham Pharmacia Biotech로부터 입수 가능); 및 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, 및 pCMV-EGFP(Clontech로부터 입수 가능)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
유전자 프로그램의 성분의 신속한 삽입 및 제거를 위한 분자 삽입 피봇을 포함하는 특히 유용한 벡터는 미국 특허 공개공보 제2004/0185556호, 미국 특허원 제11/233,246호 및 국제 특허 공개공보 제WO 2005/040336호 및 제WO 2005/116231호에 기술되어 있다. 이러한 벡터의 예는 제WO 2007/038276호에 기술된 바와 같은, Ultra VectorTM Production System(제조원: Intrexon Corp., 미국 버지니아주 블랙스부르그 소재)이다. 본원에 기술된 것으로서, "유전자 프로그램"은 프로모터(P), 발현 서열(E) 및 3' 조절 서열(3)을 포함하는 유전 성분의 조합이므로, "PE3"는 유전자 프로그램이다. 유전자 프로그램내 성분들은 유전자 프로그램의 성분들 각각을 플랭킹하는 분자 피봇사이에 용이하게 스왑될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 분자 피봇은 선형 양식으로 배열된 적어도 2개의 비-가변성의 드믄 또는 일반적이지 않은 제한 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 정의된다. 하나의 양태에서, 분자 피봇은 선형 양식으로 배열된 적어도 3개의 비-가변성의 드믄 또는 일반적이지 않은 제한 부위를 포함한다. 통상적으로 어떠한 하나의 분자 피봇도 동일한 유전자 프로그램내에 어떠한 다른 분자 피봇의 드물거나 일반적이지 않은 제한 부위를 포함하지 않는다. 제공된 제한 효소가 작용시 6개보다 큰 뉴클레오타이드의 인지 서열은 "드믄" 제한 부위로 언급된다. 그러나, 통계적으로 예견되는 것보다 더욱 드물게 발생하는 6bp의 제한 부위, 및 이들 부위들 및 이들을 분해하는 엔도뉴클레아제는 "일반적이지않은" 제한 부위로 언급된다. 드물거나 일반적이지 않은 제한 효소의 예는 AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, AfIIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, FIp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, 및 Sse8781 I을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
벡터는 또한 호밍 엔도뉴클레아제(HE) 효소로 불리는 제한 효소의 제2 부류에 대한 제한 부위를 포함할 수 있다. HE 효소는 큰, 비대칭 제한 부위(12-40개 염기쌍)을 가지며, 이들의 제한 부위는 천연적으로 드물다. 예를 들어, I-SceI로서 공지된 HE는 랜덤 서여의 매 7 x 1010개 염기 쌍에서 단지 1회 발생하는 것으로 예측된 18bp 제한 부위(5' TAGGGATAACAGGGTAAT3'(서열 12))를 가진다. 이러한 발생율은 포유동물 게놈의 크기의 20배인 게놈에서의 단지 1개 부위와 동일하다. HE 부위의 드믄 특성은, HE 부위가 클로닝 벡터 플라스미드내 적절한 유전자자리에 포함되는 경우 유전자 프로그램의 통합성을 파괴하지 않고 유전자 프로그램을 절단할 수 있다.
숙주 세포내에서 발현을 위한 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 잘-공지된 과정이며, 벡터 작제 및 숙주내로의 도입, 및 숙주내에서 이의 발현을 위한 필수적인 기술은 당해 분야의 통상의 기술이다.
세포내로 폴리뉴클레오티드의 도입은 일시적인 형질감염, 안정한 형질감염일 수 있거나, 벡터의 유전자자리-특이적인 삽입일 수 있다. 숙주 세포내로 벡터의 일시적이고 안정한 형질감염은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 기타 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험 매뉴얼[참조: Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185: 527- 37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y]에 기술되어 있다. 이들 안정한 형질감염 방법은 세포의 게놈내로 벡터의 무작위 삽입을 초래한다. 또한, 벡터의 카피 수 및 배향은 일반적으로 말해서 무작위적이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 벡터는 게놈내 생-중성 부위내로 삽입된다. 생-중성 부위는, 폴리뉴클레오티드의 삽입이 경우에 따라 세포의 정상적인 작용과 함께 거의 방해하지 않는 게놈내 부위이다. 생-중성 부위는 유용한 생물정보학을 사용하여 분석할 수 있다. 많은 생-중성 부위는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들면, ROSA-동등 부위가 있다. 게놈성 삽입 부위(들)의 특성화는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 유전자자리를 조절하기 위하여, 벡터를 세포내로 도입할 때 폴리뉴클레오티드의 카피 수 및/또는 배향, 유전자자리-특이적인 삽입 방법을 사용할 수 있다. 유전자자리-특이적인 삽입의 방법은 당해 분야에 잘-공지되어 있으며 동종 재조합 및 리컴비나제-매개된 게놈 삽입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 물론, 유전자자리-특이적인 삽입 방법이 본 발명의 방법에서 사용되는 경우, 벡터는 동종 재조합과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 유전자자리-특이적인 삽입에서 도움을 주는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들면, ㅂ게터는 1, 2, 3, 4개 이상의 게놈 통합 부위(GIS)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "게놈 통합 부위"는, 뉴클레오타이드 서열이 동일하거나 게놈내 벡터의 삽입을 허용하는 세포내 게놈의 부위와 동일하거나 거의 동일한 벡터 서열의 부위로 정의된다. 특히, 벡터는 적어도 폴리뉴클레오티드를 플랭킹하는 2개의 게놈 삽입 부위를 포함할 수 있다. 물론, GIS는 플랭크 추가 성분, 또는 심지어 벡터상에 존재하는 모든 성분을 플랭킹할 수 있다.
다른 양태에서, 유전자자리-특이적인 삽입은 리컴비나제-부위 특이적인 유전자 삽입으로 수행할 수 있다. 요약하면, 예를 들면, PhiC31 인테그라제와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 세균 레컴비나제 효소는 사람 게놈내 "슈도(pseudo)" 재조합 부위상에서 작용할 수 있다. 이들 슈도 재조합 부위는 리컴비나제를 사용하여 유전자자리-특이적인 삽입에 대한 표적일 수 있다. 리컴비나제-부위 특이적인 유전자 삽입은 문헌[참조: Thyagarajan et al, Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001)]에 기술되어 있다. 리컴비나제 및 리컴비나제-부위 특이적인 유전자 삽입에 사용될 수 있는 이들의 각각의 부위의 다른 예들은 R4 및 TP901-1와 같은 세린 리컴비나제 및 제WO 2006/083253호에 기술된 리컴비나제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가의 양태에서, 벡터는 화학-내성 유전자, 예를 들면, 다중약물 내성 유전자 mdrl, 디하이드로 폴레이트 리덕타제, 또는 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 화학-내성 유전자는 구성적(예를 들면, CMV) 또는 유도성(예를 들면, RheoSwitch®) 프로모터의 조절하에 존재할 수 있다. 당해 양태에서, 대상체내에 변형된 세포를 유지하면서 대상체에서 질병을 치료하는 것이 바람직한 경우, 임상의는 질병이 든 세포를 파괴하기 위한 화학치료요법 제제를 적용하면서 변형된 세포를 적합한 화학-내성 유전자의 발현으로 제제로부터 보호하고 질병 또는 질환의 치료, 완화 또는 예방에 지속적으로 사용할 수 있다. 유도성 프로모터하에 화학-내성 유전자를 둠으로써, 화학-내성 유전자의 불필요한 발현을 피하면서, 여전히 지속된 치료가 요구되는 경우에 이용가능할 것이다. 변형된 세포 자체가 질병이 드는 경우, 이들은 여전히 하기 기술되는 바와 같은 치사 폴리펩타이드의 발현을 유도함으로써 파괴할 수 있다.
본 발명의 방법은 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 외인성 유전자를 대상체의 세포내로 도입함으로써 수행한다. 위에서 기술된 것들고 같은, 당해 분야에 공지된 세포내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 공지된 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 생체외에서 세포내로 도입되어야 하는 경우, 세포는 생체검사, 스크래핑 및 외과적 조직 제거를 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 어떠한 기술에 의해서도 대상체로부터 수득할 수 있다. 분리된 세포는, 폴리뉴클레오티드가 세포내로 도입되도록 하기에 충분한 시간, 예를 들면, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48시간 또는 그 이상 배양할 수 있다. 짧은 기간 동안 원시 세포를 배양하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 세포는 부착시키거나 또는 현탁액 속에서 플레이트(예를 들면, 미세웰 플레이트) 속에서 배양할 수 있다.
생체외 치료학적 방법을 위해, 세포를 대상체로부터 분리하여 폴리뉴클레오티드를 세포내로 도입하는데 적합한 조건하에 배양한다. 폴리뉴클레오티드가 세포내로 도입되면, 세포를 리간드-의존적인 전사 인자가 발현되도록 하기에 충분한 기간, 예를 들면, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 또는 24시간 이상 동안 배양한다. 폴리뉴클레오티드가 세포내로 도입된 후 싯점에서(또는 현저한 수준의 리간드-의존적인 전사 인자가 발현되기 전 또는 후), 세포를 대상체내로 역 도입한다. 재도입은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법, 예를 들면 조직 또는 강내로 정맥내 주입 또는 직접적인 주사로 수행할 수 있다. 하나의 양태에서, 세포내 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포를 대상체내로 역 도입하기 전에 측정된다. 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포가 선택되며(예를 들면, 폴리뉴클레오티드내 선택성 마커의 존재를 기준으로) 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포만이 대상체내로 재도입된다. 세포가 대상체내로 재도입된 후, 리간드가 대상체에 투여되어 치료학적 폴리펩타이드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 대안적인 양태에서, 리간드는, 심지어 세포가 대상체로 재도입되기 전에 세포내로 가해짐으로써 치료학적 폴리펩타이드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드가 세포의 재도입 전에 발현된다. 리간드는 특정의 적합한 방ㅂ버에 의해, 전신계적으로(예를 들면, 경구적으로, 정맥내로) 또는 국소적으로(예를 들면, 복강내로, 수막공간내, 심실내 또는 세포가 예를 들면, 종양내로 재도입되는 조직 또는 기간내로 직접 주사) 투여될 수 있다. 리간드 투여의 최적 타임밍은 세포 및 질병 또는 질환의 각각의 유형에 대해 단지 통상의 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 생체내 치료학적 방법은 대상체의 세포내로 폴리뉴클레오티드의 생체내 도입을 지시함을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 대상체내로 전신계적으로 또는 국소적으로(예를 들면, 질병 또는 질환의 부위에서) 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 대상체내로 도입되면, 리간드를 투여하여 치료학적 폴리펩타이드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있다. 리간드는 어떠한 적합한 방법에 의해서도, 전신계적으로(예를 들면, 경구적으로, 정맥내적으로) 또는 국소적으로(예를 들면, 봉각내적으로, 심실내적으로, 수막공간내적으로 또는 질병 또는 질환이 발생하는 조직 또는 기간내로 직접 주사, 예를 들면, 종양내적으로) 투여할 수 있다. 리간드 투여의 최적 타이밍은 세포 및 질병 또는 질환 각각의 유형에 대해 단지 통상의 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
생체내 사용을 위해, 본원에 기술된 리간드를 예를 들면, 용액, 현탁액, 정제, 캅셀제, 연고제, 엘릭서르제 및 주사가능한 조성물과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 속에 취할 수 있다. 약제학적 조성물은 리간드를 0.01 중량% 내지 99 중량% 함유할 수 있다. 조성물은 단일 또는 다수 투여형일 수 있다. 특정의 특수 약제학적 조성물내 리간드의 양은 유효 투여량, 즉, 목적한 유전자 발현 또는 제어를 유발하기에 요구되는 투여량에 의존할 것이다.
약제학적 제제를 투여하는 적합한 경로는 경구, 직장, 국소(피부, 볼내 및 설하 포함), 질내, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 심실내, 종양내 및 경막외 포함) 및 비-구강 튜브를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는, 바람직한 투여 경로가 치료되는 상태에 의존하며 수용체의 상태와 같은 인자들에 따라 변할 것임을 이해할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "rAD.RheoIL12"는 RheoSwitch® Therapeutic System (RTS)의 유전자 스위치의 조절하에 IL-12 유전자를 지닌 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 벡터를 말하며, 이는 활성화 리간드의 존재하에서 IL-12를 생산할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "IL-12p70"은 천연적으로 p40 및 p35로 일반적으로 언급된 2개의 소단위를 갖는 IL-12 단백질을 말한다. 용어 IL-12p70은 IL-12의 2개의 소단위(p40 및 p35)를 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서, 유합 단백질은 소단위사이의 링커 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "IL-12의 작용을 가진 단백질"은 사람 IL-12의 특정 생활성 중 적어도 20%(예를 들면, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%)를 가진 단백질을 말한다. IL-12의 생활성은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 제한없이, 천연의 T 세포의 Th1 세포로의 분화, T 세포의 성장 및 작용의 자극, 인터페론-감마(IFN-γ)의 생산, 및 T 및 천연 킬러(NK) 세포로부터의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), IFN-γ의 IL-4 매개된 제어의 감소, NK 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성의 증진, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2의 발현, 및 항-혈관형성 활성의 자극을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "IL-12의 작용을 갖는 단백질"은 야생형 IL-12 서열의 돌연변이체(여기서, 야생형 서열은 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 변경되어 있다), 및 IL-12의 생활성중 하나 이상을 모사하는 비-IL-12 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "rAd.cIL12"는 구성적 프로모터의 조절하에 IL-12 유전자를 함유하는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 조절 벡터를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "활성화하는" 또는 "활성화하다"는 목적 유전자(예를 들면, IL-12 단백질)의 발현을 초래하는, 유전자 스위치의 세포 활성에 있어서의 특정의 측정가능한 증가를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 질병을 "치료하는" 또는 "치료"는 프로토콜을 실행하는 것을 말하며, 이는 하나 이상의 약물 또는 시험관내 가공된 세포를 포유동물(사람 또는 비-사람)에게 질병의 신호 또는 증상을 완화시키기 위한 노력으로 투여함을 포함할 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 반드시 신호 또는 증상을 완전히 완화시키는 것으로 고려되지 않으며, 치료를 요구하지 않고, 상세하게는 대상체에서 단지 중요하지 않은 효과만을 갖는 프로토콜을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, "면역 세포"는 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 중성 킬러 세포 및 림프세포(예를 들면, B 및 T 세포)를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "수지상 세포" 및 "DC"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료요법 지지체 세포"(TSC)는 본 발명의 벡터로 변형(예를 들면, 형질감염)되어 면역조절인자의 작용을 갖는 하나 이상의 단백질 및 임의로, IL-12의 작용을 갖는 단백질을 종양 미세환경에 전달할 수 있는 세포이다. 이러한 TSC는 줄기 세포, 섬유모세포, 내피세포 및 각질세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "시험관내 가공된 수지상 세포" 또는 "시험관내 가공된 수지상 세포의 집단" 또는 "시험관내 가공된 DC" 또는 "IL-12를 발현하는 DC" 또는 "DC.RheoIL12"는 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는, 유전자 스위치의 조절하에 IL-12를 조건적으로 발현하는 수지상 세포를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "시험관내 가공된 TSC" 또는 "시험관내 가공된 TSC의 집단" 또는 "가공된 TSC의 집단" 또는 "면역조절인자를 발현하는 TSC" 또는 "IL-12를 발현하는 TSC"는 치료요법 지지체 세포, 예를 들면, 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는, 유전자 스위치의 조절하에 존재하는 경우와 같이 면역조절인자 및/또는 IL-12를 조건적으로 발현하는, 줄기 세포, 섬유모세포, 내피 세포 및 각질 세포를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "MOI" 또는 "감염 다중성"은 특수 환경하에 단일 세포를 감염시키는 아데노바이러스(예를 들면, 재조합 아데노바이러스 또는 조절 아데노바이러스)의 평균 수를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "종양"은, 전암 또는 암 세포 및/또는 조직에 상관없이, 생체내 또는 시험관내에서 모든 양성 또는 악성 세포 성장 및 증식을 말한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 예는 유방 암, 전립샘 암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원시 뇌 암종, 두부암, 아교종, 아교모세포종, 간암, 방광 암종, 난소암종, 비-소세포 폐암, 두부 또는 경부 암종, 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소-세포 폐 암종, 윌름즈 종양(Wilms' tumor), 자궁경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 결장 암종, 전립샘 암종, 비뇨생식 암종, 갑상샘 암종, 식도 암종, 흑색종, 다발 흑색종, 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 융모막암종, 균상식육종, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부 과다증식, 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프모구 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 과립세포 백혈병, 급성 과립세포 백혈병, 털세포 백혈병, 신경모세포종, 횡문근육종, 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증, 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non- Hodgkin's lymphoma), 연조직 육종, 골육종, 원발성 고분자글로불린혈증, 및 망막모세포종 등을 포함한다.
본 발명은 IL-12 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하기 위한 DC의 가공 및 암 또는 종양 또는 이들 둘다의 치료를 위한 치료학적 용도 및/또는 적용을 제공한다. IL-12의 작용을 갖는 단백질을 조건적으로 발현하는 시험관내 가공된 DC는 IL-12 단백질의 구성적 생산보다 안전성이 증진되어 있다. 또한, IL-12 발현 타이밍 및 수준을 조절하는 능력은 치료 효능의 개선된 조절을 제공한다. 따라서, 시험관내 가공된 DC는 사람 또는 비-사람 기관내 암 또는 종양의 치료를 위한 치료제로서 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 달리는, DC 또는 이의 소단위의 시험관내 가공된 집단은 사람 또는 비-사람 유기체의 체내에서 특수 부위(정상 조직, 암 또는 종양)으로 IL-12 단백질 생산을 조건적으로 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 가공된 수지 세포는 또한 IFN-알파를 조건적으로 발현할 수 있다. 이용된 수지상 세포는 자가 또는 비-자가 수지상 세포이다. 수지상 세포는 골수 또는 말초 혈액 순환으로부터 분리될 수 있다. 사람 환자에서, 수지상 세포 집단은 류코포레시스(leukophoresis) 과정으로 분리할 수 있으며, 여기서, 백혈구 세포 분획이 분리되어 제거되고 다른 혈액 성분은 환자에게 재-주입된다.
본 발명은 또한 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하기 위한 대식구, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포)와 같은 DC이외의 면역 세포의 가공 및 암 또는 종양 또는 이들 둘다의 치료를 위한 치료학적 용도 및/또는 적용을 제공한다. IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하는, DC 이외의 시험관내 가공된 면역 세포, 예를 들어, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포)는 IL-12 단백질의 구성적 생산보다 안전성이 개선되어 있다. 또한, IL-12 발현 타이밍 및 수준을 조절하기 위한 능력은 치료의 효능의 개선된 조절을 제공한다. 따라서, DC이외의 시험관내 가공된 면역 세포, 예를 들어, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포)는 사람 또는 비-사람 유기체에서 암 또는 종양의 치료를 위한 치료제로서 약제학적 조성물내로 제형화될 수 있다. 달리는, DC 이외의 면역 세포의 시험관내 가공된 집단, 예를 들어, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포) 또는 이의 소세트들은 IL-12 단백질 생산을 사람 또는 비-사람 유기체의 체내의 특수 부위(정상 조직, 암 또는 종양)로 조건적으로 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. DC 이외의 가공된 면역 세포, 예를 들어, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포)는 또한 INF-알파를 조건적으로 발현할 수 있다. 이용된 면역 세포는 자가 또는 비-자가 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 골수 또는 말초 혈액 순환으로부터 분리할 수 있다. 사람 환자에서, 면역 세포 집단은 류코포레시스를 통해 분리할 수 있으며, 여기서, 백혈구 세포 분획이 분리되어 제거되고 다른 혈액 성분들은 환자에게 재-주입된다.
다른 양태에서, 수지상 세포는 사람 조혈간세포를 IL-12의 작용을 갖는 단백질을 발현하고 수지상 세포로 제공하기 위해 형질감염된 간 세포를 분화시키는 본 발명의 벡터로 형질감염시켜 제조할 수 있다(참조: 미국 특허 제6,734,014호).
하나의 양태에서, 유전자 스위치를 함유하는 핵산 아데노바이러스 벡터(rAd.RheoIL12)[여기서, EMCV 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 서열에 의해 분리된 VP16-RXR 및 GaW-EcR에 대한 암호화 서열은 사람 우비퀴틴 C 프로모터의 조절하에 아데노바이러스 셔틀 벡터내로 삽입된다. IRES 서열에 의해 분리되고 합성의 유도성 프로모터의 조절하에 위치한 IL-12의 p40 및 p35 소단위에 대한 암호화 서열은 우비퀴틴 C 프로모터의 상부에 삽입된다.
다른 양태에서, 본 발명은 이. 콜라이 BJ5183 세포에서 아데노바이러스 골격(AdEasy1)으로 재조합된 유도성 IL-12 및 2개의 융합 단백질에 대한 전사 단위(VP16-RXR 및 Gal4-EcR)를 수반하는 셔틀 벡터를 제공한다. 재조합 클론을 확인하기 위해, rAd.RheoIL12 게놈을 수반하는 플라스미드를 성장시키고 XLlO-Gold 세포로부터 정제하고, 플라스미드 골격을 분해하고 HEK 293 세포내로 형질감염에 의해 패키징한다.
특수 양태에서, 수득되는 원시 바이러스 스톡을 HEK 293 세포의 재-감염에 의해 증폭시키고 CsCl 밀도-구배 원심분리로 정제한다.
하나의 양태에서, IL-12 유전자는 야생형 IL-12 유전자 서열이다. 다른 양태에서, IL-12 유전자는 변형된 유전자 서열, 예를 들면, 바람직한 코돈을 사용하기 위해 변형된 서열 또는 키메라 서열이다.
하나의 양태에서, IL-12 유전자는 사람 야생형 IL-12 서열이다. 다른 양태에서, 서열은 야생형 사람 IL-12 서열과 적어도 85%, 예를 들면, 야생형 사람 IL-12와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 양태에서, IL-12 유전자 서열은 사람 IL-12 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 양태에서, 유전자는 야생형 사람 IL-12에 대해 적어도 85%, 예를 들면, 야생형 사람 IL-12에 대해 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다.
하나의 양태에서, IL-12 유전자는 야생형 마우스 IL-12 서열이다. 다른 양태에서, 서열은 야생형 마우스 IL-12에 대해 적어도 85%, 예를 들면, 야생형 마우스 IL-12와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 양태에서, IL-12 유전자 서열은 마우스 IL-12 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 양태에서, 유전자는 야생형 마우스 IL-12에 대해 적어도 85%, 예를 들면, 야생형 마우스 IL-12에 대해 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하는 시험관내 가공된 DC의 집단을 생산하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 (a) DC의 적어도 일부, 예를 들면, 골수 기원한 DC내로 IL-12 작용을 가진 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 스위치를 지닌 벡터를 도입시킴으로써 질병을 치료하거나 예방할 수 있는 시험관내 가공된 DC의 집단을 생산함으로써 DC의 적어도 일부를 변형시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하는 DC 이외의 시험관내 가공된 면역 세포, 예를 들면, 대식구, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포) 또는 TSC의 집단을 생산하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 (a) DC 또는 TSC이외의 면역 세포내로 IL-12의 작용을 가진 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 스위치를 지닌 벡터를 도입시킴으로써 질병을 치료하거나 예방할 수 있는 DC 또는 TSC이외의 시험관내 가공된 면역 세포의 집단을 생산함으로써 DC 또는 TSC 이외의 면역 세포의 적어도 일부를 변형시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 DC, DC 또는 TSC 이외의 면역 세포의 분리 및 축적을 포함한다. DC는 사람, 마우스 또는 기타 포유동물로부터의 골수로부터 분리할 수 있다. 수지상 세포는 사람, 마우스 또는 기타 포유동물의 혈액으로부터 분리할 수 있다. 사람 환자에서, 수지상 세포 집단은 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 류코포레시스 과정을 통해 분리될 수 있으며, 여기서, 백혈구 세포 분획이 분리되어 제거되고 다른 혈액 성분이 환자로 재-주입된다. 하나의 양태에서, DC는 앞서 기술한 바와 같이 쥐 골수로부터 기원한다(참조: Tatsumi et al, 2003). 요약하면, 야생형 또는 EGFP Tg 마우스 골수(BM)를 1000 단위/ml의 재조합 쥐 과립구/대식구 콜로니-자극 인자 및 재조합 mIL-4(제조원: Peprotech, 미국 뉴저지주 록키 힐 소재)이 보충된 조건화된 배지(CM) 속에서 37℃로 습도가 조절된, 5% CO2 항온배양기 속에서 7일 동안 배양한다. 이후에, CD11c+ DC를 예를 들면, 특수한 MACSTM 비드를 사용하여 제조업자의 지시(제조원: Miltenyi Biotec, 미국 캘리포니아주 아우부른 소재)에 따라 분리한다. 당해 방식으로 생산된 CD11c+ DC는 CD11b, CD40, CD80, 및 제I 및 제II 부류의 MHC 항원의 형태 및 공-발현을 기준으로 >95% 순수하였다.
본 발명의 하나의 양태는 사람 또는 비-사람 유기체내 유전자 치료요법으로서 암 또는 종양, 또는 이들 둘다의 치료를 위한 치료학적 적용에 적합한 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하는 가공된 DC를 제공한다. 본 발명의 하나의 양태는 사람 또는 비-사람 유기체내에서 유전자 치료요법으로서 암 또는 종양 또는 이들 둘다의 치료를 위한 치료학적 적용에 적합한 IFN-알파의 작용을 가진 단백질 및/또는 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하는 가공된 DC를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 함유하는 가공된 DC를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 디아실하이드라진 리간드를 투여함을 포함하여 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 RG-115830 또는 RG-115932를 투여함을 포함하여 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 활성화시키는 리간드를 포함하고 유전자 스위치를 함유하도록 가공된 수지상 세포를 포함하는 키트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 RG-115830 또는 RG-115932를 함유하는 조성물을 포함하고 유전자 스위치를 함유하도록 가공된 수지상 세포를 포함하는 키트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 탈피 호르몬 수용체의 적어도 일부를 함유하는 TSC를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 탈피호르몬 수용체-계 유전자 스위치를 함유하는 TSC를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 RheoSwitch를 함유하는 TSC를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 유전자 스위치를 함유하는 TSC 및 유전자 스위치를 조절하는 리간드를 포함하는 키트를 제공한다. 다른 양태에서, 키트는 또한 디아실하이드라진 리간드를 포함한다. 다른 양태에서, 키트는 또한 RG-115830 또는 RG-115932를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 DC의 가공된 집단을 제공한다. 7일 배양된 DC을 처리하지 않고, 구성적(rAd.cIL12) 또는 유도성(rAd.RheoIL12) 프로모터가 구동되지 않는 쥐 IL-12p70를 암호화하는 재조합 아데노바이러스로 또는 모의의, 대조군 아데노바이러스 벡터(rAdψ5)로 다중 감염도(MOI)의 범위로 형질감염시켰다. 48시간 후, 형질감염된 DC를 수거하고, 62.5 pg/ml의 낮은 검출 수준으로, 특이적인 키트(제조원: BD-PharMingen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하여 IL-12p70의 생산 및 표현형에 대해 분석하였다.
다른 양태에서, 본 발명은 벡터, 예를 들면 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현할 수 있는 유전자 스위치를 갖는 DNA 벡터를 포함하고 추가로 활성화 리간드를 포함하는, DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC의 시험관내 가공된 집단을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 IL-12의 작용을 가진 단백질 및/또는 IFN-알파의 작용을 가지는 단백질을 조건적으로 발현할 수 있는 유전자 스위치를 갖는 벡터를 포함하고 추가로 활성화 리간드를 포함하는 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC의 시험관내 가공된 집단을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC를 환자에게 투여한 후, RG-115919, RG-115830 또는 RG-115932와 같은 활성화 리간드를 환자에게 투여함으로써 암, 예를 들면, 흑색종 또는 아교종을 치료하는 방법을 제공한다. 환자는 암 환자 또는 동물일 수 있다. 치료 방법 및 생성물, 가공된 세포, 키트 및 리간드는 사람 치료요법 및 수의 동물 치료요법에 적용된다. 따라서, 생성물 및 방법은 사람 및 수의 동물 목적으로 사용되는 것으로 고려된다.
본 발명은, DC(DC.RheoIL12로서 언급), DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC에서 IL-12 단백질의 조건적 발현이 통상의 유전자 치료요법 구도를 사용한 치료학적 결과와 관련하여 해결할 수 없었던 종양 배출 림프절내 종양 병변내 조기 및 말기 IL-12의 면역학적 충격을 극복할 수 있음을 제공한다. 또한, 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC의 투여 후 IL-12의 발현 타이밍은 암의 성공적인 치료에 중요함이 발견되었다.
하나의 측면에서, 본 발명은 IL-12의 작용을 가진 단백질을 조건적으로 발현하거나 IL-12 및/또는 IFN-알파를 조건적으로 발현하는 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC의 집단을 포함하는 사람 또는 비-사람에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서, 제형은 종양내 투여로 투여하기에 적합하다. 본 발명은 또한 RG-115830 또는 RG-115932와 같은 활성화 리간드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물은 복강내, 경구 또는 피하 투여에 의해 투여하기 적합하다.
본원에 기술된 특수 양태에서, 본 발명은
a. 포유동물에서 위에서 기술한 시험관내 가공된 DC를 종양내 투여하는 단계; 및
b. 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계를 포함하여, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 본 발명은
a. 시험관내 가공된 DC를 제공하는 단계;
b. 포유동물에서 상기 시험관내 가공된 DC를 종양내 투여하는 단계; 및
c. 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계를 당해 순서로 포함하는, 종양의 치료방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은
a. 포유동물에서 수지상 세포이외의 시험관내 가공된 면역 세포, 예를 들면, 대식구, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 천연 킬러 세포 및 림프구(예를 들면, B 및 T 세포) 또는 위에서 기술된 치료요법 지지 세포를 종양내 투여하는 단계; 및
b. 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계를 포함하여, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC는 1회 투여된다. 다른 양태에서, DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC는, 단일 투여가 안전하고 잘 견디는 것으로 입증되고 추가의 주사(들)이 환자에게 유익할 것으로 입증되는 경우 1회 이상 투여된다. 재치료 범위는, 대상체의 질병이 안전하거나 임상[예를 들면, CT 스캔(종양(들)의 소멸), 혈청 화학, 뇨분석, 혈액학, 생 신호(vital sign), 종양 직경에 있어서의 감소, 등) 또는 개선의 실질적인 신호(예를 들면, 개선된 ECOG 상태 등)을 나타내는 것이다. 재치료는 처음 치료 후 1, 2, 3, 또는 4주 째에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 째에, 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5년째에 개시할 수 있다.
다중 투여량의 트랜스겐(transgene)의 효능 및 안전성은 종양의 미세 침 호흡 생검에 의해 평가될 수 있으며 배출 림프절과 관련되어 있다. 이들은 hIL-12의 트랜스겐 발현 및 세포 면역 반응의 생체내 평가를 위한 재처리 기간의 -12 내지 -7일 및 14일째에 수집된다. 생검은 표준 광학 현미경 및 면역조직화학으로 평가하여 T 세포의 종양 및 배출 림프절내로의 침윤,을 추정할 수 있으며, RNA 상에서 RT-PCR을 적절히 설계된 프라이머로 사용할 수 있다. 혈액은 재처리 기간의 -12 내지 -7일, 8일 및 14일째에 혈청 사이토킨 프로파일을 위해 수거할 수 있다. 혈청 사이토킨 프로파일은, 다른 사이토킨의 발현이 hIL-12 트랜스겐을 사용한 치료에 영향을 받는지를 측정하기 위해 수득할 수 있다. 다중 사이토킨 시험은 루미넥스(Luminex)에 의해 IL-12, INF-감마, IP-10, 및 기타 Thl1/Th2 사이토킨(예: IL- 1, TNF-알파, IL-4, IL-5, 및 IL-10)에 대해 혈청 속에서 수행할 수 있다.
하나의 양태에서, 호라성화 리간드는 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC와 실질적으로 동시에, 예를 들면 세포의 투여 전 또는 투여 후 1시간 내에 투여한다. 다른 양태에서, 활성화 리간드는 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC의 투여 후 약 24시간 째 또는 미만에 투여된다. 여전히 다른 양태에서, 활성화 리간드는 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포, 또는 TSC 투여 후 약 48시간 째 또는 미만에 투여된다. 다른 양태에서, 리간드는 RG-115932이다. 다른 양태에서, 리간드는 약 1 내지 50 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 다른 양태에서, 리간드는 5 내지 28일의 기간동안 매일 투여된다. 다른 양태에서, 리간드는 14일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 양태에서, 약 1 x 106 내지 1 x 108 세포가 투여된다. 다른 양태에서, 약 5 x 107 세포가 투여된다.
효과적인 IL-12-매개된 유전자 치료요법을 입증하기 위하여, 종양내 주사 후 각종 싯점에서 DC.RheoIL12 세포에 의해 IL-12 생산을 작동하도록 하는 조건화된 IL- 12 cDNA 발현 시스템을 사용한다. C57BL/6 마우스내 응집성 B16 흑색종 모델에서의 결과를 바탕으로 하여, 다음 결론을 얻었다: 1) 상승된 수준의 IL-12가 DC.RheoIL12로부터 활성화 리간드 RG-115830의 존재하에서 분비되나 리간드의 부재하에서는 분비되지 않는다; 2) 종양내 DC.RheoIL12-계 치료요법은, RG-115830가 DC 주사 후 24시간 내 치료된 동물에게 투여하는 한 종양내 DC.cEL12-계 치료요법과 같이 효과적(이고 리간드 제공의 말기 싯점에서, RG-115830 치료요법은 실패한다)이다; 3) DC에서 IL-12 발현은 종양 미세환경내 이들 세포의 생존을 연장시키는 것으로 여겨지며 종양-배출 림프절로 이주하는 종양내-주사된 DC의 보다 많은 수와 관련되어 있다; 및 4) 치료요법 결과와 관련된 가장 강력한 면역은 치료요법에 의해 교차-프라이밍된 종양-특이적인 CD8+ T 세포의 수준이며 종양 미세환경내 존재하는 주사된 DC의 수가 아니다. 총괄적으로, 이들 데이타는, DC.IL12-계 치료요법이 제1형 CD8+ T 세포 효과기의 구심(교차-프라이밍)에 있어 이들의 포지티브 영향을 바탕으로 하여 성공되었으며 종양 미세환경내로 항-종양 T 세포의 주사된 DC-매개된 재순환과 같은 말기 원심성 현상에 의한 것이 아니라는 것을 제안한다.
종양내 주사 전에, 세포(면역 세포 또는 TSC)를 세포의 활성을 자극하는 인자와 함께 치료할 수 있다. 예를 들면, 세포를 OX40L, 4-1BBL, CD40, CD40L, GITRL, CD70, LIGHT 또는 ICOS-L을 포함하는 포지티브 공-자극인자 분자와 같은 공-자극인자 분자 또는 항-CTLA4, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체와 같은 네가티브 공-자극인자 분자와 함께 치료할 수 있다. 예를 들면, 세포(예를 들면, DC, 면역 세포 또는 TSC)는 하나 이상의 공-자극 분자를 발현하는 세포, 예를 들면, DC40 리간드 분자를 발현하는 J588 림프종 세포와 함께 배양할 수 있다. 다른 양태에서, 세포(면역 세포 또는 TSC)는 항-TGF-베타 항체(미세환경내 TGF 시그날링을 억제하기 위한), 항-IL1O 항체, TGF-베타 RII DN(유전자 변형된 세포내 TGF 시그날링을 억제하기 위한), IL-IOR DN, dnFADD(세포내 세포 사멸 경로를 억제하기 위한), 항-SOCS1 항체, siRNA 또는 유인물(decoy)(세포내 제어성 사이토킨 시그날링을 억제하기 위한), 또는 항-TGF-알파 항체와 같은 역 면역 제어 분자(내성 억제제)로 치료할 수 있다.
DC 및 기타 항원 표시 세포로부터 IL-12 생산은 CD4+ 및 CD8+ T 세포상에서 작용하여 이들을 각각 Th1 또는 Tc1 형 표현형내로 움직인다. 따라서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 Th1/Tc1형 사이토킨, IFN-γ의 활성 또는 발현의 수준을 측정함으로써 세포 집단에서 IL-12의 효과를 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 목적을 위해, 본 발명은
a. 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포 또는 TSC의 투여 전에 사람 환자로부터 수득된 제1 생물학적 샘플내 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정함으로써 대조군 수준을 생성시키는 단계;
b. 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포 또는 TSC를 상기 환자에게 종양내 투여하는 단계;
c. 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
d. 상기 활성화 리간드의 투여 후 싯점에서 상기 환자로부터 입수한 제2 생물학적 샘플에서 IFN-γ의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정함으로써 시험 수준에 대한 데이터를 생성시키는 단계; 및
e. IFN-γ의 대조군 수준을 IFN-γ의 시험 수준에 대해 비교하는 단계(여기서, 대조군 수준과 비교한 시험 수준에 있어서 IFN-γ의 발현 수준, 활성 수준 또는 이들 둘다의 수준에서의 증가를 나타내는 데이타는 상기 환자에서 효과적임을 나타낸다)를 포함하여, 암 환자에서 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포 또는 TSC-계 치료요법 섭생의 효능을 측정하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은
a. 시험관내 가공된 DC 이외의 면역 세포 또는 TSC의 투여 전에 사람 환자로부터 수득된 제1 생물학적 샘플내 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정함으로써 대조군 수준을 생성시키는 단계;
b. 시험관내 가공된 DC, DC 이외의 면역 세포 또는 TSC를 상기 환자에게 종양내 투여하는 단계;
c. 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
d. 상기 활성화 리간드의 투여 후 싯점에서 상기 환자로부터 입수한 제2 생물학적 샘플에서 IFN-γ의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘다를 측정함으로써 시험 수준에 대한 데이터를 생성시키는 단계; 및
e. IFN-γ의 대조군 수준을 IFN-γ의 시험 수준에 대해 비교하는 단계(여기서, 대조군 수준과 비교한 시험 수준에 있어서 IFN-γ의 발현 수준, 활성 수준 또는 이들 둘다의 수준에서의 증가를 나타내는 데이타는 상기 환자에서 효과적임을 나타낸다)를 포함하여, 암 환자에서 시험관내 가공된 DC 이외의 면역 세포 또는 TSC-계 치료요법 섭생의 효능을 측정하는 방법을 제공한다.
용어 "대상체"는 완전한 곤충, 식물 또는 동물을 의미한다. 리간드는, 대상체가 진균 또는 효모인 경우 동등하게 잘 작업할 것으로 예상된다. 용어 "대상체"는 진단, 예후 또는 치료요법이 요구되는 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물은 사람, 가축 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 예를 들면, 곰, 스포츠 동물, 개, 고양이, 기나아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 곰, 젖소와 같은 애완 동물; 영장류, 예를 들면, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 개과 동물, 예를 들면, 개 및 늑대; 고양이과 동물, 예를 들면, 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예를 들면, 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 예를 들면, 소, 돼지 및 양; 유제류, 예를 들면, 사슴 및 기린; 설치류, 예를 들면, 마우스, 랙스, 햄스터 및 기니아 피그; 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 양태에서, 동물은 사람 대상체이다.
용어 "동물"은 단일 "동물" 및 다수의 "동물"을 포함하는 것으로 의도되며, 포유동물 및 조류, 및 어류, 파충류 및 양서류를 포함한다. 용어 동물은 또한 모델 동물, 예를 들면, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 동물은 경제적으로 또는 기타, 예를 들면 경제적으로 중요한 목축, 경주 동물, 쇼 동물, 희귀 동물, 드물거나 또는 멸종 동물 또는 반려 동물을 포함한다. 특히 포유동물은 사람 대상체, 식용 동물 또는 반려 동물일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "이를 필요로 하는 포유동물"은 치료, 예를 들면, 종양의 크기를 감소시키거나 종양을 제거하는 것이 요구되는 동물을 말한다.
본 발명의 방법은 종양 환경으로부터 종양내 주사된 수지상 세포에 의한 종양 한원의 포획 및 종양-특이적인 T 세포 반응을 개발하기 위한 배출 림프절내 T 세포의 프라이밍에 의존한다. 따라서, DC는 최적의 치료학적 잇점을 위해 종양내 주사 시기에 높은 세포내이입 활성 상태이어야 한다. GM-CSF 및 IL-4를 약 6 내지 7일 동안 처리함으로써 CD 14+ 단핵구로부터 제조된 미성숙 DC는 미성숙 표현형이며 높은 세포내이입율을 나타냄은 잘 확립되어 있다(참조: Cella et al. 1999; Gilboan, 2007). DC의 성숙은 세포내이입 활성의 제어와 관련된다. IL-12는 미성숙 DC 및 성숙 유도 인자의 발현 신호에서 작용하는 것으로 밝혀졌다(참조: Nagayama et al. 2000). 따라서, RTS를 사용함으로써, 이들이 종양내로 주입될 때까지 형질도입된 DC내 IL-12의 발현을 지연시킴으로써 사람 치료학적 결과를 최적화하는 것이 가능하다. 구성적 발현 시스템은 발현을 일시적으로 조절하기 위한 당해 능력을 결여하고 있으므로, 생산된 IL-12의 자가 작용 및 수득되는 성숙 결과는 조절될 수 없다(참조: Mazzolini et al. 2005). 또한, 사람 대상체에서 조절된 유전자 발현 시스템의 수행을 시험할 본 발명은 다른 사람 유전자 치료요법 영역내 시스템의 적용을 발견할 수 있다.
이론에 의해 구속되지 않지만, 본 발명은 임상 셋팅, 주요 연구 종점으로서 객관적인 임상 반응에 있어서의 포커싱(focusing), 및 제2 연구 종점으로서 교차-프라이밍된 항-종양 CD8+ T 세포(생산성 IFN-γ)에 있어서 종양내 투여된, 시험관내 가공된 DC-, DC- 이외의 면역 세포 또는 TSC-계 유전자 치료요법의 용도를 지지할 것으로 예측된다. 데이타는, IL-12 발현의 타이밍 및 수준이 리간드의 투여에 의해 조절될 수 있고, IL-12 발현의 타이밍이 당해 방법의 치료학적 효능에 중요한 것으로 예측된다는 점에서, 생체내 IL-12를 발현시키거나 발현시키지 않는 능력이치료에 대한 치료학적 조절 및 안전성 성분을 가함을 나타낸다.
본 발명은 또한 사람 질병의 효과적이고 효율적인 치료를 위한 획기적인 시도로서 조건적으로 발현된 목적 유전자를 사용한 시험관내 가공된 세포의 치료학적 적용을 지지한다.
본원 및 명세서에 인용된 어떠한 참조문헌의 제안 또는 어떠한 교시 사이에 충돌이 발생하는 경우, 본 발명의 목적을 위해 후자가 우선시된다.
본 발명의 방법에 따른 특수 양태가 이제 하기 실시예에 기술될 것이며, 당해 실시예는 예시할 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
도 1은 벡터 rAd.RheoIL12의 구조를 나타내며, 여기서, E1 및 E3 영역은 결실되어 있고 RheoSwitch® 치료학적 시스템(RTS)-IL-12 성분들은 E1 영역을 대체하고 있다. "IL12"을 표지한 박스는 IRES에 의해 분리된 IL-12p40 및 IL-12p35 암호화 서열을 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 가공된 DC가 RG-115830의 존재하에서 IL-12 단백질을 조건적으로 발현함을 나타낸다.
도 3a는 RG-115830이 B16 피하 종양이 7일째 확립된 C57B1/6 마우스내로 복강내 주사된 경우, DC 주사한지 24시간내에 종양 회복을 유발함을 나타낸다. 3b-3c: 종양 회복은, RG-115830을 1일 내지 5일째에 투여했던 경우 발생하였으나, DC-주사를 2일 또는 2일 또는 1 내지 3일에만 투여하는 경우에는 발생하지 않았다.
도 4는 DC 주사 후 24시간내에 화렁화 리간드의 복강내 주사 후 종양 및 종양이 제거된 림프절에서 연장된 생존을 나타내며, 48시간 및 72시간째에 각각 리간드에 의한 DC의 생존은 거의 없거나 없다.
도 5a는, 활성화 리간드가 가공된 DC 주사 후 24시간내에 제공되는 경우 항-B16 CD8+ T 세포의 강력한 말초 활성화를 촉진함을 나타낸다. 도 5b는, 흑색종이 이미 치유된 모든 마우스가 B16 종양 세포에 대해서는 특이적인 보호를 나타내지만 종양이 없는 동물을 관련 B16 흑색종 세포 또는 MC38 결장 암종 세포로 45일 째에 재챌린지(rechallenge)시키는 경우(초기 B16 챌린지 후) M38 결장 암종에 대해 특이적인 보호를 하지 않음을 나타낸다.
도 6은 복강내 또는 경구 경로로 리간드를 투여함에 의해 유도된 치료학적 잇점을 나타낸다.
도 7은 RTS의 조절하에 IL-12 및/또는 IFN-알파를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 유전자도입된 수지상 세포를 사용하여 마우스 신경아교종(GL261)에 종양내 주사한 결과로서 마우스 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meier)를 나타낸다. 당해 도에서 약어는 다음과 같다: Ad-IFNα는 IFN-알파를 구성적으로 발현하는 다데노바이러스 벡터이고; Ad-RTS-IFNα는 RTS의 조절하에 IFN-알파를 암호화하는 아데노바이러스 벡터이며; Ad-RTS-IFNα 리간드 부재는 RTS 및 IFN-알파를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 나타내며, 여기서, 활성화 리간드는 존재하지 않고; Ad-rFNa/IL-12는 IFN-알파 및 IL-12를 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 유전자도입된 DC에 상응하며; Ad-RTS-EFNa/IL-12는 RTS 조절하에 IFN-알파 및 IL-12를 암호화하는 2개의 아데노바이러스 벡터로 유전자도입된 DC에 상응한다.
도 8은 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hTL-12에 대한 맵을 나타낸다.
도 9는 상이한 MOI에서 및 바이러스 흡착 동안 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-mIL-12로 유전자도입된 사람 수지상 세포에 의한 IL-12 생산을 나타낸다. 상이한 MOI에서 및 상이한 바이러스 흡착 동안에 사람 DC의 아데노바이러스 유전자도입은 500의 MOI에서 3시간 바이러스 흡착에 의한 당해 세포의 효율적인 유전자도입을 나타내었다. 활성인자 약물("AD" 또는 "활성화 리간드")는 이들 유전자삽입도니 사람 수지상 세포에서 IL-12 발현을 유도하였다.
도 10은 상이한 IL-12-함유 아데노바이러스 벡터의 효과의 비교를 나타낸다. SP1-RheoIL-12 변이체는 가장 효과적인 레오스위치(Rheoswitch)-함유 변이체이다. Sp1-RheoIL-12는 oldRheoIL-12와는, 이것이 AdEasy-1 벡터 골격을 RAPAd 벡터 골격(제조원: ViraQuest)로 대체하고 있다는 점에서 상이하다. 유사하게, TTR-RheoIL-12는 oldRheoIL-12와는, 이것이 Gal14 결합 부위의 하부에 TTR 최소 프로모터를 함유하며 합성의 최소 프로모터 및 Sp1 결합 부위를 대체하고 있고, 벡터 골격이 RAPAd(제조원: ViraQuest)이라는 점에서 상이하다. 도 10에 나열한 바와 같이, Sp1-RheoIL-12는 oldRheoIL-12와 비교가능하며 B16 흑색종 종양 크기를 감소시키는데 있어서 TTR-RheoIL-12보다 더 효과적이다.
도 11은 재조합 아데노바이러스 레오스위치 유도성 IL-12를 함유하는 수상 체로로 이미 처리한 마우스의 재챌린지 후 B16 흑색종 종양 형성의 결여를 나타낸다. 이는, B16 흑색종 종양이, B16 면역 마우스에 B16 세포를 처음 접종한 후 45일 째에 재-접종하는 경우 25일까지 성장이 예방됨을 나타낸다. 쥐 수지상 세포는 rmIL-4 및 rmGM-CSF를 함유하는 완전 배지(RPMI- 1640, 10% FBS) 속에서 7일 배양함에 의해 B6 마우스의 골수로부터 생성되었다. 이후에, CD11c 양성 수지 세포를 제조업자의 프로토콜(제조원: Miltenyi Biotech)당 특이적인 MACS 비드를 사용하여 분리하고 rAd.IL-12(RheoIL-12 대 SP1 대 TTR)를 사용하여 100의 MOI에서 10E6 DC를 확립된 9일된 피하 B 16 흑색종 종양(그룹당 5마리 마우스, 우측 옆구리상의 종양)내로 주사하기 전 24시간 동안 감염시켰다. 마우스를 DC 주사한지 0 내지 4일째에 활성화 리간드 RG-115830(50 마이크로리터 DMSO중 30 mg/kg)의 매일 복강내 주사로 치료하거나 치료하지 않는다. 종양 크기는 매 3 내지 4일째에 모니터링하고 직각 직경의 산물로서 mm2로 보고한다. 치료요법-관련 보호의 특이성을 평가하기 위하여, 모든 종양-유리된 동물을 우측 옆구리상에서 10E5 B16 흑색종 세포로 및 MC38 결장 암종 세포로 우측 옆구리 상에서 초기 B16 종양 챌린지 후 45일 째에 재챌린지하였다. MC38 종양은 형성되나 B16 종양은 형성되지 않았다.
도 12는 B16 종양내로 주사된 수지상 세포의 수(10E5, 10E6, 10E7) 및 리간드 투여 시간의 길이(6일 또는 13일) 중에서의 비교를 나타내며 10E7 수지상 세포와 함께 13일 동안 매일 투여한 B16 흑색종 종양 마우스 모델에서 수득되는 종양 회복은 25일의 기간에 걸쳐 종양 회복을 유발하는데 있어 가장 효과적임을 나타낸다.
도 13은, 본원에 기술된 치료요법이 소모로 인한 동물 체중에 있어서의 원치않는 감소와 관련되어 있지 않음을 나타낸다. 소모 및 체중 감소는 흔히 IL-12에 대해 반응하여 상향조절되는 것으로 알려진 인터페론-감마 및 TNF-알파의 높은 수준과 관련되어 있다.
도 14는 재조합 아데노바이러스 Rheoswitch® 유도성 IL-12 및 활성인자 리간드 RG-115932를 함유하는 수지상 세포로 이미 처리한 마우스의 재챌린지 후 B16 흑색종 종양 형성의 결여를 나타낸다. B16 흑색종은 5마리의 동계 B6 마우스의 우측 옆구리에 7일 동안 피하 확립시켰다. 7일째에, DC.SP1-IL-12(SP1 최적 스위치를 사용하여 100의 MOI에서 감염시킨 골수 기원 DC)를 105, 106 또는 107의 투여량에서 종양내(i.t.) 주사하였다. RG-115932는 DC 주사한 날(및 이후 6일 또는 13일동안 매일)로부터 개시하여 복강내 주사로 제공하였다. 각각의 집단은 5마리의 동물을 함유하였으며, 종양 성장은 매 3 내지 4일째에 모니터링하고 평균 크기(직각 측정의 산물을 기준으로 평방 mm)로 보고하였다. 개개의 동물 체중을 또한 종양 측정 시기에 평가하였다(도 13). 어떠한 치료요법에 의해서도 질병이 없도록 한 모든 동물을 50일 째(초기 B16 종양 접종 후)에 105 B16 흑색종 세포를 원래의 종양의 반대쪽 옆구리(좌측 옆구리)에 및 105 MC38 결장 암종 세포를 우측 옆구리에 재챌린지하였다. 종양 성장을 3 내지 4일마다 모니터링하고 천연(치료되지 않은) 동물에서 관측된 성장에 대해 비교하였다(참조: 도 12). 따라서, 도 14는, B16 흑색종 종양이 B16 면역 마우스를 B16 세포로 재-접종한 경우 24일째까지 성장이 예방되었음을 나타낸다. 도 14는, 또한 B16 천연 마우스가 MC38 면역 마우스 및 MC38 천연 마우스에서와 같이, 종양 형성으로부터 보호되지 않았음을 나타낸다. MC38은 당해 분야에 공지된 결장 암종이다. 이는 재조합 아데노바이러스 Rheoswitch® 유도성 IL-12를 함유하는 수지상 세포를 사용한 원래의 B16 종양 주사에 의해 유발된 면역화의 특이성을 입증한다.
도 15는 Ad-RTS-mIL-12로 유전자도입된 마우스 수지상 세포에서 활성인자 약물(RG-115932) 투여량-의존적인 IL-12 발현을 나타낸다.
도 16은 Ad-RTS-mIL-12로 유전자십입된 HT1080 세포에서 RG-115932의 존재 또는 부재에 대한 mIL-12 발현의 온/오프(On/Off) 반응을 나타낸다.
도 17은 활성화 약물(AD)의 존재 또는 부재하에 아데노바이러스 형질도입된 DC의 종양내 주사에 의한 면역화에 대한 CD8+ T 세포 반응이 항종양 반응에 상응함을 나타낸다.
도 18은, RTS 조절하에 사람 IL-12를 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 유전자삽입된 3명의 지원자로부터 사람 DC에 있어서 사람 IL-12 유도를 나타낸다.
실시예 1
DC.RheoIL12는 시험관내에서 리간드 RG-115830에 반응하여 고수준의 IL-12p70을 조건부로 생산한다
1.1 재료 및 방법
1.1.1 마우스
6-8 주령의 암컷 C57BL/6 야생형 및 C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFP Tg 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 구매하여 마이크로-아이솔레이터 케이지(micro-isolator cage) 내에 유지하였다. 실험 동물의 적절한 관리 및 이용에 관한 권고에 따라 동물들을 취급하였다.
1.1.2 세포주
C57BL/6 마우스와 동계인 B16 흑색종 및 EL-4 흉성종 H-2b 세포주는 이전에 기술된 바와 같다(Itoh et al., 1994). 5% CO2 및 37 ℃의 가습 인큐베이터에서 CM(10% 가열-불활화 우태아 혈청, 100 유닛/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 10 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640; 모든 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 입수) 내에 세포주를 유지하였다.
1.1.3 수지상 세포(DC: Dendritic Cell)의 생성
쥐과 골수로부터 이전에 기술된 바와 같이 DC를 생성시켰다(Tatsumi et al., 2003). 약술하면, 야생형 또는 EGFP Tg 마우스 BM을 1000 유닛/ml 재조합 쥐과 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 및 재조합 mIL-4(Peprotech, Rocky Hill, NJ)로 보충된 CM 내에서 5% CO2, 가습 인큐베이터에 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 특이적 MACSTM 비드를 사용하여 제조자 프로토콜(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 따라 CD11c+ DC를 분리하였다. 이러한 방법으로 생산된 CD11c+ DC는 형태 및 CD11b, CD40, CD80, 및 클라스 I 및 클라스 II MHC 항원의 동시 발현을 기준으로 한 순도가 >95%였다.
1.1.4 바이러스 벡터
CMV 프로모터가 제거된 mIL-12를 암호화하는 대조군 아데노바이러스 벡터 rAd.ψ5 및 rAd.cIL12(Tatsumi et al., 2003)는 피츠버그 대학교 암 연구소의 벡터 핵심 기지(Vector Core Facility)에서 생산하여 제공하였다.
rAd.RheoIL12 벡터는 하기의 방법으로 생산되었다. EMCV 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 서열에 의해 분리된 VP16-RXR 및 Gal4-EcR에 대한 코딩 서열을 인간 유비퀴틴 C 프로모터의 조절하에 아데노바이러스 셔틀 벡터에 삽입하였다. 이어서, IRES 서열에 의해 분리되고 합성 유도성 프로모터의 제어를 받는 IL12의 p40 및 p35 서브유닛에 대한 코딩 서열을 유비퀴틴 C 프로모터의 업스트림에 삽입하였다(도 1 참조). 다양한 강도의 독립적인 프로모터하에 2개의 융합 단백질(VP-16 RXR 대 Gal4-EcR)을 발현시킴에 의한 시스템의 성능을 조사한 결과, Gal4-EcR에 대한 VP16-RXR의 비율이 높을 때 최상의 성능이 얻어지는 것으로 확인되었다. 따라서, IRES의 업스트림에 VP-16 RXR이 있고 다운스트림에 Gal-4 EcR이 있는 경우가 반대의 설계보다 최적의 성능을 제공하였다.
2개 융합 단백질 및 유도성 IL12 서브유닛에 대한 이들 전사 유닛을 운반하는 셔틀 벡터는 E. coli BJ5183 세포내에서 아데노바이러스 골격(AdEasy1, stratagene, La Jolla, CA)에 재조합되었다. 재조합 클론을 확인한 후에, rAd.RheoIL12 게놈을 운반하는 플라스미드를 XL10-Gold 세포에서 성장시켜 정제하고, 플라스미드 골격을 분해하고 HEK 293 세포에 형질감염시킴으로써 패키지로 만들었다.
얻어진 1차 바이러스 스톡을 HEK 293 세포에 재감염시켜 증폭하고 CsCl 밀도-경사 원심분리로 정제하였다.
1.1.5 ELISA
7일 배양한 DC를, MOI 범위에 걸쳐 모의 대조군 벡터 rAdψ5로 감염시키거나, 구성성(rAd.cIL12) 또는 유도성(rAd.RheoIL12) 프로모터가 제거된 쥐과 IL-12p70을 암호화하는 재조합 Ad로 감염시키거나, 처리하지 않았다. 이후로 다양한 시점에(0-48 시간), 활성화 리간드(10-200 μg/ml)의 부재 또는 존재하에 추가의 24 시간 동안 DC를 배양한 후 특이적 ELISA 키트(BDPharMingen, San Diego, CA; 검출 하한 = 62.5 pg/ml)를 사용하여 IL-12p70 분비를 분석하였다. 일부 경우에는, 조건부 사이토카인 생산의 엄격성을 조사하기 위하여, rAd.RheoIL12(즉 DC.RheoIL12)로 감염시킨 DC를 활성화 리간드로 사전 처리한 후, 리간드를 세척해 제거하고 대조군 배지에서 추가의 24 시간 동안 배양한 다음에 IL-12p70 분비를 분석하였다. 대안적으로, 48 시간 후에, 감염된 DC를 수확하고, 62.5 pg/ml의 검출 하한을 가진 ELISA 키트(BD-PharMingen, San Diego, CA)를 사용하여 표현형 및 IL-12p70 생산을 분석하였다.
1.1.6 유세포 분석
아데노바이러스 감염 DC의 표현형 분석을 위하여, 마우스 세포 표면 분자(CD11b, CD11c, CD40, CD54, CD80, CD86, H-2Kd, I-Ad(모두 BD-PharMingen으로부터 입수))에 대한 PE- 또는 FITC-접합 mAb 및 적절한 동형 대조군을 사용하고, FACscan(Becton Dickinson, San Jose, CA) 유세포 분석기를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
1.2 결과
1.2.1 Rheo-IL12로 감염된 쥐과 BM-유래 DC는 시험관내에서 리간드로 처리할 때 고수준의 IL-12p70을 조건부로 생산한다.
rmIL-4 및 rmGM-CSF의 존재하에 7일 동안 C57BL/6(B6) 마우스 BM에서 배양한 DC를, 처리하지 않거나, 다양한 MOI에서 대조군 rAd.ψ5, rAd.cIL-12(구성성 CMV 프로모터하에 mIL-12p70를 암호화) 또는 rAd.RheoIL12(소분자 리간드 RG-115830에 반응하는 조건부 프로모터하에 IL-12 p70을 암호화)로 감염시켰다. 감염으로부터 48 시간 후에, RG-115830의 부재 또는 존재하에 추가의 24 시간 동안 DC를 배양하고, 그 시점에 배양 상등액을 수거하여 ELISA로 IL-12p70 생산을 정량하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 대조군 미감염 DC 또는 외인성 약물의 부재 또는 존재하에 Ad.ψ5로 감염된 DC는, rAd.cIL12(DC.cIL12)로 감염된 DC와 비교할 때, 상승된 수준의 IL-12p70을 생산하지 못하였다. rAd.RheoIL-12(DC.RheoIL12)로 감염된 DC는 RG-115830으로 처리하였을 때에만 IL-12p70을 생산하였다(도 2a 및 2b 참조). "십자(criss-cross)" 실험의 결과에 의하면, 50-200 μg/ml RG-115830로 처리한 세포에 100의 MOI를 사용할 때, 감염된 DC에서 최적의 IL-12p70 생산이 일어났다(도 2a). 시험관내에서 DC.RheoIL12에 RG-115830의 공급을 48 시간까지 지연시킨 결과, 이 리간드를 0 시간 시점에 첨가한 경우에 비해 IL-12p70의 생산이 유의적으로 감소하지 않았다(도 2b). 최종적으로, 리간드를 제거하면 DC.RheoIL12(사전에 리간드로 활성화된)가 시험관내에서 상승된 수준의 IL-12p70 생산을 지속하는 능력이 즉시 억제된다(도 2c).
실시예 2
시험관내 가공된 수지상 세포의 동물에 대한 종양내 투여
2.1 방법 및 재료
2.1.1 B16 종양 모델
제0일에 B6 마우스의 우측 옆구리에 1×105 B16 흑색종 세포를 피하 주사하였다. 제7일에, 종양의 크기가 약 20-30 mm2에 도달하였고, PBS 또는 총부피 50 μl의 PBS 내의 1×106 대조군 대 아데노바이러스 형질도입(MOI=100) DC를 i.t. 주사하여 마우스를 처리하였다. 또한, 표시된 바와 같이 DC 투여후 0 시간, 24 시간 또는 48 시간에 개시되는 200 μg RG-115830(50 μl DMSO 내의) 대 DMSO 담체 대조군을 마우스에 i.p. 주사하였다. 개시 후에, 마우스에 연속하여 매일 상기 용량의 RG-115830을 총 5회 복강내 주사하였다. 추가 실험에서는, 리간드 투여를 DC 주사 당일에 시작하여 DC 주사후 1, 3 또는 5일에 종료함으로써, IL-12p70 형질전환 유전자 촉진의 조기 중단이 상기 접근방법의 치료적 유익을 감소시키는지 여부를 조사하였다. 모든 경우에 있어서, 버어니어 캘리퍼스로 측정한 최대 직교 직경의 곱을 결정함으로써 매 3일 또는 4일마다 종양 크기를 평가하여 mm2으로 기록하였다. 데이터는 평균 종양 면적±SD로 보고하였다. 모든 동물 코호트는 5 마우스/그룹을 포함하였다.
표시된 실험에서, 요법후에 종양이 없어진(45일) 동물에게 B16 흑색종(좌측 옆구리, 즉, 원래의 B16 접종 부위의 반대쪽에 105 세포를 주사) 및 MC38 대장암종(우측 옆구리에 105 세포) 세포를 재접종하여, 이들 마우스에서 기억 면역(memory immunity)의 존재 및 특이성을 조사하였다. 모든 데이터는 평균 종양 면적±SD로 보고하였다. 모든 동물 코호트는 5 마우스/그룹을 포함하였다.
주사된 DC의 행방 및 기능을 평가하기 위하여, C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFP Tg 마우스로부터 제7일 BM-유래, CD11c+ DC를 생성시켰다. 상기 표시한 바와 같이, EGFP+ CD11c+ DC는 감염시키지 않거나 rAd 바이러스로 감염시켰다. 감염후 48시간에 1×106개의 대조군 또는 바이러스-감염된 DC를 수확하여 PBS로 세척하고, 동계의 B6 마우스에 확립된 제7일 B16 종양 병변내에 주사하였다. DC 주사후 3일에, 종양 및 배출(draining) 서혜부 림프절(LN: lymph node)을 절제하여 2% 파라포름알데히드(PBS 내)에 1 시간 고정시킨 후에 PBS 내의 30% 수크로스에 동해방지하여 액체 질소-냉각 이소펜탄에 급속냉동하였다. 5 미크론 동결 절편을 만들어 2 mg/ml 획스트(Hoechst) 33258(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 3 분간 대조염색하였다. 세척한 절편을 젤바톨(Gelvatol)(Monsanto Chemical Co., St. Louis, MO)에 마운팅하고 냉각 전하결합소자(cooled charge-coupled device) 컬러 카메라가 장착된 올림푸스(Olympus) BX51 현미경을 사용하여 관찰하였다.
2.1.2 B16 흑색종에 대한 특이적 CD8+ T 세포 반응의 평가
종양 접종으로부터 25일 후에, 자기 비드 세포 분류(MACSTM; Miltenyi Biotec)를 이용하여 2 마리 처리군 마우스/그룹의 비장으로부터 수집(Pooled) CD8+ T 세포를 >95%의 순도로 분리한 후에 1×104개의 방사선 조사된(10,000 rad) B16 또는 EL-4 종양세포와 함께 공동배양하였다(1×105/웰). 48 시간 인큐베이션 후에 배양 상등액을 수집하고 검출 하한 31.5 pg/ml의 상업적 ELISA(BD-PharMingen)를 사용하여 IFN-γ 방출을 분석하였다. 데이터는 삼중 실험의 평균±SD로 보고하였다.
2.1.3 통계적 분석
완전 무작위 설계로 처리를 적용한 3개 이상의 그룹에 대한 모든 실험은 먼저 1원(one-way) 또는 2원(two-way) 요인 분산분석(factorial ANOVA)으로 분석하였다. 얻어진 P가 <0.05이면, 필요한 이분산성(unequal variance)에 대한 웰치 보정(Welch's correction)을 수반하는 T 검정으로 특이적 짝 대비(specific pairwise contrast)를 시험하였다. 데이터의 분포 특성을 확인하여 적절한 변환을 적용하였다. 비장세포-유래 T 세포로부터의 IFN-γ 생산은 정확한 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)으로 분석하였다. 크루스칼-왈리스 검정의 P가 <0.05이면 선험적 대비(priori contrast)를 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)으로 산정하였다. 치료적 단일 종양 접종 쥐과 처리 모델은 혼합 선형 모델로 분석하였다. 데이터를 로그 변환하여 마우스내의 공분산(within-mouse covariance)을 산정하고 처리의 고정 효과(fixed effect)를 마우스 무선 효과(random mouse effect)에 대해 조정하였다. 단일 시점에 그룹의 짝을 비교하는 원자료 P는 부트스트랩 재추출(bootstrap re-sampling)로 조정하였다. 처리 그룹, 관찰일 및 그의 상호작용을 혼입하는 일반 선형 모델(이항 링크를 수반하는)에 종양 제거율(tumor rejection rate)을 적합시켰다.
2.2 결과
2.2.1 DC.cIL12 단독 또는 RG-115830의 i.p. 투여와 조합된 DC.RheoIL12의 종양내 투여가 구축된 s.c. B16 흑색종 병변의 퇴행을 촉진한다
B16 흑색종 세포(1×105)를 동계의 H-2bB6 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하여 확립되도록 하였다. 제7일에 평균 코호트 종양 크기가 약 20-30 mm2가 되도록 각각 5 마리 동물의 코호트에 마우스들을 무작위 배정하였다. 이어서 PBS 또는 총부피 50 μl PBS 내의 106 DC(rAd.ψ5, rAd.cIL12 또는 rAd.RheoIL12로 48 시간 동안 시험관내 사전-감염)를 마우스에게 종양내 주사하였다. 또한, DC 투여시(즉, 처리 제1일) 또는 DC 투여후 24 시간 또는 48 시간(즉, 처리 제2일)에 DMSO 또는 RG-115830(DMSO 내)을 동물들에게 복강내 주사하였다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, RG-115830 단독 또는 RG-115830 부재하의 DC.RheoIL12로 마우스를 처리한 경우에는 어떠한 치료적 이익도 발생하지 않았다. 이와는 현저히 대조적으로, DC.cIL-12 또는 DC.RheoIL-12+RG-115830(5일 경로의 리간드 투여와 병행하여, DC 주사로부터 24 시간 이내에 제공)으로 처리한 종양은 이후 3주에 걸쳐 크기가 퇴행하였다. 종양 크기 측정을 기준으로 할 때 이들 요법은 통계적으로 구별되지 않았으며, 각각의 경우에 100%(5/5 마우스) 종양 퇴행율이 얻어졌다. 흥미롭게도, 종양내 DC 주사후 48 시간까지 RG-115830 투여를 지연시켰을 경우(시험관내에서 상기 약제가 DC.RheoIL-12로부터 IL-12p70 생산을 효율적으로 촉진할 수 있는 시점, 도 2b 참조), DC.RheoIL12-기제의 요법은 종양 성장률을 미약하게 저해하였으나(제10일 후의 모든 시점에서 p<0.05), 모든 동물들이 진행하여 제30일까지는 희생이 필요하였다(도 3a). 이는 종양내 DC.IL12 처리의 치료적 유익이 대체로 이른 시점에서의 IL-12p70 생산(종양 병변 및/또는 배출 림프절 내에서 일어날 것으로 추정됨)에 결정적으로 의존함을 시사한다.
DC.RheoIL-12를 주사한 마우스에게 DC 주사후 1, 3, 5일 동안 활성화 리간드(RG-115830)를 투여한 추가 실험을 수행하였다(도 3b-3c). 이들 연구 결과는, 리간드 투여의 조기 종료가 i.t. 전달된 DC.RheoIL-12의 항종양 효능에 영향을 미치며, 여기에서 유전자-개질된 DC의 제공 후에 약 5일 이상 리간드가 마우스에게 제공되지 않으면 종양 성장의 저해가 제한 또는 소멸됨을 시사한다. 이러한 발견은 도 2b 및 2c에 제공된 데이터와 일치하며, 상기 모델에 주사된 DC.RheoIL-12로부터 얻어지는 치료적 영향의 엄격한(리간드-의존적인) 조절을 뒷받침한다. 또한, 종합하면, 도 3에 나타낸 결과는 DC.RheoIL12의 i.t. 전달에 연계된 최적의 항-흑색종 효능은 B16 종양내 DC 주사후 d1-d5 기간 동안의 리간드 제공에 의해 유발됨을 강력하게 시사한다.
2.2.2 조건부 DC.RheoIL12 요법의 활성화 지연은 주사된 DC의 명백한 생체내 생존 실패로 인해 효과가 없다.
본 발명자들의 이전 보고(Tatsumi et al., 2003)에서는, DC에 IL-12 유전자를 삽입함으로써 이들 세포의 종양 미세환경내 주사후 생존 증진 및 이들 세포가 항종양 CD8+ T 세포를 교차-초회감작(cross-prime)하는 결과적 능력을 촉진하여 생체내에서 혈중 효과 T 세포(circulating effector T cell)를 종양 미세환경내로 추정적으로 동원함을 시사하였다. 그러므로, 차기 시도는 DC 주사후 48 시간에 (i.p. RG-115830 투여에 의해) 개시된 DC-RheoIL12 요법의 실패가 종양 미세환경내에서 DC가 존속하지 못함에 기인하는지, 이들 세포가 종양-배출 LN으로 수송되지 못하기 때문인지, 및/또는, 처리의 결과로서 특이적 CD8+ T 세포가 교차-초회감작되지 못하기 때문인지 여부를 판별하는 것이었다. DC 생성을 위한 골수의 공급원으로서 EGFP Tg (H-2b) 마우스를 사용한 점을 제외하고는 도 3a에 개관된 실험을 반복하여 DC의 종양내 주사후 72 시간에 코호트당 2 마리의 마우스를 희생시켰다. 형광 현미경에 의한 EGFP+ DC의 분석을 위해 종양 및 LN을 절제하여 조직 절편을 준비하였다. 나머지 3 동물/코호트는 제25일까지 추적하여 희생시키고 B16-특이적 CD8+ T 세포 반응 분석을 위해 수집 비장세포를 분리하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, i.t. 주사후 72 시간에 종양 또는 LN에서 EGFP+ DC를 분해하는 능력은, 이들 세포의 생체내 투여로부터 24-48 시간 이내의 IL-12 형질전환 유전자 활성화에 절대적으로 의존하였다. DC.cIL12 또는 DC.RheoIL12를 i.t. 주사한 마우스에서, EGFP+ DC.cIL12 및 DC.RheoIL12는 B16 병변에서 용이하게 관찰할 수 있었으며 배출 LN에서는 좀더 드물게 관찰되었다(DC 투여후 0 시간 또는 24 시간에 RG-115830이 i.p. 제공된 경우). 대조군(미감염) DC 또는 DC.RheoIL12로 처리한 마우스로부터 수확한 조직에는 검출가능한 EGFP+ DC가 매우 적거나 없었다(DC 주사후 48 시간 동안 RG-115830 투여가 지연된 경우). DC.RheoIL12로 처리하고 RG-115830을 0 시간에 제공한 경우와 24 시간에 제공한 경우의 마우스로부터 분리된 조직을 비교한 결과, 활성화 약물을 일찍 제공했을 때 종양(p=0.001) 및 배출 LN(p=0.02) 양자 모두에 더 많은 EGFP+ DC가 존재했다.
2.2.3 DC.RheoIL12 투여의 치료적 유익은 특이적 CD8+ T 세포 및 지속성 항종양 면역의 유도에 연계된다.
주사된 DC 생존력의 리간드 주사 시기에 대한 명백한 의존성을 고려할 때, RG-115830에 의해 0 시간에 활성화된 DC.RheoIL12를 투여한 마우스의 경우의 특이적 CD8+ T 세포 교차 초회감작 정도가, 이후의 시점에 활성화된 경우에 비해 우월할 것이 예측되었다. 흥미롭게도, 0 시간(DC.RheoIL-12, d1-d5) 대 48 시간(DC.RheoIL-12, d3-d7) DC.RheoIL-12 코호트에 있어서는 이러한 현상이 분명히 관찰되었으나, 0 시간 대 24 시간(DC.RheoIL-12+L, d2-d6) DC.RheoIL12 그룹들을 비교했을 때에는 그렇지 않았다(도 5a). 실제로, 관련된 B16 대 무관한 EL-4 종양 표적에 대한 시험관내 비장 CD8+ T 세포 반응(IFN-γ 분비)은 이들 코호트 모두에 대해 유사하였으며, 이들 각각은 DC.cIL12로 처리한 마우스에서 검출된 것에 근접하였다. 전체적으로, 이들 CD8+ T 세포 반응 프로파일은 요법 성과에 직접적인 상관관계를 가지는 것으로 나타났다(도 3a). 도 5a와 유사하게, 특이적 B16 종양 세포 대 무관한 MC38 세포에 대한 비장 T 세포의 IFN-감마 생산에 의한 반응은 치료 성과에 상관관계를 가지고 있었다.
효과적인 DC.RheoIL12-기제의 요법이 지속성 항종양 면역의 발달에 연계되었는지 여부를 고찰하기 위하여, 종양이 없는 동물에 관련된 B16 흑색종 세포 또는 무관한 MC38 대장 암종 세포를 (초기 B16 접종후) 제45일에 (재)접종하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 흑색종이 사전에 치료된 모든 마우스는 B16 종양 세포에 대한 특이적 보호를 나타낸 반면에, MC38 종양 병변은 점진적으로 성장하였다. 이는 본 발명의 수지상 세포가 부가적인 안전성 및 치료 양식에 대한 잠재적인 치료적 제어를 가지고 있음을 증명한다(IL-12 발현의 시기 및 수준 양자 모두가 리간드의 투여에 의해 제어될 수 있다는 점에서).
실시예 3
치료 효과에 대한 리간드 투여 경로/용량의 비교
3.1 방법 및 재료
동계의 B6 마우스 우측 옆구리에 B16 흑색종을 7일 동안 s.c. 확립하였다. 제7일에, 106 DC.SP1-IL12(도 10 비교에 동정된 최적 스위치)를 종양내(i.t.) 주사하였다. DC 주사 전일에 시작하여 (이후로 6일 동안 매일), i.p. 주사, 라브라솔(Labrasol) 내의 경구 급식, 또는 무제한 제공되는 약물-함유 고형사료를 통해 활성화 리간드(RG-115932)를 제공하였다. 각각의 코호트는 5 마리의 동물을 포함하였으며, 매 3-4일마다 종양 성장을 관찰하여 평균 크기(직교 측정의 곱을 기준으로 한 mm2)로서 보고하였다. 각 코호트에 있어서의 처리를 하기에 기술한다.
코호트 # 처리 내역
1 대조군, DC 없음, 리간드 없음
2 대조군, DC 없음, 리간드 i.p., 50 mg/kg/day(최대)
3 대조군, DC 없음, 고형사료, 무제한 제공(45 mg/kg/day)
4 대조군, DC 없음, 경구 급식, 30 mg/kg/day
5 DC.SP1-IL12, 리간드 없음
6 DC.SP1-IL12, i.p., 1 mg/kg/day
7 DC.SP1-IL12, i.p., 3 mg/kg/day
8 DC.SP1-IL12, i.p., 10 mg/kg/day
9 DC.SP1-IL12, i.p., 30 mg/kg/day
10 DC.SP1-IL12, i.p., 50 mg/kg/day
11 DC.SP1-IL12, 고형사료, 무제한 제공(45 mg/kg/day)
12 DC.SP1-IL12, 경구 급식, 30 mg/kg/day
3.2 결과
결과에 의하면, 어떤 용량으로든 어떤 경로를 통해서든 리간드 단독 투여는 B16 종양 성장에 영향을 미치지 않았다(도 6). DC-SP1 i.t. 요법은 리간드가 적용되는 경우에 한하여 B16 성장의 조절에 효과적이며, 리간드 투여의 모든 경로가 어느 정도의 효능을 발생시킨다. i.p. 투여된 리간드를 사용하는 DC-SP1 i.t. 요법은 명확한 리간드 용량-종양 저해 반응 양상을 나타내었으며, 최적의 항종양 효과는 리간드 용량이 >30 mg/kg/day일 때였다. i.p. 주사, 경구 급식 또는 식이 혼합에 의해 리간드가 투여된다면, 30 mg/kg/day의 용량으로 DC-SP1 i.t. 요법에 적용된 리간드는 동일하게 효과적이었다. 고형 사료에 제공된 더 높은 리간드 용량은 다소 덜 효과적이었다. R 에난티오머(RG-115932)만 RTS를 활성화시킬 수 있으므로, 라세믹 혼합물을 함유하는 고형 사료는 약 20-22.5 mg/kg/day의 활성 에난티오머만을 제공한다. 이와 관련하여, 고형 사료 코호트에서의 항종양 효과가 10 및 30 mg/kg/day i.p. RG-115932 용량 그룹들의 사이에 놓인다는 점에서, 고형 사료를 통해 라세믹 혼합물 AD를 투여한(즉, ~20-22.5 mg/kg/day의 활성 에난티오머 RG-115932) 동물들에서 관찰된 종양 퇴행은 순수한 RG-115932에 의해 나타난 i.p. 용량 반응과 일치하였다. 상기 데이터는 치료 효과의 유도에 있어서 리간드의 경구 투여가 효과적임을 시사한다. 리간드의 경구 투여의 이용가능성은 환자의 치료 부담을 경감시킨다.
상기의 활성화 약제 의존성 효과는 (1) 종양 및 DLN에서의 형질전환 유전자 발현, (2) 종양 미세환경에서의 장기적인 Ad-DC 생존, (3) DLN에서 AdDC의 이동(migration) 및 존속(persistence), 및 (4) 항 B16 CD8+ T 세포의 유도에 연계되었다.
도 10은 상이한 IL-12-함유 아데노바이러스 벡터의 효과 비교를 나타낸다. 레오스위치(Rheoswitch)-함유 변이체 중에서 SP1-RheoIL-12 변이체가 가장 효과적이었다. SP1-RheoIL-12는 벡터 골격에 있어서 oldRheoIL-12와 상이하다(oldRheoIL-12에는 AdEasy1 벡터이고 Sp1-RheoIL-12에는 ViraQuest의 RAPAd 벡터임). TTR-RheoIL-12는 Gal4 반응 요소의 다운스트림에 TTR 미니멀 프로모터를 포함한다는 점에서 oldRheoIL-12와 상이하다. 도 10에서 설명하는 바와 같이, B16 흑색종 종양 크기를 감소시킴에 있어서 SP1-RheoIL-12가 TTR-RheoIL-12보다 효과적이었다.
도 11은 재조합 아데노바이러스 레오스위치 유도성 IL-12를 포함하는 수지상 세포(DC-SP1-RheoIL-12)로 사전에 처리한 마우스에서 재접종 후에 B16 흑색종 종양 형성이 없음을 나타낸다. 이는 B16 세포로 최초 접종한 후 45일에 B16 면역 마우스를 재접종했을 때 최대 25일까지 B16 흑색종 종양의 성장이 방지됨을 증명한다. 쥐과 수지상 세포는 rmIL-4 및 rmGM-CSF를 함유하는 완전 배지(RPMI-1640, 10% FBS)내에서의 7일간 배양에 의해 B6 마우스의 골수로부터 생성되었다. 그 후에 제조자 프로토콜(Miltenyi Biotech)에 따라 특이적 MACS 비드를 사용하여 CD11c 양성 수지상 세포를 분리하고 rAd.IL-12(RheoIL-12 대 SP1 대 TTR)를 100의 MOI로 사용하여 24 시간 동안 감염시킨 후, 확립된 제9일 s.c. B16 흑색종 종양(그룹당 5 마리 마우스, 우측 옆구리의 종양)내에 10E6 DC를 주사하였다. DC 주사후 제0일 내지 제4일에 활성화 리간드 RG-115830(50 마이크로리터 DMSO 내의 30 mg/kg)의 일일 i.p. 주사로 마우스를 처리하거나 처리하지 않았다. 매 3-4일마다 종양 크기를 관찰하여 직교 직경의 곱으로서 제곱 mm로 보고하였다. 요법-연계성 보호의 특이성을 평가하기 위하여, 종양이 없는 모든 마우스의 좌측 옆구리에는 10E5 B16 흑색종 세포를, 우측 옆구리에는 MC38 대장 암종 세포를, 초기 B16 종양 접종후 제45일에 재접종하였다. MC38 종양은 형성되었으나 B16 종양은 형성되지 않았다.
도 12는, B16 흑색종 종양 마우스 모델에서 B16 종양에 주사된 수지상 세포(DC-SP1-RheoIL-12)의 수(105, 106, 107) 및 리간드 투여 및 종양 퇴행의 시간의 길이(6일, 13일) 사이의 비교를 나타낸다. 도 12는 종양내에 주사된 형질도입 DC의 용량 및 AD 투여(i.p. 주사, 30 mg/kg/day) 지속 기간의 종양 성장 저해에 대한 의존성을 나타낸다. 종양을 보유한 마우스에 AdDC를 105, 106, 및 107 세포의 용량으로 단회 종양내 주사하고, 107 세포의 주사일에 시작하여 6일 또는 13일 동안 활성화 리간드를 30 mg/kg/day의 단회 용량으로 매일 i.p. 주사하였다. 역시, 활성화 리간드를 13일간 제공한 경우에 6일간의 제공에 비해 유의적으로 더 강력한 종양 성장 억제가 관찰되었다. 107 수지상 세포와 조합하여 13일간 연이어 투여된 리간드(RG-115932)는 25일 기간에 걸쳐 종양 퇴행을 효과적으로 유발하였다. 이는 생체외 형질도입 DC가 종양내에 주사된 후에는 단지 수일간만 생존한다는 통념에 대조적으로, RTS의 제어하에 IL-12를 발현시키는 AdDC가 종양내 주사후 1주 이상 여전히 온전할 수 있으며 주사후 13일까지도 생존하여 활성화 리간드에 반응할 수 있음을 시사한다. 활성화 리간드 단독(AdDC 없이)으로는 종양 성장에 효과가 없었다.
도 12와 유사한 실험에서, 활성화 리간드를 9일 및 12일 동안 경구 급식을 통해 투여하였다. 라브라솔내의 상이한 용량에서 활성화 리간드의 경구 제형에 의한 항종양 용량 반응을 평가하였다. 용량 의존성 항종양 효과가 관찰되었으며, 12일 동안 50 mg/kg/day로 경구 투여한 동물에서 최대의 반응이 나타났다. 사실상, 시험한 모든 용량에서 13일간의 활성화 리간드 처리가 9일간의 활성화 약물 처리에 비해 우수하였다. 이는, 최적의 치료 효능을 위해서는 생체내(종양 미세환경 또는 림프계 기관내)에서 적어도 9 내지 12일 동안 생존하여 IL-12 생산을 지속하는 DC가 중요함을 시사한다.
도 13은 본 명세서에 기술된 요법이 소모로 인한 동물 체중의 뜻밖의 감소에 연계되지 않음을 나타낸다. IL-12에 반응하여 상향조절되는 것으로 알려진 인터페론-감마 및 TNF-알파의 높은 수준에 소모 및 체중 감소가 종종 연계된다.
5 마리의 동계 B6 마우스의 우측 옆구리에 B16 흑색종을 7일간 s.c. 확립하였다. 제7일에, DC.SP1-IL-12(SP1 최적 스위치를 사용하여 100의 MOI로 감염시킨 골수 유래 DC)를 10E5, 10E6 또는 10E7의 용량으로 종양내(i.t.) 주사하였다. DC 주사일에 시작하여 (이후로 6일 또는 13일 동안 매일) i.p. 주사로 RG-115932를 제공하였다. 각각의 코호트는 5 마리의 동물을 포함하였으며, 매 3-4일마다 종양 성장을 관찰하여 평균 크기(직교 측정의 곱을 기준으로 한 제곱 mm)로서 보고하였다. 종양 측정시에 개별적인 동물 체중도 산정하였다(도 13). 임의의 요법에 의해 질환을 제거한 모든 동물들에게, 원래의 종양의 반대쪽 옆구리(좌측 옆구리)에는 10E5 B16 흑색종 세포를, 우측 옆구리에는 10E5 MC38 대장 암종 세포를, (초기 B16 종양 접종후) 제50일에 재접종하였다. 매 3-4일마다 종양 성장을 관찰하여 무경험(비처리) 동물에서 관찰된 성장에 비교하였다(도 12 참조).
도 14는 재조합 아데노바이러스 레오스위치 유도성 IL-12를 포함하는 수지상 세포 및 활성화 리간드 RG-115932로 사전에 처리한 마우스에서 재접종 후에 B16 흑색종 종양 형성이 없음을 나타낸다. 그러므로 도 14는 B16 면역 마우스에 B16 세포를 재접종했을 때 최대 24일 동안 B16 흑색종 종양의 성장이 방지됨을 증명한다. 도 14는 또한, B16 무경험 마우스가 종양 성장으로부터 보호되지 않았으며, MC38 면역 마우스 및 MC38 무경험 마우스도 그러함을 설명한다. MC38은 당업계에 공지된 대장 암종이다. 이는 재조합 아데노바이러스 레오스위치 유도성 IL-12를 포함하는 수지상 세포를 원래의 B16 종양에 주사함으로써 유발된 면역화의 특이성을 설명한다.
CD14+ 세포의 분화에 의해 생성된 DC는 미숙한 표현형으로서, 검출가능한 수준의 IL-12를 생산하지 않는다(Cella et al. 1999). 도 15는, 골수 세포를 GM-CSF 및 IL-4로 7일 동안 처리한 후 CD11c+ 선택에 의해 생산된 쥐과 DC에서도, RTS의 제어하에 IL-12를 내포한 아데노바이러스 벡터로 형질도입한 후에 검출가능한 IL-12 발현이 나타나지 않음을 보여준다. 형질도입 세포를 다양한 용량의 활성화 약물(RG-115932)로 처리하면 용량 의존적 방식으로 IL-12가 생산되었다.
아데노바이러스 형질도입은, NFkB 활성화 경로를 통해 TNF-알파의 생산을 유발하는 펜톤-인테그린 상호작용에 의해 DC에 어느 정도의 성숙을 유도하는 것으로 보고된 바 있다. 이 경우에, TNF-알파의 자가분비 작용이 DC에 대한 성숙-유도 신호인 것으로 보고되었다(Philpott et al. 2004). 짧은 아데노바이러스 형질도입(2-3 시간)을 이용하고 MOI를 최소 요구 수준으로 선택하면 이러한 조기 성숙 효과가 제한될 것으로 예상된다.
실시예 4
본 실시예에서는 골수로부터 수지상 세포를 분리하여 도 7에 나타낸 아데노바이러스 작제물로 형질도입하고, 동계의 두개강내 GL261 신경아교종을 보유한 마우스에 조작된 수지상 세포를 종양내 주사하고, RG-115830을 복강내 주사하였다. 도 7은 RTS의 제어하에, 또는 RTS의 부재하에, IL-12 및/또는 IFN-알파를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입한 수지상 세포를 마우스 두개강내 신경아교종 GL261에 종양내 주사한 결과를 나타낸다. 이 데이터로부터, RG-115830에 의한 RTS의 활성화를 통한 IFN-알파 및 IL-12의 리간드 유도성 발현이 GL261 신경아교종 마우스의 50일 생존을 IFN-알파 단독 발현에 비해 75 퍼센트 촉진함이 밝혀졌다. 또한, 레오스위치 및 리간드에 의해 제공되는 제어가 생존율 증대를 촉진하였다.
실시예 5
병기 III 및 IV 흑색종을 보유한 대상에서 RTS의 제어하에 hIL-12를 발현시키도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 종양내 주사(들)의 안전성, 내성, 형질전환 유전자 기능 및 면역학적 효과를 하기에 기술하는 바와 같은 절차를 통해 평가하고자 한다.
병기 III 및 IV 흑색종을 보유한 연구 대상들이 참여하는 연구는 4개 코호트(그룹)의 대상에 실행되며, 각 대상에게는 인간 인터류킨-12(hIL-12)를 발현시키도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래(이들이 유래하는 대상에 재삽입됨) 수지상 세포(DC)를 5×107의 용량으로 활성화 약물(활성화 리간드)의 일일 경구 용량과 조합하여 단회 종양내(흑색종 종양내로) 주사한다. 본 연구에서는 인간 IL-12의 유도성 발현을 위한 아데노바이러스 벡터로 생체외(대상으로부터 세포를 수거한 후) 형질도입한 수지상 세포 주사를 이용한다. 활성화 약물(RG-115932)의 경구 투여에 의한 RTS의 활성화를 통해, 주사된 DC로부터 IL-12 생산이 "켜진다"(유도된다). 신체검사(ECOG 수행 상태를 포함), 활력 징후 측정, 혈청 화학검사, 요검사, 혈액검사, 유해 사례 "부작용", 및 아데노바이러스, RTS 구성성분 및 활성화 약물에 대한 항체 및 세포 면역 반응을 통해 안전성 및 내성을 평가한다. 경과를 평가하기 위해서, 경구 활성화 약물 및 그의 주요 대사산물의 단회 용량 및 항정상태 약물동태학/ADME, 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환의 생검에서의 hIL-12 수준 및 세포 면역 반응(T 세포) 분석과 함께 혈청 사이토카인 프로파일을 측정한다.
예를 들어, 병기 III 및 IV 흑색종을 보유한 16 대상을 4개 코호트로 분할하여 코호트 1 및 2는 3 대상을 포함하고 코호트 3 및 4는 5 대상을 포함하도록 한다. RTS 제어하에 인간 IL-12를 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입한 5×107 자가유래 DC를 모든 대상에게 단회 종양내 주사한다. 대상에게 단회 일일 경구 용량의 활성화 약물(코호트 1: 0.01 mg/kg, 코호트 2: 0.1 mg/kg, 코호트 3: 1.0 mg/kg 또는 코호트 4: 3 mg/kg)을 투여하며, 최초 용량은 제1일에 DC 주사 약 3 시간 전에 시작하고 이후로 연속되는 13일 동안 계속한다. 재처리에 관한 기준에 부합하는 적격 대상에게는 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 추가 주사(들)를 14회의 단회(1회) 일일 경구 용량의 활성화 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 차기 최고 용량의 활성화 약물 투여에 대상이 선정되기 전에, 시험관내 가공된 수지상 세포의 주사후 최대 1개월 동안 코호트 1의 각 그룹내의 모든 대상에 대하여 안전성, 내성 및 수지상 세포 기능을 평가한다. 조작된 수지상 세포의 초기 주사후 3개월 동안 모든 대상에서 안전성 평가를 계속하며, 독성이 관찰되거나 대상에게 수지상 세포의 추가 주사(들)을 투여하는 경우에는 대상 안전성을 관찰하기 위하여 추적 기간을 총 6개월까지 연장할 수 있다.
상기 연구는, 흑색종을 보유한 대상에서 경구 활성화 약물과 조합된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 단회 또는 다중 종양내 주사(들)의 안전성 및 내성을 입증한다. 본 연구는 경구 활성화 약물의 항정상태 약물동태학/ADME를 제공한다. 본 연구는, 활성화 약물의 경구 투여에 의한 RTS의 활성화에 반응하는 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 hIL-12 발현을 표적 종양 및/또는 배출 림프절에서 측정함으로써 대상 내에서 RTS의 기능성을 입증한다. 본 연구는 또한, 활성화 약물의 경구 투여에 따른 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환에서의 세포 면역 반응의 관점에서 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 면역학적 효과를 입증한다.
병기 III 및 IV의 흑색종 환자들에게는 이용가능한 성공적 요법이 없고, 고형 종양 중에서 특히 흑색종은 면역요법 접근방법에 반응하는 것으로 나타났으며, 흑색종 종양은 종양내 주사 및 생검을 위한 접근이 용이하기 때문에, (RTS와 함께 사용하기 위한) 예시적 암으로서 흑색종을 선택하였다. 본 연구에 포함된 대상들은 절제불능 병기 III 또는 IV의 흑색종을 보유하며, 이는 적어도 0.5 cm의 직경, 임의의 종양 두께, 임의의 수의 관련 림프절, 국소 전이 또는 원격 전이를 가진다.
5.1. 레오스위치 치료 시스템 및 hIL-12를 내포하는 아데노바이러스의 제조
생체외 아데노바이러스 벡터 형질도입에 의해 재조합 DNA를 수지상 세포(DC)에 전달하였다. 재조합 DNA를 사용하여 종양내 주사된 미성숙 수지상 세포로부터 인간 IL-12(p70)을 발현시키며, 이는 종양 환경에서 DC의 생존력을 부여하고 성숙을 자극하여 차후에 이들이 배출 림프절로 이동하게 한다. 이는 T 보조세포가 Th1 유형으로 분화하는 성향을 유발하며, 종양 항원과의 교차 초회감작에 의한 종양-특이적 세포독성 T 세포의 활성화도 유발한다.
재조합 아데노바이러스 벡터로서 사용된 재조합 DNA는 레오스위치® 치료 시스템(RTS)의 제어하에 인간 IL-12의 발현을 가능하게 한다. RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로부터 발현되는 바이시스트로닉(bicistronic) 메시지 및 2개의 융합 단백질 Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 위한 암호를 포함한다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인(아미노산 1-147) 및 곤충 코리스토뉴라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana)로부터의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합이다. 다른 구체예에서, RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로부터 발현되는 바이시스트로닉 메시지 및 2개의 융합 단백질 Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 위한 암호로 구성되어 있다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인(아미노산 1-147) 및 곤충 코리스토뉴라 푸미페라나로부터의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합이다. VP16-RXR은 HSV-VP16의 전사 활성화 도메인 및 인간 및 메뚜기 서열로부터 유래된 키메릭 RXR의 EF 도메인 사이의 융합이다. 이들 Gal4-EcR 및 VP16-RXR 서열들은 EMCV로부터의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 분리된다. Gal4-EcR가 소분자 약물(RG-115932)에 결합하면 이들 2개 융합 단백질이 이량체를 이루고, 6개의 Gal4-결합 부위 및 합성 미니멀 프로모터를 포함하는 Gal4-반응성 프로모터로부터 hIL-12의 전사를 활성화시킨다. 상기의 RTS 전사 유닛은 hIL-12 전사 유닛의 다운스트림에 위치한다. 상기 전체 RTS-hIL12 카세트는 아데노바이러스 5개 게놈 내에 E1 지역이 삭제된 부위에 혼입된다. 아데노바이러스 골격에는 E3 유전자 또한 결여된다. 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12의 맵은 도 8에 나타낸다.
본 연구에 사용된 재조합 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터 서열에 부가하여 하기의 예시적 조절 요소를 포함한다: 인간 유비퀴틴 C 프로모터, EMCV로부터 유래된 내부 리보솜 진입 부위, 합성 미니멀 프로모터 서열, 3 카피의 SP-1 결합 부위 및 6 카피의 Gal4-결합 부위를 포함하는 유도성 프로모터, SV40 폴리아데닐화 부위 및 인간 알파-글로빈 유전자로부터 유래된 전사 종결 서열. 대안으로서 다른 조절 요소를 이용할 수 있음을 이해하여야 한다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12를 하기 방법으로 생산하였다. EMCV-IRES(내부 리보솜 진입 부위)에 의해 분리된 수용체 융합 단백질, VP16-RXR 및 Gal4-EcR의 코딩 서열을 인간 유비퀴틴 C 프로모터(구성성 프로모터)의 제어하에 아데노바이러스 셔틀 벡터에 삽입한다. 이어서, 6 카피의 Gal4-결합 부위를 포함하는 합성 유도성 프로모터의 제어를 받는, IRES에 의해 분리된 hIL-12의 p40 및 p35 서브유닛의 코딩 서열을 유비퀴틴 C 프로모터 및 수용체 서열의 업스트림에 삽입한다. 셔틀 벡터는 좌측 말단에서 맵 유닛 16(mu16)까지 아데노바이러스 혈청형 5 서열을 포함하며, 이로부터 E1 서열이 삭제되어 RTS 및 IL-12 서열(RTS-hIL-12)로 대체된다. HT-1080 세포에서 일시적 형질감염에 의해 RTS-hIL-12를 운반하는 셔틀 벡터를 활성화 약물-의존성 IL-12 발현에 대해 시험한다. 이어서 HEK 293 세포에의 공동 형질감염에 의해 아데노바이러스 골격에 셔틀 벡터를 재조합하여 재조합 아데노바이러스 Ad-RTS-hIL-12를 수득한다. 아데노바이러스 골격은 게놈의 좌측 말단에 mu 0 내지 9.2 및 E3 유전자의 서열 결실을 포함한다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스 골격은 mu9.2 내지 mu16의 중첩 서열을 포함하며, 이는 그들 사이의 재조합 및 재조합 아데노바이러스 벡터의 생산을 가능하게 한다. 재조합 아데노바이러스 벡터에는 E1 및 E3 지역이 없으므로, 정상 포유동물 세포에서 바이러스는 복제-불능이다. 그러나, 아데노바이러스-5 E1 지역을 내포하여 E1 기능을 트랜스로 제공하는 HEK 293 세포에서는 바이러스가 복제할 수 있다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터는 하기의 방법으로 생산되었다: 인간 IL12의 유도성 발현을 위한 DNA 요소를 운반하는 선형화 셔틀 벡터 및 아데노바이러스 골격을 HEK293 세포에 공동 형질감염시킨다. 셔틀 벡터상의 중첩 서열 및 바이러스 골격 사이의 재조합에 의해 재조합 아데노바이러스의 생산이 유발되어 HEK293 세포 내에서 바이러스 입자로 패키지된다. HEK293 세포는 우태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다.
제안된 연구에 사용된 바이러스는 CsCl 밀도 경사 원심분리에 의해 정제되었다. 재조합 아데노바이러스에 2 라운드의 플레이크 정제를 실시하고, 얻어진 종자 스톡을 사용하여 완전히 특성조사된 마스터 세포 뱅크로부터의 HEK293 세포내에서 증폭함으로써 마스터 바이러스 뱅크(MVB: master viral bank)를 생산하였다. 복제 적격 아데노바이러스(RCA: replication competent adenovirus), 무균성, 미코플라스마, 우발 바이러스, 레트로바이러스, 인간 바이러스 HIV1/2, HTLV1/2, HAV, HBV, HCV, EBV, B19, CMV, HHV-6, 7 및 8, 소 및 돼지 바이러스, 완전 벡터 서열분석을 포함하는 대규모의 cGMP/GLP 출하 시험, 및 인간 세포주에서의 AD-유도성 IL12 발현에 의한 기능적 시험을 MVB에 실시하였다.
MVB로부터의 바이러스는 cGMP 시설에서 정제 바이러스의 생산에 사용될 수 있고, 동정, RCA, 무균성, 미코플라스마, 우발 바이러스, 바이러스 입자 대 감염유발량 단위 비율, 숙주 세포 DNA 오염, 내독소 및 단백질을 포함하는 출하 시험 및 인간 세포주에서의 AD-유도성 IL12 발현에 의한 기능적 시험을 다시 실시할 수 있다.
6.2. hIL-12 형질전환 유전자 및 레오스위치® 치료 시스템(RTS)을 포함하는 아데노바이러스에 의한 자가유래 수지상 세포의 형질도입
인간 대상으로부터 유래된 수지상 세포를 생체외 형질도입하여 종양 내에 주사한다. 바이러스 형질도입 전에 생존력, 순도(통상 DC 표현형을 나타내는 세포가 >80%), 무균성, 미코플라스마 및 내독소에 대하여 DC를 특성조사한다. 바이러스 형질도입 후에, 세포를 반복 세척하여 흡수되지 않은 바이러스를 모두 제거한다. 최종 세척의 상등액에서 잔류 바이러스 함량을 PCR로 시험한다. DC는 아데노바이러스 벡터(비-통합 바이러스)에 의해 생체외 형질도입되며, 종양내 주사후 DC의 수명 및 차후의 배출 림프절로의 이동이 짧으므로, 바이러스 DNA가 임의의 비-표적 세포내로 혼입될 것이 예상되지는 않는다. DC의 아데노바이러스 형질도입에 사용된 프로토콜은 80-90% 형질도입을 달성할 것으로 기대되며 매우 효율적인 것으로 생각된다.
백혈구 성분채집술(leukapheresis)에 의한 PBMC 의 수확: UPCI 외래 성분채집술 유닛에서 환자에게 표준 90 내지 120 분의 백혈구 성분채집술을 시행한다. 백혈구 성분채집술 절차는, 한쪽 팔 정맥으로부터 혈액을 채취하는 단계; 혈액 구성성분이 분리되고 하나 이상의 구성성분이 제거되는 원심분리기(세포 분리기)를 통해 혈액이 통과하는 단계; 및 대상의 동일하거나 상이한 팔의 정맥으로 나머지 구성성분이 환류되는 단계를 포함한다. 세포 분리기 장치를 통해 혈액을 처리하는 동안 임의의 시점에 대상의 총 혈액 부피의 15% 이하를 뽑아낸다. 세포 분리기내에서 혈액은 혈장, 혈소판, 백혈구 및 적혈구로 분리된다. 백혈구(WBC)를 수거하고 다른 모든 구성성분들은 대상의 혈액 순환으로 환류된다. 이 절차에 2개의 말초 IV 라인(peripheral IV line)을 사용하기 위하여 모든 시도를 동원한다. 그것이 불가능할 경우, 중심 라인(central line)이 필요할 수 있다. 대상은 백혈구 성분채집술 시행에 있어서 의사의 허가를 받아야 하며, 절차에 앞서 활력 징후(예를 들어 혈압)에 대해 일상적 검사를 실시한다.
프로세싱: 수집 후에 류코팩(leukapack)은 CPL에 손으로 전달되어 일루트라(ELUTRA)™에서 원심 경사법(centrifugal elutriation)에 의해 즉시 프로세싱된다. 이는 임상적 사용이 승인된 폐쇄 시스템이다. 단핵구 분획을 회수하고, 세포의 회수 및 생존력이 확보된 후에 이들을 아스트롬 카트리지(Aastrom cartridge)에 전달하여 IL-4 및 GM-CSF의 존재하에 6일간 배양한다. 모든 프로세싱 및 세척 절차는 무균 조건하에 수행된다.
초기 평판배양: 단일 류코팩으로부터 회수된 단핵구를 트리판 블루 염료의 존재하에 계수하여 생존가능 세포의 수를 결정한다. 단핵구의 순도를 유세포 분석으로 평가한다. SOP-CPL-0166당 1,000 IU/mL의 IL-4 및 1,000 IU/mL의 GM-CSF를 함유하는 무혈청 무항생제 셀제닉스(CellGenix) 배지에 단핵구를 5 내지 10×106 세포/mL로 재현탁하여 아스트롬 카트리지에 넣는다. 카세트 접종에는 50 ml의 최소 로딩 부피 및 최소 세포수가 요구된다.
배양: 완전히 폐쇄된 cGMP-적합성 자동 배양 장치인 리플리셀(Replicell) 시스템 내의 인큐베이터에 아스트롬 카트리지를 넣어 미성숙 DC를 생성시킨다.
미성숙 DC 수확: 제6일에, 아스트롬 카트리지를 인큐베이터로부터 회수하고 미성숙 DC를 수확한다. 1,500 rpm에서 원심분리하여 세포를 회수하고, 셀제닉스 배지로 세척한 후, 트리판 블루 염료의 존재하에 계수하여 형태 및 표현형 특성을 확인한다.
생존력: 트리판 블루의 존재하에 혈구계 세포 계수를 수행하여 생존력을 결정한다. 일반적으로 수확된 세포의 >95%가 생존가능하며, 다시 말해서 트리판 블루 염료를 배제한다. 생존력이 70% 미만이면 미성숙 DC를 폐기한다.
표현형 분석: 배양중에 생성된 세포를 혈구계상에서 현미경으로 관찰하여 계수하고, 트리판 블루 염료를 사용하여 예비 감별 계수(preliminary differential count)(DC 대 림프구)를 얻는다. DC 대 림프구에 게이팅하고 미성숙 DC의 높은 전방 산란 및 측방 산란 특성을 동정 기준으로 하는 유세포 분석으로 감별 계수를 확정한다. 통상적으로 미성숙 DC는 수지상 세포의 형태를 지닌 세포를 >80%로 함유하고 DC 표현형을 가진다.
IL -12 p70 효능 에세이: 선천 면역 신호(예를 들어, LPS)의 존재 또는 부재하에 CD40L에 의해 활성화될 경우, 또는 자발적으로, 성숙한 DC(mDC)가 IL-12p70을 생산하는 능력을 보유한다는 사실이 확립되어 있다. 표준화된 IL-12p70 생산 에세이가 최근에 확립되어, 다양한 조건하에 생성된 DC 백신의 소량 시료 또는 대량 로트에 적용할 수 있게 되었다. 현행 효능 에세이는 별개의 2 단계로 구성되며, 제1 단계는 자극인자로서의 인간 CD40 리간드 유전자로 안정하게 형질감염시킨 J588 림프종 세포와 반응자 DC(responder DC)의 공동 인큐베이션을 포함한다. 제2 단계는, J558/CD40L +/- LPS로 자극한 DC에 의해 분비되는 IL-12p70 수준에 대하여 상기 공동-배양으로부터의 상등액을 루미넥스(Luminex) 시스템에서 분석함을 포함한다. 이 효능 에세이는 18.5%(n=30)의 에세이간 CV 및 넓은 동적 범위를 가지며, 이는 대단히 상이한 수준의 IL-12p70 생산을 특징으로 하는 다양한 DC 산물의 평가를 용이하게 한다. 13명의 정상 공여자의 단핵구로부터 생성된 DC 산물을 이용하여 확립된 에세이의 정상 범위는 8-999 pg/mL이고, 평균은 270 pg/mL이다.
수지상 세포의 생산 및 출하 기준
시험관내 생성된 수지상 세포의 각 로트를 미생물 오염(호기성 및 혐기성 박테리아, 진균 및 미코플라스마) 및 내독소 존재에 대해 시험하고 표현형 및 기능성에 관해 특성조사한다. 대상에게 주사할 모든 수지상 세포는 신선해야 하며 냉동보존하지 않는다.
DC 의 품질 보장 시험: 상기와 같이 생성된 DC에 대해 무균성, 생존력, 순도, 효능 및 안정성을 평가한다. 세포성 산물의 출하 기준을 확립하여 철저하게 준수한다.
생존력: 배양중에 생성된 세포를 혈구계상에서 현미경으로 관찰하여 계수하고, 트리판 블루 염료를 사용하여 감별 계수(DC 대 림프구)를 얻는다. 이 계수는 시험 배양물 내의 생존가능 세포의 백분율을 제공한다. 출하 기준에 부합하기 위해서는, 트리판 블루 배제에 의한 세포 생존력이 70%를 초과하고, 최소 70%의 세포에서 단핵구-유래 DC 표지자로서 HLA-DR 및 CD86가 발현될 것이 요구된다. DC 성숙 상태를 평가하기 위한 CD83 및 CCR7, 및 림프구 오염을 평가하기 위한 CD3 및 CD19와 같이, 탐구적 분석을 위해 추가의 표지자들이 포함될 수 있다.
순도: FITC- 및 PE-접합된 mAb로 염색된 세포의 2-색상 유세포 분석을 이용하여, 형태학적으로 동정된 DC 개체군이 DC에 대해 정의된 표면 항원을 발현하고 단핵구 및 T 및 B 세포 계열 항원은 가지고 있지 않음을 결정한다. 백신 제조를 위해서는, 생성된 DC가 HLA-DR 및 CD86을 발현해야 하고 CD3, CD19 또는 CD14은 발현하지 않아야 한다. mDC로 간주하기 위해서는 세포가 CD83+ 및 CCR7+을 발현해야 한다.
효능: DC의 효능 측정을 정의하기 위하여, 상기와 같이 IL-12p70을 생산하는 그의 능력을 결정하였다.
무균성: 피츠버그 대학교 의료 센터 미생물학 실험실에서 BD 백텍(Bactec) 시스템(Becton Dickinson Co., Sparks, MD)을 사용하여 박테리아(호기성 및 혐기성) 및 진균 배양으로 DC를 시험한다. 미생물 배양의 최종 결과는 14일 후에 이용가능하다. 백신용으로 DC를 출하하기 전에 그람 염색을 수행하며, 미생물 존재에 대해 음성이어야 한다.
핵산 혼성화 기술에 기초한 젠-프로브 미코플라스마 조직 배양 고속 검출 시스템(Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture Rapid Detection System)(Gen-Probe, Inc. San Diego, CA)을 사용하여 IMCPL이 미코플라스마를 시험한다. 리물러스 유주세포 용해물 발열원 플러스 에세이(Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Plus assay (Bio Whittaker, Inc., Walkerville, MD)를 이용하여 내독소 시험을 수행한다. 내독소 시험은 최종 산물의 출하에 앞서 수확시에 세포 배양물에 수행한다. 허용되는 내독소 수준은 <5 EU/kg 체중이다. 향후 분석을 위하여, 형질도입되지 않았거나 형질도입된 수지상 세포를 냉동보존한다.
형질도입된 모든 세포가 형질전환 유전자를 발현할 것으로 예상된다. 80%를 초과하는 DC가 형질도입될 것으로 예상된다. 천연 코딩 서열이 형질전환 유전자 내에 유지되므로, 산물은 생물학적으로 활성일 것이다. 종양 내에 주사된 바이러스-형질도입 DC는 미성숙 DC 표현형으로서 성숙될 때까지는 IL-12를 발현하지 않으므로, 이 단계에서의 IL-12는 대부분 형질전환 유전자로부터 발현된다. IL-12 형질전환 유전자의 발현이 소분자 활성화 약물 RG-115932에 의해 용량 의존적 방법으로 유도되므로, 형질도입 DC 내의 형질전환 유전자 발현의 수준을 목적하는 수준으로 제어할 수 있다. 인간 대상에게 투여하기 위해 제조된 형질도입 DC의 작은 부분을, IL12 발현의 활성화 약물-의존성 유도에 대해 시험관내에서 시험할 수 있다. IL-12 발현은 ELISA에 의해 4 ng/ml의 감도로 에세이할 수 있다.
제안된 인간 연구와 동일한 방법으로 아데노바이러스 형질도입 DC의 주사 및 쥐과 IL12 형질전환 유전자의 유도를 통해 피하 흑색종(B16) 종양을 보유한 마우스를 처리한다는 점에서, 생체내 마우스 종양 모델은 인간 연구와 유사하다. 종양 퇴행이 관찰된 후에 동일한 종양 세포의 재접종은 종양 성장을 유발하지 않았으며, 이는 전신 종양 면역을 의미한다.
제안된 연구에 사용된 벡터에 의해 형질도입된 세포에서 IL-12를 시험관내 유도하면 24 시간 내에 106 세포당 약 500 ng의 IL-12가 생산되어 ELISA에 의해 결정될 것으로 예상된다. 흑색종의 마우스 모델을 사용하는 전임상 연구에서, 106 이상의 형질도입 DC의 종양내 주사가 효능을 나타냈다. 그러나, 요구되는 종양내 주사는 상기 양 미만의 수준에서 효능을 나타낼 것으로 예상되므로, 양의 증감이 필요한지 여부를 결정하기 위한 시작점으로서 5×107 형질도입 DC의 주사가 이용될 수 있다.
예를 들어 시험관내에서, IL12의 유전자를 운반하는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입한 인간 및 마우스 세포주 및 1차 수지상 세포는 용량 의존적 방법으로 활성화 약물에 반응하여 IL12 발현의 유도를 나타낸다.
인간 DC의 아데노바이러스 형질도입에 있어서 바이러스 흡착의 지속기간 및 MOI를 변화시킨 결과, 3 시간의 바이러스 흡착 및 500의 MOI에 의해 이들 세포가 효율적으로 형질도입되는 것으로 나타났다. 이들 형질도입 인간 DC에서 활성화 약물은 IL-12 발현을 유도하였다(도 9).
상기와 같은 마우스 흑색종 모델에 대한 생체내 실험을 위하여, C57/BL6 마우스에 B16 세포를 피하 주사하여 종양을 형성시켰다. RTS의 제어하에 쥐과 IL-12 유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터를 형질도입한 DC의 종양내 주사는, 활성화 약물의 투여와 함께, 종양에 특이적인 전신 면역을 유발하였다. 이 처리는 종양 퇴행을 유발하였다. 50일 후에 B16 세포를 치료된 마우스에 재접종한 결과, B16 세포는 종양을 형성하지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 종양 면역의 유도는 활성화 약물의 투여에 의존적이었으며, 따라서 주사된 형질도입 DC 내의 IL-12 발현에도 의존적이었다. 활성화 약물은 복강내 및 경구 경로에서 효과적이었다. 도 11 및 도 14를 참조한다.
6.3. 활성화 약물의 제형
본 명세서에서 사용된 활성화 약물은 하기 제형 중 어느 하나로 제형화된다:
(1) 100% 라브라솔;
(2) (a) 멘톨, (b) 티몰, (c) 유칼립톨, (d) 아스파탐, (e) 소듐 사카린, (f) 시트르산, (g) 페퍼민트 향, (h) 크림 향, (i) 라브라솔을 포함하는 리스테린 향미 라브라솔(Latitude Pharmaceuticals Inc., USA);
(3) 미글리올 812 및 포스포리폰 90G(Latitude Pharmaceuticals Inc., USA); 또는
(4) 미글리올 812, 포스포리폰 90G 및 비타민 E 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(Latitude Pharmaceuticals Inc., USA).
6.4. 전달
다양한 농도 및 구체적인 프로토콜을 생각할 수 있지만 환자를 치료하는 한 예는, RTS의 제어하에 hIL-12(인간 인터류킨 12)를 발현하도록 조작된 형질도입 자가유래 수지상 세포(AdDCs)를 5×107개의 농도로 무균 식염에 현탁하여 경구 활성화 약물(RG-115932)과 조합하여 환자에게 투여하는 종양내 주사(들)을 포함한다.
6.4.1. 초기 치료
제1일 입원환자 방문: 제1일에, 기준선 신체검사(활력 징후, 체중 및 ECOG 상태를 포함)를 수행한다. 기준선 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 시험관내 가공된 수지상 세포의 종양내 주사로부터 약 3 시간 전에, 각 대상에게 활성화 약물(코호트 1 - 0.01 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 및 3 mg/kg)을 식사 직후에 투여한다. 활성화 약물 및 그의 주요 대사산물의 단회 용량 약물동태학 평가를 위하여, 제1일에 정해진 시간 간격으로(투여전, AD 투여후 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 및 24 시간) 채혈한다. RTS의 제어하에 hIL-12를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포를 5×107 세포의 농도로 각 대상에게 단회 종양내 주사한다. 국소 주사 부위 반응 및/또는 과민 반응에 관하여 대상을 신중히 관찰한다. 제2일 내지 제14일 입원환자 방문: 제2일부터 제14일까지 각 대상에게 활성화 약물을 식사 직후에 투여한다. 제2일부터 제14일까지 활력 징후 및 유해 사례를 매일 수집한다. hIL-12 및 세포 면역 반응 측정을 위하여, 제4일±24 시간에 약 50%의 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검을 수거한다. 제8일에 체중을 측정한다. hIL-12 및 세포 면역 반응 측정을 위하여, 제8일±24 시간에 제4일의 생검을 수행하지 않은 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검을 수거한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응의 에세이를 위해 제4일±24 시간 및 제8일±24 시간에 채혈한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 작성하여 hIL-12 형질전환 유전자에 의한 치료로 인해 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 제8일에 기준선 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 활성화 약물 및 그의 주요 대사산물의 항정상태 약물동태학/ADME 평가를 위해, 제8일에 정해진 시간 간격으로(투여전, AD 투여후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 및 24 시간) 채혈한다.
제14일 입원환자 방문: 제14일에 각 대상에게 활성화 약물을 식사 직후에 투여한다. 각 대상에게 신체검사(활력 징후, 신장, 체중 및 ECOG 상태를 포함)를 실시한다. 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응의 에세이를 위해 제14일±24 시간에 채혈한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 작성하여 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지 여부를 결정한다.
정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 대상으로부터 채혈하여 아데노바이러스 및 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응을 측정한다. 기준선 혈청 사이토카인 프로파일을 위해 혈액을 채취한다. AdVeGFP 감염성 차단 유형 에세이(infectivity blocking type assay)를 사용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다(Gambotto, Robins et al. 2004). 환자의 혈청 및 발현 벡터로부터 생산된 RTS 단백질을 사용하여 웨스턴 블로팅 및/또는 ELISA로 RTS 구성성분에 대한 항체 반응을 평가한다. 추가로, 혈청에서 IL-12, IFN-감마, IP-10 및 다른 Th1/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNF-알파, IL-4, IL-5 및 IL-10에 대한 다발 사이토카인 시험을 루미넥스에 의해 실행한다. 이들 항체 및 사이토카인 에세이에는 약 10 ml의 혈액이 필요하다.
세포 면역 반응 에세이에는 약 50-60 ml의 혈액이 사용되며, 이로부터 CD4 및 CD8 T 세포 서브세트가 분리된다. 만약 있다면 AdV- 및 RTS-유래 항원에 의해 활성화되는 T 세포에 의한 INF-감마 생산에 대한 ELISPOT 에세이에서, 빈 AdV 벡터, AdV-RTS 또는 AdV-RTS-hIL12 벡터로 형질도입시킨 자가유래 DC와 분리된 T 세포를 혼합한다. 공유 흑색종 항원을 발현하는 DC 및/또는 이러한 종양 세포를 사용하여 유사한 에세이를 수행함으로써 종양에 대한 조기 반응을 평가한다. 필요한 경우에는 추가의 에세이도 수행한다.
제14일±24 시간에, hIL-12 및 세포 면역 반응의 측정에 이용가능한 조직을 가진 모든 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검을 수거한다. 유해 사례를 기록한다. 제14일 절차를 완료한 후에, 각 대상을 입원환자 진료소로부터 퇴원시키고 약 3주 후에 1개월 추적 외래환자 방문을 위해 내원하도록 요청한다.
조기 종료 방문: 대상이 입원환자 치료 단계를 완료하지 못할 경우에는, 진료소로부터 퇴원하기 전에 하기의 조기 종료 방문 절차를 실행한다. 각 대상은 신체검사(활력 징후, 신장, 체중 및 ECOG 상태를 포함)를 받는다. 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 상기와 같이 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응의 에세이를 위해 혈액을 채취한다. 또한 상기와 같이 혈청 사이토카인 프로파일을 작성하여 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지 여부를 결정한다. hIL-12 및 세포 면역 반응의 측정에 이용가능한 조직을 가진 모든 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검을 수거한다. 유해 사례를 기록한다. 조기 종료 방문 절차를 완료한 후에, 각 대상을 입원환자 진료소로부터 퇴원시키고 약 3주 후에 1개월 추적 외래환자 방문을 위해 내원하도록 요청한다.
제1월 내지 제4월 추적 방문: 제1월 내지 제4월의 추적 기간 동안 유해 사례를 수집한다. 제1월, 제2월 및 제3월 방문시에 추적 신체검사(활력 징후, 체중 및 ECOG 상태를 포함)을 실행한다. 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 제1월, 제2월 및 제3월 방문시에 소변 및 혈액을 수집한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응의 에세이를 위해 제1월 및 제3월 방문시에 혈액을 수집한다. 제1월 방문시에 혈청 사이토카인 프로파일 작성을 위해 채혈한다. 제1월 방문시에, hIL-12 및 세포 면역 반응의 측정을 위해 이용가능한 조직을 가진 대상에 대해 종양 및/또는 배출 림프절의 생검을 수행한다. 제2월 및 제4월 방문시에 CT/PET 스캔을 수행하여 전체적인 질환 진행 또는 퇴행을 평가한다.
제5월 내지 제6월 추적 방문: 제3월 또는 제4월에 약물-관련 독성이 관찰된 경우, 제5월 내지 제6월 추적 방문을 실행한다. 제5월 내지 제6월 추적 기간 동안 유해 사례를 수집한다. 제5월부터 제6월 외래환자 방문시까지 진료소 직원이 각 대상에게 전화를 연결하여 대상 안전성을 관찰한다. 약물-관련 독성이 제5월 동안에 발생하거나 지속되고, 조사자가 판단하기에 심각하거나 불안정하거나 추가의 평가를 요한다면, 진료소 직원은 대상에게 전화를 연결할 뿐 아니라 대상으로 하여금 내원할 것을 요청한다. 제6월 방문시에 추적 신체검사(활력 징후, 체중 및 ECOG 상태를 포함)을 실행한다. 혈청 화학검사, 요검사 및 혈액검사(안전성 프로파일)를 위해 소변 및 혈액을 수집한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응의 에세이를 위해 제6월 방문시에도 혈액을 수집한다. 제6월 방문시에 CT/PET 스캔을 수행하여 전체적인 질환 진행 또는 퇴행을 평가한다.
활성화 약물 투여 및 중지 기준: 용량-제한 독성(DLT: dose-limiting toxicity, 즉, 코호트 1 내의 그룹에 선정된 3명의 대상 중에서 총 >2명이 CTCAE v3.0에 따른 >등급 3 독성을 경험)이 결정될 경우에는, 주어진 용량 수준에서 다음 그룹의 3명의 대상에게 동일한 용량 수준의 활성화 약물을 투여한다. 추가의 용량 그룹에서 1명 이상의 대상에게서 DLT가 관찰될 경우에는, 단계적 용량 확대를 중단하고 다음으로 낮은 용량을 최대 용인 용량(MTD: maximum tolerated dose)으로 간주하며, 그렇지 않을 경우에는 MTD에 도달하거나 10 mg/kg의 최대 용량에 이르기까지(어느 것이 먼저 발생하든) 단계적 용량 확대를 재개한다.
차기 최고 용량의 활성화 약물 투여에 대상이 선정되기 전에, AdDC의 주사후 최대 1개월 동안 코호트 1의 각 그룹내의 모든 대상에 대하여 안전성, 내성 및 형질전환 유전자 기능을 평가한다.
대상이 CTCAE v3.0에 따른 >등급 3 독성을 경험하고, 그것이 연구 약물 치료에 관련되었음이 가능성을 가지거나(possibly), 유력하게 추정되거나(probably), 명백하다고(definitely) 여겨지는 경우에는, 그 대상에 대한 활성화 약물의 투여를 중단하고 대상은 조기 종료 방문 절차를 수행한다.
연구 중지 기준: 코호트 내의 대상 중 >70%가 CTCAE v3.0에 따른 >등급 3 독성을 경험하고, 그것이 연구 약물 치료에 관련되었음이 가능성을 가지거나, 유력하게 추정되거나, 명백하다고 여겨지는 경우에는, 모든 대상에 대한 활성화 약물의 투여를 중단하고 모든 대상은 조기 종료 방문 절차를 수행한다.
조사용 시험 투약(Investigational Trial Medication): 본 시험에서는 안전성, 내성, 형질전환 유전자 기능 및 면역학적 효과에 대하여 2개의 조사용 투약의 조합을 평가한다. 병기 III 또는 IV 흑색종을 보유한 대상에게, hIL-12를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포를 5×107개의 농도로 단회 종양내 주사함과 조합하여, 소분자 활성화 약물을 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 1.0 mg/kg 및 10.0 mg/kg의 용량으로 연속하는 14일 동안 매일 1회 경구 용액으로 투여한다. 대상은 연속하는 14일 동안의 활성화 약물 치료와 조합한 추가의 AdDC 종양내 주사를 선택할 수 있다.
6.5. 형질전환 유전자 기능 및 면역학적 효과의 평가에 대한 안전성의 평가
내독소 시험은 최종 산물의 출하에 앞서 수확시에 세포 배양물에 수행한다. 허용되는 내독소 수준은 <5 EU/kg 체중이다. 향후 분석을 위하여, 형질도입되지 않았거나 형질도입된 수지상 세포를 냉동보존한다.
안전성 평가: 신체검사, 활력 징후, 혈청 화학검사, 요검사, 혈액검사, 유해 사례, 및 시험 및 12개월 추적 기간 동안 아데노바이러스 및 RTS 구성성분에 대한 항체 및 세포 면역 반응을 통해, 경구 활성화 약물과 조합된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 단회 종양내 주사의 안전성을 평가한다. 임신 가능성이 있는 여성에게는 선별시에 임신 시험을 시행한다. 또한, 재치료 기간의 제0일 및 선별시에 대상으로부터 동시 투약 목록을 입수하여, 동시 투약 및 잠재적 유해 사례 사이에 어떤 관계가 있는지 여부를 결정한다. 선별 단계 및 초기 입원환자 치료 단계(26일 기간) 중에 대상으로부터 대략 총 89 티스푼(439 ml)의 혈액 및 백혈구 성분채집술이 수집된다. 입원환자 재치료 단계(26일 기간, 이전의 입원환자 방문으로부터 5-6주) 중에 대상으로부터 대략 총 75 티스푼(370 ml)의 혈액 및 백혈구 성분채집술이 수집된다. 외래환자 추적 단계(제1월-제6월) 중에 대상으로부터 대략 총 46 티스푼(227 ml)의 혈액이 수집된다.
신체검사: 정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 완전 신체검사(ECOG 수행 상태를 포함)를 실행한다. 선별 방문시에 각 대상의 의료적 개인력 및 인구학적 정보(demographics)도 기록한다.
활력 징후: 각 대상의 활력 징후는 각각의 예정된 신체검사에 포함되나 모든 입원환자 및 외래환자 방문시에도 수집된다. 활력 징후는 혈압, 맥박, 체온 및 호흡을 포함한다. 정해진 방문시에 체중 및 신장도 기록된다. 활력 징후(신장 및 체중은 제외)는 최초 2 시간 동안에는 매시간 기록하고, 이후에는 활성화 약물이 투여된 후에 매 8 시간마다 기록한다.
혈액 화학검사: 정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 각 대상으로부터 금식하지 않은 상태에서의 무작위 혈액 시료를 채취하고, 화학검사를 위해 혈청을 수확하였다. 하기의 혈청 시험을 수행한다: AST(아스파테이트 트란스아미나제), ALT(알라닌 트란스아미나제), GGT(감마글루타밀 트란스펩티다제), LDH(락틱 데하이드로게나제), LAP(류신 아미노펩티다제), 알칼린 포스파타제, 크레아티닌, 총 빌리루빈, 총 단백질, 알부민, 혈중 우레아 질소, 총 콜레스테롤, 글루코스 및 전해질.
요검사: 정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 각 대상으로부터 무작위 중간뇨(mid-stream urine) 시료를 수집하여 분석한다. 하기의 시험을 수행한다: 색도 및 성상의 기술, 비중, pH, 글루코스, 케톤체, 단백질, 적혈구 및 백혈구 수, 및 피롤우리아.
혈액검사: 정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 각 대상으로부터 금식하지 않은 상태에서의 무작위 혈액 시료를 채취하고, 하기와 같은 혈액학적 시험을 실행한다: 백혈구 계수, 감별 백혈구 계수(differential white blood cell count), 적혈구 계수, 헤마토크릿, 헤모글로빈, 적혈구 지수 및 혈소판 계수를 포함하는 전혈구 계수(CBC: complete blood count). 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT: partial thromboplastin time) 및 프로트롬빈 시간(PT: prothrombin time)도 산정한다.
유해 사례: NCI 유해 사례 표준 용어 기준(CTCAE: Common Terminology Criteria for Adverse Events)(version 3.0)을 이용하여 시험 및 3-6개월 추적 기간 중의 독성을 평가한다. 유해 사례/경험은 시험 품목(약물, 생물제제 또는 장치)의 사용에 연계된 임의의 반응, 부작용 또는 다른 뜻밖의 사건(징후, 증상, 실험실적 데이터의 변화)으로서, 사건이 시험 품목에 관련된 것으로 간주되는지 여부에 무관하다. 심각한 유해 사례/경험은 하기의 결과 중 어느 하나를 유발하는 임의의 유해 사례 또는 경험이다: 사망, 생명을 위협하는 유해 경험, 선천성 이상/출생 결함, 입원환자의 입원 또는 기존 입원의 장기화, 지속적이거나 심각한 장애/불능. 중요한 의료 사건/경험은, 사망을 초래하거나 생명을 위협하거나 입원을 요하지 않더라도, 적절한 의학적 판단에 기초할 때 이들이 대상을 위태롭게 하거나 본 정의에 열거한 결과 중의 하나를 방지하기 위해 내과적 또는 외과적 중재를 필요로 할 수 있다면, 심각한 유해 경험으로 간주될 수 있다.
유해 사례의 중증도는 하기와 같은 등급으로 분류된다: 등급 I(경도), 등급 2(중등도), 등급 3 (중증), 등급 4 (생명 위협 또는 장애 유발), 등급 5 (유해 사례에 관련된 사망). 유해 사례 및 연구 의약 사이의 관계는 임상적 판단 및 하기의 정의에 기초하여 결정된다:
a. 명백하게 관련됨(definitely related)은, 연구 의약의 투여로부터 합리적인 시기적 순서를 따르고, 연구 의약에 대한 공지의 반응 양상을 따르며, 프로토콜상 적절한 경우에는 연구 의약의 중단 후에 개선되고(양성 투여중단(positive dechallenge)) 반복 노출후에는 다시 나타남(양성 재투여(positive rechallenge))으로써 확인되며, 대상의 임상적 상태의 공지 특성 또는 다른 요법에 의해 합리적으로 설명될 수 없는 유해 사례이고,
b. 유력한 추정상 관련됨(probably related)은, 연구 의약의 투여로부터 시기적 순서를 따르고, 연구 의약에 대한 공지의 반응 양상을 따르며, 프로토콜상 적절한 경우에는 투여중단 후에 개선됨으로써 확인되고, 대상의 임상적 상태의 공지 특성 또는 다른 요법에 의해 합리적으로 설명될 수 없는 유해 사례이며,
c. 관련될 가능성 있음(possibly related)은, 연구 의약의 투여로부터 합리적인 시기적 순서를 따르고, 연구 투약에 대한 공지의 반응 양상을 따르지만, 대상의 임상적 상태 또는 다른 요법에 의해 발생하였을 수도 있는 유해 사례이고,
d. 무관함(unrelated)은, 병인이 연구 의약에 무관함을 의미하는 충분한 정보가 존재하는 유해 사례이다. 하기 변수 중 2개 이상이면 무관한 유해 사례에 해당한다: 1. 유해 사례가 연구 의약의 투여로부터 합리적인 시기적 순서를 따르지 않음, 2. 유해 사례가 대상의 임상적 상태 또는 다른 요법에 의해 용이하게 설명됨, 3. 용량 감소 또는 요법 중지시에 유해 사례가 약화되지 않음(관찰 간격 이내에 유해 사례의 약화가 합리적으로 예상된다는 가정하에).
대상의 선정 이후에 관찰 또는 보고된 모든 유해 사례는 기록된다. 선정 당시에 존재하였다가 악화된 임의의 병태는 유해 사례로서 기록된다. 시험 방문시에 자진하여 말한 증상 및 임상적 관찰 및 평가에 기초하여 유해 사례를 결정한다. 각각의 입원환자 및 외래환자 방문시에, 선정된 대상에게는 "좀 어떠십니까?"와 같은 비-유도 질문(non-leading question)으로 유해 사례에 관한 정보를 자진하여 말할 것을 요청한다. 실험실적 수치의 변화는, 임상적으로 유의하고 치료의 개시와 같은 임상적 변화 또는 조치가 필요할 경우에 유해 사례로서 기록된다.
아데노바이러스 및/또는 RTS 구성성분에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응: 정해진 입원환자 및 외래환자 방문시에 대상으로부터 혈액을 수집하여, 아데노바이러스 및 RTS 구성성분 및 종양 항원에 대한 잠재적 항체 및 세포 면역 반응을 평가한다. AdVeGFP 감염성 차단 유형 에세이를 사용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다(Nwanegbo, et al. 2004). 대상의 혈청 및 발현 벡터로부터 생산된 RTS 단백질을 사용하여 웨스턴 블로팅 및/또는 ELISA로 RTS 구성성분에 대한 항체 반응을 평가한다. 추가로, 혈청에서 IL-12, IFN-감마, IP-10 및 다른 Th1/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 및 IL-10에 대한 다발 사이토카인 시험을 루미넥스에 의해 실행한다. 이들 항체 및 사이토카인 에세이에는 약 10 ml의 혈액이 필요하다.
세포 면역 반응 에세이에는 약 50-60 ml의 혈액이 사용되며, 이로부터 CD4 및 CD8 T 세포 서브세트가 분리된다. 만약 있다면 AdV- 및 RTS-유래 항원에 의해 활성화되는 T 세포에 의한 INF-감마 생산에 대한 ELISPOT 에세이에서, 빈 AdV 벡터, AdV-RTS 또는 AdV-RTS-hIL12 벡터로 형질도입시킨 자가유래 DC와 분리된 T 세포를 혼합한다. 공유 흑색종 항원을 발현하는 DC 및/또는 이러한 종양 세포를 사용하여 유사한 에세이를 수행함으로써 종양에 대한 조기 면역 반응을 평가한다. 필요한 경우에는 추가의 에세이도 수행할 수 있다.
임신 시험: 임신 가능성이 있는 여성에게는 선별 방문시 및 재치료 단계의 최초 입원환자 방문 전에 소변 임신 시험을 처방한다. 초기 치료 및 모든 재치료 기간중에 시험은 활성화 약물의 투여로부터 적어도 72, 48, 24 또는 12 시간 전에 수행한다. 소변 임신 시험이 양성일 경우에는 혈청 임신 시험으로 확정한다. 임신이 확정되면, 대상이 시험에 진입하거나 재치료 단계를 계속함을 불허한다. 임신 시험은 필요한 횟수만큼 재수행할 수 있다.
동시 투약 조회: 선별시 및 재치료 단계의 최초 입원환자 방문 전에, 시험 및 추적 단계중에 발생하는 유해 사례에 대한 임의의 가능한 관계를 결정하기 위하여, 동시 투약 목록을 제공할 것을 각 대상에게 요청한다.
재치료 기준: 대상이 제한 유해 반응 없이 이전의 AdDC 접종을 용인하였고, 잠재적 재치료 시점에서 질환의 진행이 없거나 증상의 경감을 나타낸다면, 이들의 재치료를 고려한다. 주 조사자 및 치료 의사의 의견에, 연속하여 14일간 활성화 약물(코호트 1의 최대 용인 용량)과 조합된 AdDC의 종양내 주사(들)를 추가할 경우에 잠재적인 임상적 유익이 있다고 판단된다면, 하기 기준에 부합하는 조건하에 대상에게 재치료를 제안한다:
1. 제한 독성이 없었고,
2. 대상의 질환이 안정되거나 임상적 또는 주관적 개선 징후를 나타내며,
3. 레오스위치® 치료 시스템의 아데노바이러스 구성성분에 대한 항체 또는 세포 면역 반응의 증거가 없다.
형질전환 유전자 기능 및 면역학적 효과의 평가:
hIL-12의 형질전환 유전자 발현 및 세포 면역 반응의 생체내 평가를 위하여, 선별 도중(제-12일 내지 제-7일), 시험의 제4일, 제8일 및 제14일, 및 추적 기간의 제1월에 종양 및 연계된 배출 림프절의 펀치 또는 절제 생검을 수집한다(표 3-5 참조). hIL-12의 형질전환 유전자 발현 및 세포 면역 반응의 생체내 평가를 위하여, 재치료 기간의 제-12일 내지 제-7일 및 제14일에 종양 및 연계된 배출 림프절의 세침 흡인 생검을 수집한다. 생검을 표준 광학 현미경 및 면역조직화학으로 평가하여, T 세포에 의한 종양 및 배출 림프절 내로의 세포 침윤을 평가한다. 연구 주제 배경을 모르는 병리학자가 생검 절편을 판독한다. 종양 및 배출 림프절에서 DC에 의한 내인성 및 유도성 IL-12 발현을 구별하기 위하여, 적절하게 설계된 프라이머와 함께 RNA에 대한 RT-PCR을 사용한다. 혈청 사이토카인 프로파일을 위하여, 선별시, 시험의 제4일, 제8일 및 제14일, 추적 기간의 제1월, 및 재치료 기간의 제-12일 내지 제-7일, 제8일 및 제14일에 채혈한다(표 3-5 참조). hIL-12 형질전환 유전자에 의한 치료로 인해 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해 혈청 사이토카인 프로파일을 작성한다. 혈청에서 IL-12, IFN-감마, IP-10 및 다른 Th1/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 및 IL-10에 대한 다발 사이토카인 시험을 루미넥스에 의해 실행한다. 이들 항체 및 사이토카인 에세이에는 약 10 ml의 혈액이 필요하다.
활성화 약물의 단회 용량 및 항정상태 약물동태학: 활성화 약물 및 그의 주요 대사산물의 단회 용량 약물동태학 평가를 위해서는 시험의 제1일에, 항정상태 약물동태학/ADME 측정을 위해서는 시험의 제8일에, 정해진 시간 간격(투여전, 아침 투여후 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 및 24 시간)으로 채혈한다. HPLC로 혈장을 평가하여 활성화 약물 및 주요 대사산물의 하기와 같은 항정상태 약물동태학 결과를 얻는다: Cmax(최대 관찰 혈장 농도), Tmax(최대 관찰 혈장 농도까지의 시간), Ctrough(0 시간 및 24 시간에서의 농도의 평균으로서 계산된 최소 관찰 혈장 농도), C24h(24 시간에서의 혈장 농도), AUC24h(0 시간 내지 24 시간의 혈장 농도-시간 곡선하 면적), Ke(겉보기 제거율), 및 T112 (겉보기 반감기).
앞서 기술한 구체예 및 예시는 어떤 관점에서든 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니며, 본 명세서에 제시된 청구범위는 본 명세서에 분명하게 제시되었는지 여부와 무관하게 모든 구체예 및 예시를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Intrexon Corporation University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education <120> Engineered Dendritic Cells And Uses For The Treatment Of Cancer <130> IPA100266 <150> US 61/019,089 <151> 2008-01-04 <150> US 60/991,807 <151> 2007-12-03 <150> US 60/990,689 <151> 2007-11-28 <150> US 60/990,167 <151> 2007-11-26 <150> US 60/979,480 <151> 2007-10-12 <150> US 60/979,485 <151> 2007-10-12 <150> US 60/978,509 <151> 2007-10-09 <150> US 60/978,394 <151> 2007-10-08 <150> US 60/978,224 <151> 2007-10-08 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 648 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <223> IL-12 p35 <400> 1 atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60 ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120 ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180 actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240 tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300 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tcacaaaaga taaaaccagc 240 acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 300 gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360 gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420 atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480 gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540 tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600 gctttcagaa ttcgggcagt gactattgac agagtgacga gctatctgaa tgcttcctaa 660 <210> 4 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL-12 p40 <400> 4 atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300 ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt 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accccgtgta tccatatgac acggaaaccg gtcctccaac tgtgcctttt cttactcctc 32520 cctttgtatc ccccaatggg tttcaagaga gtccccctgg ggtactctct ttgcgcctat 32580 ccgaacctct agttacctcc aatggcatgc ttgcgctcaa aatgggcaac ggcctctctc 32640 tggacgaggc cggcaacctt acctcccaaa atgtaaccac tgtgagccca cctctcaaaa 32700 aaaccaagtc aaacataaac ctggaaatat ctgcacccct cacagttacc tcagaagccc 32760 taactgtggc tgccgccgca cctctaatgg tcgcgggcaa cacactcacc atgcaatcac 32820 aggccccgct aaccgtgcac gactccaaac ttagcattgc cacccaagga cccctcacag 32880 tgtcagaagg aaagctagcc ctgcaaacat caggccccct caccaccacc gatagcagta 32940 cccttactat cactgcctca ccccctctaa ctactgccac tggtagcttg ggcattgact 33000 tgaaagagcc catttataca caaaatggaa aactaggact aaagtacggg gctcctttgc 33060 atgtaacaga cgacctaaac actttgaccg tagcaactgg tccaggtgtg actattaata 33120 atacttcctt gcaaactaaa gttactggag ccttgggttt tgattcacaa ggcaatatgc 33180 aacttaatgt agcaggagga ctaaggattg attctcaaaa cagacgcctt atacttgatg 33240 ttagttatcc gtttgatgct caaaaccaac taaatctaag actaggacag 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aagtgaacgc gctcccctcc ggtggcgtgg tcaaactcta 35820 cagccaaaga acagataatg gcatttgtaa gatgttgcac aatggcttcc aaaaggcaaa 35880 cggccctcac gtccaagtgg acgtaaaggc taaacccttc agggtgaatc tcctctataa 35940 acattccagc accttcaacc atgcccaaat aattctcatc tcgccacctt ctcaatatat 36000 ctctaagcaa atcccgaata ttaagtccgg ccattgtaaa aatctgctcc agagcgccct 36060 ccaccttcag cctcaagcag cgaatcatga ttgcaaaaat tcaggttcct cacagacctg 36120 tataagattc aaaagcggaa cattaacaaa aataccgcga tcccgtaggt cccttcgcag 36180 ggccagctga acataatcgt gcaggtctgc acggaccagc gcggccactt ccccgccagg 36240 aaccatgaca aaagaaccca cactgattat gacacgcata ctcggagcta tgctaaccag 36300 cgtagccccg atgtaagctt gttgcatggg cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa 36360 aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga aagcacatcg tagtcatgct catgcagata 36420 aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga aaaagacacc atttttctct caaacatgtc 36480 tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc 36540 tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata agcataagac ggactacggc catgccggcg 36600 tgaccgtaaa 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Claims (73)

  1. 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 유전자 스위치는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및 (2) 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 인터류킨-12(IL-12)의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, IL-12의 기능을 가진 단백질을 조건부로(conditionally) 발현시키는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 (1) 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하며, 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및 (2) 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 IL-12의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  4. 제3항에 있어서, rAD.RheoIL12인 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 스위치가 엑디손 수용체(EcR)-기제의 유전자 스위치인 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 스위치를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기에서 상기 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열에 의해 암호화되는 단백질들이 상호작용하여 리간드-의존적인 전사 인자로서 기능하는 단백질 복합체를 형성하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 및 제2 전사 인자가 내부 리보솜 도입 부위에 의해 연결되는 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 내부 리보솜 도입 부위가 EMCV IRES인 벡터.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 스위치를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드가 제1 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열을 포함하고 제2 프로모터의 조절하에 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기에서 상기 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열에 의해 암호화되는 단백질들이 상호작용하여 리간드-의존적인 전사 인자로서 기능하는 단백질 복합체를 형성하는 벡터.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 서열이 VP-16 전사활성 도메인 및 레틴산-X-수용체(RXR) 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 전사 인자 서열이 GAL-4 DNA 결합 도메인 및 엑디손 수용체(EcR) 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 벡터가 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 IFN-알파의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-12의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 IL-12를 암호화하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서, IL-12의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드가 야생형 인간 IL-12와 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 벡터를 수지상 세포내에 도입함으로써 수지상 세포의 적어도 일부를 개질함을 포함하는, IL-12의 기능을 가진 단백질을 조건부로 발현하는 수지상 세포의 개체군의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 수지상 세포가 인간 수지상 세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 수지상 세포가 골수 수지상 세포인 방법.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 벡터를 포함하는 시험관내 가공된 수지상 세포.
  19. 제18항에 있어서, IFN-알파의 기능을 가진 단백질을 조건부로 발현하는 벡터를 추가로 포함하며, 여기에서 상기 벡터는 유전자 스위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 리간드-의존적인 전사 인자를 암호화하며, 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및 (2) 리간드-의존적인 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 IFN-알파의 기능을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시험관내 가공된 수지상 세포.
  20. 제18항에 따른 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 종양내, 복강내 또는 피하 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군이 적어도 104 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군이 적어도 107 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 포유동물의 종양을 치료하는 의약의 제조에 있어서, 제18항 또는 제19항에 따른 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군의 용도.
  25. 제24항에 있어서, 상기 종양이 양성 종양인 용도.
  26. 제24항에 있어서, 상기 종양이 악성 종양인 용도.
  27. 제24항에 있어서, 상기 종양이 흑색종인 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양이 악성 흑색종 피부암인 용도.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 용도.
  30. 제29항에 있어서, 리간드-의존적인 전사 인자를 활성화시키는 유효량의 리간드를 포유동물에게 추가로 투여하는 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 리간드가 RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 리간드가 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 용도.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 종양내, 경구, 복강내 또는 피하 투여되는 용도.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 전 또는 후로 1 시간 미만 투여되는 용도.
  35. 제30항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 조작된 수지상 세포 후로 24 시간 미만 투여되는 용도.
  36. 제30항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 후로 48 시간 미만 투여되는 용도.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료가 종양 성장을 감소시키는 용도.
  38. 제24항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료가 종양 성장을 저해하는 용도.
  39. 하기 단계(a) 내지 (e)를 포함하는, 환자에게서 시험관내 가공된 수지상 세포 기제의 치료 요법의 효능을 결정하는 방법:
    (a) 시험관내 가공된 수지상 세포의 투여 전에, 이를 필요로 하는 환자로부터 채취한 제1 생물학적 시료에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 양자 모두를 측정하여 대조 수준(control level)을 생성하는 단계;
    (b) 제18항 또는 제19항에 따른 시험관내 가공된 수지상 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;
    (c) 활성화 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;
    (d) 시험관내 조작된 DC 및 활성화 리간드의 투여 후에, 이를 필요로 하는 환자로부터 채취한 제2 생물학적 시료에서 IFN-γ의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 양자 모두를 측정하여 시험 수준(test level)을 생성하는 단계; 및
    (e) IFN-γ의 대조 수준을 시험 수준과 비교하여, IFN-γ의 발현, 활성 또는 양자 모두의 시험 수준이 대조 수준에 비해 증가한 경우, 치료 요법이 이를 필요로 하는 환자에게 효과적인 것으로 판단하는 단계.
  40. 제39항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자가 인간 환자인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 환자가 암 환자인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 암 환자가 흑색종 환자인 방법.
  43. 제39항에 있어서, IFN-γ의 수준이 ELISA로 측정되는 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 디아실하이드라진인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 리간드가 RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  46. 제39항에 있어서, 리간드가 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드가 종양내, 경구, 복강내 또는 피하 투여되는 방법.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 전 또는 후로 1 시간 미만 투여되는 방법.
  49. 제39항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 후로 24 시간 미만 투여되는 방법.
  50. 제39항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 후로 48 시간 미만 투여되는 방법.
  51. 제18항 또는 제19항에 따른 시험관내 가공된 수지상 세포를 포함하는 키트.
  52. 제51항에 있어서, RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932로 구성된 그룹으로부터 선택된 리간드를 추가로 포함하는 키트.
  53. 수지상 세포 내에서 인터류킨-12(IL-12)의 기능을 가진 단백질의 조건부 발현을 유도하는 의약의 제조에 있어서, 제18항 또는 제19항에 따른 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군의 용도.
  54. 제53항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포가 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 용도.
  55. 제54항에 있어서, 리간드-의존적인 전사 인자를 활성화시키는 유효량의 리간드를 포유동물에게 추가로 투여하는 용도.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 포유동물이 종양을 보유하는 용도.
  57. 제56항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포가 종양내, 복강내 또는 피하 투여되는 용도.
  58. 제56항에 있어서, 상기 종양이 양성 종양인 용도.
  59. 제56항에 있어서, 상기 종양이 악성 종양인 용도.
  60. 제56항에 있어서, 상기 종양이 흑색종인 용도.
  61. 제60항에 있어서, 상기 종양이 악성 흑색종 피부암인 용도.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포가 인간 수지상 세포인 용도.
  63. 제62항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포가 골수 수지상 세포인 용도.
  64. 제53항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군이 적어도 107 세포를 포함하는 용도.
  65. 제53항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시험관내 가공된 수지상 세포의 개체군이 적어도 5×107 세포를 포함하는 용도.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  67. 제55항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 용도.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 리간드가 종양내, 경구, 복강내 또는 피하 투여되는 용도.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 전 또는 후로 1 시간 미만 투여되는 용도.
  70. 제66항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 후로 24 시간 미만 투여되는 용도.
  71. 제66항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리간드가 시험관내 가공된 수지상 세포 후로 48 시간 미만 투여되는 용도.
  72. 제53항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이를 필요로 하는 포유동물에서 종양 성장을 감소시키는 용도.
  73. 제53항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이를 필요로 하는 포유동물에서 종양을 저해하는 용도.
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