RU2644210C2 - Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей - Google Patents
Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644210C2 RU2644210C2 RU2013106702A RU2013106702A RU2644210C2 RU 2644210 C2 RU2644210 C2 RU 2644210C2 RU 2013106702 A RU2013106702 A RU 2013106702A RU 2013106702 A RU2013106702 A RU 2013106702A RU 2644210 C2 RU2644210 C2 RU 2644210C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- modified
- ligand
- cells
- vitro
- sequence
- Prior art date
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 425
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 50
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 21
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims abstract description 224
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims abstract description 206
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 202
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims abstract description 191
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 167
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 103
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 88
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 36
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 344
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 308
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 174
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 157
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 151
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 138
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 138
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 138
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 116
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 116
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 105
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 99
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 80
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 67
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 66
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 63
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 claims description 50
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 claims description 48
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 claims description 48
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 43
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 40
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 40
- 229940040731 human interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 25
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 22
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 13
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 11
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 9
- 125000005077 diacylhydrazine group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000255942 Choristoneura fumiferana Species 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 42
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 147
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 86
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 71
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 67
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 63
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 56
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 55
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 51
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 51
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 50
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 49
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 43
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 38
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 37
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 36
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 36
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 33
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 32
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 30
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 29
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 27
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 25
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 25
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 23
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 22
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 22
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 18
- -1 GALl1O Proteins 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 15
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 10
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 9
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 8
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 8
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 8
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 8
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 8
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 description 7
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 4
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 3
- 101100382264 Mus musculus Ca14 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 3
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 239000000260 (2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1-ol Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 241000702449 African cassava mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000656 Annexin A6 Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 description 2
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 101000959737 Mus musculus Annexin A1 Proteins 0.000 description 2
- 101000583937 Mus musculus CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Proteins 0.000 description 2
- 101001038345 Mus musculus GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein Proteins 0.000 description 2
- 101000808124 Mus musculus Uroplakin-3b Proteins 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 108090001145 Nuclear Receptor Coactivator 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100022883 Nuclear receptor coactivator 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000417 anti-transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 150000008037 diacylhydrazines Chemical class 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 229930002886 farnesol Natural products 0.000 description 2
- 229940043259 farnesol Drugs 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 101800000857 p40 protein Proteins 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011268 retreatment Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 102220262620 rs1478918808 Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N trans-Farnesol Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCO CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- CRDAMVZIKSXKFV-FBXUGWQNSA-N (2-cis,6-cis)-farnesol Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CO CRDAMVZIKSXKFV-FBXUGWQNSA-N 0.000 description 1
- RZPAXNJLEKLXNO-UHFFFAOYSA-N (20R,22R)-3beta,22-Dihydroxylcholest-5-en Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C(O)CCC(C)C)C1(C)CC2 RZPAXNJLEKLXNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZPAXNJLEKLXNO-GFKLAVDKSA-N (22R)-22-hydroxycholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)[C@H](O)CCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 RZPAXNJLEKLXNO-GFKLAVDKSA-N 0.000 description 1
- IOWMKBFJCNLRTC-XWXSNNQWSA-N (24S)-24-hydroxycholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](O)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 IOWMKBFJCNLRTC-XWXSNNQWSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- WEEGYLXZBRQIMU-UHFFFAOYSA-N 1,8-cineole Natural products C1CC2CCC1(C)OC2(C)C WEEGYLXZBRQIMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 2,3,14,20,22-pentahydroxy-(2β,3β,5β,22R)-Cholest-7-en-6-one Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- HXWZQRICWSADMH-SEHXZECUSA-N 20-hydroxyecdysone Natural products CC(C)(C)CC[C@@H](O)[C@@](C)(O)[C@H]1CC[C@@]2(O)C3=CC(=O)[C@@H]4C[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C HXWZQRICWSADMH-SEHXZECUSA-N 0.000 description 1
- IOWMKBFJCNLRTC-UHFFFAOYSA-N 24S-hydroxycholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(O)C(C)C)C1(C)CC2 IOWMKBFJCNLRTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQGNCUXDDPRDJH-UHFFFAOYSA-N 3'-GMP Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(C(O)CC3(C(C(C)(O)C(O)CCC(C)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 LQGNCUXDDPRDJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMVOQQDNEYOJOK-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylbenzoic acid Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C(O)=O)=C1 UMVOQQDNEYOJOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRUCYBDNMKWMBO-UHFFFAOYSA-N 3,5-ditert-butyl-4-hydroxy-n-(2-methylpropyl)benzamide Chemical compound CC(C)CNC(=O)C1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 ZRUCYBDNMKWMBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKNSMBZZZFGYCB-UHFFFAOYSA-N 4,5-dihydrooxadiazole Chemical class C1CN=NO1 JKNSMBZZZFGYCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000238679 Amblyomma Species 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 101150033765 BAG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700034663 BCL2-associated athanogene 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006131 Brain neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- IOQDSYWDUGZDMS-UHFFFAOYSA-N C(C)(C)(C)C(CCC)N(NCC1=C(C(=CC=C1)OC)CC)C(C1=CC(=CC(=C1)C)C)=O Chemical compound C(C)(C)(C)C(CCC)N(NCC1=C(C(=CC=C1)OC)CC)C(C1=CC(=CC(=C1)C)C)=O IOQDSYWDUGZDMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100459439 Caenorhabditis elegans nac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000701459 Caulimovirus Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005133 Chloroplast RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 1
- 102100031186 Chromogranin-A Human genes 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078339 DNA alkyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001460069 Emerita talpoida Species 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108010074124 Escherichia coli Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEGYLXZBRQIMU-WAAGHKOSSA-N Eucalyptol Chemical compound C1C[C@H]2CC[C@]1(C)OC2(C)C WEEGYLXZBRQIMU-WAAGHKOSSA-N 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000030914 Fatty Acid-Binding Human genes 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282818 Giraffidae Species 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000694288 Homo sapiens 40S ribosomal protein SA Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000959738 Homo sapiens Annexin A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000583935 Homo sapiens CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Proteins 0.000 description 1
- 101000912009 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 5 activator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101001038346 Homo sapiens GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein Proteins 0.000 description 1
- 101001090483 Homo sapiens Glutathione S-transferase LANCL1 Proteins 0.000 description 1
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000974343 Homo sapiens Nuclear receptor coactivator 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000603958 Homo sapiens Oxysterols receptor LXR-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000980900 Homo sapiens Sororin Proteins 0.000 description 1
- 101000642268 Homo sapiens Speckle-type POZ protein Proteins 0.000 description 1
- 101000808126 Homo sapiens Uroplakin-3b Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 description 1
- 102000014158 Interleukin-12 Subunit p40 Human genes 0.000 description 1
- 108010011429 Interleukin-12 Subunit p40 Proteins 0.000 description 1
- 102100020790 Interleukin-12 receptor subunit beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710103841 Interleukin-12 receptor subunit beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- QVJMXSGZTCGLHZ-VWADHSNXSA-N Juvenile hormone III Natural products O=C(OC)/C=C(\CC/C=C(\CC[C@H]1C(C)(C)O1)/C)/C QVJMXSGZTCGLHZ-VWADHSNXSA-N 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000254023 Locusta Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- LRJUYAVTHIEHAI-UHFFFAOYSA-N Muristeron A Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(C(O)CC3(C(C(C)(O)C(O)CCC(C)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21O LRJUYAVTHIEHAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRJUYAVTHIEHAI-LHBNDURVSA-N Muristerone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](O)C[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@]21O LRJUYAVTHIEHAI-LHBNDURVSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000780136 Mus musculus Annexin A6 Proteins 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597780 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108090001146 Nuclear Receptor Coactivator 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037223 Nuclear receptor coactivator 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037226 Nuclear receptor coactivator 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090001144 Nuclear receptor coactivator 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100022927 Nuclear receptor coactivator 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022935 Nuclear receptor corepressor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710153661 Nuclear receptor corepressor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000016978 Orphan receptors Human genes 0.000 description 1
- 108070000031 Orphan receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100038477 Oxysterols receptor LXR-beta Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000251574 Polyandrocarpa misakiensis Species 0.000 description 1
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N Ponasterone A Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@@](O)([C@@H](O)CCC(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150002757 RSL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701507 Rice tungro bacilliform virus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100434411 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000573530 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Myosin light chain 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 102100036422 Speckle-type POZ protein Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102100022011 Transcription intermediary factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000242582 Tripedalia Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 101100181311 Xenopus laevis lsm14b-a gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- MPDLCAJKCPFDKP-ABXCMAEBSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-7-oxo-1,2,3,4,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] hydrogen sulfate Chemical compound C1C[C@H](OS(O)(=O)=O)CC2=CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@]21C MPDLCAJKCPFDKP-ABXCMAEBSA-N 0.000 description 1
- SFEQTFDQPJQUJM-UHFFFAOYSA-N [3,4-diacetyloxy-5-(6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(COC(=O)C)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 SFEQTFDQPJQUJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 101150102866 adc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001943 adrenal medulla Anatomy 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- UCOHKZKRNWNULS-UHFFFAOYSA-N aminocyanamide Chemical class NNC#N UCOHKZKRNWNULS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008003 autocrine effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-UHFFFAOYSA-N beta-ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C)(O)C(O)CCC(C)(O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 NKDFYOWSKOHCCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960005233 cineole Drugs 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001214 effect on cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 108091022862 fatty acid binding Proteins 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 229940084434 fungoid Drugs 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- KQPYUDDGWXQXHS-UHFFFAOYSA-N juglone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C2=C1C=CC=C2O KQPYUDDGWXQXHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVJMXSGZTCGLHZ-HONBPKQLSA-N juvenile hormone III Chemical compound COC(=O)\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC[C@H]1OC1(C)C QVJMXSGZTCGLHZ-HONBPKQLSA-N 0.000 description 1
- 229930000772 juvenile hormones III Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- CPTIBDHUFVHUJK-NZYDNVMFSA-N mitopodozide Chemical compound C1([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H](CO)[C@@H]2C(=O)NNCC)=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 CPTIBDHUFVHUJK-NZYDNVMFSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- QYYXITIZXRMPSZ-UHFFFAOYSA-N n'-tert-butyl-n'-(3,5-dimethylbenzoyl)-2-ethyl-3-methoxybenzohydrazide Chemical compound CCC1=C(OC)C=CC=C1C(=O)NN(C(C)(C)C)C(=O)C1=CC(C)=CC(C)=C1 QYYXITIZXRMPSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091008569 nuclear steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007967 peppermint flavor Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000048 toxicity data Toxicity 0.000 description 1
- 108010071511 transcriptional intermediary factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 108090000195 villin Proteins 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/47—Brain; Nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
- A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4245—Oxadiazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4635—Cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46432—Nervous system antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5434—IL-12
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
- C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/555—Interferons [IFN]
- G01N2333/57—IFN-gamma
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным in vitro дендритным клеткам, и может быть использовано в медицине. Полученные определенным способом дендритные клетки используют в составе фармацевтической композиции или набора для регулируемой экспрессии полипептида, обладающего функцией интерлейкина-12 (IL-12) в присуствии активирующего лиганда. Изобретение позволяет эффективно ингибировать рост опухоли у млекопитающих. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 пр.
Description
Область изобретения
[0001] Настоящее изобретение относится к области генной терапии при лечении злокачественных опухолей. Согласно одному варианту реализации, настоящее изобретение относится к модификации дендритных клеток для обеспечения регулируемой экспрессии интерлейкина-12, и применению указанных клеток в терапии. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение относится к модификации дендритных клеток для обеспечения регулируемой экспрессии интерлейкина-12 (IL-12) и/или интерферона-альфа (IFN-alpha), и применению указанных клеток в терапии.
Уровень техники
[0002] Описание различных патентов, патентных заявок и публикаций полностью включено в данное описание посредством ссылок. Тем не менее, упоминание любой ссылки в настоящей заявке не следует рассматривать как признание того, что указанная публикация доступна в качестве предшествующего уровня техники по отношению к настоящему изобретению.
[0003] Интерлейкин-12 принадлежит к семейству цитокинов 1-го типа, участвующих во множестве биологических процессов, включающих в себя (но не ограниченных) защитные иммунные реакции и подавление процессов образования опухолей (Abdi et al, 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al, 2002; Adorini et al, 1996; Akhtar et al, 2004; Akiyama et al, 2000; Al-Mohanna et al, 2002; Aliberti et al, 1996; Allavena et al, 1994; Alii and Khar, 2004; Alzona et al, 1996; Amemiya et al, 2006; Araujo et al, 2001; Arulanandam et al, 1999; Athie et al, 2000; Athie-Morales et al, 2004; Bertagnolli et al, 1992; Bhardwaj et al, 1996; Biedermann et al, 2006; Brunda and Gately, 1994; Buchanan et al, 1995; Romani et al, 1997; Rothe et al, 1996; Satoskar et al, 2000; Schopf et al, 1999; Thomas et al, 2000; Tsung et al, 1997; Wolf et al, 1994; Yuminamochi et al, 2007). Увеличивающееся количество публикаций по данной тематике указывает на то, что воздействие на интерлейкин-12 может являться весьма многообещающим средством контроля заболеваний человека (например, рака).
[0004] Несмотря на то, что интерлейкин-12 рассматривают в качестве потенциального терапевтического агента для лечения рака, благодаря его способности поддерживать активность противоопухолевых NK-клеток 1-го типа, CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток (Trinchiery 2003), имеющиеся данные о токсичности рекомбинантного интерлейкина-12 человека (rhlL-12) по отношению к пациентам (Atkins et al, 1997), а также ограниченность источников получения рекомбинантного интерлейкина-12 человека по системе контроля качества GMP для клинического применения препятствуют успешному развитию способов терапии, основанных на использовании интерлейкина-12. Таким образом, разумно предположить, что способы генной терапии могут предоставить возможности более безопасного и надежного лечения. Действительно, первая фаза клинических испытаний внутри- или околоопухолевого введения рекомбинантной вирусной (Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005) или плазмидной кДНК интерлейкина-12 (Heinzerling et al, 2005) или аутологичных фибробластов с модифицированным геном интерлейкина-12 (Kang et al, 2001) была показана и безопасность и хорошая переносимость.
[0005] Тем не менее, объективные клинические результаты у пациентов с меланомой или различными видами карциномы, которых подвергали указанной генной терапии, были редкими, многовариантными, временными и, в большинстве своем, локализированными в месте применения (Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005; Heinzerling et al, 2005). В случаях, когда излечивание заболевания было частичным или полным, наблюдали повышенные количества противопоухолевых эффекторых лимфоцитов (Heinzerling et al, 2005; Sangro et al, 2004) и циркулирующих опухолеспецифических CD8+ Т-клеток (Heinzerling et al, 2005), что вполне согласуется с примированием перекрестно-реагирующим антигеном Т-клеток у таких пациентов.
[0006] Кроме того, имеется несколько дополнительных оснований для беспокойства, например: непредвиденная токсичность, связанная с генной терапией дендритных клеток (DC) интерлейкином-12, и возможные зависимые от интерлейкина-12 изменения в миграции терапевтических дендритных клетках, вырабатывающих интерлейкин-12 (DC.IL-12) после внутриопухолевого введения. Есть также опасения, касающиеся времени синтеза интерлейкина-12 в трансдуцированных дендритных клетках, что наиболее важно для эффективного лечения (Murphy et al, 2005).
[0007] Поскольку примирование перекрестно-реагирующим антигеном специфических Т-клеток наиболее эффективно осуществляется дендритными клетками, которые служат естественным, но регулируемым источником интерлейкина-12 (Berard et al, 2000), недавние отчеты о превосходной пре-клинической эффективности генной терапии с применением DC.IL-12, вызвали огромный интерес (Satoh et al, 2002; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002). Так, оказалось, что внутриопухолевое введение дендритных клеток, модифицированных для выработки интерлейкин-12р70 (путем их инфицирования рекомбинантным аденовирусом), вызывает значительное повышение интенсивности примирования перекрестно реагирующим антигеном спектра высокоактивных опухолеспецифических CD8+ T-клеток, вместе с отторжением опухолей у исследуемых мышей (Tatsumi et al, 2003). Ввиду применения рекомбинантного аденовируса, кодирующего интерлейкин-12 мыши под контролем CMV-промотора (rAd.cIL12, Tatsumi et al, 2003), экспрессия интерлейкина-12 модифицированными дендритными клетками была постоянной, вследствие этого, нельзя было определить относительное иммунологическое действие этого цитокина, поначалу в месте повреждения опухоли, а затем и внутри инфильтрованных опухолью (дренирующих опухоль) лимфатических узлах. Таким образом, существует необходимость в дендритных клетках, модифицированных для регулируемой экспрессии интерлекийна-12. Настоящее изобретение обеспечивает многообещающий терапевтический результат при использовании таких клетке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, который кодирует белок, обладающий функцией интерлейкина-12 под контролем регулируемого промотора. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор, кодирующий интерлейкин-12р70 и под контролем регулируемого промотора, который активируется при условии присоединения к нему растворимого низкомолекулярного лиганда, такого, как диацилгидразин, например: RG-115819, RG-115830 или RG-115932. Такой вектор позволяет контролировать экспрессию интерлейкина-12 дендритными клетками (rAD.RheoIL12).
[0009] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает вектор для регулируемой экспрессии белка, обладающего функций интерлейкина-12, который содержит полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержащий по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная, по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает вектор для регулируемой экспрессии белка, обладающего функций интерлейкина-12 и/или интерферона-альфа, который содержит: (1) полинуклеотид, который кодирует переключатель гена, при этом, указанный переключатель содержит по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[0010] Например, настоящее изобретение обеспечивает вектор для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12, который содержит полинуклеотид, который кодирует переключатель гена, причем указанный полинуклеотид содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Также, настоящее изобретение обеспечивает вектор для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа, и содержащий полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, причем указанный полинуклеотид содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[ООП] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12, посредством модификации указанных дендритных клеток рекомбинантным вектором, обеспечивающим регулируемую экспрессию белка, обладающего функцией интерлейкина-12, например: rAd.RheoIL12. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12 и/или белок, обладающий функцией интерферона-альфа, путем модификации дендритных клеток рекомбинантным вектором, обеспечивающим регулируемую экспрессию белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или интерферона-альфа.
[0012] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12, включающий в себя модификацию по меньшей мере части дендритных клеток путем введения в них вектора, содержащего: (1) полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, который содержит по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12 и/или белок, обладающий функцией интерферона-альфа, включающий в себя модификацию по меньшей мере части дендритных клеток путем введения в них вектора, содержащего: (1) полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, который содержит по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[0013] Например, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, управляемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12, включающий в себя модификацию по меньшей мере части дендритных клеток путем введения в них вектора, содержащего полинуклеотид, который кодирует переключатель гена, причем данный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, при этом, данный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения популяции дендритных клеток, управляемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12 и/или белок, обладающий функцией интерферона-альфа, включающий в себя модификацию по меньшей мере части дендритных клеток путем введения в них вектора, содержащего полинуклеотид, который кодирует переключатель гена, причем данный полинуклеотид содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа белок, при этом, указанный полинуклеотид связан с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[0014] Также, настоящее изобретение обеспечивает популяцию дендритных клеток, модифицированных для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12, с применением рекомбинантного вектора, обеспечивающего регулируемую экспрессию белка, который обладает функцией интерлейкина-12, например, вектора rAd.RheoIL12. Было показано, что дендритные клетки, инфицированные rAd.RheoIL12, вырабатывают повышенные количества интерлейкина-12 только после обработки активирующим лигандом. Другой вариант реализации относится к популяции дендритных клеток, модифицированных для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа, с применением рекомбинантного вектора, обеспечивающего регулируемую экспрессию белка, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или белка, который обладает функцией интерферона-альфа. Подходящие лиганды включают в себя, но не ограничиваются следующими: RG-115830, RG-115932, RG-115819, RSL1 и другими диацилгидразинами.
[0015] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные in vitro дендритные клетки, содержащие вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, который содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные in vitro дендритные клетки, содержащие вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, который содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, функционально связанный с промотором, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[0016] Например, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные in vitro дендритные клетки, содержащие вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержащий: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией интерлейкина-12, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным in vitro фактором. Настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки, содержащие вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, причем полинуклеотид содержит: (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12, и/или полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерферона-альфа, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
[0017] Также, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую популяцию дендритных клеток, модифицированных для регулируемой экспрессии, белка, который обладает функцией интерлейкина-12, с помощью рекомбинантного вектора, регулируемо экспрессирующего обладающий функцией интерлейкина-12 белок, например: вектора rAd.RheoIL12. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую популяцию дендритных клеток, модифицированных для управляемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа с помощью рекомбинантного вектора, регулируемо экспрессирующего обладающий функцией интерлейкина-12 белок и/или обладающий функцией интерферона-альфа белок.
[0018] Также, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения злокачественных опухолей, таких как меланомы или глиомы. Лечение геном интерлейкина-12 показало противоопухолевую активность в исследованиях на модельных животных, при применении рекомбинантного кДНК-вектора (Faure et al, 1998; Sangro et al, 2005), и, еще в большее степени, при применении в форме генетически модифицированных дендритных клеток (Satoh et al, 2002; Svane et al, 1999; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002). К настоящему моменту, тем не менее, процедуры первой фазы клинических испытаний на людях терапии геном интерлейкина-12, включающие в себя применения плазмидных или вирусных векторов, не обеспечили стойкого объективного клинического эффекта в контролировании злокачественных опухолей (Heinzerling et al, 2005; Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005). Лечение геном интерлейкина-12, основанное на дендритных клетках (с или без интерферона-альфа) и описанное в данном материале, показало многообещающую терапевтическую перспективу.
[0019] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий:
(a) внутриопухолевое введение в микроокружение опухоли популяции модифицированных in vitro дендритных клеток, содержащих вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий переключатель гена и содержащий (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий обладающий функцией интерлейкина-12 белок, и связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором, и
(b) введение указанному млекопитающему эффективного количество лиганда, активирующего указанный лиганд-зависимый транскрипционный фактор; что приводит к стимулированию экспрессии обладающего функцией интерлейкина-12 белка и излечиванию указанной опухоли.
[0020] Например, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий в себя следующие стадии:
(a) модификацию in vitro дендритных клеток для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12;
(b) внутриопухолевое введение в микроокружение опухоли, указанных, модифицированных in vitro дендритных клеток; и
(c) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективной дозы активирующего лиганда;
что приводит к стимулированию экспрессию белка, обладающего функцией интерлейкина-12, и излечиванию вышеуказанной опухоли.
[0021] Согласно следующим вариантам реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий: (а) внутриопухолевое введение в микроокружение опухоли модифицированных in vitro дендритных клеток, причем указанные дендритные клетки содержат вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий переключатель гена и содержащий (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, который обладает функцией интерлейкина-12 и/или белок, который обладает функцией интерферона-альфа, связанный с промотором, который активируется вышеуказанным лиганд-зависимым фактором транскрипции, и (b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективной дозы активирующего лиганда; что приводит к стимулированию экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12, и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа, и излечиванию вышеуказанной опухоли.
[0022] Например, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие стадии:
(a) модификация in vitro дендритных клеток для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа;
(b) внутриопухолевое введение в микроокружение опухоли, указанных, модифицированных in vitro дендритных клеток; и
(c) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективной дозы активирующего лиганда;
что приводит к стимулированию экспрессию белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белка, обладающего функцией интерферона-альфа, и излечиванию вышеуказанной опухоли.
[0023] Также настоящее изобретение обеспечивает способ определения степени эффективности терапии модифицированными дендритными клетками посредством: определения контрольного уровня, который получают в результате измерения уровня экспрессии или активности интерферона-гамма у пациента до начала терапии;
введения дендритных клеток, модифицированных для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12, и последующего введения эффективного количества активирующего лиганда; и затем
определения тестового уровня, который получают в результате, измерения уровня экспрессии интерферона-гамма;
сравнения указанного контрольного уровня с указанным тестовым для определения, является ли терапевтический режим эффективным.
[0024] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ определения эффективности терапевтического режима пациента, основанного на терапии модифицированными in vitro дендритными клетками,, включающий:
(a) измерения экспрессии и/или активности интерферона-гамма в первом биологическом образце, полученном от нуждающегося в этом пациента перед введением модифицированных in vitro дендритных клеток с получением контрольного уровня;
(b) введение нуждающемуся в этом пациенту дендритных клеток, модифицированных in vitro для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12;
(c) введение пациенту терапевтически эффективной дозы активирующего лиганда;
(d) измерение экспрессии и/или активности интерферона-гамма во втором биологическом образце, полученном от нуждающегося в этом пациента, после введения модифицированных in vitro дендритных клеток и активирующего лиганда с получением тестового уровня;
(e) сравнение указанного контрольного и указанного тестового уровня экспрессии или активности интерферона-гамма, причем повышенный тестовый уровень экспрессии и/или активности, по сравнению с контрольным уровнем говорит об эффективности терапии для данного пациента.
[0025] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ стимуляции регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 в дендритных клетках, включающий: (1) введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества популяции модифицированных in vitro дендритных клеток согласно настоящему изобретению; и (2) введение указанному млекопитающему эффективного количества активирующего лиганда для активации лиганд-зависимого транскрипционного фактора.
[0026] Для исследования клинической эффективности, были продолжены исследования проведенные на модели саркомы CMS4 на мышах BALB/c, и оказалось, что внутриопухолевое введение изогенных дендритных клеток, взятых из костного мозга и предварительно инфицированных Ad.cIL12 (конститутивная экспрессия), привело к эффективному отторжению опухоли. (Tatsumi et al., 2003). Отторжение произошло в связи с системной CD8+ T-клеточно опосредованной иммунной реакцией против опухолей CMS4 (Tatsumi et al, 2003).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0027] На Фигуре 1 изображена структура вектора rAd.RheoIL12, из которого удалили области Е1 и Е3 и заменили область Е1 компонентами RheoSwitch® Therapeutic System (RTS)-IL-12. Мотив, обозначенный как ʺIL12ʺ, показывает кодирующие последовательности IL-12p40 и JL-12p35, разделенные участком внутренней посадки рибосомы (IRES).
[0028] На Фигуре 2A-2C показано, что модифицированные дендритные клетки регулируемо вырабатывают белок интерлейкин-12 в присутствии RG-115830.
[0029] На Фигуре 3A: показано, что модифицированные дендритные клетки, введенные в микроокружение меланомы, вызывают регресс опухоли у мышей C57B 1/6 на 7-й день после появления у них подкожных опухолей В16, при внутрибрюшинном введении RG-115830, в течение 24 часов после введения дендритных клеток. Фигура 3B-3C: регресс опухоли произошел при постоянном введении RG-115830 в течение суток 1-5, но не произошел при введении RG-115830 только в течение суток 1-2 или 1-3 после введения дендритных клеток.
[0030] На Фигуре 4 показано, что модифицированные дендритные клетки лучше выживают в опухоли и в инфильтрованных опухолью лимфатических узлах (ЛУ) после внутрибрюшинного введения активирующего лиганда, в случае, если введение было произведено в течение 24 часов после инъекции дендритных клеток, при этом выживаемость значительно ниже или равна нулю при введении лиганда в течение 48 и 72 часов после инъекции клеток, соответственно.
[0031] На Фигуре 5A показано, что модифицированные дендритные клетки вызывают сильную периферическую активацию анти-B16 CD8+ T-клеток после внутрибрюшинного введения активирующего лиганда, в случае, если введение было произведено в течение 24 часов после инъекции указанных дендритных клеток. Фигура 5B показывает, что мыши, перед тем получавшие лечение от меланомы, обладают специфической защитой от опухолевых клеток B16, но не от опухолевых клеток MC38 карциномы прямой кишки, когда не зараженные опухолью животные были инфицированы соответствующими клетками B16 меланомы или клетками MC38 карциномы толстой кишки на 45-й день после первичного заражения B16.
[0032] Фигура 6 показывает терапевтические преимущества, обусловленные введением лиганда внутрибрюшинно или орально.
[0033] На Фигуре 7 изображены графики Каплана-Майера, иллюстрирующие динамику выживаемости мышей при глиоме мышей (GL261) в результате внутриопухолевой инъекции дендритных клеток, модифицированных полинуклеотидами, кодирующими интерлейкин-12 и/или интерферон-альфа под контролем RTS. Аббревиатуры на данном рисунке расшифровываются следующим образом: Ad-IFNa - аденовирусный вектор, регулируемо вырабатывающий интерферон-альфа; Ad-RTS-IFHa - аденовирусный вектор, кодирующий интерферон-альфа под контролем RTS; Ad-RTS-IFHa no ligand - аденовирусный вектор, содержащий RTS и интерферон-альфа при отсутствии активирующего лиганда; Ad-rFNa/IL-12 относится к дендритным клеткам, модифицированным аденовирусным вектором, кодирующим интерферон-альфа и интерлейкин-12; и Ad-RTS- EFNa/IL-12 относится к дендритным клеткам, модифицированным двумя аденовирусными векторами, кодирующими интерферон-альфа и интерлейкин-12 под контролем RTS.
[0034] На Фигуре 8 изображена карта аденовирусного вектора Ad-RTS-hTL-12.
[0035] На Фигуре 9 показана выработка интерлейкина-12 дендритными клетками человека, модифицированными аденовирусным вектором Ad-RTS-IL-12 мыши, при разных значениях MOI и разной продолжительности адсорбции вирусов. Трансдукция дендритных клеток человека аденовирусом при разных значениях MOI и разной продолжительности адсорбции вирусов выявила эффективную трансдукцию клеток при 3-часовой адсорбции вирусов и значении MOI, равном 500. Активирующее вещество (ʺADʺ или ʺактивирующий лигандʺ) индуцировало экспрессию интерлейкина-12 указанными дендритными клетками человека.
[0036] На Фигуре 10 показан результат сравнительного анализа эффекта различных, содержащих ген интерлейкина-12 аденовирусных векторов. Вариант SPl-RheoIL-12 оказался наиболее эффективным среди всех вариантов, содержащих Rheoswitch. Spl-RheoIL-12 отличается от oldRheoIL-12 тем, что последовательность AdEasy-1 в нем заменена на последовательность RAPAd (ViraQuest). Аналогичным образом, TTR-RheoIL-12 отличается от oldRheoIL-12 тем, что он содержит минимальный промотор TTR, по направлению транскрипции от сайтов связывания Gal4, который заменяет синтетический минимальный промотор и сайты связывания SpI, а основа последовательности вектора является последовательностью RAPAd (ViraQuest). Как показано на Фигуре 10, Spl-RheoIL-12 оказался аналогичным oldRheoIL-12 и более эффективным, чем TTR-RheolL-12 в отношении уменьшения размера опухоли меланомы B16.
[0037] На Фигуре 11 показано отсутствие формирования опухоли меланомы B16 после повторной инициации опухоли у мышей, перед этим получивших лечение дендритными клетками, содержащими рекомбинантный аденовирусный Rheoswitch-индуцируемый интерлейкин-12. Это говорит о том, что опухолевый рост меланомы B16 блокируется в течение приблизительно 25 суток, когда мышей, обладающих иммуннитетом к B16 подвергали повторной инокуляции через 45 дней после первичного заражения клетками B16. Дендритные клетки мыши были получены из костного мозга мышей B6 путем 7-дневного культивирования в полной среде (RPMI-1640, 10% FBS), содержащей rmIL-4 и rmGM-CSF. Затем CD11c-положительные дендритные клетки выделяли с помощью специфичных частиц MACS согласно протоколу производителя (Miltenyi Biotech) и инфицировали при значении MOI, равном 100, с использованием rAd.IL-12 vs. SP1 vs. TTR), в течение 24 часов до инъекции дендритных клеток 10E6 подкожно (s.c.) в образовавшиеся на 9-й день опухоли меланомы B16 (5 мышей в каждой группе, опухоль на правом боку). Затем часть мышей подвергли ежедневным внутрибрюшинным (i.p.) инъекциям активирующего лиганда RG-115830 (30 мг/кг в 50 мкл диметилсульфоксида, DMSO) в дни 0-4 после введения дендритных клеток. Размер опухоли контролировали каждые 3-4 дня и измеряли в мм2, как произведение ортогональных диаметров. Для оценки специфичности защиты, связанной с терапией, всех животных, у которых отсутствовала опухоль, подвергли повторным инъекциям клеток меланомы 10E5 B16 в левый бок и клеток карциномы толстой кишки MC38 в правый бок на 45-е сутки после первичного инфицирования клетками опухоли B16. Опухоли MC38 были выявлены, в то время как опухоли B16 не образовались.
[0038] Фигура 12 показывает результат сравнительного анализа между количеством дендритных клеток, введенных в опухоль B16 (10E5, 10E6, 103E7), продолжительностью введения лиганда (6 дней или 13 дней) и последующим регрессом опухоли у модельных мышей, зараженных меланомой B16. Лиганды, при введении ежедневно в течение 13 дней в комбинации с дендритными клетками 10E7, оказались наиболее эффективным средством, вызывающим регресс опухолей в течение 25 дней.
[0039] На Фигуре 13 показано, что описанная в данной заявке терапия не была причиной нежелательной потери веса вследствие изнуренного состояния. Изнуренное состояние и потеря веса часто связаны с высокими уровнями интерферона-гамма и фактора некроза опухолей-альфа (TNF-alpha), синтез которых положительно регулируется интерлейкином-12.
[0040] На Фигуре 14 показано, что в результате повторной инициации опухоли у мышей перед этим получивших лечение дендритными клетками, содержащими рекомбинантный аденовирусный RheoSwitch-индуцируемый интерлейкин-12 и активизирующий лиганд RG-115932, опухоли меланомы B16 не формируются. Меланомы B16 развивались в течение 7 дней после подкожных инъекций пяти изогенным мышам B6 в правый бок. На седьмой день, внутриопухолево, в дозах 105, 106 или 107 ввели дендритные клетки DC.SP1-IL-12 (взятые из костного мозга дендритные клетки, инфицированные при значении MOI, равном 100, с применением оптимального переключателя SP1). RG-115932 вводили внутрибрюшинно в день введения дендритных клеток (и затем ежедневно в течение 6 или 13 дней). Каждая группа состояла из 5 животных, рост опухолей контролировали каждые 3-4 дня и протоколировали в виде среднего размера (кв. мм как произведение ортогональных измерений). Во время измерения размеров также оценивали индивидуальные массы животных (Фигура 13). Все животные, избавившиеся от болезни благодаря любому способу лечения, были повторно инокулированы на 50-й день (следующая за первичной прививка опухоли B16) 105 клетками меланомы B16 в противоположный бок (левый бок) относительно первичной опухоли и 105 клетками карциномы толстой кишки MC38 в правый бок. Рост опухолей контролировали каждые 3-4 дня и сравнивали с ростом, наблюдаемым у животных, ранее не получивших лечение (см. Фигура 12). Таким образом, Фигура 14 демонстрирует, что рост опухолей меланомы B16 был блокирован в течение около 24 дней, при повторном введении клеток меланомы B16 иммунным к B16 мышам. Фигура 14 также показывает, что мыши не привитые B16 не были защищены от образования опухолей также, как и MC38-иммунные мыши и мыши, не привитые MC38. MC38 - это вид карциномы толстой кишки, известный специалистам в данной области. Вышеописанное демонстрирует специфичность иммунизации, обусловленной введением в первичную опухоль B16 дендритных клеток, содержащих рекомбинантный аденовирусный Rheoswitch-индуцируемый интерлейкин-12.
[0041] Фигура 15 показывает экспрессию интерлейкина-12 в дендритных клетках мышей, модифицированных Ad-RTS-IL-12, зависимую от дозы активирующего вещества.
[0042] Фигура 16 показывает реакцию Включения/Выключения экспрессии интерлейкина-12 в присутствие или отсутствие RG-115932 в клетках НТ1080, модифицированных Ad-RTS-IL-12 мыши.
[0043] Фигура 17 показывает, что реакция CD8+ Т-клеток на иммунизацию путем внутриопухолевой инъекции аденовирусных модифицированных дендритных клеток в присутствие или отсутствие активирующего вещества (AD) соответствует противоопухолевой реакции.
[0044] Фигура 18 иллюстрирует активацию синтеза интерлейкина-12 человека во взятых от трех добровольцев дендритных клетках человека, модифицированных аденовирусным вектором, кодирующим интерлейкин-12 под контролем RTS.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0045] SEQ ID NO: 1 - полная нуклеотидная последовательность гена p35 интерлейкина-12 мыши дикого типа.
[0046] SEQ ID NO: 2 - полная нуклеотидная последовательность гена p40 интерлейкина-12 мыши дикого типа.
[0047] SEQ ID NO: 3 - полная нуклеотидная последовательность гена p35 интерлейкина-12 человека дикого типа.
[0048] SEQ ID NO: 4 - полная нуклеотидная последовательность гена p40 интерлейкина-12 человека дикого типа.
[0049] SEQ ID NO: 5 - полная полипептидная последовательность белка p35 интерлейкина-12 мыши дикого типа.
[0050] SEQ ID NO: 6 - полная аминокислотная последовательность белка p40 интерлейкина-12 мыши дикого типа.
[0051] SEQ ID NO: 7 - полная аминокислотная последовательность белка p35 интерлейкина-12 человека дикого типа.
[0052] SEQ ID NO: 8 - полная аминокислотная последовательность белка p40 интерлейкина-12 человека дикого типа.
[0053] SEQ ID NO: 9 - последовательность ДНК элемента отклика (элемент ответа, response element, RE) экдизона, найденного у Drosophila.
[0054] SEQ DD NO: 10 - последовательность ДНК элемента отклика (RE) экдизона, найденного у Drosophila melanogaster.
[0055] SEQ ID NO: 11 - последовательность ДНК элемента отклика (RE) экдизона, найденного у Drosophila melanogaster.
[0056] SEQ ID NO: 12 - Сайт рестрикции эндонуклеазы генной конверсии I-SceI.
[0057] SEQ ID NO: 13 - последовательность ДНК аденовирусного вектора, содержащего кодирующую последовательность человеческого интерлейкина-12: Ad-RTS-IL-12 человека (SPl-RheoIL-12).
[0058] Аминокислотная последовательность интерферона-альфа (IFN-alpha) доступна в публичных базах данных, ее регистрационным номер - ААА52724, данная последовательность включена в ссылки данного документа. См. также Capon et al., Mol. Cell. Biol. 5, 768-779 (1985).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0059] Если не оговорено иначе, все специальные термины и обозначения, а также научные термины и терминология, использованные в настоящей заявке, имеют значения, повсеместно принятые специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях, термины, с повсеместно принятыми значениями, пояснены в данном описании для уточнения и/или в качестве готовых справок и разъяснений. Значение таких определений в настоящей заявке необязательно должно различаться со значением этих определений, принятым в данной области техники. Повсеместно принятые определения терминов и/или методик и/или протоколов, относящихся к молекулярной биологии, могут быть найдены в Rieger et ah, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer- Verlag: New York, 1991; Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994). Предполагается, что процедуры, включающие в себя применение коммерчески доступных комплектов (kits) и/или реагентов, осуществляются стандартно, в соответствии с инструкциями и/или протоколами и/или параметрами, предоставленными производителем, если не оговорено иначе.
[0060] В настоящей заявке термин «выделенный/изолированный» относится к биологическому материалу (клетке, нуклеиновой кислоте или белку), извлеченному из его естественной среды (окружения, в которой он находится в природе). Например, полинуклеотид, присутствующий в естественном состоянии в растении или животном, не является изолированным, но этот же нуклеотид, отделенный от смежных нуклеиновых кислот, в состав которых он входит в природе, считается «изолированным».
[0061] Термин «очищенный», при использовании в отношении биологического материала, не обязательно требует, чтобы биологический материал находился в абсолютно чистой беспримесной форме, исключающей наличие других веществ в его составе. Это определение относительно.
[0062] Термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» являются взаимозаменяемыми и относятся к полимерной форме сложных фосфатных эфиров рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулы РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, 5 дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулы ДНК») или любых их фосфоэфирных аналогов, таких как фосфоротиолаты и тиоэфира, либо в одноцепочечной форме, или в форме двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин молекула нуклеиновой кислоты, а в частности, молекула ДНК или РНК, относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее (молекулу) до каких-либо 10 конкретных третичных форм. Таким образом, этот термин охватывает двухцепочечную ДНК, существующую, в том числе, в линейных и кольцевых формах молекулы ДНК (например,
фрагментах рестрикции), плазмидах, суперспирализованной ДНК и хромосомах. При рассмотрении структуры отдельных двухцепочечных молекул ДНК, последовательности могут быть описаны в настоящей заявке соответственно принятым условным обозначениям в 15 направлении от 5’ к 3’ по нетранскрибируемой цепочке ДНК (т. е. цепочке, последовательность которой гомологична последовательности иРНК). «Рекомбинантная молекула ДНК» - это молекула ДНК, подвергшаяся молекулярно-биологической обработке. К ДНК относятся, однако не ограничивают это понятие: кДНК, геномная ДНК, плазмидная ДНК, синтетическая ДНК и полусинтетическая ДНК.
[0063] Термин «фрагмент», применяемый к полинуклеотидным последовательностям, относится к нуклеотидной последовательности, которая состоит из меньшего числа нуклеотидов по сравнению с исходной нуклеиновой кислотой и содержащей, кроме общей области, последовательность нуклеотидов, идентичную изначальной нуклеиновой кислоте. Согласно настоящему изобретению, такой фрагмент нуклеиновой кислоты, может, если необходимо, входить в больший полинуклеотид и являться, таким образом, составной частью последнего. Согласно изобретению, такие фрагменты включают в себя или, в качестве альтернативы могут состоять из олигонуклеотидов, размер которых варьирует от, по меньшей мере 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, или большего числа последовательных нуклеотидов нуклеиновой кислоты.
[0064] В настоящем описании, термин «изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты» относится к одно- или двухцепочечному полимеру РНК или ДНК, факультативно содержащему синтетические, не встречающиеся в природе или измененные основания. Изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты в форме полимера ДНК может содержать один или более сегмент кДНК, геномной ДНК или искуственной ДНК.
[0065] Под определение «Ген» попадает полинуклеотид, состоящий из нуклеотидов, кодирующих функциональную молекулу, а также функциональные молекулы, получаемые посредством одной лишь транскрипции (например, биологически активный вид РНК) или транскрипции и трансляции (например, полипептид). Термин «ген» охватывает кДНК и геномные ДНК. Под определение «Ген» также попадает фрагмент нуклеиновой кислоты, экспрессирующий специфическую РНК, белок или полипептид, и включающий в себя регуляторные последовательности, предшествующие (5’ некодирующие последовательности) и следующие за (3’ некодирующие последовательности) кодирующей последовательностью. Определение «Нативный ген» описывает ген в той форме, в которой он существует в природе, с его собственными регуляторными последовательностями. Определение «химерный ген» (рекомбинантный ген) относится к любому ненативному гену, содержащему регуляторные и/или кодирующие последовательности, не существующие вместе в естественном состоянии. Соответственно, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, взятые из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, взятые из одного и того источника, но расположенные иначе, нежели они располагаются в естественном состоянии. Химерный ген может содержать кодирующие последовательности, которые были взяты из различных источников, и/или регуляторные последовательности, которые были взяты из различных источников. Определение «эндогенный ген» относится к нативному гену в его естественном расположении в геноме организма. Определение «чужеродный» ген или «гетерологичный» ген относится к гену, в нормальных обстоятельствах не присутствующему в организме хозяина, но искусственно введенному в организм хозяина с помощью переноса гена. К чужеродным генам могут относиться встречающиеся в природе гены, внедренные в чужеродный организм или рекомбинантные гены. «Трансген» - это ген, введенный в геном при помощи процедуры трансформации. Например, ген интерлейикна-12 (IL-12) кодирует белок интерлейкин-12 (IL-12). Интерлейкин-12 является гетеродимером состоящим из 35-kD субъединицы (р35) и 40-kD субъединицы (р40), которые, связываясь дисульфидным мостиком, формируют полнофункциональный IL-12p70. Ген IL-12 кодирует обе субъединицы: р35 и р40.
[0066] Термин «гетерологичная ДНК» относится к ДНК, в нормальных условиях не присутствующей в клетке или в хромосомном сайте клетки. В понятие гетерологичной ДНК может входить ген, чужеродный клетке.
[0067] Термин «геном» включает в себя хромосомную, митохондриальную, и вирусную ДНК или РНК, а также ДНК или РНК хлоропластов.
[0068] Молекула нуклеиновой кислоты является «гибридизующейся» с другой молекулой нуклеиновой кислоты, как, например, кДНК, геномной ДНК или РНК, когда одноцепочечная форма молекулы нуклеиновой кислоты может образовать комплекс с другой молекулой нуклеиновой кислоты при соответствующих значениях температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации и промывания хорошо известны и иллюстрированы в Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), в частности, в Главе 11 и Таблице 11.1 этого описания. Температурные условия и ионная сила определяют «точность и безошибочность» гибридизации.
[0069] Условия жесткости гибридизации можно отрегулировать для выделения относительно сходных фрагментов, таких как гомологичные последовательности дальнеродственных организмов, а также фрагментов, обладающих высоким сходством, таких как гены, воспроизводящие функциональные ферменты близкородственных организмов. Для предварительного выявления гомологичных нуклеиновых кислот, применяют мягкие условия, соответствующие низкой жесткости (точности и безошибочности) гибридизации, например: при Tm=55°, в среде содержащей: 5Х SSC, 0.1% SDS, 0.25% молоко, без формамида; или в среде содержащей: 30% формамид, 5Х SSC, 0.5% SDS. Для получения более высоких значений жесткости гибридизации применяют Tm выше, чем в предыдущем примере,в среде содержащей 40%) формамид, с 5X или 6X SSC. Для получения высоких значений жесткости гибридизации применяют высокую Tm, в среде содержащей: 50% формамид, 5X или 6X SSC.
[0070] Для успешной гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя, в зависимости от условий жесткости гибридизации, возможно ошибочное спаривание оснований. Термин «комплементарный» применяют для описания соответствия между нуклетидными основаниями, которые способны гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин комплементарен тимину и гуанин комплементарен цитозину. В соответствии с этим, изобретение также включает в себя изолированные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные к полным последовательностям, как раскрыто или применено в настоящем описании, а также существенно сходные последовательности нуклеиновых кислот о которых говорилось ранее.
[0071] Согласно одному из вариантов реализации, полинуклеотиды выявляют гибридизацией при Tm, равной 55°C, и обеспечении условий, описанных выше. Согласно другим вариантам реализации, значение Tm берется равным 60°C, 63°C или 65°C.
[0072] Пост-гибридизационные промывки также определяют жесткость гибридизации. Одна группа условий подразумевает серию промываний, начинающуюся с 6X SSC, 0.5% SDS при комнатной температуре в течение 15 минут, затем 2X SSC, 0.5% SDS при 45°C в течение 30 минут, а затем дважды 0.2Х SSC, 0.5% SDS при 50°C в течение 30 минут. Предпочитаемая совокупность более жестких условий подразумевает более высокие температуры, при тех же промываниях, с единственным отличием: температура двух последних 30-минутных промываний 0.2Х SSC, 0.5% SDS повышена до 60°C. Другая предпочитаемая совокупность жестких условий подразумевает два последних промывания 0.1X SSC, 0.1% SDS при 65°C.
[0073] Жесткость, приемлемая для гибридизации нуклеиновых кислот, зависит от длины цепочки нуклеиновых кислот и степени комплементарности, значения этих переменных хорошо известны в данной области. Чем выше степень сродства и гомологичности между двумя нуклеотидными последовательностями, тем выше значение Tm для гибридизации нуклеиновых кислот, соответствующих данным последовательностям. Относительная стабильность (соответствующая более высокой Tm) гибридизации нуклеиновых кислот повышается в следующем ряду: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов, длина которых превышает 100 нуклеотидов, разработаны уравнения для вычисления Tm (см. Sambrook et ah, supra, 9.50-0.51). При гибридизации нуклеиновых кислот меньшей длины, т. е. олигонуклеотидов, количество позиций ошибочного спаривания приобретает большее значение, и специфичность олигонуклеотида определяется его длиной (см. Sambrook et al, supra, 11.7-11.8).
[0074] Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, полинуклеотиды распознаются путем применения условий гибридизации, включающих в себя стадию гибридизации при содержании солей менее чем 500 mM и температуре не ниже 37°C, и стадию промывания в 2X SSPE при температуре не ниже 63°C. Согласно другому варианту реализации, условия гибридизации подразумевают менее чем 200 мМ соли и, по меньшей мере 37°C для стадии гибридизации, согласно другому варианту гибридизации, условия подразумевают 2X SSPE и 63°C для стадий гибридизации и промывания.
[0075] Согласно другому варианту реализации изобретения, длина подвергающейся гибридизации нуклеиновой кислоты составляет, как минимум, 10 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы минимальная длина нуклеиновой кислоты составляла по меньшей мере 15 нуклеотидов; например по меньшей мере 20 нуклеотидов; например по меньшей мере 30 нуклеотидов. Более того, опытный специалист учтет, что температура и соленость промывочного раствора может быть отрегулирована до необходимого значения, в зависимости от факторов, таких как длина образца.
[0076] Термин «образец» относится к молекуле одноцепочечной нуклеиновой кислоты, основания которой обладают способность связаться с соответствующими основаниями комплементарной одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени с образованием двухцепочечной молекулы.
[0077] Термин «олигонуклеотид» в настоящем описании относится к короткой нуклеиновой кислоте, способной к гибридизации с молекулой геномной ДНК, кДНК, плазмидной ДНК или иРНК. Олигонуклеотиды могут быть помечены, например, 32P - нуклеотидами или нуклеотидами, к которым можно ковалентно присоединить метку, например, биотин. Меченый олигонуклеотид может быть использован в качестве зонда для выявления присутствия нуклеиновой кислоты. Олигонуклеотиды (один или оба из которых могут быть помечены) могут быть использованы в качестве праймеров ПЦР при клонировании фрагмента или всей нуклеиновой кислоты, для определения последовательности ДНК, либо для выявления наличия ДНК. Олигонуклеотид также может быть использован для получения тройной спирали с молекулой ДНК. Обычно, олигонуклеотиды получают синтетическим путем, предпочтительно, в синтезаторе нуклеиновых кислот. Соответственно этому, полученные олигонуклеотиды могут нести не встерчающиеся в природе аналоги фосфодиэфирных связей, например, тиоэфирных связей и т.п.
[0078] Термин «праймер» относится к олигонуклеотиду, гибридизующемуся с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени с получением двухцепочечного участка нуклеиновой кислоты. Этот участок, в соответствующих условиях, может служить точкой инициации синтеза ДНК. Такие праймеры могут быть использованы в ПЦР или для определения последовательности ДНК.
[0079] Термин «полимеразная цепная реакция», в сокращении, ПЦР, относится к in vitro способу ферментативной амплификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот. ПЦР включает в себя повторяющиеся серии температурных циклов, состоящих из трех стадий: денатурация матричной нуклеиновой кислоты с разделением цепочек молекулы-мишени, гибридизация одноцепочечного олигонуклеотидного праймера ПЦР с матричной нуклеиновой кислотой и удлинение гибридизованного примера(ов) ДНК-полимеразой. ПЦР обеспечивает обнаружение молекулы-мишени, а также определение относительного количества этой молекулы-мишени в первичной смеси нуклеиновых кислот в полуколичественных или количественных условиях,.
[0080] Термин «полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией», в сокращении, ОТ-ПЦР (RT-PCR), относится к in vitro способу ферментативного синтеза молекулы-мишени или молекул-мишеней кДНК из молекулы или молекул РНК с последующей ферментативной амплификацией специфической последовательности или последовательностей в составе молекулы-мишени или молекул-мишеней кДНК, как описано выше. ОТ-ПЦР обеспечивает обнаружение молекулы-мишени, а также определение относительного количества этой молекулы-мишени в первичной смеси нуклеиновых кислот в полу количественных или количественных условиях.
[0081] Термин «кодирующая последовательность» ДНК относится к последовательности двухцепочечной ДНК, кодирующей полипептид и поддающейся транскрипции и трансляции в полипептид в клетке in vitro или in vivo, под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Термин «соответствующие регуляторные последовательности» относится к нуклеотидным последовательностям, предшествующим (5’ некодирующие последовательности), находящимся в составе или следующим за (3’ некодирующие последовательности) кодирующей последовательностью, и влияющим на транскрипцию, процессинг, стабильность РНК, или трансляцию соответствующей кодирующей последовательности. К регуляторным последовательностям могут относиться промоторы, лидирующие последовательности трансляции, интроны, сайты распознавания полиаденилирования, сайты процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа «стебель-петля». Границы кодирующих последовательностей определяются старт-кодоном на 5’ (амино) конце и стоп-кодоном трансляции на 3’ (карбоксильном) конце. Кодирующая последовательность может содержать (но не ограничена) прокариотические последовательности, кДНК из иРНК, геномные последовательности ДНК и даже искусственные последовательности ДНК. Если кодирующая последовательность предназначается для экспрессии в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и терминации транскрипции, как правило, будет находиться в направлении 3’ от кодирующей последовательности.
[0082] Термин «открытая рамка считывания», в сокращении, ОРС (ORF), относится к всей последовательности нуклеиновой кислоты, ДНК, кДНК или РНК, включающей в себя старт-сигнал трансляции, или кодон инициации, как АТГ(ATG) или АУГ(AUG), и кодон терминации. Может происходить трансляция этой последовательности в полипептидную последовательность.
[0083] Термин «голова к голове» (head-to-head) в настоящей заявке относится к пространственной ориентации двух полинуклеотидных последовательностей по отношению друг к другу. Полинуклеотиды позиционированы в ориентации «голова к голове», когда 5’ конец кодирующей цепочки одного полинуклеотида прилегает к 5’ концу кодирующей последовательности другого полинуклеотида, причем направление транскрипции каждого полинуклеотида идет от 5’ конца другого полинуклеотида. Термин «голова к голове» может быть кратко представлен в виде (5’)-к-(5’) и может также обозначаться символами (← →) или (3’←5’5’→»3’).
[0084] Термин «хвост к хвосту» в в настоящей заявке относится к пространственной ориентации двух полинуклеотидных последовательностей по отношению друг к другу. Полинуклеотиды позиционированы в ориентации «хвост к хвосту», когда 3’ конец кодирующей последовательности одного полинуклеотида прилегает к 3’ концу кодирующей последовательности другого полинуклеотида, причем направление транскрипции каждого полинуклеотида идет к другому полинуклеотиду. Термин «хвост к хвосту» может быть кратко представлен в виде (3’)-к-(3’) и может также обозначаться символами (→←) или (5’→3’3’-5’).
[0085] Термин «голова к хвосту» в настоящей заявке относится к ориентации двух полинуклеотидных последовательностей по отношению друг к другу. Полинуклеотиды позиционированы в ориентации «голова к хвосту», когда 5’ конец кодирующей последовательности одного полинуклеотида прилегает к 3’ концу кодирующей последовательности другого полинуклеотида, причем направление транскрипции каждого полинуклеотида однонаправленно с направлением транскрипции другого полинуклеотида. Термин «голова к хвосту» может быть сформулирован в виде (5’)-к-(3’) и может также обозначаться символами (→→) или (5’-3’5’→3’).
[0086] Термин, «находящийся по ходу транскрипции» («следующий за» кодирующей последовательностью) относится к нуклеотидной последовательности, расположенной в направлении 3’ отностительно рассматриваемой точки нуклеотидной последовательности. В частности, находящиеся по ходу транскрипции нуклеотидные последовательности обычно относятся к последовательностям, следующим за начальной точкой транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена следует за стартовой точкой транскрипции.
[0087] Термин, «находящийся против хода транскрипции» («предшествующий» кодирующей последовательности) относится к нуклеотидной последовательности, расположенной в направлении 5’ относительно рассматриваемой точки нуклеотидной последовательности. В частности, находящиеся против хода транскрипции нуклеотидные последовательности обычно относятся к последовательностям, предшествующим начальной точке транскрипции. Например, большинство промоторов предшествуют стартовой точке транскрипции.
[0088] Термины «рестрикционная эндонуклеаза», «рестриктаза» взаимозаменяемы и относятся к ферменту, присоединяющемуся к специфической нуклеотидной последовательности в составе двухцепочечной ДНК и расщепляющему ее.
[0089] Термин «гомологичная рекомбинация» относится к встраиванию чужеродной последовательности ДНК в другую молекулу ДНК, например, внедрение вектора в хромосому. Предпочтительно, при гомологичной рекомбинации вектор нацеливается на специфический участок хромосомы. Для специфической гомологичной рекомбинации вектор должен содержать достаточно длинные участки гомологии к хромосомным последовательностям, чтобы обеспечить комплементарное присоединение и внедрение вектора в хромосому. Более длинные участки гомологии и более высокая степень сродства последовательностей могут повысить эффективность гомологичной рекомбинации.
[0090] В данной области техники известно несколько способов репродуцирования полинуклеотидов, пригодных для использования согласно изобретению. Как только предоставлена подходящая система хозяина и условия для роста, рекомбинантные векторы экспрессии могут быть репродуцированы и получены в нужном количестве. Согласно настоящему описанию, к векторам экспрессии, пригодным для использования, относятся (но не ограничивают) следующие векторы или их производные: вирусы человека или животных, как вирус осповакцины или аденовирус; вирусы насекомых, как бакуловирус; дрожжевые векторы; векторы-бактериофаги (например, фаг лямбда); и некоторые плазмидные и космидные ДНК-векторы.
[0091] Термин «вектор» относится к любому средству клонирования и/или транспорта нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может быть репликоном, к которому можно присоединить другой сегмент ДНК для осуществления репликации такого сегмента. Термин «репликон» относится к любому генетическому элементу (например плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), функционирующему как автономная единица репликации ДНК in vivo, т. е. способному реплицироваться под собственным контролем. Термин «вектор» подразумевает как вирусные, так и невирусные средства введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. Большое количество векторов, известных в данной области техники, может быть использовано для различных операций с нуклеиновыми кислотами, внедрения в гены элементов отклика, промоторов и т.п.. К возможным векторам относятся, например, плазмиды или модифицированные вирусы, включая, например, производные фага лямбда или такие плазмиды, как производные плазмид pBR322 и pUC, или вектор Bluescript. Другим примером векторов, пригодных для использования согласно изобретению, является UltraVector™ Production System (Intrexon Corp., Blacksburg, VA), описанный в WO 2007/038276. Например, внедрение фрагментов ДНК, соответствующих элементам отклика и промоторам, в подходящий вектор может быть осуществлено лигированием соответствующих фрагментов ДНК в выбранный вектор, обладающий комплементарными «липкими» концами. В качестве альтернативы, концы молекул ДНК могут быть ферментативно модифицированы, или любой участок может быть модифицирован путем лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) в терминальные участки ДНК. Такие векторы могут быть модифицированы таким образом, чтобы нести произвольные маркерные гены, обеспечивающие возможность селекции клеток, в геном которых введен маркер. Такие маркеры позволяют идентифицировать и/или отбирать клетки, инкорпорировавшие и вырабатывающие белки, кодируемые маркером.
[0092] Вирусные, а особенно ретровирусные векторы применяют в широком спектре процедур по внедрению генов в клетки, а также в живые животные организмы. Пригодные к применению вирусные векторы включают в себя (но не ограничиваются) ретровирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирусы оспы, бакуловирусы, вирус осповакцины, вирусы герпеса, вирус Эпштейна-Барра, аденовирусы, геминивирусы и каулимовирусы. К невирусным векторам относятся плазмиды, липосомы, катионные липосомы (цитофектины), ДНК-белковые комплексы и биополимеры. Кроме нуклеиновой кислоты, вектор также может содержать один или несколько регуляторных участков и/или селектируемые маркеры, удобные для селекции, количественного анализа и мониторинга результатов перемещения нуклеиновых кислот (например, в какую ткань происходит перемещение, продолжительности экспрессии и т.п.).
[0093] Термин «плазмида» относится к экстрахромосомному элементу, часто несущему ген, не являющийся компонентом центрального метаболизма клетки, и обычно имеющему форму кольцевой двухцепочечной ДНК. Такие элементы могут являться автономно реплицирующимися последовательностями, интегрирующимися в геном последовательностями, фаговыми или нуклеотидными последовательностями, линейными, циркулярными или сверхспиральными,
состоящими из одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, имеющими любое происхождение последовательности в которые было внедрено несколько нуклеотидных последовательностей, таким образом, что они рекомбинированы в уникальные конструкции, способные к внедрению в клетку фрагмента промотора и последовательности ДНК определенного генного продукта вместе с соответствующей нетранслируемой 3’ последовательностью.
[0094] Термин «клонирующий вектор» относится к «репликону», который является единицей измерения длины нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК, который последовательно реплицируется и включает в себя кодирующую последовательность, такую, как плазмиду, фаг или космиду, к которой может быть присоединен другой участок нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы обеспечить репликацию присоединенного участка. Клонирующие векторы могут быть способны к репликации в одном типе клеток и экспрессии в другом (челночный вектор). Клонирующие векторы могут содержать одну или более последовательностей, пригодных к использованию при селекции клеток, в которых присутствует данный вектор и/или один или множество сайтов клонирования для введения последовательностей, представляющих интерес.
[0095] Термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, плазмиде или носителю, предназначенному для экспрессии внедренной последовательности нуклеиновой кислоты в хозяине после трансформации. Клонированный ген, т. е. внедренная последовательность нуклеиновой кислоты обычно ставится под контроль контролирующих элементов, таких как промотор, минимальный промотор, энхансер и т.п. Участки контроля инициации или промоторы, которые используются при запуске экспрессии нуклеиновой кислоты в заданной клетке-хозяине, существуют в больших количествах и известны специалистам в данной области. Практически любой промотор, способный запустить экспрессию этих генов, может быть использован как вектор экспрессии, включая (но, не ограничиваясь): вирусные промоторы, бактериальные промоторы, промоторы животных, промоторы млекопитающих, синтетические промоторы, конститутивные промоторы, тканеспецифические промоторы, связанные с заболеваниями или патогенезом промоторы, промоторы, связанные с индивидуальным развитием, индуцируемые промоторы, фоторегулируемые промоторы; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GALl1O, ADH1, PGK, РН05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, промоторы щелочной фосфатазы (эффективные для применения в Saccharomyces); AOX1 промоторы (эффективные для применения в Pichia); промоторы (3-лактамазы, lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac, и trc (эффективные для применения в Escherichia coli); фоторегулируемые-, семяспецифичные-, специфичные к пыльнику, специфичные к завязи, вируса мозаики цветной капусты 35S, минимальные промоторы CMV 35S, промоторы вируса мозаики маниоки (CsVMV), промотор хлорофилл a/b-связывающего белка, промоторы рибулоза 1,5-бифосфат карбоксилазы, специфичные к вегетативным побегам, специфичные к корням, промоторы хитиназы, стрессовые, промоторы бацилловидного вируса риса tungo (rice tungro bacilliform), суперпромоторы растений, промоторы лейциновой аминопептидазы картофеля, промоторы нитрат-редуктазы, промоторы маннопин-синтазы, промоторы нопалин-синтазы, промоторы убиквитина, промоторы зеина и антоцианина (эффективные для применения в растительных клетках); промоторы животных и млекопитающих, известные в данной области техники, включающие в себя (но не ограниченные), участок раннего промотора SV40 (SV40e), промотор, содержащий на 3’ конце длинный концевой повтор (LTR) вируса саркомы Роуза (RSV), промоторы E1A или гены главных поздних промоторов (MLP) аденовирусов(Ad), ранние промоторы цитомегаловируса (CMV), промоторы тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV), IE1 промоторы бакуловируса, промоторы фактора элонгации 1-альфа(ЕР1), промоторы фосфоглицераткиназы(PGK), промоторы убиквитина (Ubc), промоторы альбумина, регуляторные последовательности и участки контроля транскрипции промотора металлотионеина-L мыши, убиквитарные промоторы (HPRT, виментина, α-актина, тубулина и т.п.), промоторы промежуточных филаментов (десмина, нейрофиламентов, кератина, GFAP и т.п.), промоторы клинически важных генов (MDR, CFTR или фактора VIII и т.п.); связанные с заболеваниями или патогенезом промоторы и промоторы, обладающие тканевой специфичностью и используемые в трансгенных животных, как, например, регуляторный участок гена эластазы I; который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы; регуляторный участок гена инсулина, который активен в бета-клетках поджелудочной железы; регуляторный участок гена иммуноглобулина, который активен в лимфоидных клетках; регуляторный участок вируса опухолей молочной железы мышей, который активен в тестикулярных, лимфоидных, тучных клетках и клетках молочной железы; регуляторный участки Apo AI и Apo AII гена альбумина, которые активны в печени; регуляторный участки гена альфа-фетопротеина, активные в печени; регулятрные участки гена бета-глобина, активные в миелоидных клетках; регуляторный участки гена основного белка миелина, активные в олигодендроцитах мозга; регуляторные участки гена легкой цепи миозина 2, активные в скелетных мышцах; регуляторные участки гонадотропного рилизинг-гормона, активные в гипоталамусе; промоторы пируваткиназы, промоторы виллина; промоторы интестинальных белков, связывающих жирные кислоты; промоторы альфа-актина клеток гладких мышц, и т.п.Кроме того, указанные экспрессируемые последовательности могут быть модифицированы с помощью энхансеров, регуляторных последовательностей и т.п.
[0096] Векторы можно вводить в указанную клетку-хозяина способами, известными в данной области тхники, например: трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, слиянием клеток, трансфекцией, опосредованной диэтиламиноэтил декстраном, преципитацией фосфатом кальция, липофекцией (слиянием с лизосомами), с помощью «генной пушки» или транспортного ДНК-вектора (см., например., Wu et al, J. Biol. Chem. 267:963 (1992); Wu et al, J. Biol. Chem. 265:14621 (1988); и Hartmut et al, Canadian Patent Application No. 2,012,311).
[0097] Согласно настоящему изобретению, полинуклеотид также можно вводить липофекцией in vivo. За последние десять лет, заметно увеличилось использование липосом для инкапсуляции и трансфекции нуклеиновых кислот in vivo. Синтетические катионные липиды, созданные для ограничения трудностей и угроз, связанных с опосредованной липосомами трансфекцией, можно использовать для получения липосом, и применения последних для in vivo трансфекции генов, кодирующих маркеры. (Feigner et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA. 84:7413 (1987); Mackey et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA<S5:8027 (1988); и Ulmer et al., Science 259:1745 (1993)). Применение катионных липидов может вызвать инкапсуляцию отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами (Feigner et al., Science 337:387 (1989)). Особенно эффективные для транспорта нуклеиновых кислот липидные соединения и композиции описаны в WO 95/18863, WO 96/17823 и патенте США 5,459,127. Применение липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы in vivo обладает определенными практическими преимуществами. Молекулярное нацеливание липосом на определенные типы клеток представляет одно из них. Очевидно, что направленная трансфекция в определенные типы клеток будет особенно предпочтительна в тканях, отличающихся клеточной гетерогенностью, таких как поджелудочная железа, печень, почки и мозг. Для обеспечения направленной доставки (таргетинга), липиды могут быть химически присоединены к другим молекулам (Mackey et al. 1988, supra). Таргетированные пептиды, например, гормоны или нейротрансмиттеры, и протеины, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть связаны с липидами химически.
[0098] Для облегчения трансфекции нуклеиновых кислот in vivo можно также применять другие молекулы, например, катионные олигопептиды (например, WO 95/21931), пептиды-производные от ДНК-связывающих белков (например, WO 96/25508) или катионные полимеры (например, WO 95/21931).
[0099] Также, можно ввести вектор in vivo в форме «голой» ДНК-плазмиды (см. патенты США №5,693,622, 5,589,466 и 5,580,859). Кроме того, можно быть применены методы рецептор-опосредованной доставки ДНК (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 5:147 (1992); и Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429(1987)).
[0100] Термин «трансфекция» относится к поглощению экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК клеткой. Клетка оказывается «трансфецированной» экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК, когда такая РНК или ДНК проникает в клетку. Клетка считается «трансформированной» экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК, когда трансфицированная РНК или ДНК вызывает изменение фенотипа. Трансформирующая РНК или ДНК может быть интегрирована (ковалентно связана) в хромосомную ДНК, меняя геном клетки.
[0101] Термин «трансформация» относится к доставке фрагмента нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, приводящей к генетически стойкому наследованию. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, обозначаются как «трансгенные», или «рекомбинированные», или «трансформированные» организмы.
[0102] Кроме того, рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид согласно настоящему изобретению, может включать в себя одну или более точек инициации репликации в клеточных хозяевах, в которых будет выявляться амплификация или экспрессия данного вектора, маркеров или селектируемых маркеров.
[0103] Термин «селектируемый маркер» относится к идентифицирующему фактору, обычно, антибиотику или гену химической устойчивости (резистентности), который можно выбрать соответственно эффекту гена-маркера, т. е. устойчивость к антибиотику, устойчивость к гербициду, колориметрические маркеры, ферменты, флуоресцентные маркеры и т.п., где эффект применяется для прослеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты и/или для идентификации клетки или организма, унаследовавших эту нуклеиновую кислоту. Примеры селектируемых маркеров, известных и применяемых в данной области техники, включают в себя: гены устойчивости к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; а также гены, применяемые как фенотипические маркеры, т. е. регуляторные гены антоцианина, ген изопентанил трансферазы и т.п.
[0104] Термин «репортерный ген» относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей идентифицирующий фактор, который можно выявить, основываясь на эффекте репортерного гена, где эффект используется для прослеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты, и/или для идентификации клетки или организма, унаследовавших эту нуклеиновую кислоту, и/или для количественной оценки активации экспрессии гена или транскрипции. Примеры репортерных генов, известных и применяемых в данной области техники, включают в себя: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол ацетилтрансферазу (CAT), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus) и т.п. Гены селектируемых маркеров также можно отнести к репортерным генам.
[0105] Термины «промотор» и «промоторная последовательность» взаимозаменимы и относятся к последовательности ДНК, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или экспрессию функциональной РНК. Обычно кодирующая последовательность находиться в направлении 3’ от промоторной последовательности. Промоторы могут происходить от нативного гена или состоять из различных элементов, происходящих от различных промоторов, существующих в природе, и даже содержать сегменты синтетической ДНК. Специалисты в данной области понимают, что разные промоторы могут управлять экспрессией гена в разных тканях и типах клеток, либо на разных стадиях развития, либо при различных внешних или физиологических условиях. Промоторы, запускающие экспрессию гена в большинстве типов клеток и в большинстве случаев, обычно называются «конститутивными промоторами». Промоторы, запускающие экспрессию гена в специфических типах клеток, обычно называются «клеточно-специфичными промоторами» или «ткань-специфичными промоторами». Промоторы, запускающие экспрессию гена на определенной стадии развития или дифференцировки клетки, обычно называют «промоторы, специфичные к стадии развития» или «промоторы, специфичные к стадии дифференцировки клетки». Промоторы, индуцируемые и запускающие экспрессию гена после воздействия или обработки клетки агентом, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, светом или другим подобным фактором, индуцирующим промотор, обычно называются «индуцируемыми промоторами» или «регулируемыми промоторами». Кроме того, общепризнано, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не определены полностью, фрагменты ДНК различной длины могут обладать одинаковой промоторной активностью.;
[0106] Как правило, промоторная последовательность со своего 3’ конца граничит с точкой инициации транскрипции и расположена по ходу транскрипции (в направлении 5’) с тем, чтобы включать в себя минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровне общего фона. В состав промотора входит точка инициации транскрипции (легко определимая, например, картированием нуклеазой S1), а также белок-связывающие домены (консенсусные последовательности), обеспечивающие присоединение РНК полимеразы.
[0107] Кодирующая последовательность находится «под контролем» последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию в клетке, когда РНК полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в иРНК, которая затем транс-сплайсируется (если в кодирующей последовательности есть интроны) и транслируется с получением белка, кодируемого кодирующей последовательностью.
[0108] Термин «последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию», относится к регуляторным последовательностям ДНК, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы и т.п., обеспечивающим экспрессию кодирующей последовательности в клетке. В эукариотических клетках, сигналы полиаденилирования являются регуляторными последовательностями.
[0109] Термин «элемент отклика» (элемент ответа, response element, RE) относится к одному или более действующему в цис-положении элементу ДНК, придающему промотору способность к реагированию через взаимодействие с ДНК-связывающими доменами транскрипционного фактора. Последовательность такового элемента ДНК может быть либо палиндромом (точным или неточным), либо состоящей из мотивов последовательностей, либо из половинных сайтов, разделенных различным количеством нуклеотидов. Половинные сайты могут быть схожими или идентичными, располагаться в виде прямых либо обратных повторов, в виде единичного полу-сайта либо в виде мультимеров прилегающих последовательных половинных сайтов. Элемент отклика может содержать минимальный промотор, полученный от различных организмов, в зависимости от природы клетки или организма, в который данный элемент отклика будет введен. ДНК-связывающий домен транскрипционного фактора присоединяется, в присутствии лиганда или без оного, к последовательности ДНК элемента отклика с тем, чтобы инициировать или подавлять транскрипцию гена(ов), расположенных по ходу транскрипции, под регуляцией этого элемента отклика. Примеры последовательностей ДНК элементов отклика природного рецептора экдизона включают в себя: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (SEQ ID NO: 9) (см. Cherbas et. al, Genes Dev. 5:120 (1991)); AGGTCAN(n)AGGTCA, где N(n) может быть одним или несколькими разделяющими нуклеотидами (SEQ K) NO: 10) (см. D’Avino et al, Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)); and GGGTTGAATGAATTT (SEQ ID NO: 11) (см. Antoniewski et al, Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)).
[0110] Термин «функционально связанный» относится к присоединению последовательностей нуклеиновых кислот к единичному фрагменту нуклеиновой кислоты таким образом, что функция одного элемента находится под влиянием другого. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (т. е. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.
[0111] Термин «экспрессия» в настоящем описании относится к транскрипции и стойком накоплении смысловой РНК (иРНК) или антисмысловой РНК, синтезированной из нуклеиновой кислоты или полинуклеотида. Экспрессия также может относиться к трансляции иРНК с получением белка или полипептида.
[0112] Термины «кассета», «экспрессионная кассета», «генная экспрессионная кассета» относятся к сегменту ДНК, который может быть вставлен в нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в специфических сайтах рестрикции или путем гомологичной рекомбинации. Сегмент ДНК содержит полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес полипептид, причем кассета и сайты рестрикции спланированы таким образом, чтобы гарантировать вставку кассеты в надлежащую рамку считывания для транскрипции и трансляции. «Кассета трансформации» относится к специфическому вектору, содержащему полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес полипептид, и элементы помимо этого полинуклеотида, облегчающие трансформацию в определенной клетке-хозяине. Кассеты, экспрессионные кассеты, генные экспрессионные кассеты и кассеты трансформации согласно определению могут также содержать элементы, позволяющие осуществление повышенной экспрессии в клетке-хозяине полинуклеотида, который кодирует представляющий интерес полипептид. К таким элементам могут относиться (но не ограничивают): промотор, минимальный промотор, энхансер, элемент отклика, терминаторная последовательность, последовательность полиаденилирования и т.п.
[0113] Согласно настоящему изобретению, термин «переключатель гена» относится к комбинации элемента отклика, связанного с промотором, и системы на основе лиганд-зависимого транскрипционного фактора, которая, в присутствии одного или нескольких лигандов, модулирует экспрессию гена, в который внедрены указанный элемент отклика и промотор. Термин «полинуклеотид, кодирующий переключатель гена», относится к комбинации элемента отклика, связанного с промотором, и системы лиганд-зависимого транскрипционного фактора, которая, в присутствии одного или нескольких лигандов, модулирует экспрессию гена, в который внедрены указанные элемент отклика и промотор.
[0114] Термин «на базе рецептора экдизона», в отношении переключателя гена, относится к переключателю гена, содержащему, как минимум, функциональную часть лиганд-связывающего домена природного или синтетического рецептора экдизона, и регулирующему генную экспрессию в ответ на присоединение лиганда к лиганд-связывающему домену рецептора экдизона. Примеры экдизонреактивных (экдизонзависимых) систем описаны в Патентах США №7,091,038 and 6,258,603. Согласно одному из вариантов реализации, системой является RheoSwitch® Therapeutic System (RTS), в которую входят два рекомбинантных белка, домены DEF мутированных рецепторов экдизона (EcR), связанные с ДНК-связывающим доменом Gal4, и домены EF химерного RXR, связанные с доменом активации транскрипции VP 16, экспрессируемые под контролем конститутивного промотора, как иллюстрировано на Фигуре 1.
[0115] Термины «модулировать» и «модулирует» относятся к стимуляции, снижению или подавлению экспрессии нуклеиновой кислоты или гена, приводящей к соответствующей стимуляции, снижению или подавлению выработки белка или полипептида.
[0116] Полинуклеотиды или векторы согласно настоящему изобретению могут также содержать по меньшей мере один промотор, подходящий для управления экспрессией гена в клетке-хозяине.
[0117] Энхансеры, которые можно использовать согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают в себя (но не ограничиваются): энхансер SV40, энхансер цитомегаловируса (CMV), энхансер фактора элонгации 1 (EF1), энхансер дрожжей, энхансеры вирусных генов и т.п.
[0118] Участки, контролирующие терминацию, т. е. терминаторные или полиаденилирующие последовательности, могут также быть получены из различных генов, нативных для выбранных хозяев. При желании, терминальный участок можно исключить, однако его наличие является предпочтительным. Согласно одному из вариантов реализации, участок, контролирующий терминацию может содержать или быть получен из синтетической последовательности, синтетического сигнала полиаденилирования, позднего сигнала полиаденилирования SV40, сигнала полиаденилирования SV40, сигнала полиаденилирования коровьего гормона роста (BGH), вирусных терминаторных последовательностей и т.п.
[0119] Термины «3’ некодирующая последовательность» или «3’ нетранслируемый участок» (UTR) относятся к последовательностям ДНК, расположенным по ходу транскрипции (3’) от кодирующей последовательности, и которые могут содержать последовательности распознавания полиаденилирования [poly(A)] и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг иРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется влиянием на присоединение цепочек поли(А)к 3’ концу предшественника иРНК.
[0120] Термин «регуляторный участок» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, регулирующей экспрессию последовательности второй (другой) нуклеиновой кислоты. Регуляторный участок может содержать последовательности, естественно отвечающие за экспрессию определенной нуклеиновой кислоты (гомологичный участок), либо последовательности иного происхождения, отвечающие за экспрессию других белков или даже синтетических белков (гетерологичный участок). В частности, такие последовательности могут быть последовательностями прокариотических, эукариотических или вирусных генов, либо их производными, стимулирующими или подавляющими транскрипцию гена специфично или неспецифично, индуцируемым или неиндуцируемым образом. К регуляторный участкам относятся точки начала репликации, сплайсинг-сайты РНК, промоторы, энхансеры, последовательности терминации транскрипции и сигнальные последовательности, направляющие полипептид по секреторным путям к целевой клетке.
[0121] Регуляторный участок, взятый из «гетерологичного участка», относится к регуляторному участку, естественно не связанному с экспрессируемой нуклеиновой кислотой. К гетерологичным регуляторным участкам относятся регуляторные участки других видов, других генов, гибридные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, которые не существуют в природе, но которые может разработать рядовой специалист в данной области.
[0122] Термин «РНК-транскрипт» относится к продукту, полученному в результате транскрипции последовательности ДНК, катализированной РНК-полимеразой. Если РНК-транскрипт является точной комплементарной копией последовательности ДНК, его называют первичным транскриптом. Также это может быть последовательность РНК, полученная в результате пост-транскрипционного процессинга первичного транскрипта, называемая зрелой РНК. Термин «информационная РНК (иРНК)» относится к РНК, не содержащей интронов и которая может быть транслирована клеткой с получением белка. Термин «кДНК» относится к двухцепочечной ДНК, комплементарной и полученной из иРНК. Термин «смысловая РНК» относится к РНК-транскрипту, содержащему иРНК и, таким образом, который может быть транслированным в белок клеткой. Термин «антисмысловая РНК» относится к РНК-транскрипту, комплементарному всему первичному транскрипту-мишени или его части, либо комплементарному иРНК, и блокирующему экспрессию гена-мишени. Комплементарность антисмысловой РНК может выражаться по отношению к любой части специфического транскрипта гена, т. е. в районе 5’ некодирующей последовательности, 3’ некодирующей последовательности или в области кодирующей последовательности. Термин «функциональная РНК» относится к антисмысловой РНК, рибозимной РНК или другой РНК, которая не транслируется, но оказывает эффект на клеточные процессы.
[0123] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» взаимозаменяемы и относятся к полимерному соединению, состоящему из ковалентно связанных остатков аминокислот.
[0124] Термины «изолированный/выделенный полипептид», «изолированный/выделенный пептид» или «изолированный/выделенный белок» относятся к полипептиду или белку, практически свободному от соединений, обычно ассоциированных с ним в его естественной форме (например, другие белки или полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды). Термин «Изолированный/выделенный» не означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими веществами, либо наличие примесей, не влияющих на биологическую активность, каковые могут присутствовать вследствие, например, неполной очистки, добавления стабилизирующих веществ, либо превращения в фармацевтически приемлемую композицию.
[0125] Термины «замещенный мутантный полипептид», «замещенный мутант» относятся к мутантному полипептиду, содержащему замену, по меньшей мере одной аминокислоты дикого типа или природной аминокислоты, аминокислотой, отличающейся от присутствующей в полипептиде дикого типа или природном полипептиде. Замещенный мутантный полипептид может содержать лишь одну замену аминокислоты дикого типа или природной аминокислоты и может называться полипептидом с «точечной мутацией» или «единичной точечной мутацией». В другом случае, в замещенном мутантном полипептиде может оказаться две или более замены аминокислот дикого типа или природных аминокислот, аминокислотами, отличающимся от присутствующих в полипептиде дикого типа или природном полипептиде. Согласно изобретению, полипептид лиганд-связывающего домена ядерного рецептора Группы H, в котором наличествует мутация замены, содержит замену, по меньшей мере одной аминокислоты дикого типа или природной аминокислоты, аминокислотой, отличающейся от присутствующей в полипептиде дикого типа или природном полипептиде лиганд-связывающего домена ядерного рецептора Группы H.
[0126] Когда в замещенном мутантном полипептиде происходит замена двух или более аминокислот дикого типа или природных аминокислот, эта замена может подразумевать, либо эквивалентную делецию аминокислот дикого типа или природных аминокислот в процессе замены, т. е. 2 аминокислоты дикого типа или природной аминокислоты замещаются 2 отличными от дикого типа аминокислотами, или не встречающимися в природе аминокислотами, либо в процессе замены произошла делеция неэквивалентного числа аминокислот, т. е. произошла замена 2-х аминокислот дикого типа на 1 аминокислоту не дикого типа (мутация замещения + делеции), или 2 аминокислоты дикого типа заменили на 3 аминокислоты не дикого типа (мутация замены + вставки).
[0127] Замещенные мутанты можно описать с помощью системы сокращенной номенклатуры для обозначения аминокислотного остатка и его позиции при замещении, в соответствии с эталонной полипептидной последовательностью, и указания заменившей новой аминокислоты. Например, замещенный мутант, в котором произошла замена 20-го аминокислотного остатка полипептидной цепи, может быть обозначен как «x20z», где «x» - это заменяемая аминокислота, 20 - это позиция или порядковый номер аминокислотного остатка в полипептиде, а «z» - это новая, заменившая старую аминокислота. Поэтому, замещенный мутант, взаимозаменяемо обозначаемый как «Е20А» или «Glu20Ala», подразумевает, что мутант содержит остаток аланина (обычно обозначаемый в данной области техники как ʺAʺ или ʺAlaʺ) вместо глутаминовой кислоты (обычно обозначаемой в данной области техники как ʺEʺ или ʺGIuʺ) на 20-й позиции полипептида.
[0128] Мутация замены может быть осуществлена любым способом мутагенеза, известным в данной области, включая (но не ограничиваясь) сайт-направленный мутагенез in vitro (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 255:6551 (1978); Zoller et al, ДНК 5:479 (1984); Oliphant et al, Gene 44:117 (1986); Hutchinson et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 83:710 (1986)), использование линкеров TAB® (Pharmacia), расщепление рестриктивной эндонуклеазой/расщепление фрагмента и замещение, ПЦР-опосредованный/сайт-направленный мутагенез и т.п. Основанные на ПЦР методы предпочтительны при сайт-направленном мутагенезе (см. Higuchi, 1989, ʺUsing PCR to Engineer ДНКʺ, in PCR Technology: Principles and Applications for ДНК Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70).
[0129] Термин «фрагмент», применяемый к полипептиду, относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого короче таковой эталонного полипептида, и который содержит, на всем своем протяжении, аминокислотную последовательность, идентичную таковой эталонного полипептида. Такие фрагменты могут, если целесообразно, входить в состав большего полипептида, частью которого они являются. Фрагменты такого рода, согласно изобретению, могут состоять по меньшей мере из 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 или 300 или более аминокислот.
[0130] Термин «вариант» по отношению к полипептиду или белку относится к любому аналогу, фрагменту, производному или мутанту, полученному из полипептида или белка, сохранившему, по меньшей мере биологические особенности полипептида или белка. В природе могут существовать разные варианты полипептидов и белков. Эти варианты могут быть аллельными вариациями, характеризующимися различиями в нуклеотидной последовательности структурного гена, кодирующего белок, любо могут появиться в результате дифференциального сплайсинга или пост-трансляционной модификации. Опытный специалист может создать различные варианты, характеризующиеся единичными или множественными аминокислотными заменами, делециями, вставками или переносами. Среди всех прочих, эти варианты могут включать в себя: (а) варианты, где одна или несколько аминокислот замещаются консервативными (обычно встречающимися в белках) или неконсервативными аминокислотами, (b) варианты, где одна или несколько аминокислот вставляются в полипептид или белок, (с) варианты, где одна или несколько аминокислот содержат замещенную химическую группу, и (d) варианты, где полипептид или белок связывается с другим полипептидом, таким как сывороточный альбумин. Способы получения таких вариантов, включая генетические (супрессии, делеции, мутации и т.д.), химические и ферментативные способы, известны рядовым специалистам в данной области техники. Согласно одному из вариантов реализации, вариант полипептида состоит, по меньшей мере из приблизительно 14 аминокислот.
[0131] Термин «гомология» относится к проценту идентичности между фрагментами двух полинуклеотидов или полипептидов. Соответствие между последовательностями может быть выявлено способами, известными в данной области техники. Например, гомология может быть установлена прямым сравнением информации о последовательностях двух полипептидных молекул путем сопоставления информации о последовательностях и применения легкодоступных компьютерных программ. В качестве альтернативы, гомология может быть установлена гибридизацией полинуклеотидов в условиях, когда гомологичные области формируют стабильные дуплексы (пары), и последующим расщеплением специфичной к одноцепочечным участкам нуклеазой(ами) и определением размера расщепленных фрагментов.
[0132] В данном описании термин «гомологичный» во всех его грамматических формах и фонетических вариантах относится к связи между белками, имеющими «общее эволюционное происхождение», включая белки из суперсемейств (например, суперсемейство иммуноглобулинов) и гомологичные белки разных видов (например, легкая цепь миозина и т.п.) (Reeck et ai, Cell 50:667 (1987)). Такие белки (и кодирующие их гены) обладают гомологичностью последовательностей, как показывает высокая степень сходства их последовательностей. Тем не менее, в повсеместном использовании и применении, термин «гомологичный», при модификации его наречием «высоко», может относиться к сходству последовательностей, а не к общему эволюционному происхождению.
[0133] В соответствии с этим, термин «сходство последовательностей» во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот белков, которые могут иметь или не иметь общее эволюционное происхождение, (см. Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). Согласно одному из вариантов реализации, две последовательности ДНК «существенно гомологичны» или «существенно схожи», когда, по меньшей мере приблизительно 50% (например, по меньшей мере приблизительно 75%, 90%, или 95%) нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины последовательностей ДНК. Существенно гомологичные последовательности могут быть выявлены путем сравнения последовательностей с применением стандартного программного обеспечения и доступа к базам данных последовательностей, либо с применением процедуры гибридизации по Саузерну в строгих условиях, задаваемых для каждой отдельной системы. Установка соответствующих условий гибридизации входит в данную область техники (см. например, Sambrook et al., 1989, supra).
[0134] В настоящем описании, термин «существенно схожи» относится к фрагментам нуклеиновых кислот, где изменения в одном или нескольких основаниях нуклеотида приводят к замене одной или нескольких аминокислот, что, однако не влияет на функциональные особенности белка, кодируемого последовательностью ДНК. Термин «существенно схожи» также относится к фрагментам нуклеиновых кислот, где изменения в одном или нескольких основаниях нуклеотида не влияют на способность фрагмента нуклеиновой кислоты опосредовать изменения экспрессии гена антисмысловыми или ко-супрессионными технологиями. Термин «существенно схожи» также относится к модификациям фрагментов нуклеиновых кислот согласно изобретению, таким как делеции или вставки одной или нескольких оснований нуклеотида, не оказывающим существенного влияния на функциональные особенности полученного транскрипта. Поэтому, очевидно, что изобретение охватывает не только специфические типовые последовательности. Каждая из представленных модификаций относится к обычным приемам в данной области знания, так же, как и оценка сохранения биологической активности кодируемых продуктов.
[0135] Кроме того, опытный специалист учтет, что существенно схожие последовательности, охваченные настоящим изобретением, также характеризуются способностью гибридизироваться в строгих условиях (0.1Х SSC, 0.1% SDS, 65°C, с промыванием 2Х SSC, 0.1% SDS, а затем 0.1X SSC, 0.1% SDS), с последовательностями, приведенными в примерах в настоящем описании. Существенно схожие фрагменты нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению - это такие фрагменты нуклеиновых кислот, последовательности ДНК которых, по меньшей мере приблизительно на 70%, 80%, 90% или 95% идентичны последовательностям ДНК фрагментов нуклеиновых кислот, указанных в настоящем описании.
[0136] Две аминокислотные последовательности являются «существенно гомологичными» или «существенно схожими», когда более, чем 40% аминокислот идентичны, либо более, чем 60% аминокислот схожи (функционально идентичны). Предпочтительно, схожие или гомологичные последовательности выявляются сопоставлением, с применением, например, программы наложения и выравнивания GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin).
[0137] Термин «соответствующие» в данном описании относится к схожим или гомологичным последовательностям, вне зависимости от того, совпадает ли их точная позиция в молекулах, схожесть или гомологичность которых оценивается. При выравнивании последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот между сравниваемыми последовательностями возможны промежутки (пробелы). Таким образом, термин «соответствующий» относится к схожести последовательностей, но не порядковому номеру остатков аминокислот или оснований нуклеотида.
[0138] «Существенная часть» аминокислотной или полинуклеотидной последовательности содержит достаточное количество аминокислот полипептида или нуклеотидов гена для предполагаемой идентификации этого полипептида или гена, либо неавтоматизированной оценки последовательности специалистом в данной области техники, либо компьютеризированным автоматизированным сравнением и идентификацией последовательностей с помощью таких алгоритмов, как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403 (1993)); доступен у ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/). Обычно, последовательность, состоящая из 10 или более смежных аминокислот или тридцати или более смежных нуклеотидов необходима для ориентировочной идентификации полипептида или нуклеиновой кислоты как гомологичной известному полипептиду или гену. Более того, касательно нуклеотидных последовательностей, ген-специфичные зонды, содержащие 20-30 последовательно расположенных нуклеотидов, могут быть применены в зависимых от последовательности способах идентификации (например, гибридизация по Саузерну) и изоляции генов (например, in situ гибридизация бактериальных колоний или бляшек бактериофагов). Затем, небольшие олигонуклеотиды длиной в 12-15 оснований могут быть использованы в качестве амплификационных праймеров в ПЦР для получения определенного фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего праймеры. В соответствии с этим, «существенная часть» нуклеотидной цепочки содержит достаточную долю последовательности для специфичной идентификации и/или изоляции фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего эту последовательность.
[0139] Термин «процент идентичности», известный в данной области техники, относится к соответствию двух или более полипептидных последовательностей, либо двух или более полинуклеотидных последовательностей, определенному сравнением последовательностей. В данной области, «идентичность» также подразумевает степень сродства полипептидных или полинуклеотидных последовательностей, определяемая совпадениями в цепочках этих последовательностей. «Идентичность» и «схожесть» может легко быть определена известными способами, включающими в себя (но не ограниченными) таковые, описанные в: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Выбранные методы определения идентичности разработаны для получения наибольшего количества совпадений в исследуемых последовательностях. Способы определения идентичности и схожести кодированы в публично доступных компьютерных программах. Выравнивания и вычисления процента идентичности могут быть осуществлены с применением программного обеспечения для анализа последовательности, такого, как программа Megalign пакета LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Множественные выравнивания последовательностей могут быть осуществлены применением метода выравнивания «Clustal» (Higgins et al, CABIOS. 5:151 (1989)) с параметрами по умолчанию: (GAP PENALTY=IO, GAP LENGTH PENALTY=IO). По умолчанию параметры для попарного выравнивания с применением метода Clustal могут быть выбраны следующими: KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WIND0W=5 and DIAGONALS SAVED=5.
[0140] Термин «программное обеспечение для анализа последовательности» относится к любого рода компьютерным алгоритмам и программам, применяемым для анализа последовательностей аминокислот и нуклеотидов. «Программное обеспечение для анализа последовательности» может быть коммерчески доступным или независимо разработанным. Типичное программное обеспечение для анализа последовательности включает в себя (но не ограничивается) пакетом the GCG suite of programs (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)), и DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA). В контексте настоящего приложения, подразумевается, что в процессе исследования, когда применяется программное обеспечение для анализа последовательности, результаты анализа будут опираться на «значения по умолчанию» указанной программы, если не оговорено иначе. В настоящем описании, «значения по умолчанию» подразумевают любого рода совокупность значений или параметров, изначально загруженных вместе с программным обеспечением при первой инициализации (инсталляции).
[0141] «Химически синтезированный» в отношении последовательностей ДНК означает, что составляющие нуклеотиды полимеризуются in vitro. Неавтоматизированный химический синтез ДНК может быть осуществлен применением надежных процедур, а автоматизированный химический синтез осуществляется с помощью одной из многих коммерчески доступных машин. В соответствии с этим, гены могут быть синтезированы с тем, чтобы экспрессия генов была оптимальной, благодаря оптимизации последовательности нуклеотидов для отражения погрешностей в кодонах клетки-хозяина. Опытные специалисты оценят высокую вероятность удачной экспрессии генов, в случае если подборка кодонов обеспечивает кодоны, благоприятные для хозяина. Определение предпочитаемых кодонов может быть основано на исследовании генов, экспрессируемых клеткой-хозяином, когда информация о последовательностях доступна.
[0142] В настоящем описании, две или более индивидуально функционирующие системы регуляции генов обозначаются «ортогональными», когда a) в результате модуляции каждой из данных систем соответствующим лигандом в выбранной концентрации выявляется ощутимое изменение в величине экспрессии гена этой системы и b) изменение статистически значительно отличается от изменений в экспрессии всех других систем, одновременно функционирующих в клетке, ткани или организме, вне зависимости от спонтанности или последовательности данной модуляции. Предпочтительно, модуляция каждой индивидуально функционирующей системы регуляции генов вызывает изменение в экспрессии генов по меньшей мере вдвое превосходящее таковое для всех остальных функционирующих систем в клетке, ткани или организме, например, пятикратное, десятикратное, стократное или пятисоткратное. В идеале, модуляция каждой из данных систем соответствующим лигандом в выбранной концентрации приведет к значительному изменению в величине экспрессии гена этой системы, без значительного (измеримого) изменения в экспрессии всех остальных систем, функционирующих в клетке, ткани или организме. В таком случае, множественно индуцируемая система регуляции гена называется «полностью ортогональной». Применяемые ортогональные лиганды и ортогональные рецептор-опосредованные системы регуляции генов описаны в патенте США 2002/0110861 А.
[0143] Термин «экзогенный ген» относится к гену, чужеродному по отношению к организму, другими словами, гену, введенному в организм путем процесса трансформации, либо не мутированной версии мутированного эндогенного гена, либо мутированной версии не мутированного эндогенного гена. Способ трансформации не является критичным относительно настоящего изобретения и может быть любым способом, применимым к субъекту и известным специалистам в данной области. Экзогенные гены могут быть природными или синтетическими, вводимыми в организм в форме ДНК или РНК, которая может функционировать посредством ДНК с помощью обратной транскриптазы. Такие гены можно вводить в клетки-мишени, вводить в организм напрямую, либо вводить не напрямую, посредством введения трансформированных клеток в организм.
[0144] Термин «терапевтический продукт» относится к лечебному полипептиду или лечебному полинуклеотиду, оказывающему благотворный эффект по отношению к клетке-хозяину, в которой данный продукт экспрессируется. К лечебным полипептидам могут относиться, без каких-либо ограничений, пептиды малого размера, состоящие даже из трех аминокислот, одно- или многоцепочечные белки и рекомбинантные белки. К лечебным полинуклеотидам могут относиться, без каких-либо ограничений, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы и внешние вспомогательные последовательности РНК. Терапевтический продукт может содержать последовательность, существующую в природе, синтетическую последовательность или комбинацию встречающихся в природе и синтетических последовательностей.
[0145] Термин «комплекс рецептора экдизона» обычно относится к гетеродимерному белковому комплексу, состоящему из по меньшей мере двух членов семейства ядерных рецепторов: рецептора экдизона (ʺEcRʺ) и белков Ultraspiracle (ʺUSPʺ) (см. Yao et al., Nature 366Λ16 (1993)); Yao et al., Cell 71:63 (1992)). Функциональный комплекс EcR может также содержать добавочный белок(ки), такие как иммунофилины. Другие, вспомогательные члены белкового семейства ядерных рецепторов, известные как транскрипционные факторы (например, DHR38, betaFTZ-1 или другие гомологи насекомых), могут также служить лиганд-зависимыми или лиганд-независимыми партнерами EcR и/или USP. Комплекс EcR может также являться гетеродимером белка EcR и аналога белка Ultraspiracle позвоночных, ретиноидного Х-рецептора (ʺRXRʺ) или химерной комбинацией USP и RXR. Термин комплекс EcR также охватывает гомодимерные комплексы белка EcR или USP.
[0146] Комплекс EcR может быть активирован активным экдистероидным или нестероидным лигандом, связывающимся с одним из белков комплекса, включающим EcR, но не исключающим другие белки комплекса. В данной заявке, термин «лиганд», примененный к основанным на EcR генным переключателям, описывает небольшие и растворимые молекулы, обладающие способностью активировать переключатель гена со стимуляцией экспрессии полипептида, кодируемого зависимым геном. Примеры лигандов включают в себя, без каких-либо ограничений, экдистероид, как, например, экдизон, 20-гидроксиэкдизон, понастерон А, муристерон А и т.п., 9-цис-ретиноидную кислоту, синтетические аналоги ретиноидной кислоты, N-N’-диацилгидразины, описанные в патентах США №6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; и 5,378,726 и публикации заявки США №2005/0209283 и 2006/0020146; оксадиазолины, описанные в публикации заявки США №№2004/0171651; дибензилалкил циангидразины, подобные описанным в Европейской заявке №461,809; N-алкил-N,N’-диароилгидразины, подобные описанным в патенте США №5,225,443; N-ацил-N-алкилкарбонилгидразины, подобные описанным в Европейской заявке №234,994; N-ароил-N-алкил-N’-ароилгидразины, подобные описанным в патенте США №4,985,461; амидокетоны, подобные описанным в публикации заявки США №2004/0049037; и другие подобные материалы, включающие в себя 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-N-изобутил-бензамид, 8-O-ацетилгарпагид, оксистеролы, 22(R) гидроксихолестерин, 24(S) гидроксихолестерин, 25-эпоксихолестерин, T0901317, 5-альфа-6-альфа-эпоксихолестерин-3-сульфат (ECHS), 7-кетохолестерин-3-сульфат, фарнезол, желчные кислоты, сложные эфиры 1,1-бифосфоната, ювенильный гормон III и т.п. Примеры лигандов диацилгидразина, применимых в изобретении, включают в себя RG-115819 (N-(1-этил-2,2-диметил-пропил)-N’-(2-метил-3-метокси-бензил)- гидразид 3,5-диметил-бензойной кислоты), RG-115932 (N-(1-трет-бутил-бутил)-N’-(2-этил-3-метокси-бензил)-гидразид ((R)-3,5-диметил-бензойной кислоты) и RG-115830 (N-(1-трет-бутил-бутил)-N’-(2-этил-3-метокси-бензил)-гидразид 3,5-диметил-бензойной кислоты). См. заявку США №12/155,111, зарегистрированную 29 мая, 2008 и PCT/US2008/006757, зарегистрированный 29 мая, 2008, где описаны другие диацилгидразины, применимые в практической реализации изобретения.
[0147] Комплекс EcR включает в себя белки, являющиеся членами суперсемейства ядерных рецепторов, при том, что все члены этого суперсемейства характеризуются наличием амино-терминального домена трансактивации (ʺТАʺ), ДНК-связывающего домена (ʺDBDʺ) и лиганд-связывающего домена (ʺLBDʺ), которые разделены шарнирным участком. Некоторые члены семейства могут также содержать другой домен трансактивации на карбокси-терминальной стороне LBD. DBD характеризуется наличием двух цистеиновых цинковых пальцев, между которыми расположены два аминокислотных мотива, P-box и D-box, придающие специфичность экдизоновым элементам отклика. Эти домены могут быть как естественными, так и модифицированными или химерными по отношению к различным доменам гетерологичных белков-рецепторов.
[0148] Последовательности ДНК, составляющие экзогенный ген, элемент отклика и комплекс EcR могут быть интегрированы в архебактерии, прокариотические клетки, как, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis или другие энтеробактерии, либо в эукариотические клетки, как клетки растений и животных. Тем не менее, ввиду того, что многие экспрессируемые геном белки не могут пройти правильный процессинг в бактериальной клетке, предпочтение отдается эукариотическим клеткам. Клетки могут быть в форме единичных клеток, либо многоклеточных организмов. Нуклеотидные последовательности экзогенного гена, элемент отклика и рецепторный комплекс могут также быть инкорпорированы в форме молекул РНК, предпочитаемо, в форме функциональных вирусных РНК, как, например, РНК вируса табачной мозаики. Среди эукариотических клеток предпочтение отдается клеткам позвоночных, ввиду того, что последние в естественном состоянии не несут молекул, реагирующих на лиганды EcR согласно настоящему изобретению. В результате, они являются «в значительной степени нечувствительными» к лигандам, которые обеспечивает настоящее изобретение. Так, лиганды, которые применяют согласно настоящему изобретению, будут оказывать незначительный, малый физиологический, которым можно пренебречь, или какой-либо другой эффект на трансформированные клетки и организм в целом. Поэтому клетки могут расти и вырабатывать желаемый продукт, не подвергаясь значительному влиянию присутствия самого лиганда.
[0149] Лиганды EcR, применяемые вместе с комплексом EcR, который в свою очередь, связан с элементом отклика, который присоединен к экзогенному гену (например, IL-12), обеспечивают средства внешней временной регуляции экспрессии экзогенного гена. Порядок, в котором различные компоненты связываются друг с другом, то есть лиганд к рецепторному комплексу, а рецепторный комплекс к элементу отклика, не является критичным. Обычно, модуляция экспрессии экзогенного гена происходит в ответ на присоединение комплекса EcR к специфическому контрольному, или регуляторному элементу ДНК. Белок EcR, как и другие члены семейства ядерных рецепторов, содержит, по меньшей мере три домена: домен трансактивации, ДНК-связывающий домен и лиганд-связывающий домен. Этот рецептор как подгруппа семейства ядерных рецепторов также содержит другие, менее определенные участки, ответственные за особенности гетеродимеризации. Присоединение лиганда к лиганд-связывающему домену белка EcR, после гетеродимеризации с белками USP или RXR, позволяют ДНК-связывающим доменам гетеродимерных белков присоединиться к активированной форме элемента отклика, таким образом, приводя к экспрессии или подавлению экзогенного гена. Этот механизм не исключает потенциального присоединения лиганда к EcR или USP, и, в результате, образования активных гомодимерных комплексов (например, EcR+EcR или USP+USP). Согласно одному из вариантов реализации, один или более рецепторных домена могут меняться с получением химерного переключателя гена. Как правило, один или более из трех доменов могут быть выбраны из источника, отличного от источника происхождения остальных доменов, таким образом, что химерный рецептор оказывается оптимальным для трансактивационной активности в выбранной клетке-хозяине или организме, для комплементарного присоединения лиганда и распознавания специфического элемента отклика. Кроме того, сам элемент отклика может быть модифицирован или заменен на элемент отклика для доменов других ДНК-связывающих белка, как, например, белок GAL-4 дрожжей (см. Sadowski et al, Nature 335:563 (1988) или белок LexA Е. coli (see Brent et al, Cell 43:129 (1985)), для взаимодействия с химерными комплексами EcR. Другим преимуществом химерных систем является то, что они позволяют выбрать промотор для экспрессии экзогенного гена в соответствии с желаемым конечным результатом. Такой двойной контроль может оказаться особенно важным в областях генной терапии, особенно когда происходит выработка цитотоксичных белков, потому, как и время экспрессии, и клетки, в которых эта экспрессия происходит, могут быть проконтролированы. Когда экзогенные гены, функционально связанные с соответствующим промотором, вводятся в клетки субъекта, экспрессия экзогенных генов контролируется наличием лиганда согласно настоящему изобретению. Промоторы могут быть конститутивно или индуцируемо регулированы, или могут быть тканеспецифичными (то есть экспрессируемыми лишь в особом типе клеток), или специфичными к определенным стадиям развития организма.
[0150] Многие геномные последовательности и последовательности кДНК, кодирующие различные полипептиды, такие как: транскрипционные факторы и репортерные белки, хорошо известны в данной области техники. Специалисты в данной области имеют доступ к информации о последовательностях нуклеиновых кислот практически всех известных генов и могут получить молекулы нуклеиновых кислот либо прямо из публичного банка данных, либо из организации, опубликовавшей последовательность, либо применить рутинные методы для получения молекул. В качестве примера даны описания последовательностей учетные номера которых также представлены выше.
[0151] Переключатель гена может быть любой системой переключателя гена, которая регулирует экспрессию гена при добавлении или удалении специфического лиганда. Согласно одному из вариантов реализации, переключатель гена контролирует уровень экспрессии гена в соответствии с концентрацией присутствующего лиганда. Примеры лиганд-зависимых транскрипционных факторов, которые применяют в переключателях генов согласно настоящему изобретению, включают в себя (но не ограничиваются): члены суперсемейств ядерных рецепторов, которые активируются соответствующими им лигандами (например, глюкокортикоиды, эстроген, прогестины, ретиноиды, экдизон, аналоги и их миметики) и плазмидный вектор rTTA, активируемый тетрациклином. Согласно одному из вариантов реализации, переключатель гена представляет собой переключатель гена на основе EcR. Примерами таких систем являются (но не ограничиваются) системы, описанные в патентах США №6,258,603, 7,045,315, публикациях патентных заявок США №2006/0014711, 2007/0161086 и международной патентной заявке №WO 01/70816. Примеры химерных систем рецепторов экдизона описаны в патентах США №7,091,038, публикации патентной заявки №2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457 и 2006/0100416, а также в международных патентных заявках №WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075 и WO 2005/108617. Примером агонист-регулируемой нестероидной экдизоновой системы является RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System (New England Biolabs, Ipswich, MA).
[0152] Согласно одному из вариантов реализации, полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержит одну последовательность транскрипционного фактора, кодирующую лиганд-зависимый транскрипционный фактор, под контролем промотора. Последовательность транскрипционного фактора может кодировать лиганд-зависимый транскрипционный фактор, существующий в природе, или искусственный транскрипционный фактор. Искусственный транскрипционный фактор - это такой фактор, природная последовательность которого была изменена, например, посредством мутации последовательности или комбинирования доменов, взятых у разных транскрипционных факторов.
Согласно одному из вариантов реализации, транскрипционный фактор содержит лиганд-связывающий домен (LBD) ядерного рецептора группы Н. Согласно одному из вариантов реализации, лиганд-связывающий домен (LBD) ядерного рецептора группы Н берется от EcR, от убиквитарного рецептора, от орфанного рецептора 1, от NER-I, от ядерного рецептора 1 стероидных гормонов, от белка-15, взаимодействующего с ретиноидным рецептором X (a retinoid X receptor interaxting protein-15), от печеночного X рецептора (3, от белка, подобного рецептору стероидных гормонов, от печеночного X рецептора, от печеночного X рецептора а, от фарнезоидного X рецептора, от белка-14, взаимодействующего с рецептором, либо от рецептора фарнезола. Согласно другому варианту реализации, LBD Группы Н ядерного рецептора берется от рецептора экдизона.
[0153] EcR и другие ядерные рецепторы Группы Н входят в суперсемейство ядерных рецепторов, все члены которого, как правило, характеризуются наличием амино-терминального трансактивационного домена (TD), ДНК-связывающего домена (DBD) и LBD, отделенного от DBD шарнирным участком. В данном описании, термин ʺДНК-связывающий доменʺ описывает минимальную полипептидную последовательность ДНК-связывающего белка, достаточно длинную для того, чтобы ДНК-связывающий домен функционировал, обеспечивая соединение с определенным элементом отклика. Члены суперсемейства ядерных рецепторов также характеризуются наличием четырех или пяти доменов: A/B, C, D, E и, в случае некоторых членов суперсемейства, F (см. патент США 4,981,784 и Evans, Sciencea 240:889 (1988)). Домен ʺА/Вʺ относится к трансактивационному домену, ʺCʺ относится к ДНК-связывающему домену, ʺDʺ относится к шарнирному участку, а ʺEʺ относится к лиганд-связывающему домену. Некоторые члены семейства могут также включать в себя другой трансактивационный домен на карбоксильном терминале LBD, соответствующем ʺFʺ.
[0154] DBD характеризуется наличием двух цистеиновых цинковых пальцев, между которыми расположены два аминокислотных мотива, P-box и D-box, придающих специфичность этих участков для элементов отклика. Эти домены могут быть либо нативными, либо модифицированными, либо химерными комплексами других доменов гетерологичных белковых рецепторов. EcR, как подгруппа семейства ядерных рецепторов, также содержит менее определенные участки, отвечающие за особенности гетеродимеризации. Так как домены ядерных рецепторов являются модулярными по природе, домены LBD, DBD и TD являются взаимозаменяемыми.
[0155] Согласно другому варианту реализации, транскрипционный фактор содержит TD, DBD, распознающий элемент отклика, ассоциированный с экзогенным геном, экспрессия которого должна быть модулирована; и лиганд-связывающий домен ядерного рецептора Группы Н. Согласно определенным вариантам реализации, лиганд-связывающий домен ядерного рецептора Группы H содержит заместительную мутацию.
[0156] Согласно другим вариантам реализации, полинуклеотид, кодирующий переключатель гена содержит первую последовательность транскрипционного фактора под контролем первого промотора и вторую последовательность транскрипционного фактора под контролем второго промотора, причем белки, кодируемые указанными первой последовательностью транскрипционного фактора и второй последовательностью транскрипционного фактора, взаимодействуют с формированием белкового комплекса, который функционирует, как лиганд-зависимый транскрипционный фактор, то есть как переключатель гена, обозначаемый, как «двойной переключатель» или «двугибридный» переключатель гена. Первый и второй промоторы могут быть одинаковыми или разными.
[0157] Полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, может также содержать первую последовательность транскрипционного фактора и вторую последовательность транскрипционного фактора под контролем промотора, причем белки, кодируемые первой последовательностью транскрипционного фактора и второй последовательностью транскрипционного фактора, взаимодействуют, формируя белковый комплекс, который функционирует как лиганд-зависимый транскрипционный фактор, то есть в качестве «единичного переключателя гена». Последовательность первого транскрипицонного фактора и последовательность второго транскрипицонного фактора могут быть связаны внутренним сайтом посадки рибосомы, например, EMCV IRES.
[0158] Согласно одному из вариантов реализации, первая последовательность транскрипционного фактора кодирует полипептид, содержащий TD, ДНК-связывающий домен, который распознает элемент отклика, ассоциированный с экзогенным геном, экспрессия которого будет модулироваться, а также лиганд-связывающий домен ядерного рецептора Группы Н; в то время как вторая последовательность транскрипционного фактора кодирует транскрипционный фактор, содержащий LBD ядерного рецептора, выбранного из лиганд-связывающих доменов RXR позвоночных, лиганд-связывающих доменов RXR беспозвоночных, лиганд-связывающих доменов белков ultraspiracle и химерных лиганд-связывающих доменов, содержащих два полипептидных фрагмента, причем первый из них происходит из лиганд-связывающего домена RXR позвоночных, лиганд-связывающего домена RXR беспозвоночных, либо LBD белка ultraspiracle, а второй полипептидный фрагмент происходит от другого LBD белка RXR позвоночных, беспозвоночных или другого LBD белка ultraspiracle.
[0159] Согласно другому варианту реализации, переключатель гена содержит первую последовательность транскрипционного фактора, кодирующую первый полипептид, в который входят LBD ядерного рецептора и ДНК-связывающий домен, распознающий элемент отклика, который ассоциирован с экзогенным геном, экспрессия которого будет модулироваться, а также вторую последовательность транскрипционного фактора, кодирующую второй полипептид, в который входят трансактивационный домен TD и лиганд-связывающий домен ядерного рецептора, причем один из LBD ядерного рецептора является лиганд-связывающим доменом ядерного рецептора Группы H. Согласно предпочтительному варианту реализации, первый полипептид по существу не содержит трансактивационный домен, а второй полипептид по существу не содержит ДНК-связывающий домен. В контексте настоящего изобретения фраза: «по существу не содержит» значит, что рассматриваемый белок не содержит последовательность рассматриваемого домена, достаточно длинную для обеспечения активации или связывания.
[0160] Согласно другому аспекту настоящего изобретения, первая последовательность транскрипционного фактора кодирует белок, содержащий партнер гетеродимеризации и трансактивационный домен (TD), а вторая последовательность транскрипционного фактора кодирует белок, содержащий ДНК-связывающий домен и лиганд-связывающий домен.
[0161] Когда один лиганд-связывающий домен (LBD) ядерного рецептора относится к Группе Н, другой лиганд-связывающий домен ядерного рецептора может принадлежать любому другому ядерному рецептору, формирующему димер с LBD Группы H. Например, когда LBD ядерного рецептора Группы H представляет собой лиганд-связывающий домен рецептора EcR, другой «партнер» ядерного рецептора LBD может происходить от EcR, RXR позвоночных, RXR беспозвоночных, быть белком ultraspiracle (USP), либо химерным ядерным рецептором, содержащим по меньшей мере два полипептидных фрагмента LBD ядерного рецептора, выбранных из RXR позвоночных или RXR беспозвоночных, или белка USP (см. WO 01/70816 A2, International Patent Application No. PCT/US02/05235 и US 2004/0096942 Al. Партнер LBD ядерного рецептора может также содержать укорачивающую мутацию, делецию, мутацию замещения, либо иную модификацию.
[0162] Согласно одному из вариантов реализации, лиганд-связывающий домен белка RXR позвоночных происходит от белка RXR человека (Homo sapiens), мыши (Mus musculus), крысы (Rattus norvegicus), курицы (Gallus gallus), свиньи (Sus scrofa domestica), лягушки (Xenopus laevis), полосатого данио (Danio rerio), оболочника (Polyandrocarpa misakiensis), либо медузы (Tripedalia cysophora).
[0163] Согласно одному из вариантов реализации, лиганд-связывающий домен белка RXR беспозвоночных берется из: полипептида ultraspiracle саранчи (Locusta migratoria-ʺLmUSPʺ), белка гомолога 1 RXR иксодового клеща (Amblyomma americanum-ʺAmaRXR1ʺ), белка гомолога 2 RXR иксодового клеща (Amblyomma americanum-ʺAmaRXR2ʺ), гомолога RXR атлантического песчаного краба (Celuca pugilator-ʺCpRXRʺ), гомолога RXR малого мучного хрущака (Tenebrio molitor-ʺTmRXRʺ), гомолога RXR пчелы (Apis mellifera-ʺAmRXRʺ), гомолога RXR персиковой тли (Myzus persicae-ʺMpRXRʺ), либо гомолога RXR не двукрылых/не чешуекрылых.
[0164] Согласно одному из вариантов реализации, химерный лиганд-связывающий домен белка RXR содержит, по меньшей мере два полипептидных фрагмента, выбранных 'из полипептидного фрагмента RXR позвоночных животных и полипептидного фрагмента гомолога RXR у беспозвоночных животных, не относящихся к чешуекрылым или двукрылым. Химерный LBD белка RXR согласно настоящему изобретению может состоять из полипептидных фрагментов RXR, которые были взяты от по меньшей мере двух разных видов, либо, в случае если; выбран лишь один вид, два или более полипептидных фрагмента могут быть получены от двух или более полипептидных фрагментов изоформ RXR этого вида.
[0165] Согласно одному из вариантов реализации, химерный лиганд-связывающий домен RXR содержит по меньшей мере полипептидный фрагмент RXR позвоночного животного и полипептидный фрагмент RXR беспозвоночного.
[0166] Согласно другому варианту реализации, химерный лиганд-связывающий домен RXR содержит по меньшей мере полипептидный фрагмент RXR позвоночного животного и полипептидный фрагмент гомолога RXR беспозвоночного животного, не принадлежащего к двукрылым или чешуекрылым.
[0167] Лиганд, при присоединении к LBD ядерного(ых) рецептора(ов), который, в свою очередь, связан с элементом отклика, который связан с экзогенным геном, обеспечивает внешнюю временную регуляцию экспрессии экзогенного гена. Механизм связывания или порядок, в котором различные компоненты согласно настоящему изобретению присоединяются друг к другу, то есть например, лиганд к LBD, ДНК-связывающий домен к элементу отклика, трансактивационный домен к промотору и т.п., не критичен.
[0168] В конкретном примере, лиганд присоединяется к LBD ядерного рецептора Группы H и этот «партнер» ядерного рецептора LBD запускает экспрессию экзогенного гена. Этот механизм не исключает возможность для ядерного рецептора Группы H (GHNR) или с его «партнера» связываться с лигандом с формированием активных гомодимерных комплексов (например GHNR+GHNR или «партнер»+«партнер»). Предпочитаемо, один или более доменов рецептора заменены для получения гибридного переключателя гена. Как правило, один или более из трех доменов DBD, LBD, и TD может быть взят из источника, отличного от источников происхождения остальных доменов, так, что гибридные гены и получаемые гибридные белки оптимизируются в выбранной клетке-хозяине или организме для трансактивационной активности, комплементарного присоединение лиганда и распознавания специфического элемента отклика. Кроме того, сам элемент отклика может быть модифицирован или заменен элементами отклика для других доменов ДНК-связывающих белков, таких как белок GAL-4 дрожжей (см. Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)), или белок LexA Escherichia coli (см. Brent et al, Cell 43:129 (1985)), или синтетические элементы отклика, специализированные для направленных взаимодействий с белками, созданные, модифицированные и выбранные для осуществления таких специфических взаимодействий (см., например, Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)) и функционирования с гибридными рецепторами.
[0169] Функциональный комплекс EcR может также включать в себя вспомогательный белок (белки),такие как, например, иммунофилины. Вспомогательные члены белкового семейства ядерных рецепторов, известные как транскрипционные факторы (такие как DHR38 или betaFTZ-1), могут также быть лиганд-зависимыми или независимыми партнерами для EcR, USP, и/или RXR. Кроме того, могут требоваться и другие кофакторы, такие как белки, обычно называемые коактиваторами (а также адаптерами или медиаторами). Эти белки не присоединяется специфично к последовательности ДНК и не участвуют в собственно транскрипции. Они могут оказывать эффект на активацию транскрипции разными механизмами, включающими в себя стимуляцию ДНК-связывающей активности активаторов путем воздействия на структуру хроматина, либо посредством взаимодействия активатор-инициирующего комплекса. Примерами таких коактиваторов могут служить: RIP 140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1 /NCoA-I, TEF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIBl/RACS/pCIP, а также, в качестве случайного (неспецифичного) коактиватора, элемент отклика С связывающий белок В, СВР/p300 (для обзора, см. Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)). Кроме того, для эффективного ингибирования активации транскрипции в отсутствие лиганда могут быть необходимы белковые кофакторы, обычно называемые корепрессорами (также называемые репрессорами, сайленсерами или сайленсинговыеми медиаторами). Эти корепрессоры могут взаимодействовать с EcR, который не связан с лигандом, для подавления активности элемента отклика. Существующие данные свидетельствуют о том, что присоединение лиганда меняет конформацию рецептора, приводя к отделению корепрессора и привлечению вышеуказанных коактиваторов, таким образом, выключая их подавляющую активность. Примеры корепрессоров включают в себя N-CoR и SMRT (для обзора, см. Horwitz et al, Mol Endocrinol. 70:1167 (1996)). Эти кофакторы могут быть либо эндогенными, присутствующими внутри клетки или организма, либо могут быть добавлены экзогенно в качестве трансгенов, экспрессируемых в регулируемом или нерегулируемом режиме.
[0170] Экзогенный ген функционально связан с промотором, содержащим по меньшей мере один элемент отклика, который распознается ДНК-связывающим доменом лиганд-зависимого транксрипционного фактора, кодируемого переключателем гена. Согласно одному из вариантов реализации, промотор содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более копий элемента отклика. Промоторы, содержащие желаемые элементы отклика, могут быть промоторами естественного происхождения или искусственными промоторами, созданными с применением способов, хорошо известных в данной области техники, например, содержащими один или более элемент отклика, функционально связанный с минимальным промотором.
[0171] Для введения полинуклеотидов в клетки можно применять вектор. Вектором может быть, например, плазмидный вектор, либо вирусный вектор, состоящий из одно- или двухцепочечной РНК или ДНК. Такие векторы можно вводить в клетки путем применения хорошо известных способов введения ДНК и РНК в клетки. Вирусные векторы могут быть способны или не способны к репликации. В другом случае, размножение вирусов, как правило, будет происходить только в комплементирующих клетках-хозяевах. В данном описании, термин «клетка-хозяин» или «хозяин» относится к клетке согласно изобретению, в которую вводится и функционирует один или более полинуклеотидов согласно изобретению.
[0172] Таким образом, векторы по меньшей мере должны включать в себя полинуклеотиды согласно настоящему изобретению. Другими компонентами вектора могут быть (но, не ограничиваясь нижеперечисленным): селектируемые маркеры, домены модификации хроматина, дополнительные промоторы, запускающие экспрессию других полипептидов (например, апоптозный белок), которые могут быть представлены в векторе, геномные сайты интеграции, сайты рекомбинации и точки молекулярных вставок (полилинкер). Векторы могут содержать любое количество этих дополнительных элементов в составе полинуклеотидов или вне их таким образом, что вектор может выполнять необходимые специфические задачи терапевтических методов которые применяются.
[0173] Согласно одному из вариантов реализации векторы, которые вводят в клетку содержат также «селектируемый ген-маркер», при обнаружении экспрессии которого можно говорить о том, что конструкт переключателя гена согласно настоящему изобретению интегрировался в геном клетки-хозяина. Таким образом, селектируемый ген может стать положительным маркером для интеграции в геном. В то же время, наличие селективного гена-маркера, некритичное в отношении способов данного изобретения, позволяет выделить популяцию живых клеток, в геном которых интегрировалась векторная конструкция. Таким образом, определенные варианты реализации согласно настоящему изобретению включают в себя способ отбора клеток, в которых интеграция вектора прошла успешно. В данном описании, термин «отбирать» и его вариации, примененные в отношении клеток, подразумевают стандартные, хорошо известные способы отбора клеток со специфической генетической структурой или фенотипом. Обычные способы включают в себя (но, не ограничиваются нижеперечисленным): культивирование клеток в присутствии антибиотиков, как G418, неомицин и ампициллин. Другие примеры селектируемых генов-маркеров включают в себя (но, не ограничиваются нижеперечисленным) гены, придающие устойчивость к дигидрофолат-редуктазе, гигромицину или микофеноловой кислоте. Другие способы селекции включают в себя (но, не ограничиваются нижеперечисленным) селектируемый ген-маркер, позволяющий использовать тимидин-киназу, гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, либо аденин-фосфорибозилтрансферазу в качестве агентов отбора.
Клетки, содержащие векторный конструкт, в который входят ген(ы) устойчивости к антибиотику, будут, таким образом, способны выживать в присутствии антибиотика в культуре. Соответственно, клетки, не содержащие векторный конструкт, в который входит(ят) ген(ы) устойчивости к антибиотику, погибнут в присутствии антибиотика в культуре.
[0174] В данном описании, термин «домен модификации хроматина» (CMD) относится к нуклеотидным последовательностям, взаимодействующим с различными белками, которые связаны процессом сохранения и/или изменения структуры хроматина, такие, как, например, с инсуляторы ДНК (но не ограничивающимися последними). См. Ciavatta et al, Proc. Nat 1 Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006). Примеры CMD включают в себя (но, не ограничиваются нижеперечисленным): инсулятор гена бета-глобулина курицы и сайт гиперчувствительности 4 (cHS4) курицы. Использование различных последовательностей CMD в отношении одной или более генных программ (т.е, промотора, кодирующей последовательности и 3’ регуляторного участка), например, может облегчить применение различных CMD последовательностей ДНК в качестве «участков - «плеч»-мини-гомологии» в комбинации с различными микроорганизмами, либо в рекомбинационных технологиях in vitro, для «переключения» программ генов между имеющимися мультигенными и моногенными челночными векторами. Другие примеры доменов модификации хроматина известны в данной области техники и могут быть легко идентифицированы.
[0175] Конкретные векторы, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой векторы экспрессии, кодирующие белки или полинуклеотиды. Как правило, такие векторы содержат cw-активные контрольные участки (cw-acting control regions), эффективные для экспрессии в хозяине и функционально связанные с экспрессируемым полинуклеотидом. Соответствующие транс-активные факторы предоставляются хозяином, комплементарным вектором, либо самим вектором после введения в хозяина.
[0176] Для экспрессии белков или полинуклеотидов можно примененять различные векторы. Такие векторы включают в себя хромосомные, эписомальные и вирусные векторы, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, как, например, адено-ассоциированные вирусы, лентивирусы, бакуловирусы, паповавирусы (как SV40), вакциния, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также векторы, получающиеся при комбинации вышеперечисленных, например, из генетических элементов плазмид и фагов, таких как космиды и фагемиды. Все они могут использоваться для экспрессии, в соответствии с данным аспектом изобретения. Как правило, любой вектор, подходящий для сохранения, размножения и экспрессии полинуклеотидов или белков в клетке, можно применять при экспрессии в этом отношении.
[0177] Полинуклеотидная последовательность в экспрессионном векторе функционально связана с соответствующей последовательностью (последовательностями) контроля экспрессии, включающей в себя, например, промотор для управления транскрипцией иРНК. К представителям вспомогательных промоторов относятся (но, не ограничиваются): конститутивные, ткане-специфичные и индуцирующие промоторы. Примеры конститутивных эукариотических промоторов включают в себя (но не ограничиваются): промотор гена металотионеина 1 мыши (Hamer et al, J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982)); промотор TK вируса герпеса (McKnight, Cell 37:355 (1982)); ранний промотор SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)); и промотор вакцинии. К другим промоторам, применимым для управления экспрессией белка или полинуклеотида, относятся (но, не ограничиваются) ткане-специфичные промоторы и другие эндогенные промоторы, такие как: промотор альбумина (гепатоциты), промотор проинсулина (панкреатические бета-клетки) и т.п. В целом, экспрессионные конструкты должны содержать сайты инициации и терминации транскрипции и, в составе транскрибируемого участка, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструктами, могут содержать кодон инициации трансляции AUG в начале и кодон терминации (UAA, UGA или UAG), соответственно расположенный в конце транслируемого полипептида.
[0178] Кроме этого, конструкты могут содержать контролирующие участки, регулирующие, а также активирующие экспрессию. Обычно, такие участки функционируют в качестве транскрипционных регуляторов, среди прочего, как сайты присоединения репрессоров или энхансеры.
[0179] Примеры эукариотических векторов включают (но не ограничиваются нижеперечисленными): pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные у Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные у Amersham Pharmacia Biotech; а также pCMVDsRed2-express, plRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito и pCMV-EGFP, доступные у Clontech. Существует множество других хорошо известных и коммерчески доступных векторов.
[0180] Особенно удобны в применении векторы, содержащие точки молекулярных вставок (полилинкеры) для быстрой вставки и удаления элементов генных программ, которые описаны в United States Published Patent Application No. 2004/0185556, United States Patent Application No. 11/233,246 и International Published Application Nos. WO 2005/040336 и WO 2005/116231. Примером таких векторов является Ultra Vector™ Production System (Intrexon Corp., Blacksburg, VA), описанный в WO 2007/038276. В данном описании, термин «генная программа» относится к комбинации генетических элементов, состоящей из промотора (P), экспрессионной последовательности (E) и 3’ регуляторной последовательности (3), так, что «PE3» означает генную программу. Элементы, входящие в генную программу, могут быть легко перенесены в другие точки молекулярных вставок, расположенные по краям каждого элемента генной программы. Термин «точка молекулярной вставки» при использовании в данном описании, относится к полинуклеотиду, который содержит по меньшей мере два редко встречающихся или необычных сайта рестрикции, расположенные линейно. Согласно одному из вариантов реализации, точка молекулярной вставки (полилинкер) состоит из по меньшей мере трех редко встречающихся или необычных сайтов рестрикции, расположенных линейно. Как правило, одна точка молекулярной вставки не содержит редкий или необычный сайт рестрикции, принадлежащий другой точке молекулярной вставки, в составе одной и той же генной программы. Родственные последовательности, состоящие из более, чем 6 нуклеотидов, по которым действует рестрикционный фермент, называют «редкими» сайтами рестрикции. Тем не менее, существуют сайты рестрикции, состоящие из 6 пар оснований, встречающиеся реже, чем может быть статистически предсказано; такие сайты и эндонуклеазы, их расщепляющие, называются «необычными». Примеры редких и необычных рестрикционных ферментов включают в себя (но, не ограничиваются нижепредставленными): AsiS I, Рас I, Sbf I, Fse I, Asc I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, AfIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, FIp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I и Sse8781 I.
[0181] Вектор также может содержать рестрикционные сайты для второго класса рестрикционных ферментов, называемых эндонуклеазами генной конверсии (homing endonuclease) (HE). HE распознают большие, асимметричные сайты рестрикции (12-40 пар оснований), и их рестрикционные сайты редко встречаются в природе. Например, HE, известная, как I-Scel, распознает состоящий из 18 пар оснований сайт рестрикции (5 TAGGGAT AAC AGGGTAAT3’ (SEQ ID NO: 12)) и статистически может встречаться один раз на каждые 7×1010 пар оснований в произвольной последовательности. Такая частота эквивалентна тому, что указанный сайт может встретиться лишь единожды в геноме, размер которого в 20 раз превышает размер генома млекопитающего. Редкая встречаемость HE-сайтов значительно повышает вероятность того, что генный инженер сможет вырезать генную программу без нарушения целостности этой программы, при условии, что сайты эндонуклеазы генной конверсии располагаются в соответствующих участках векторной плазмиды клонирования.
[0182] Выбор соответствующих векторов и промоторов для экспрессии в клетке-хозяине является хорошо известной процедурой, а необходимые для создания и введения вектора в хозяина техники, вместе с техниками экспрессии таковых в хозяине, являются рутинными процедурами в данной области техники.
[0183] Введение полинуклеотидов в клетки может выполняться в форме временной трансфекции, стойкой трансфекции, либо в форме локус-специфичной вставки вектора. Временная и стойкая трансфекция векторов в клетку хозяина может быть осуществлена путем трансфекции с использованием фосфата кальция, DEAE-декстран-опосредованной трансфекции, липофекции (опосредованной катионными липидами трансфекции), электропорации, трансдукции, инфекции или с применением других методов. Такие методы описаны во многих лабораторных справочниках, как, например, Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185: 527- 37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Эти способы стабильной трансфекции приводят к произвольному встраиванию вектора в клеточный геном. Более того, количество копий и расположение векторов, в целом, также являются произвольными.
[0184] Согласно одному из вариантов реализации, вектор вводят в биологически нейтральный сайт генома. Биологически нейтральный сайт - это участок генома, встраивание полинуклеотидов в который слабо влияет, либо не влияет вообще на нормальное функционирование клетки. Биологически нейтральные сайты могут быть определены с помощью доступной биоинформатики. Многие биологически нейтральные сайты известны в данной области, как, например, ROSA-эквивалентный локус (ROSA-equivalent locus). Другие биологически нейтральные сайты могут быть выявлены с помощью рутинных технологий, хорошо известных в данной области техники. Определение параметров геномных сайтов вставки выполняется с применением способов, известных в данной области. Для контроля расположения, количества копий и/или ориентации полинуклеотидов при введении вектора в клетки могут применяться методы локус-специфичной вставки. Методы локус-специфичной вставки хорошо известны в данной области и включают в себя (но не ограничиваются): гомологичную рекомбинацию и опосредованную рекомбиназой вставку в геном. Безусловно, в случае применения способов локус-специфичной вставки в составе методов, согласно изобретению, векторы могут содержать элементы, способствующие данной локус-специфичной вставки, включающей в себя (но не ограничивающейся) гомологическую рекомбинацию. Например, векторы могут содержать один, два, три, четыре или более геномных интеграционных сайтов (GIS). В данном описании, термин «геномный интеграционный сайт» относится к части векторной последовательности, идентичной или практически идентичной частям генома внутри клеток, позволяющим вставку вектора в геном. В частности, вектор может содержать по меньшей мере два сайта интеграции в геном, располагающихся по краям указанных полинуклеотидов. Безусловно, ГИСы могут находиться по краям вспомогательных элементов или даже всех элементов, наличествующих в составе вектора.
[0185] Согласно другому варианту реализации, локус-специфичная вставка может быть осуществлена посредстовом специфичной по сайту рекомбиназы вставки гена. Вкратце, бактериальные рекомбиназы, такие как (но не ограничивающиеся данным ферментом) интеграза PhiC31, могут функционировать в «псевдорекомбинационных» областях человеческого генома. Такие псевдорекомбинационные сайты могут быть мишенями для локус-специфичной рекомбинации, опосредованной рекомбиназами. Специфичная к сайту рекомбиназы генная вставка описана в Thyagarajan et al, Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001). Другие примеры рекомбиназ и соответствующих им сайтов, которые могут применяться для специфичной к рекомбинационному сайту генной вставки, включают в себя (но не ограничиваются) сериновыми рекомбиназами, как R4 и ТР901-1, а также рекомбиназами, описанными в WO 2006/083253.
[0186] Согласно другому варианту реализации, вектор может содержать ген множестенной устойчивости к лекарственным препаратам, например, ген mdrl, дигидрофолат-редуктазы или O6-алкилгуанин-ДНК алкилтрансферазы. Ген химической устойчивости может контролироваться конститутивным (например, CMV) или индуцируемым (например, RheoSwitch®) промотором. Согласно этому варианту реализации, если целью является лечение заболевания субъекта параллельно с присутствием модифицированных клеток в указанном субъекте, врач может применить хемотерапевтический агент для уничтожения пораженных клеток, в то время как модифицированные клетки будут защищены от этого агента благодаря экспрессии соответствующего гена химической устойчивости, а указанный агент может быть использован в дальнейшем для лечения заболевания, облегчения состояния пациента, либо профилактики этого заболевания или нарушения. Помещение гена химической устойчивости под контроль индуцируемого промотора позволяет избежать нежелательной экспрессии гена химической устойчивости, причем экспрессия этого гена может всегда быть возобновлена, в случае, если продолжение лечения окажется необходимым. В случае поражения самих модифицированных клеток, они могут быть уничтожены активацией экспрессии апоптозного полипептида, как описано ниже.
[0187] Способы согласно настоящему изобретению осуществляют посредстовм введения полинуклеотидов, кодирующих переключатель гена, и экзогенного гена в клетки субъекта. Может быть применен любой из способов введения полинуклеотида в клетку, известный в данной области знания, подобный описанным ниже.
[0188] Если полинуклеотиды вводят в клетки ex vivo, клетки могут быть получены у субъекта при помощи любого способа, известного в данной области, включающего в себя (но не ограничивающегося): биопсии, соскобы и хирургическое удаление ткани. Изолированные клетки можно культивировать в течение достаточного времени для того, чтобы позволить полинуклеотидам проникнуть в клетки, например, в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 часов или дольше. Способы культивирования первичных клеток за короткие промежутки времени хорошо известны в данной области. Например, клетки могут быть культивированы в чашках (например, в микроячеечных чашках), прикреплены или выращены в суспензии.
[0189] В случае терапевтических методов ex vivo, клетки изолируются из ткани пациента и культивируются в условиях, пригодных для введения в них полинуклеотидов. Как только полинуклеотиды вводятся в клетки, последние инкубируют в течение времени, достаточного для экспрессии лиганд-зависимого транскрипционного фактора, например, в течение 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 или 24 часов или дольше. В определенный момент после интеграции полинуклеотидов в клетки (до или после того, как будет выработано значительное количество лиганд-зависимого транскрипционного фактора), клетки вводят обратно индивидууму. Обратное (повторное) введение можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники, например, внутривенным введением или прямой инъекцией в ткань или полость. Согласно одному из вариантов реализации, наличие полинуклеотидов в клетках определяется до повторного введения клеток субъекту. Согласно другому варианту реализации, клетки, содержащие полинуклеотиды, подвергаются селекции (например, основываясь на наличии селективного маркера в этих полинуклеотидах), и субъекту повторно вводятся только клетки, содержащие представляющий интерес полинуклеотид. После того, как клетки повторно вводятся индивидууму, для запуска экспрессии терапевтического полипептида или терапевтического полинуклеотида, вводится соответствующий лиганд. Согласно альтернативному варианту реализации, лиганд можно добавлять к клеткам даже до того, как их обратного введения субъекту, для того, чтобы терапевтический полипептид или полинуклеотид начал вырабатываться до повторного введения клеток субъекту. Лиганд может вводиться любым возможным способом, как системно (например, орально, внутривенно), так и локально (например, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно или прямой инъекцией в ткань или орган, куда были повторно введены модифицированные клетки, например, внутриопухолево). Оптимальный временной режим введения лиганда может быть определен для каждого типа клеток, заболевания или нарушения, путем применения рутинных процедур.
[0190] Терапевтические методы in vivo согласно настоящему изобретению включают в себя прямое введение полинуклеотидов in vivo в клетки субъекта. Полинуклеотиды можно вводить субъекту системно или локально (например, в пораженную заболеванием или нарушением область). Как только полинуклеотиды введены субъекту, для экспрессии терапевтического полинуклеотида или полипептида может быть введен и соответствующий лиганд. Введение лиганда может быть выполнено любым применимым способом, как системно (например, орально, внутривенно) так и локально (например, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно или прямой инъекцией в ткань или орган, пораженный заболеванием или нарушением, например, внутриопухолево). Оптимальный временной режим введения лиганда можно определить для каждого типа клеток, заболевания или нарушения, путем применения рутинных процедур.
[0191] При применении in vivo, описанные в данном изобретении, лиганды можно быть включены в фармацевтически приемлемые носители, такие, как, например, растворы, суспензии, таблетки, капсулы, мази, эликсиры и композиции, вводимые посредством инъекций. Фармацевтические композиции могут содержать от 0.01% до 99% лиганда по массе. Композиции могут быть в форме как единовременных, так и множественных доз. Содержание лиганда в какой-либо отдельной фармацевтической композиции зависит от эффективной дозы, иначе говоря, от дозы, необходимой для осуществления экспрессии или подавления гена, представляющего интерес.
[0192] К пригодным путям введения фармацевтических препаратов относятся оральный, ректальный, топикальный (включая дермальный, буккальный и сублингвальный), вагинальный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интратекальный, внутриопухолевый и эпидуральный), а также способ с применением назогастральной трубки. Для специалистов в данной области техники очевидно, что предпочитаемый способ введения будет зависеть от условий, вызвавших необходимость лечения, и может меняться относительно различных факторов, как, например, состояние пациента.
[0193] В данном описании, термин ʺrAD.RheoIL12ʺ относится к аденовирусному полинуклеотидному вектору, в который входит ген интерлейкина-12, под контролем переключателя гена RheoSwitch® Therapeutic System (RTS), способного вырабатывать белок IL-12 в присутствии активирующего лиганда.
[0194] В данном описании, термин ʺIL-12p70ʺ относится к белку IL-12, который в природном состоянии состоит из двух субъединиц, обычно обозначаемых как р40 и р35. Термин IL-12p70 охватывает рекомбинантные белки, состоящие из двух субъединиц интерлейкина-12 (p40 и p35), притом, что рекомбинантный белок может содержать линкерные аминокислоты, связывающие субъединицы.
[0195] В данном описании, термин ʺобладающий функцией интерлейкина-12 белокʺ относится к белку, обладающему по меньшей мере 20% (например по меньшей мере 30%, 40%, 50%о, 60%, 70%), 80%), 90%), 95%, 99% или 100%) биологической активности интерлейкина-12 человека. Биоактивность IL-12 хорошо известна в данной области техники и включает в себя, без ограничений, дифференциацию нативных T-клеток в Th1-клетки, стимуляцию роста и функционирования T-клеток, выработку интерферона-гамма (IFN-γ) и фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α) T-клетками и NK-клетками, подавление супрессии интерферона-гамма интерлейкином-4, повышение цитотоксической активности NK-клеток и CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов, стимуляцию экспрессии IL-12R β1 и IL-12R-B2, а также антиангиогенную активность. Термин ʺобладающий функцией интерлейкина-12 белокʺ охватывает мутированные последовательности IL-12 дикого типа, где последовательность дикого типа меняется добавлением, делецией или замещением аминокислот, а также белки, не являющиеся интерлейкином-12, имитирующие одну или несколько функций последнего.
[0196] В данном описании, термин ʺrAd.cIL12ʺ относится к аденовирусному полинуклеотидному контрольному вектору, содержащему ген интерлейкина-12 который регулируется конститутивным промотором.
[0197] В данном описании, термины «активирующий» или «активировать» относятся к любому измеримому (значительному) повышению клеточной активности переключателя гена, приводящему к экспрессии гена, представляющего интерес (например, гена, кодирующего белок IL-12).
[0198] В данном описании, термины «лечение» или «излечение» заболевания относятся к осуществлению протоколов (лечения), которые могут включать в себя применение одного или нескольких лекарственных препаратов, либо модифицированных клеток по отношению к млекопитающему (человеку или отличному от человека млекопитающему), для облегчения признаков или симптомов заболевания. Таким образом, термин «лечение» или «излечение» не должен обязательно быть интерпретирован в качестве полного избавления от признаков или симптомов, не должен подразумевать полное излечение, и, в частности, включает протоколы, оказывающие лишь минимальное действие на субъекта.
[0199] В данном описании, термин «иммунные клетки» относится к дендритным клеткам, макрофагам, нейтрофилам, тучным клеткам, эозинофилам, базофилам, натуральным (естественным) киллерам и лимфоцитам (например, B и T-клеткам).
[0200] В данном описании, термины «дендритные клетки» и «DC» являются взаимозаменяемыми.
[0201] В данном описании, термин «поддерживающие терапию клетки» (TSC) относится к клеткам, которые могут модифицироваться (например, трансфекцией), вектором согласно изобретению, для доставки одного или более белков, функционирующих в качестве иммуномодуляторов и, как альтернатива, белка, обладающего функцией интерлейкина-12, в отношении опухолевой микросреды. Такие TSC включают в себя (но не ограничиваются) стволовые клетки, фибробласты, эндотелиоциты и кератиноциты.
[0202] В данном описании, термины «модифицированные in vitro дендритные клетки», или «популяция модифицированных дендритных клеток», или «DC, экспрессирующие IL-12», или «DC.RheoIL12» относятся к дендритным клеткам, регулируемо экспрессирующим интерлейкин-12 под контролем переключателя гена, который может быть активирован активирующим лигандом.
[0203] В данном описании, термины «модифицированные in vitro TSC», или «популяция модифицированных in vitro TSC», или «TSC, экспрессирующие иммуномодулятор», или «TSC, экспрессирующие IL-12» относятся к поддерживающим терапию клеткам, например, стволовым клеткам, фибробластам, эндотелиоцитам и кератиноцитам, регулируемо экспрессирующим иммуномодулятор и/или IL-12, в зависимости от конкретного случая под контролем переключателя гена, активируемого активирующим лигандом.
[0204] В данном описании, термины «MOI» или «множественность инфицирования» относится к среднему количеству аденовирусных частиц, инфицирующих отдельную клетку в процессе отдельного эксперимента (например, рекомбинантных аденовирусов или контрольных аденовирусов).
[0205] В данном описании, термин «опухоль» относится к любого рода доброкачественному или злокачественному разрастанию и пролиферации клеток, как in vivo, так и in vitro, и охватывает предраковые или раковые клетки и/или ткани.
[0206] Примеры злокачественных опухолей, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают: рак груди, рак простаты, лимфому, рак кожи, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, меланому, злокачественную меланому, рак яичников, злокачественные опухоли головного мозга, первичную карциному головного мозга, рак органов головы и шеи, глиому, глиобластому, рак печени, рак мочевого пузыря, не-мелкоклеточный рак легких, карциному органов головы и шеи, карциному легких, карциному яичников, карциному легких, мел ко клеточную карциному легких, опухоль Вильмса, цервикальную карциному (рак шейки матки), тестикулярную карциному, карциному мочевого пузыря, карциному поджелудочной железы, карциному желудка, карциному толстой кишки, карциному простаты, генитоуринарную карциному, карциному щитовидной железы, карциному пищевода, миелому, множественную миелому, карциному надпочечников, почечно-клеточную карциному, эндометриальную карциному, карциному мозгового вещества надпочечников, злокачественную панкреатическую инсулиному, злокачественную карциноидную карциному, хориокарциному, грибовидную гранулему (mycosis fungoides), злокачественную гиперкальциемию, цервикальную гиперплазию, лейкемию, острую лимфоцитарную лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию, острую миелогенную лейкемию, хроническую миелогенную лейкемию, хроническую гранулоцитарную лейкемию, острую гранулоцитарную лейкемию, лейкоз ворсистых клеток, нейробластому, рабдомиосаркому, саркому Капоши, истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз, ходжкинскую лимфому, не-ходжкинскую лимфому, саркому мягких тканей, остеогенную саркому, первичную макроглобулинемию, ретинобластому и т.п.
[0207] Настоящее изобретение относится к модификации дендритных клеток для обеспечения регулируемой экспрессии интерлейкина-12 (IL-12), их терапевтическому использованию и/или применению при лечении рака, других опухолей, или и того, и другого. Модифицированные in vitro дендритные клетки, регулируемо экспрессирующие белок, обладающий функцией интерлейкина-12, являются безопасным усовершенствованием по отношению к средствам конститутивного синтеза белка IL-12. Кроме того, возможность контролировать продолжительность и уровень экспрессии интерлейкина-12 обеспечивает улучшенный контроль эффективности лечения. Потому, модифицированные in vitro дендритные клетки могут быть включены в фармацевтические композиции в качестве терапевтических препаратов для лечения рака или иных опухолей в организме человека или другого животного. В качестве альтернативы, модифицированные in vitro популяции дендритных клеток или их субпопуляции могут быть применены как средства регулируемой стимуляции выработки интерлейкина-12 в специфической области (здоровой, раковой ткани или в другой опухоли), в организме человека или любом другом организме. Также, модифицированные дендритные клетки могут регулируемо синтезировать интерферон-альфа. Используемые дендритные клетки могут быть аутологичными или неаутологичными. Они могут быть изолированы из костного мозга, любо из циркулирующей периферической крови. В случае, когда пациент является человеком, популяции дендритных клеток могут быть изолированы процедурой лейкофореза, когда фракция белых кровяных клеток изолируется и удаляется, а остальные компоненты крови вновь вводятся пациенту.
[0208] Также настоящее изобретение охватывает модификации отличающихся от дендритных клеток клеток иммунной системы, таких как макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, NK-клетки и лимфоциты (например, B и T-клетки), для регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12, их терапевтическому использованию и/или применению в лечении рака, других опухолей, или и того, и другого. Модифицированные in vitro, отличные от дендритных клеток клетки иммунной системы, например, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, NK-клетки и лимфоциты (например, В и T-клетки), регулируемо вырабатывающие белок, обладающий функцией IL-12, являются безопасным усовершенствованием средств конститутивного синтеза белка интерлейкина-12. Более того, возможность контролировать продолжительность и уровень экспрессии интерлейкина-12 обеспечивает улучшенный контроль эффективности лечения. Поэтому модифицированные in vitro, клетки иммунной системы, отличные от дендритных клеток, например, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, NK-клетки и лимфоциты (например, B и T-клетки), могут быть включены в фармацевтические композиции в качестве терапевтических препаратов для лечения рака или иных опухолей в организме человека или другого животного. В качестве альтернативы, модифицированные in vitro популяции иммунных клеток, отличных от дендритных клеток, например, макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, эозинофилов, базофилов, NK-клеток и лимфоцитов (например, В и Т-клеток), или их субпопуляции могут быть применены как средства регулируемой стимуляции выработки интерлейкина-12 в специфической области (здоровой, раковой ткани или в другой опухоли), в организме человека или любом другом организме. Также, модифицированные иммунные клетки, отличные от дендритных клеток, например, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, NK-клетки и лимфоциты (например, B и T-клетки), могут регулируемо синтезировать интерферон-альфа. Используемые иммунные клетки могут быть аутологичными или неаутологичными. Они могут быть изолированы из костного мозга, любо из циркулирующей периферической крови. В случае, когда пациент является человеком, популяции иммунных клеток могут быть изолированы процедурой лейкофореза, когда фракция белых кровяных клеток изолируется и удаляется, а остальные компоненты крови вновь вводятся пациенту.
[0209] Согласно другому варианту реализации, дендритные клетки могут быть получены путем трансфекции гематопоэтических стволовых клеток человека вектором согласно настоящему изобретению, экспрессирующим белок, обладающий функцией интерлейкина-12, и дифференциации трансфицированных стволовых клеток с получением дендритных клеток. См. патент США 6,734,014.
[0210] Согласно одному из вариантов реализации, содержащий нуклеиновую кислоту аденовирусный вектор (rAd.RheoIL12), содержащий переключатель гена, в котором кодирующие VP16-RXR и GaW-EcR последовательности разделены последовательностью внутреннего сайта посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита EMCV, вставлены в аденовирусный челночный вектор под регуляцией промотора убиквитина С человека. Кодирующие субъединицы р40 и р35 интерлейкина-12 последовательности разделены последовательностью внутреннего сайта посадки рибосомы, помещены под контроль синтетического индуцируемого промотора и расположены в направлении 5’ относительно промотора убиквитина С.
[0211] Согласно другому варианту реализации, в настоящием изобретении предложен челночный вектор, несущий транскрипционные единицы (VP16-RXR и Gal4-EcR) двух рекомбинантных белков и индуцируемые субъединицы IL-12, рекомбинированные с последовательностью, происходящей от аденовируса (AdEasyl) в клетках Е. coli BJ5183. После проверки рекомбинантного клона, плазмиду, несущую геном rAd.RheoIL12, культивируют и подвергают очистке в клетках XLlO-Gold, затем отщепляют от основной кодирующей последовательности плазмиды и переносят в клетки НЕК 293 путем трансфекции.
[0212] Согласно конкретному варианту реализации, полученный первичный препарат вирусов амплифицировали повторной инфекцией клеток HEK 293 и подвергали очистке центрифугированием в градиенте концентрации хлорида цезия.
[0213] Согласно одному из вариантов реализации, ген интерлейкина-12 представляет собой последовательность гена IL-12 дикого типа. Согласно другому варианту реализации, ген интерлейкина-12 представляет собой модифицированную генную последовательность, например, химерную последовательность или последовательность, модифицированную для использования предпочитаемых кодонов.
[0214] Согласно одному из вариантов реализации, ген интерлейкина-12 представляет собой последовательность человеческого гена 1L-12 дикого типа. Согласно другому варианту реализации, последовательность по меньшей мере на 85% идентична последовательности человеческого гена 1L-12 дикого типа, например, по меньшей мере на 90%, 95% или 99%. Согласно другому варианту реализации, последовательность гена 1L-12 кодирует полипептид интерлейкина-12 человека. Согласно другому варианту реализации, ген кодирует полипептид, по меньшей мере на 85% идентичный человеческому IL-12 дикого типа, например, по меньшей мере на 90%, 95% или 99%.
[0215] Согласно одному из вариантов реализации, ген интерлейкина-12 представляет собой последовательность гена IL-12 мыши дикого типа. Согласно другому варианту реализации, последовательность по меньшей мере на 85% идентична последовательности мышиного гена IL-12 дикого типа, например, по меньшей мере на 90%, 95% или 99%. Согласно другому варианту реализации, последовательность гена IL-12 кодирует полипептид интерлейкина-12 мыши. Согласно другому варианту реализации, ген кодирует полипептид, по меньшей мере на 85% идентичный мышиному IL-12 дикого типа, например, по меньшей мере на 90%, 95% или 99%.
[0216] Настоящее изобретение предлагает способ получения популяции модифицированных in vitro дендритных клеток, регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12. Данный способ включает следующие стадии: (а) модификацию по меньшей мере части дендритных клеток, например, взятых из костного мозга, посредством введения в указанные дендритные клетки вектора, который содержит переключатель гена, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, обладающий функцией интерлейкина-12. Таким образом, данный способ обеспечивает получение популяции модифицированных in vitro дендритных клеток, способных излечить или предотвратить заболевание.
[0217] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ получения популяции модифицированных in vitro клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток, например, макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, эозинофилов, базофилов, NK-клеток, лимфоцитов (например, B и T-клеток), или поддерживающих терапию клеток (TSC), регулируемо экспрессирующих белок, обладающий функцией интерлейкина-12. Данный способ включает следующие стадии: (а) модификацию, по меньшей мере части клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток, например, взятых из костного мозга, посредством введения в эти иммунные клетки, отличные от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток, вектора, содержащего переключатель гена, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий функцией интерлейкина-12. Таким образом, данный способ обеспечивает получение популяции модифицированных in vitro иммунных клеток, отличных от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток и способных излечить или предотвратить заболевание.
[0218] Согласно другим вариантам реализации, настоящее изобретение предлагает способ выделения и обогащения дендритных клеток, а также клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток. Дендритные клетки можно выделить из костного мозга человека, мыши или другого млекопитающего, а также из крови человека, мыши или другого млекопитающего. В случае с пациентами-людьми, популяции дендритных клеток могут быть изолированы с помощью лейкофореза, как описано в процедурах, известных в данной области техники, где фракция белых кровяных клеток изолируется и отделяется от остальных компонентов крови, которые повторно вводятся пациенту. Согласно одному из вариантов реализации, дендритные клетки получают из костного мозга мыши, как описано в предыдущих материалах (Tatsumi et al, 2003). Вкратце, костный мозг дикого типа, либо костный мозг мыши EGFP Tg культивируется в регулируемой среде, в которую добавляется 1000 ед./мл рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора мыши и рекомбинантного IL-4 мыши (Peprotech, Rocky Hill, NJ), при 37°C в 5% CO2 инкубаторе в течение 7 дней. Затем, с помощью специальных гранул MACSTM, в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), изолируются CD1 Ic+ дендритные клетки. CD1 Ic+ дендритные клетки, полученные таким способом, имеют степень очистки, превышающую 95%, в отношении морфологии и коэкспрессии CD1 Ib, CD40, CD80, а также антигенов главного комплекса гистосовместимости 1-го и 2-го класса.
[0219] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки, регулируемо вырабатывающие белок, обладающий функцией интерлейкина-12 и пригодные для терапевтического применения при лечении рака или иных злокачественных опухолей в процессе генной терапии в человеческом или другом организме. Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки, регулируемо вырабатывающие белок, обладающий функцией интерлейкина-12 и/или белок, обладающий функцией интерферона-альфа и пригодный для терапевтического применения при лечении рака или иных злокачественных опухолей в процессе генной терапии в человеческом или другом организме.
[0220] Согласно одному из вариантов реализации, в настоящем изобретении предлагаются модифицированные дендритные клетки, содержащие переключатель гена.
[0221] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухолей млекопитающих, включающий в себя введение эффективной дозы диацилгидразинового лиганда.
[0222] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухолей млекопитающих, включающий в себя введение эффективной дозы RG-115830 или RG-115932.
[0223] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает наборы, содержащие дендритные клетки, модифицированные таким образом, что указанные клетки содержат переключатель гена, а также настоящее изобретение обеспечивает лиганд, активирующий этот переключатель гена.
[0224] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает наборы, содержащие дендритные клетки, модифицированные таким образом, что указанные клетки содержат переключатель гена, а также настоящее изобретение обеспечивает композициии, содержащие RG-1 15830 или RG-115932.
[0225] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки и клетки, отличные от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток, которые содержат, по меньшей мере часть рецептора экдизона. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки и клетки, отличные от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток, которые содержат зависимый от рецептора экдизона переключатель гена. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированные дендритные клетки и клетки, отличные от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток, которые содержат RheoSwitch. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает набор, содержащий модифицированные дендритные клетки и клетки иммунной системы, отличные от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток, которые содержат переключатель гена, и лиганд, модулирующий переключатель гена. Согласно другому варианту реализации, указанные наборы содержат также диацилгидразиновый лиганд. Согласно другому варианту реализации, эти наборы содержат RG-115830 или RG-115932.
[0226] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает популяции модифицированных дендритных клеток. На 7-й день культивированные дендритные клетки были либо оставлены интактными, либо инфицированы рекомбинированным аденовирусом, кодирующим IL-12p70 мыши и регулируемым конститутивным (rAd.cIL12) или индуцируемым (rAd.RheoIL12) промотором, либо были инфицированы контрольным аденовирусом без вставки (rAdψ5), в спектре множественного инфицирования (MOI). Через 48 часов, инфицированные дендритные клетки собрали и провели анализ фенотипа, а также исследовали на предмет выработки IL-12p70 с применением специфического набора иммуноферментного анализа ИФА (ELISA kit, BD- PharMingen, San Diego, CA), причем нижний порог детекции составлял 62,5 пг/мл.
[0227] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированную in vitro популяцию дендритных клеток, клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток, либо содержащих вектор поддерживающих терапию клеток (TSC), например, содержащих ДНК вектор, включающий в себя переключатель гена, способный регулируемо вырабатывать белок, обладающий функцией интерлейкина-12, и содержащих активирующий лиганд. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает модифицированную in vitro популяцию дендритных клеток, клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток, либо содержащих вектор поддерживающих терапию клеток (TSC), например, содержащих ДНК вектор, включающий в себя переключатель гена, способный к регулируемой экспрессии белка, обладающего функцией интерлейкина-12 и/или белок, обладающий функцией интерферона-альфа, и содержащих активирующий лиганд.
[0228] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения злокачественных опухолей, например, меланомы или глиомы, путем введения модифицированных дендритных клеток, клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток и поддерживающих терапию клеток пациенту, и последующим введением активирующего лиганда, как, например, RG-115919, RG- 115830 или RG-115932, указанному пациенту. Пациентом может быть пораженный злокачественной опухолью человек или животное. Способы и материалы, применяемые в лечении, модифицированные клетки, наборы и лиганды могут быть применены в лечении людей и в ветеринарии. Поэтому, применение способов и материалов рассматривается в отношении лечения людей и в ветеринарных целях.
[0229] Настоящее изобретение предполагает, что регулируемая экспрессия белка IL-12 в дендритных клетках (обозначаются как DC.RheoIL12), в клетках иммунной системы, отличных от дендритных клеток или в поддерживающих терапию клетках может вызвать иммунный импульс в опухоли на раннем этапе и, позднее, в инфильтрованных опухолью лимфатических узлах, причем такой результат не может быть достигнут при применении традиционных схем генной терапии. Более того, оказалось, что согласование во времени экспрессии интерлейкина-12 после введения модифицированных дендритных клеток, отличных от дендритных клеток иммунных клеток или поддерживающих терапию клеток является критичным для успешного лечения злокачественных опухолей.
[0230] В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, подходящую для введения человеку или другому животному и содержащую популяцию модифицированных in vitro дендритных клеток, отличных от дендритных клеток иммунной системы или поддерживающих терапию клеток, регулируемо вырабатывающих белок, обладающий функцией интерлейкина-12, либо регулируемо вырабатывающих IL-12 и/или интерферон-альфа, притом, что форма данной композиции является подходящей для внутриопухолевого введения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую активирующий лиганд, такой, как RG-115830 или RG-115932, причем эта композиция пригодна для внутрибрюшинного, орального или подкожного введения.
[0231] Согласно конкретному варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли, включающий:
a) внутриопухолевое введение млекопитающему модифицированных in vitro дендритных клеток, описанных выше; и
b) введение вышеуказанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда.
[0232] Например, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли, включающий в себя стадии, следующие в описанном ниже порядке:
a) обеспечение модифицированных in vitro дендритных клеток;
b) внутриопухолевое введение млекопитающему вышеуказанных модифицированных in vitro дендритных клеток; и
c) введение вышеуказанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда.
[0233] Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения опухоли, включающий в себя:
a) внутриопухолевое введение млекопитающему модифицированных in vitro отличных от дендритных клеток клеток иммунной системы, например, макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, эозинофилов, базофилов, NK-клеток и лимфоцитов (например, B и T-клеток), либо поддерживающих терапию клеток, описанных выше; и
b) введение вышеуказанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда.
[0234] Согласно одному из вариантов реализации, модифицированные in vitro дендритные клетки, отличные от дендритных клеток клетки иммунной системы или поддерживающие терапию клетки вводят один раз. Согласно другому варианту реализации, дендритные клетки, отличные от дендритных клетки иммунной системы или поддерживающие терапию клетки вводят несколько раз, при условии, что единичное введение оказалось безопасным и хорошо переносимым, и что дополнительные введения принесут пользу пациенту. Критерием для повторного введения является то, что состояние пациента неизменно или характеризуется клиническими (т. е. результаты компьютерной томографии (регресс опухоли(ей)), химических исследований сыворотки, анализа мочи, гематологии, жизненных сигналов, уменьшение диаметра опухоли и т.п.), либо субъективными признаками улучшения (т. е. улучшающийся статус ECOG и т.п.). Повторное лечение может быть начато на 1, 2, 3 или 4-й неделе, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12-м месяце, либо на 1, 2, 3, 4 или 5-й год после первичного лечения.
[0235] Эффективность и безопасность множественных доз трансгена можно оценить с помощью аспирационной биопсии опухоли и дренирующих ее лимфатических узлов тонкой иглой. Эти анализы могут быть получены на -12-й - -7-й и на 14-й день периода повторного лечения для получения данных об экспрессии трансгена IL-12 человека и о клеточном иммунном ответе in vivo. Результаты биопсии можно проанализировать с помощью стандартной световой микроскопии и иммуногистохимии для оценки клеточной инфильтрации Т-клеток в опухоль и дренирующие ее лимфатические узлы, а ОТ-ПЦР на РНК может быть проведена с соответственно приготовленными праймерами. Для получения цитокинового профиля сыворотки, кровь может быть взята в дни -12-й - -7-й, на 8-й и на 14-й дни периода повторного лечения. Профиль сывороточных цитокинов может быть получен для определения, оказало ли влияние лечение трансгеном IL-12 человека на экспрессию других цитокинов. Мультиплексный анализ цитокинов можно провести в сыворотке с помощью Luminex для IL- 12, интерферона-гамма, IP-10 и других цитокинов Th1/Th2, таких как IL- 1, фактора некроза опухолей-альфа, IL-4, IL-5 и IL-10.
[0236] Согласно одному из вариантов реализации, активирующий лиганд вводят практически одновременно с модифицированными in vitro дендритными клетками, отличными от дендритных клеток клетками иммунной системы или поддерживающими терапию клетками, например, в течение одного часа до или после введения клеток. Согласно другому варианту реализации, активирующий лиганд вводят в течение приблизительно 24 часов после введения модифицированных in vitro дендритных клеток, клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток. Согласно другому варианту реализации, активирующий лиганд вводят в течение приблизительно 48 часов после введения модифицированных in vitro дендритных клеток, клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток. Согласно другому варианту реализации, лигандом является RG-115932. Согласно другому варианту реализации, лиганд вводят в дозе, равной приблизительно 1-50 мг/кг/в день. Согласно другому варианту реализации, лиганд вводят в дозе, равной приблизительно 30 мг/кг/в день. Согласно другому варианту реализации, лиганд вводят ежедневно в период с 5-й по 28-й день. Согласно другому варианту реализации, лиганд вводят ежедневно в течение 14 дней. Согласно другому варианту реализации, вводят от 1×106 до 1×108 клеток. Согласно другому варианту реализации, вводят 5×107 клеток.
[0237] Для демонстрации эффективной IL-12-опосредованной генной терапии, применяют регулируемую IL-12 кДНК систему экспрессии, которая позволяет инициировать выработку IL-12 клетками DC.RheoIL12 в различные временные моменты после внутриопухолевой инъекции.
Основываясь на результатах, полученных в модели агрессивной меланомы В 16 в мышах C57B L/6, были сделаны следующие выводы: 1) клетки DC.RheoIL12 выделяют повышенные количества интерлейкина-12 в присутствии активирующего лиганда RG-115830, но в отсутствие лиганда этого не происходит; 2) эффективность внутриопухолевой DC.RheoIL12-опосредованной терапии соответствует эффективности внутриопухолевой DC.cEL2-опосредованной терапии, когда RG-115830 вводится животным в течение 24 часов после введения дендритных клеток (в случаях, когда лиганд вводится позже, терапия DC.RheoIL12 оказывается неэффективной); 3) экспрессия IL-12 в дендритных клетках продлевает выживаемость этих клеток в микропространстве опухоли и связана с увеличенным количеством внутриопухолево введенных дендритных клеток, мигрирующих в дренирующие опухоль лимфатические узлы; и 4) главным иммунным коррелятом результата терапии является уровень опухоль-специфичных CD8+ T-клеток, перекрестно примированных терапией, а не количество введенных дендритных клеток, остающихся в микропространстве опухоли. В целом, эти данные указывают на то, что, скорее всего, DC.IL12-опосредованная терапия оказывается успешной благодаря ее положительному влиянию на афферентные (перекрестно примированные) эффекторные CD8+ T-клетки 1 Типа, но не на более поздние эфферентные процессы, такие как вызванный введением дендритных клеток рекрутинг противоопухолевых Т-клеток в микропространство опухоли и т.п.
[0238] Перед внутриопухолевой инъекцией, клетки (иммунные клетки или поддерживающие терапию клетки) могут быть обработаны фактором, стимулирующим клеточную активность. Например, клетки можно обрабатывать костимуляторной молекулой, такой, как положительные костимуляторы, включая OX40L, 4-IBBL, CD40, CD40L, GITRL, CD70, LIGHT или ICOS-L или отрицательные костимуляторы, включая антитела aHTH-CTLA4, анти-PD-L1 или aHTH-PD-L2. Например, клетки (дендритные клетки, иммунные клетки или поддерживающие терапию клетки) можно инкубировать с клеткой, вырабатывающей одну или несколько костимуляторных молекул, например, клетки лимфомы J588, которые экспрессируют молекулу лиганда CD40. Согласно другому варианту реализации, клетки (иммунные клетки или поддерживающие терапию клетки) могут быть обработаны молекулой контр-иммунодепрессанта (ингибитора толерантности), как, например, анти-трансформирующий фактор роста-бета (TGF-beta) антитела (для подавления сигнальной системы трансформирующего фактора роста в микропространстве), анти IL-10 антитела, трансформирующий фактор роста-бета RII DN (для подавления сигнальной системы трансформирующего фактора роста в клетках с модифицированным геном), IL-IOR DN, dnFADD (для подавления в клетках путей гибели клетки), анти-SOCS1 антитела, малые интерферирующие РНК (siPHK), либо «ловушки» (приманки) (для подавления супрессивной цитокиновой сигнальной системы в клетках), либо анти-трансформирующий фактор роста-альфа антитела.
[0239] Выработка интерлейкина-12 дендритными клетками или другими антиген-презентирующими клетками, взаимодействующими с CD4+ и CD8+ T-клетками инициирует их получение фенотипа Th1 или Tc1, соответственно. Поэтому, эффект IL-12 на популяции клеток может быть оценен путем измерения уровня экспрессии или активности цитокинов типа Th1/Tc1, интерферона-гамма в биологическом образце, взятом у пациента.
[0240] В целях настоящего изобретения также обеспечивается способ определения эффективности терапевтического режима онкологических больных, опосредованного модифицированными in vitro дендритными клетками, отличными от дендритных клеток клетками иммунной системы или поддерживающими терапию клетками (TSC), включающему:
a) измерение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма (IFN-γ) в первом биологическом образце, полученном от пациента-человека до введения in vitro модифицированных дендритных клеток, отличных от дендритных клеток клеток иммунной системы или поддерживающих терапию клеток с получением контрольного уровня;
b) внутриопухолевое введения указанному пациенту модифицированных in vitro дендритных клеток, отличных от дендритных клеток клеток иммунной системы или TSC;
c) введение указанному пациенту эффективного количества активирующего лиганда;
d) измерение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма (IFN-γ) во втором биологическом образце, полученном от указанного пациента после введения указанного активирующего лиганда с получением тестового уровня; и
e) сравнение указанных контрольного и тестового уровня интерферона-гамма, причем данные, показывающие увеличение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма, соответствующих тестовому уровню по сравнению с контрольным уровнем, говорят об эффективности терапевтического режима в отношении данного пациента.
[0241] Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ определения эффективности терапевтического режима онкологических больных, опосредованного модифицированными in vitro отличными от дендритных клеток клетками иммунной системы или поддерживающими терапию клетками (TSC), включающий:
a) измерение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма (IFN-γ) в первом биологическом образце, полученном от пациента-человека до введения модифицированных in vitro дендритных клеток, отличных от дендритных клеток клеток иммунной системы или поддерживающих терапию клеток с получением контрольного уровня;
b) внутриопухолевое введения указанному пациенту модифицированных in vitro клеток иммунной системы, отличных от дендритных клеток или поддерживающих терапию клеток;
c) введение данному пациенту эффективного количества активирующего лиганда;
d) измерение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма (IFN-γ) во втором биологическом образце, полученном от указанного пациента после введения указанного активирующего лиганда с получением тестового уровня; и
e) сравнение указанных контрольного и тестового уровня интерферона-гамма, причем данные, показывающие увеличение уровня экспрессии и/или активности интерферона-гамма, соответствующих тестовому уровню по сравнению с контрольным уровнем, говорят об эффективности терапевтического режима для данного пациента.
[0242] Термины «субъект», «индивидуум» относятся к интактному насекомому, растению или животному. Также, подразумевается, что действие лигандов будет не менее эффективным, когда субъектом является гриб или дрожжи. Термин «субъект» относится к любому субъекту, в частности, млекопитающему, диагноз, прогноз или терапию по отношению к которому необходимо получить. Млекопитающие включают в себя (но не ограничиваются) людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных, обитающих в зоопарке таких, как медведи, животных, относящихся к спорту, домашних любимцев таких, как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, домашний скот, медведи, коровы; приматов таких, как низшие обезьяны, высшие обезьяны, орангутаны и шимпанзе; собачьих таких, как собаки и волки; кошачьих, как кошки, львы и тигры; непарнокопытных таких, как лошади, ослы и зебры; животных, принимающихся в пищу, как коровы, свиньи и овцы; копытных, как олени и жирафы; грызунов, как крысы, мыши, хомяки и морские свинки; и так далее. Согласно определенным вариантам реализации, животным является человек.
[0243] Термин «животное» охватывает единичное «животное», а также некое количество «животных» и подразумевает млекопитающих и птиц, а также рыб, пресмыкающихся и амфибий. Также, термин животное охватывает модельных животных, например, животные модели заболеваний. Согласно некоторым вариантам реализации, к термину животное относятся ценные животные, в отношении экономики или в каком-либо ином смысле, например, экономически значимый племенной сток, участвующие в скачках животные, животные для представлений, переданные по наследству животные, редкие или исчезающие животные, животные-спутники. В частности, млекопитающим может быть человек, животное, принимающееся в пищу или животное-компаньон.
[0244] В настоящем описании, термин «нуждающееся в лечении млекопитающее» относится к млекопитающему, которое необходимо вылечить, т. е. уменьшить размер опухоли, либо ликвидировать ее.
[0245] Способ согласно настоящему изобретению зависит от захвата опухолевых антигенов из окружения опухоли внутриопухолево введенными дендритными клетками и примирование T-клеток в дренирующих опухоль лимфатических узлах с развитием опухоль-специфичного T-клеточного ответа. Поэтому для оптимального положительного лечебного эффекта, во время внутриопухолевой инъекции дендритные клетки должны быть в статусе высокой эндоцитотической активности. Было показано, что незрелые дендритные клетки, полученные из CD14+ моноцитов путем их обработки гранулоцитарно-моноцитарным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) и IL-4 в течение 6-7 часов, имеют незрелый фенотип и показывают высокую скорость эндоцитоза, т. е. обладают высокой эндоцитотической активностью (Cella et al. 1999; Gilboan, 2007). Созревание дендритных клеток связано с подавлением эндоцитотической активности. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что IL-12 оказывает влияние на незрелые дендритные клетки и дает сигнал к экспрессии факторов, индуцирующих созревание (Nagayama et al. 2000). Поэтому, применение переключателя гена RheoSwitch® Therapeutic System (RTS), позволяет оптимизировать терапевтический результат у людей задержкой экспрессии интерлейкина-12 в трансдуцированных дендритных клетках до момента их введения в опухоль. Так как система конститутивной экспрессии не обладает способностью временного контроля экспрессии, аутокринное действие вырабатываемого IL-12 и вызванный этим процесс созревания не может регулироваться (Mazzolini et al. 2005). Кроме этого, изобретение, тестирующее производительность регулируемой системы экспрессии генов в человеке, может найти применение в других областях генной терапии человека.
[0246] Без ограничения рамками какой-либо теории, предполагается, что настоящее изобретение будет способствовать применению терапии, опосредованной внутриопухолево вводимыми модифицированными in vitro дендритными клетками, отличными от дендритных клеток клетками иммунной системы или поддерживающими терапию клетками, в клинических ситуациях, фокусирующихся на объективном клиническом результате в качестве первого результата исследования, и на перекрестно примированных (инициированных) противоопухолевых CD8+ T-клетках (вырабатывающих интерферон-гамма) в качестве второго результата исследования. Согласно полученным данным, возможность включать и выключать экспрессию интерлейкина-12 in vivo привносит в лечение элемент безопасности и терапевтического контроля как за счет того, что введением лиганда можно контролировать время и уровень экспрессии IL-12, так и за счет того, что время экспрессии IL-12 считается критичным по отношению к терапевтической эффективности способа.
[0247] Настоящее изобретение дополнительно способствует терапевтическому применению модифицированных in vitro клеток, регулируемо экспрессирующих представляющие интерес гены, в качестве инновационных средств для эффективного и успешного лечения заболеваний у людей.
[0248] В случае выявления противоречий между любой идеей или предположением в любой ссылке, указанной в данном описании, и настоящей заявкой, в рамках настоящего изобретения последняя будет иметь преимущественную силу (превалировать).
[0249] Специфические варианты реализации согласно способам настоящего изобретения описаны в нижеследующих примерах, которые являются исключительно иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
DC.RheoIL12 регулируемо вырабатывает большие количества IL-12p70 под воздействием лиганда RG-115830 in vitro
1.1 Материалы и Методы
1.1.1 Мыши
[0250] 6-8-недельных самок мышей C57B L/6 дикого типа и мышей C57B L/6-TgN(ACTbEGFP)10sb/J EGFP Tg приобрели у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) и содержали их в клетках микроизоляторных клетках. С животными обращались в соответствии с рекомендациями по правильному уходу и использованию лабораторных животных.
1.1.2 Клеточные линии
[0251] Клеточные линии меланомы B16 и EL-4 тимомы H-2b, изогенные по отношению к мышам C57B L/6, были описаны ранее (Itoh et ah, 1994). Линии клеток инкубировали в питательной среде (RPMI 1640, вместе с 10% фетальной бычей сывороткой, инактивированной нагреванием, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мМ L-глутамина; все реагенты получены у Invitrogen, Carlsbad, CA) в увлажненном инкубаторе в 5% CO2 и 37°C.
1.1.3 Получение дендритных клеток (DC)
[0252] Дендритные клетки получили из костного мозга мыши, как описано ранее (Tatsumi et al., 2003). Вкратце, костный мозг мыши дикого типа или мыши EGFP Tg культивировали в питательной среде, содержащей 1000 ед./мл рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора мыши и рекомбинантного IL-4 мыши (Peprotech, Rocky Hill, NJ) при 37°C в увлажненном инкубаторе в 5% CO2 и 37°C в течение 7 дней. CD1 Ic+ дендритные клетки затем отделили с помощью специфических гранул MACSTM, в соответствии с протоколом производителя (Miltenyi Biotec, Auburn, СА). CD1 Ic+ дендритные клетки, полученные таким образом, были беспримесными на более, чем 95%, как показала морфология и коэкспрессия CD1 Ib, CD40, CD80 и антигенов главного комплекса гистосовместимости 1-го и 2-го класса.
1.1.4 Вирусные векторы
[0253] Контрольные аденовирусные векторы rAd.ψ5 и rAd.cIL12, кодирующие IL-12 мыши и контролируемые промотором цитомегаловируса (Tatsumi et al., 2003), были созданы и предоставлены Векторным Центром (Vector Core Facility) Института Онкологии при Университете Питсбурга.
[0254] Вектор rAd.RheoIL12 получили следующим образом. Кодирующие последовательности VP16-RXR и Gal4-EcR, разделенные участком внутренней посадки рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV), ввели в аденовирусный челночный вектор под контролем промотора убиквитина C человека. Затем, кодирующие последовательности субъединиц p40 и p35 IL-12, разделенные последовательностью участка внутренней посадки рибосомы и помещенные под контроль синтетического индуцируемого промотора, вставили в направлении 5’ относительно промотора убиквитина С (См. Фигура 1). Применение системы, заключающееся в экспрессии двух рекомбинантных белков (VP-16 RXR v. Gal4-EcR) под контролем разных промоторов разной силы показала, что более высокое соотношение экспрессии VP16-RXR к экспрессии Gal4-EcR дает наилучшую производительность. Таким образом, расположение VP-16 RXR с 5’ конца участка внутренней посадки рибосомы, a Gal-4 EcR с 3’ конца участка внутренней посадки рибосомы обеспечило оптимальную производительность, в сравнении с обратным взаиморасположением.
[0255] Челночный вектор, несущий единицы транскрипции двух рекомбинантных белков и индуцируемые субъединицы интерлейкина-12, рекомбинировали с основной кодирующей последовательностью аденовируса (AdEasyl, stratagene, La Jolla, CA) в клетках BJ5183 E. coli. После того, как выявили образование рекомбинантного клона, в клетках XLlO-Gold размножили плазмиду, несущую геном rAd.RheoIL12, которую затем выделили из клеток, после чего основную кодирующую последовательность плазмиды отщепили и путем трансфекции ввели в клетки НЕК 293.
[0256] Полученный первичный препарат вирусов амплифицировали повторным инфицированием клеток HEK 293, а затем очистили центрифугированием в градиенте концентрации хлорида цезия.
1.1.5 ИФА (ELISA)
[0257] На 7 день необработанные дендритные клетки инфицировали рекомбинантным Ads кодирующим IL-12p70 мыши, регулируемым конститутивным (rAd.cIL12) или индуцируемым (rAd.RheoIL12) промотором, либо инфицировали, контрольным вектором rAdψ5 в рамках MOI. Начиная с различных моментов времени после этого (0-48h) дендритные клетки культивировали в отсутствие или присутствие активирующего лиганда (10-200 мкг/мл) в течение еще 24 часов, после чего секрецию IL-12p70 измерили с помощью специфического набора иммуноферментного анализа (ELISA kit) (BDPharMingen, San Diego, CA; нижний порог детекции = 62.5 pg/мл). В некоторых случаях, для выявления точности регулируемой выработки цитокинов, дендритные клетки инфицировали rAd.RheoIL12 (т. е. DC.RheolL12), заранее обработанным активирующим лигандом, затем лиганд удалили промыванием, а клетки выращивали в контрольной питательной среде еще 24 часа для оценки выработки IL-12p70. В качестве альтернативы, через 48 часов инфицированные дендритные клетки выделили и проконтролировали в отношении фенотипа и синтеза IL-12p70 с помощью набора иммуноферментного анализа (ELISA kit) (BD-PharMingen, San Diego, CA), нижний порог детекции = 62.5 pg/мл.
1.1.6 Поточная цитометрия
[0258] Для анализа фенотипа инфицированных аденовирусом клеток, применили PE- или FITC-конъюгированные антитела (mAb), специфичные к поверхностным молекулам клеток мыши (CD1 Ib, CD1 Ic, CD40, CD54, CD80, CD86, H-2Kd, I-Ad (все из BD-PharMingen)) и соответствующие изотипичные контроли, после чего провели цитометрический анализ с помощью поточного цитометра FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA).
1.2 Результаты
1.2.1 Взятые из костного мозга дендритные клетки мыши, инфицированные Rheo-IL12, регулируемо синтезировали большие количества IL-12p70 при обработке лигандом in vitro.
[0259] Дендритные клетки из костного мозга мышей C57B L/6 (В6) культивировали в течение 7 дней в присутствии рекомбинантного IL-4 мыши и рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора мыши, после чего часть оставили необработанными, а часть инфицировали различными MOI под контролем rAd.ψ5, rAd.cIL-12 (кодирующим p70 IL-12 мыши под регуляцией конститутивного цитомегаловирусного промотора) или rAd.RheoIL12 (кодирующим p70 IL-12 под регуляцией регулируемого промотора, реагирующего на малый молекулярный лиганд RG-115830). Через 48 часов после инфицирования, дендритные клетки культивировали в отсутствие или присутствие RG-115830 еще 24 часа, после чего надосадочную жидкость культур собрали для количественного анализа выработки IL-12p70 с помощью иммуноферментного анализа. Как видно из Фигуры 2A, контрольные неинфицированные дендритные клетки и дендритные клетки, инфицированные Ad.ψ5, в отсутствие или присутствие экзогенного препарата, не вырабатывали повышенных количеств IL-12p70 по сравнению с дендритными клетками, инфицированными rAd.cIL12 (DC.cIL12). Дендритные клетки, инфицированные rAd.RheoIL-12 (DC.RheoIL12), синтезировали IL-12p70 лишь после обработки RG-115830 (см. Фигура 2A и 2B). Судя по результатам перекрестных экспериментов, оптимальная выработка 1L-I2p70 дендритными клетками произошла при значении множественного инфицирования (MOI), равном 100, где клетки обработали 50-200 мкг/мл RG-115830 (Фигура. 2A). Отсроченное обеспечение RG-115830 для DC.RheoIL12, достигающее 48 часов, не привело к какому-либо значительному понижению выработки EL-12p70 по сравнению с тем, когда лиганд добавляли in vitro одновременно с инфицированием (Фигура 2B). В заключение, удаление лиганда резко подавило способность DC.RheolL12 (до этого времени активируемый лигандом) продолжать выработку повышенного количества IL-12p70 in vitro (Фигура 2C).
Пример 2
Внутриопухолевое введение модифицированных in vitro дендритных клеток животным
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Опухолевая модель B16
[0260] Мышам B6 в правый бок подкожно ввели 1×105 клеток меланомы B16 в день 0. На 7 день, опухоли достигли диаметра, приблизительно равного 20-30 mm2, после чего мышам внутриопухолево ввели (PBS) или 1×106 контрольных либо трансдуцированных аденовирусом (множественное инфицирование MOI=100) дендритных клеток в общем объеме PBS, равном 50 мкл. Также, для инициации, мышам внутрибрюшинно ввели 200 мкг RG-115830 (в 50 мкл диметилсульоксида (DMSO)), либо контрольного носителя DMSO, одновременно, через 24 ч или через 48 ч после введения дендритных клеток, как указано. После инициации, мышам в течение 5 дней ежедневно внутрибрюшинно вводили RG-115830 в тех же дозах. В дополнительных исследованиях, лиганд вводили начиная со дня введения дендритных клеток, затем инъекции прекращали через 1, 3 или 5 дней после инъекции дендритных клеток для определения, понижает ли раннее прекращение стимуляции трансгена IL-12p70 терапевтическую эффективность данного способа. Во всех случаях, размер опухоли контролировали каждые 3 или 4 дня и фиксировали в мм2 путем вычисления произведения наибольших перпендикулярных диаметров, измеренных штангельциркулем с нониусом. Все данные запротоколировали в виде средней площади опухоли ± стандартное отклонение. Группы животных включали в себя 5 особей.
[0261] В указанных экспериментах, животных, избавившихся от опухоли, через 45 дней после проведения терапии повторно инфицировали клетками меланомы B16 (105 клеток ввели в левый бок, т. е. со стороны, противоположной месту первичной инфекции B16) и карциномы толстой кишки MC38 (105 клеток в правый бок) для определения наличия и специфичности иммунной памяти у этих мышей. Все данные протоколировали в виде средней площади опухоли ± стандартное отклонение. Группы животных включали в себя 5 особей.
[0262] Для оценки поведения и функции введенных дендритных клеток, 7-дневные дендритные клетки CD1 Ic+, взятые из костного мозга, выделили из мышей C57B L/6-TgN(ACTbEGFP)10sb/J EGFP Tg. Дендритные клетки EGFP+ CD1 Ic+ не инфицировали или инфицировали вирусами rAd, как описано выше. Через 48 часов после заражения, собрали 1×106 контрольных или зараженных вирусом дендритных клеток, промыли в PBS и ввели в места поражения 7-дневной опухолью В16 изогенных мышей В6. Через 3 дня после введения дендритных клеток, произвели резекцию опухоли и паховых лимфатических узлов, зафиксировали их выдерживанием в течение 1 часа в 2% параформальдегиде (на PBS) и подвергли криопротекции в 30% сахарозе на PBS перед шоковой заморозкой в изопентане, охлажденном жидким азотом. Изготовленные пятимикронные срезы контрастно окрасили трехминутным промыванием 2 мг/мл Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Промытые срезы заключили в Gelvatol (Monsanto Chemical Co., St. Louis, МО) и микроскопировали с помощью микроскопа Olympus ВХ51, снабженного охлаждаемой цветной камерой с полупроводниковым детектором света (с ПЗС-матрицей).
2.1.2 Оценка специфического CD8+ T-клеточного ответа в отношении меланомы B16
[0263] Объединенные CD8+ T-клетки выделяли до степени очистки, превышающей 95% из селезенок обработанных мышей 2 особи/группа через 25 дней после прививки опухолей, произведенной сортировки клеток с помощью магнитных гранул (MACSTM; Miltenyi Biotec), затем их повторно культивировали (1×105/ячейка) с 1×104 облученными (10,000 рад) опухолевыми клетками B16 или EL-4. После 48-часовой инкубации, надосадочную жидкость культур собрали и проконтролировали на предмет выработки интерферона-гамма с помощью коммерческого иммуноферментного анализа (BD-PharMingen), с нижним порогом детекции, равном 31,5 пг/мл. Все данные запротоколировали в виде средней площади опухоли ± стандартное отклонение.
2.1.3 Статистический анализ
[0264] Все исследования, проведенные с тремя или более группами, где лечение проводилось в абсолютно произвольном порядке, сначала анализировали с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Если полученное значение P было намного ниже 3.05, специфические попарные отличия оценивали с применением T-теста с коррекцией по Вельчу для неравных вариаций. Параметры распределения данных проверили, после чего применили соответствующие преобразования. Результаты анализа продукции интерферона-гамма T-клеток, полученных из селезенки, подвергли точному тесту Краскала-Уоллиса. Если значение P теста Краскала-Уоллиса было ниже 0.05, полученные ранее разницы оценивали тестом Вилкоксона. Анализ моделей лечения мыши единичной терапевтической прививки опухоли проводился со смешанными линейными моделями. Данные протокола откорректировали, в соответствии с ковариацией и постоянные эффекты лечения округлили с учетом произвольных индивидуальных эффектов. Необработанные значения Р для одновременного сравнения пар групп определили методом «расшнурованной» выборки (bootstrap method). Значения скорости отторжения опухоли привели к генерализованной линейной модели (с биномиальной связью), включающую в себя исследуемую группу, день наблюдения и их взаимосвязь.
2.2 Результаты
2.2.1 Внутриопухолевое введение только DC.cIL12 или DC.RheoIL12 вместе с внутрибрюшинным введением RG-115830 вызывает регресс образовавшихся подкожных поражений меланомой B16.
[0265] Изогенным мышам H-2b B6 подкожно ввели клетки меланомы B16 (1×105), после чего опухоли позволили развиться. На 7 день, мышей разбили на группы, по 5 особей в каждой, со средним диаметром опухоли в группе, равным приблизительно 20-30 мм2. Затем, мышам провели инъекции PBS или 106 дендритных клеток (предварительно инфицированных in vitro rAd.ψ5, rAd.cIL12 или rAd.RheoIL12 48-часовой инкубацией) в общем объеме 50 мкл PBS. Также, животным провели внутрибрюшинные инъекции диметилсульфоксида DMSO или RG-115830 (в DMSO) одновременно с введением дендритных клеток (т. е. на 1 день лечения), либо через 24 ч, либо через 48 ч после введения дендритных клеток (т. е. на 2 день лечения). Как показано на Фигуре 3A и 3B, лечение мышей одним RG-115830 или одним DC.RheoIL12 в отсутствие RG-115830 не оказало никакого терапевтического эффекта. Напротив, опухоли, которые лечили DCcIL-12 или DC.RheoEL-12+RG-115830 (введенными в течение 24 ч после инъекции дендритных клеток 5-дневным курсом), уменьшились в размере в течение следующих 3 недель. Эти терапевтические методы оказались статистически одинаковыми, в отношении размера опухолей, и вызвали регресс опухолей в 100% (5 мышей из 5) случаев. Любопытно, что когда введение RG-115830 было отсрочено до 48 часов после внутриопухолевой инъекции DC (временной точки, когда этот агент может эффективно стимулировать выработку JL-12p70 DC.RheoIL-12 in vitro, см. Фигура 2B), DC.RheoIL12-опосредованная терапия привела к незначительному подавлению скорости роста опухоли (p<0.05 для всех временных точек после 10 дня), при этом, опухоль у всех животных прогрессировала, и их пришлось усыпить на 30 день (Фигура ЗА). Это предполагает, что лечебный эффект внутриопухолевого введения DC.IL12 находится в критической зависимости от выработки IL-12p70 особенно на раннем этапе (происходящей, судя по всему, в месте опухолевого поражения и/или в дренирующих опухоль лимфатических узлах).
[0266] Также провели дополнительные эксперименты, в которых активирующий лиганд (RG-115830) вводили получившим DC.RheolL-12 мышам в течение 1, 3 или 5 дней после инъекции дендритных клеток (Фигура 3B-3C). Результаты этих исследований показали, что раннее прекращение введения лиганда влияет на противоопухолевую эффективность внутриопухолево введенного DC.RheolL-12, причем подавление роста опухоли ограничивается или прекращается, если введение лиганда отсрочено на 5 и более дней после введения генетически модифицированных дендритных клеток. Эти данные сходятся с данными, иллюстрированными на Фигурах 2B и 2C, и подтверждают жесткую (лиганд-зависимую) регуляцию терапевтического воздействия, вызванного введенными DC.RheolL-12 в данной модели. Кроме того, рассмотренные в совокупности, результаты, иллюстрированные на Фигура 3, определенно подразумевают, что оптимальный противомеланомный эффект, обусловленный внутриопухолевым введением DC.RheoIL12, возникает благодаря введению лиганда в период с 1 по 5 день после инъекции дендритных клеток в опухоли В16.
2.2.2 Отсроченная активация регулируемой терапии DC.RheoIL12 является неэффективной ввиду очевидной неспособности дендритных клеток выживать in vivo.
[0267] Наше предыдущее сообщение (Tatsumi et al, 2003) предполагает, что введение гена IL-12 в дендритные клетки способствует лучшей выживаемости этих клеток после их инъекции в микропространство опухоли, и вследствие этого, обеспечивает способность этих клеток перекрестно примировать (инициировать) противоопухолевые CD8+ T-клетки и рекрутировать циркулирующие эффекторные Т-клетки в опухолевое микропространство in vivo. Таким образом, следующая попытка была направлена на определение, была ли отрицательная эффективность DC-RheoIL12-onocpeflOBaHHofl терапии, инициированной (внутрибрюшинным введением RG-115830) через 48 ч после инъекции дендритных клеток, обусловлена неспособностью дендритных клеток существовать в опухолевом микропространстве, неспособностью этих клеток проникать в дренирующие опухоль лимфатические узлы и/или неспособностью специфичных CD8+Т-клеток перекрестно примироваться (инициироваться) в результате лечения. Эксперименты, иллюстрированные на Фигуре 3A, провели повторно, при этом усыпляли по 2 мыши на группу через 72 ч после внутриопухолевого введения дендритных клеток, с той лишь разницей, что источником костного мозга для получения дендритных клеток были мыши EGFP Tg (H-2b). Опухоль и лимфоузлы подвергли резекции, после чего для анализа дендритных клеток EGFP+ флуоресцентной микроскопией приготовили срезы ткани. За оставшимися мышами (по 3 в группе) наблюдали в течение 25 дней, после чего их усыпили, а дендритные клетки объединили со спленоцитами, изолированными для анализа B16-специфичного CD8+ T-клеточного ответа.
[0268] Как иллюстрировано на Фигуре 4, наличие EGFP+ дендритных клеток в опухоли или лимфоузлах через 72 ч после внутриопухолевой инъекции строго зависело от активации трансгена IL-12 в течение 24-48 ч после введения этих клеток in vivo. Клетки EGFP+ DC.cIL12 и DC.RheoIL12 могли быть легко обнаружены в зоне поражения В16, но реже наблюдались в лимфатических узлах мышей, которым внутриопухолево ввели DC.cIL12 или DC.RheoIL12 (если RG-115830 вводили внутрибрюшинно в течение 0-24 ч после введения дендритных клеток). В тканях, взятых у мышей, которым вводили контрольные дендритные клетки (неинфицированные) или DC.RheoIL12 (где введение RG-115830 было отсрочено на 48 после инъекции DC), дендритные клетки были обнаружены в очень малых количествах (или не обнаружены вообще). При сравнении тканей, взятых у мышей, которым ввели DC.RheoIL12 и после этого ввели RG-115830 через 0 ч и 24 ч, было больше EGFP+ дендритных клеток как в самой опухоли (p=0.001), так и в лимфоузлах (р=0.02), в случае, когда активирующий препарат ввели ранее.
2.2.3 Терапевтические преимущества введения DC.RheoIL12 связаны с активацией специфичных CD8+ T-клеток и стойким противоопухолевым иммунитетом
[0269] Ввиду очевидной зависимости жизнеспособности введенных дендритных клеток от времени введения лиганда, мы можем предположить, что уровень перекрестного примирования (инициации) специфичных CD8+ Т-клеток в случае с мышами, получившими DC.RheoIL12, активированный сразу (временная точка 0 ч), будет выше, по сравнению с мышами, получившими активирующий лиганд в более позднее время. Любопытно, что в то время, как это очевидно подтвердилось в случае, когда сравнивали группы DC.RheoIL-12 0 ч (DC.RheoIL-12, день 1-5) и 48 ч (DC.RheoIL- 12, день 3-7), в случае, когда сравнивались группы 0 ч (DC.RheoIL-12, день 1-5) и 24 ч (DC.RheoIL- 12+L, день 2-6), предположение не подтвердилось (Фигура 5А). На самом деле, иммунный ответ селезеночных CD8+ T-клеток in vitro (выделение интерферона-гамма), направленный против соответствующих В16 опухолей и направленный против не соответствующих EL-4 опухолей, оказался сравнимым в отношении этих групп, и в обоих случаях реакция приблизительно соответствовала таковой, наблюдаемой у мышей, которым ввели DC.cIL12. В целом, оказалось, что эти профили CD8+ T-клеточного ответа прямо коррелировали с результатами терапии (Фигура A). Как и на Фигуре 5А, иммунная реакция, выражающаяся в выработке интерферона-гамма селезеночными T-клетками по отношению к специфичным клеткам опухоли В16, по сравнению с реакцией к неспецифичным клеткам МС38, коррелировала с результатами терапии.
[0270] Чтобы определить, была ли DC.RheolL12-опосредованная терапия эффективной ввиду возникновения стойкого противоопухолевого иммунитета, излеченным от опухоли животным повторно ввели соответствующие клетки меланомы B16 и клетки другой опухоли - карциномы толстой кишки М38 через 45 дней после первичного инфицирования B16. Как показано на Фигуре 5B, все мыши, прошедшие до этого курс лечения от меланомы В16, показали наличие специфической защитной реакции на клетки B16, в то время как опухоли МС38 характеризовались прогрессирующим ростом. Это доказывает, что дендритные клетки представленные в настоящем изобретении обеспечивают дополнительную безопасность и потенциальный терапевтический контроль способа лечения (в том, что как время, так и уровень экспрессии интерлейкина-12 могут быть регулируемы введением лиганда).
Пример 3
Сравнение зависимости терапевтического эффекта от пути введения/дозировки лиганда
3.1 Методы и материалы
[0271] Клетки меланомы B16, введенные подкожно в правый бок изогенным мышам В6, развивались в течение 7 дней. На 7 день, внутриопухолево ввели 106 DC.SP1-IL12 (оптимальный переключатель показан в сравнении на Фигуре 10). Активирующий лиганд (RG-115932) ввели внутрибрюшинной инъекцией, либо орально через желудочный зонд в Лабразоле (Labrasol), либо с содержащей препарат пищей ad libitum, за день до начала введения дендритных клеток (и затем ежедневно в течение 6 дней). В каждую группу входило 5 животных, рост опухоли контролировали каждые 3-4 дня и протоколировали в виде среднего размера (в мм2, основываясь на произведении ортогональных измерений). Лечение, полученное каждой группой, описано ниже.
3.2 Результаты
[0272] Результаты показали, что введение одного лишь лиганда в любых дозах любым путем не оказывает эффекта на рост опухоли В16 (Фигуре 6). DC-SP1 внутриопухолевая терапия эффективна в контроле роста В16, но только в присутствии лиганда, причем все пути введения обеспечивают некоторую степень эффективности. Внутриопухолевая терапия DC-SP1 с внутрибрюшинным введением лиганда дала профиль четкой зависимости между дозировкой и подавлением опухоли, с оптимальным противоопухолевым эффектом при дозировке лиганда, превышающей 30 мг/кг/день. Введение дозы лиганда, равной 30 мг/кг/день, при внутриопухолевой терапии DC-SP1 оказалось одинаково эффективным, если лиганд вводили внутрибрюшинно, орально через зонд или вместе с пищей. Более высокая доза лиганда, принимаемого вместе с пищей, оказалась несколько менее эффективной. Так как только R-оптический изомер (RG-115932) способен активировать RheoSwitch® Therapeutic System (RTS), пища, содержащая рацемическую смесь, обеспечивает лишь с.а. 20-22.5 мг/кг/день активного оптического изомера. В этом отношении, регресс опухоли, наблюдаемый у животных, получавших рацемическую смесь активирующего лиганда с пищей (т. е. ~20-22.5 мг/кг/день активного энантиомера RG-115932), соответствовал таковому при внутрибрюшинном введении чистого RG-1 15932 при том, что противоопухолевый эффект в группе, принимающей препарат с пищей, по интенсивности оказался промежуточным наблюдаемому при внутрибрюшинном введении RG-115932 в группах с дозировками 10 и 30 мг/кг/день. Эти данные подтверждают то, что оральное введение лиганда эффективно в обеспечении терапевтического эффекта. Простота орального введения лиганда облегчит процесс лечения пациентов.
[0273] Зависимый от активирующего препарата эффект был связан с (1) экспрессией трансгена в опухоли и дренирующих опухоль лимфоузлах, (2) пролонгируемой выживаемостью Ad-DC в микропространстве опухоли, (3) миграцией и персистенцией Ad-DCs в дренирующих опухоль лимфоузлах и (4) активацией специфичных к B16 CD8+ T-клеток.
[0274] На Фигуре 10 показан результат сравнения эффективности различных аденовирусных векторов, содержащих IL-12. Вариант SP1-RheoIL-12 был наиболее эффективным среди Rheoswitch-содержащих вариантов. SP1-RheoIL-12 отличается от oldRheoIL-12 основной кодирующей последовательности вектора (AdEasyl в OldRheoIL-12 и RAPAd в ViraQuest на SpI-RheoIL-12). TTR-RheolL-12 отличается от oldRheoIL-12 содержанием минимального промотора TTR в направлении 3’ относительно элемента отклика Gal4. Как иллюстрирует Фигура 10, SP1-RheoIL-12 был более эффективным, чем TTR-RheoIL-12 при уменьшении опухолевого размера меланому В16.
[0275] Фигура 11 иллюстрирует, что опухоль меланомы В16 не развивается после повторного заражения у мышей, которые до этого получили лечение дендритными клетками, содержащими рекомбинантный аденовирусный Rheoswitch индуцируемый IL-12 (DC-SP1-RheoIL-12). Это говорит о том, что рост опухоли меланомы В16 предотвращается на срок до 25 дней, когда В16-иммунные мыши подвергаются повторной прививке через 45 дней после первичного инфицирования клетками В16. DC мыши получили из костного мозга мышей В6 путем 7-дневного культивирования в полной питательной среде (RPMI-1640, 10% FBS), содержащей рекомбинантный IL-4 мыши и рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GM-CSF. CD1 Ic-положительные дендритные клетки затем выделили с помощью специфических гранул MACS, следуя инструкциям производителя (Miltenyi Biotech), и инфицировали при множественном инфицировании MOI=100 вектором rAd.IL-12 (RheoIL-12 vs. SP1 vs. TTR) 24-часовой инкубацией до инъекции дендритных клеток 10E6 в 9-дневные сформировавшиеся подкожные опухоли меланомы B16 (5 мышей в группе, опухоль на правом боку). Некоторым мышам делали ежедневные внутрибрюшинные инъекции активирующего лиганда RG-115830 (30 мг/кг в 50 мкл DMSO) на 0-4 дни после введения дендритных клеток. Размер опухоли контролировали каждые 3-4 дня и протоколировали в кв. мм в виде произведения ортогональных диаметров. Для оценки специфичности связанной с терапией защиты, всем избавившимся от опухоли животным в левый бок повторно ввели клетки меланомы 10E5 B16, а в правый бок ввели клетки карциномы толстой кишки MC38 на 45 день после первичного заражения опухолью B16. Произошло формирование опухолей МС38, а опухоли В16 не развились.
[0276] На Фигуре 12 приведены данные по сравнению между количеством дендритных клеток (DC-SP 1-RheoIL-12), введенных в опухоль В16 (105, 106, 107), продолжительностью введения лиганда, и регрессом опухоли в модели меланомы В16 мыши (6 дней, 13 дней). Фигура
12 иллюстрирует зависимость подавления опухолевого роста от дозы введенных в опухоль трансдуцированных дендритных клеток и длительности введения активирующего лиганда (внутрибрюшинные инъекции, 30 мг/кг/день). Зараженным опухолью мышам провели единичную внутриопухолевую инъекцию AdDC в дозировке 105, 106, и 107 клеток, а также ежедневные внутрибрюшинные инъекции активирующего препарата одной дозой 30 мг/кг/день в течение 6 или 13 дней, начиная со дня введения 107 клеток. Значительно более интенсивное подавление опухолевого роста наблюдали, когда активирующий препарат вводили в течение 13 дней, по сравнению с 6-дневным курсом. Лиганд (RG-115932), вводимый в течение 13 дней последовательно в комбинации с 107 дендритными клетками, оказался эффективным средством, вызвавшим регресс опухоли за 25-дневный период. Это позволяет предположить, что в противоположность мнению, что трансдуцированные ex vivo дендритные клетки живут всего лишь несколько дней после инъекции в опухоль, клетки AdDC, вырабатывающие IL-12 под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS, с большой вероятностью останутся интактными в течение более, чем 1 недели после внутриопухолевой инъекции, и даже могут оставаться живыми и реагирующими на активирующий препарат через 13 дней после инъекции. Активирующий препарат в одиночку (без AdDC) не оказывал эффект на рост опухоли.
[0277] В эксперименте, сходном с иллюстрированным на Фигуре 12, активирующий препарат вводили орально через зонд в течение 9 и 12 дней. Таким образом, оценили зависимость противоопухолевого иммунного ответа от дозы введенного в оральной форме в Labrasol активирующего лиганда. После наблюдения зависимого от дозировки противоопухолевого эффекта, обнаружили, что лучший иммунный ответ возникает у животных, принимающих 50 мг/кг/день активирующего лиганда орально в течение 12 дней. Как оказалось, из всех тестированных дозировок, 13 дней приема активирующего лиганда были эффективнее 9-дневного режима. Из этого можно заключить, что дендритные клетки, выжившие и способные вырабатывать IL-12 в течение, как минимум, 9-12 дней in vivo (в микропространстве опухоли или в лимфоидных органах), являются наиболее важными для оптимальной эффективности лечения.
[0278] Фигура 13 иллюстрирует, что способ терапии, описанной в данной заявке, не связан с неблагоприятной потерей массы у животных ввиду истощения. Истощение и потеря массы часто связаны с высоким уровнем интерферона-гамма и фактора некроза опухолей-альфа, синтез которых, как известно, положительно регулируется интерлейкином-12.
[0279] 5 изогенным В6 мышам в правый бок подкожно привили меланому В16. После 7-дневного развития опухоли, в дозах 10E5, 10E6 и 10E7 внутриопухолево ввели DC.SP1-IL-12 (выделенные из костного мозга дендритные клетки, инфицированные при множественном инфицировании MOI=100, под оптимальным переключателем SP1). Начиная со дня инъекции дендритных клеток (и затем ежедневно в течение 6 или 13 дней) внутрибрюшинно вводили RG-115932. В каждую группу входило 5 животных, рост опухоли контролировали каждые 3-4 дня и протоколировали в виде среднего размера (кв. мм, как произведение ортогональных измерений). Во время оценки роста опухолей, каждое животное также взвешивали (Фигура 13). Всех животным, излеченным от опухоли любым видом терапии, на 50-й день (после первичной прививки опухолью В16) в противоположный бок (левый бок) повторно ввели клетки меланомы 10Е5 В16, а в правый бок ввели клетки 10Е5 МС38 карциномы толстой кишки. Рост опухоли контролировали каждые 3-4 дня и сравнивали с ростом, наблюдаемым у не получивших лечение животных (см.Фигура 12).
[0280] На Фигуре 14 показано, что опухоль не формируется после повторного заражения клетками В16 мышей, до этого получивших лечение дендритными клетками, содержащими рекомбинантный аденовирусный Rheoswitch-индуцируемый IL-12 и активирующий лиганд RG-1 15932. Таким образом, Фигура 14 показывает, что рост меланомы В16 у В16-иммунных мышей подавлется в течение менее 24 дней после повторной прививки. На Фигуре 14 также показано, что не инфицированные В16 мыши не были защищены от формирования опухоли, как не были защищены МС38-иммунные и не инфицированные МС38 мыши. МС38 - это карцинома толстой кишки, известная в данной области техники. Таким образом, данная фигура свидетельствует о специфичности вызванной первичной инъекцией опухоли В16 иммунизации дендритными клетками, содержащими рекомбинантный аденовирусный Rheoswitch-индуцируемый IL-12.
[0281] Дендритные клетки, полученные в результате дифференциации CD 14+ клеток, обладают незрелым фенотипом и не вырабатывают выявляемых количеств IL-12 (Cella et al. 1999). Из Фигуры 15 видно, что дендритные клетки мыши, полученные путем 7-дневной обработки клеток костного мозга гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором GM-CSF и IL-4 и последующего отбора CD1 Ic+ клеток, также характеризуются неспособностью экспрессировать выявляемые количества IL-12 после трансдукции аденовирусным вектором, кодирующим интерлейкин-12 под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS. Обработка трансдуцированных клеток различными дозами активирующего препарата (RG-115932) привела к выработке IL-12 в зависимом от дозировки режиме.
[0282] По имеющимся данным, аденовирусная трансдукция в некоторой степени стимулирует созревание дендритных клеток с помощью пентон-интегриновых взаимодействий, вызывающих синтез фактора некроза опухолей-альфа путем активации ядерного фактора каппа-В (NFkB). Известно, что аутокринное действие фактора некроза опухолей-альфа в этом случае служит стимулирующим созревание сигналом для дендритных клеток (Philpott et al. 2004). Считается, что краткая аденовирусная трансдукция (2-3 часа) и подборка минимального достаточного значения множественного инфицирования MOI ограничивают этот эффект раннего созревания.
Пример 4
[0283] В этом примере дендритные клетки выделили из костного мозга, модифицировали аденовирусными конструкциями, изображенными на Фигуре 7, а затем мышам, зараженным изогенной интракраниальной глиомой GL261, внутриопухолево ввели модифицированные дендритные клетки; RG-115830 был введен внутрибрюшинно. На Фигуре 7 показаны результаты внутриопухолевой инъекции дендритных клеток, трансдуцированных кодирующими IL-12 и/или интерферон-альфа под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS или без него, полинуклеотидами. Данные показали, что лиганд-индуцированная экспрессия интерферона-альфа и 1L-12, опосредованная активацией RheoSwitch® Therapeutic System RTS лигандом RG-115830, обеспечила 50-дневную выживаемость зараженных глиомой GL261 мышей в 75% случаев; в сравнении с экспрессией лишь одного интерферона-альфа. Более того, осуществляемая RheoSwitch и лигандом регуляция обеспечила повышенную выживаемость.
Пример 5
[0284] Безопасность, переносимость, трансгенная функция и иммунологические эффекты внутриопухолевой инъекции трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток, модифицированных для экспрессии IL-12 человека под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS, у субъектов с меланомой 3 и 4 стадии можно оценить с применением процедур, подобных описанным ниже.
[0285] Исследование, включающее в себя изучение субъектов, пораженных меланомой 3 и 4 стадии, осуществляют на 4 группах субъектов, каждому из которых делают единичную внутриопухолевую инъекцию (в опухоль меланомы) трансдуцированных аденовирусом аутологичных (введенных субъекту, у которого они были взяты) дендритных клеток (DC), модифицированных для экспрессии интерлейкина-12 человека (IL-12 человека), в дозах 5×107, в комбинации с ежедневными оральными дозами активирующего препарата (активирующего лиганда). В исследовании применяют инъекции дендритных клеток, трансдуцированных ex vivo (после того, как клетки выведены из субъектов) аденовирусным вектором для индуцируемой экспрессии IL-12 человека. Выработка интерлейкина-12 введенными дендритными клетками «включается» (индуцируется) активацией RheoSwitch® Therapeutic System RTS, вызванной оральным приемом активирующего препарата (RG-115932). Безопасность и переносимость оценивают физическими исследованиями (включая статус ECOG), измерением показателей жизнедеятельности, химическим анализом сыворотки, анализом мочи, гематологических параметров, контролем нежелательных явлений (побочных эффектов), а также клеточному и гуморальному иммунному ответу на аденовирус, компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS и активирующий препарат. Для оценки прогресса, измеряют фармакокинетику/всасывание, распределение, метаболизм и выведение (ADME) единичных доз и в стационарном состоянии, уровень интерлейкина-12 и клеточного иммунного ответа (T-клеток) в биоптатах опухолей-мишеней, дренирующих опухоль лимфоузлов и периферической циркуляции, а также цитокиновый профиль сыворотки.
[0286] Например, 16 субъектов с 3 и 4 стадией меланомы разделены на 4 группы, где в группы 1 и 2 входит по 3 человека, а в группы 3 и 4 - по 5 человек. Всем субъектам проводят единичную внутриопухолевую инъекцию 5×107 аутологичных дендритных клеток, трансдуцированных аденовирусным вектором, кодирующим IL-12 человека под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS. Субъекты получают по единичной оральной ежедневной дозе активирующего препарата (группа 1: 0.01 мг/кг, группа 2: 0.1 мг/кг, группа 3: 1.0 мг/кг и группа 4: 3 мг/кг); первая доза принимается приблизительно за 3 часа до инъекции дендритных клеток в 1-й день, затем курс продолжается последовательно в течение 13 дней. Дополнительные инъекции трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток в комбинации с 14 единичными ежедневными оральными дозами активирующего препарата можно вводить подходящим субъектам, отвечающим условиям повторного лечения. Безопасность, переносимость и функция дендритных клеток для всех членов каждой группы оценивают в течение 1 месяца после инъекции модифицированных in vitro дендритных клеток перед тем, как субъекты начинают получать следующую по величине дозу активирующего препарата. Оценку безопасности у всех субъектов проводят в течение 3 месяцев после первичной инъекции модифицированных дендритных клеток, с возможным продолжением времени наблюдения до 6 месяцев для контроля безопасности субъектов, в случае если обнаружены признаки токсичности или субъект получает дополнительные инъекции дендритных клеток.,.
[0287] Такое исследование наглядно демонстрирует безопасность и переносимость единичных или множественных внутриопухолевых инъекций трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток в комбинации с оральным применением активирующего препарата у субъектов, пораженных меланомой. Исследование обеспечивает фармакокинетику/всасывание, распределение, метаболизм и выведение (ADME) орального активирующего препарата в стационарном состоянии. Исследование демонстрирует функциональность RheoSwitch® Therapeutic System RTS у субъектов путем измерения экспрессии IL-12 человека трансдуцированными аденовирусом дендритными клетками в опухоли-мишени и/или дренирующих опухоль лимфоузлах в ответ на активацию RheoSwitch® Therapeutic System RTS оральным введением активирующего препарата. Более того, исследование демонстрирует иммунологические эффекты трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток по величине клеточного иммунного ответа в опухоли-мишени, дренирующих опухоль лимфоузлах и периферической циркуляции, возникающего после орального введения активирующего препарата.
[0288] Меланома была выбрана в качестве примера злокачественной опухоли (для применения RheoSwitch® Therapeutic System RTS), поскольку для пациентов, находящихся на 3 и 4 стадии заболевания на сегодняшний день не существует способов эффективного лечения; по известным данным, меланома, в частности, среди опухолей твердых тканей, поддается иммунотерапевтическим методам; и опухоли меланомы легко доступны для внутриопухолевых инъекций и биопсии. Субъекты, участвующие в исследовании, находятся на неоперабельной 3 и 4 стадии меланомы, с размером опухоли, по меньшей мере равным 0,5 см в диаметре, с любой толщиной опухоли, с любым количеством включенных в процесс лимфатических узлов, близлежащих и отдаленных метастазов.
5.1. Получение аденовируса, несущего RheoSwitch Therapeutic System (RTS) и IL-12 [0289] Рекомбинантную ДНК вводят в дендритные клетки (DC) путем ex vivo трансдукции аденовирусным вектором. Рекомбинантная ДНК применяется для экспрессии IL-12(p70) человека внутриопухолево введенными незрелыми дендритными клетками, обеспечивает выживаемость и стимулирует созревание дендритных клеток в опухолевом пространстве, приводящее к последующей миграции дендритных клеток в дренирующие лимфатические узлы. Это, в свою очередь, обусловливает сдвиг дифференцировки T-хэлперных клеток в сторону подтипа Th1 а также активацию опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток перекрестным примированием (инициацией) опухолевыми антигенами.
[0290] Рекомбинантная ДНК, которую применяют в качестве аденовирусного вектора, позволяет вырабатывать IL- 12 человека под контролем RheoSwitch® Therapeutic System (RTS). RheoSwitch® Therapeutic System RTS представляет собой бицистронную последовательность, экспрессируемую с промотора убиквитина С человека и кодирующую два рекомбинантных белка: GaW-EcR and VP16-RXR. Gal4-EcR является комплесом ДНК-связывающего домена (аминокислоты 1-147) Gal4 дрожжей и домена DEF рецептора экдизона насекомого Choristoneura fumiferana. Согласно другому варианту реализации, RheoSwitch® Therapeutic System RTS представляет собой бицистронную последовательность, экспрессируемую с промотора убиквитина С человека и кодирующую два рекомбинантных белка: GaW-EcR and VP16-RXR. Gal4-EcR комплексом ДНК-связывающего домена (аминокислоты 1-147) Gal4 дрожжей и домена DEF рецептора экдизона насекомого Choristoneura fumiferana. VP16-RXR представляет собой комплекс домена активации транскрипции HSV-VP 16 и домена EF химерного RXR, полученного из последовательностей человека и саранчи. Последовательности Gal4-EcR и VP16-RXR разделены участком внутренней посадки рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV). Эти два рекомбинантных белка димеризуются, когда Gal4-EcR связывается с низкомолекулярным препаратом (RG-115932) и активируют транскрипцию IL-12 человека под Са14-зависимым промотором, содержащим 6 Са14-связывающих участков и синтетический минимальный промотор. Транскрипционная единица RheoSwitch® Therapeutic System RTS, описанная выше, расположена с 3' конца транскрипционной единицы IL-12 человека. Эта целая RTS-IL12 экспрессионная кассета встроена в геном аденовируса 5 на участке, откуда был удален участок Е1. Последовательность аденовируса, используемая в качестве основы для вектора также не содержит ген Е3. Карта аденовирусного вектора Ad-RTS-IL-12 человека изображена на Фигуре. 8.
[0291] Рекомбинантный аденовирусный вектор, применяемый в данном исследовании, содержит следующие типичные регуляторные последовательности, кроме последовательностей вирусного вектора: промотор убиквитина С человека, участок внутренней посадки рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита, индуцируемый промотор, содержащий 6 копией участков связывания Gal4, 3 копии участков связывания SP-I, последовательность синтетического минимального промотора, участки полиаденилирования вируса SV40 и последовательность терминации транскрипции из гена альфа-глобина человека. Следует иметь в виду, что в качестве альтернативы могут присутствовать другие регуляторные элементы.
[0292] Типичный рекомбинантный аденовирусный вектор Ad-RTS-hDL-12 получили следующим способом. Кодирующие последовательности рецепторных рекомбинантных белков VP 16-RXR и Gal4-EcR, разделенные участком внутренней посадки рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита EMCV-IRES, встраивали в аденовирусный челночный вектор под контролем промотора убиквитина С человека (конститутивный промотор). Затем, кодирующие последовательности субъединиц p40 и p35 IL-12 человека, разделенные участком внутренней посадки рибосомы (IRES) вируса энцефаломиокардита, поместили под контроль синтетического индуцируемого промотора, содержащего 6 копий Са14-связывающего участка, и встроили с 5’ конца промотора убиквитина С и рецепторных последовательностей. Челночный-вектор содержит последовательности серотипа 5 аденовируса с левого конца до 16-й точки карты (mulo), от которой отщепили последовательности Е1 и заменили на последовательности RheoSwitch® Therapeutic System RTS и IL-12 (RTS-IL-12 человека). Челночный вектор, несущий RTS-IL-12 человека, проверили временной трансфекцией в клетки НТ-1080 на зависимую от активирующего препарата экспрессию интерлейкина-12. Затем челночный вектор рекомбинировали с основной кодирующей последовательностью аденовируса путем совместной трансфекции в клетки НЕК 293 для получения рекомбинантного аденовируса Ad-RTS-IL-12 человека. Последовательность аденовируса, используемая в качестве основы для вектора содержит делеции от mu 0 до 9.2 с левого конца генома и гена Е3. Челночный вектор и последовательность аденовируса содержат перекрывающуюся последовательность от mu 9.2 до mu 16, позволяющую им рекомбинировать друг с другом, и получить рекомбинантный аденовирусный вектор. Так как в рекомбинантном аденовирусном векторе не хватает участков E1 и E3, вирус является дефектным в отношении репликации в нормальных клетках млекопитающих. Тем не менее, вирус может реплицироваться в клетках НЕК 293, несущих участок E1 аденовируса-5 и, таким образом, позволяющий Е1 функционировать в транс-конфигурации.
[0293] Типичный рекомбинантный аденовирусный вектор получили следующим способом: линеаризованный рекомбинантный аденовирусный челночный вектор, несущий элементы ДНК для индуцируемой экспрессии человеческого интерлейкина-12, и основную кодирующую последовательность аденовируса трансфицировали в клетки HEK293. Рекомбинация между перекрывающимися последовательностями челночного вектора и основной кодирующей последовательностью вируса приводит к получению рекомбинантного аденовируса, который упаковали в вирусные частицы в клетки HEK293. Клетки HEK293 культивировали в питательной среде DMEM, содержащей фетальную бычью сыворотку.
[0294] Вирус, применяемый в предлагаемом исследовании, очистили центрифугированием в градиенте концентрации хлорида цезия. Рекомбинантный аденовирус подвергли двум циклам очистки бляшек, а полученный семенной препарат использовали для получения главного банка вирусов (MVB) амплификацией в клетках НЕК293 из главного банка полностью характеризованных клеток. Главный банк вирусов MVB подвергли расширенным тестам, выпуска cGMP/GLP, включая те сты на аденовирус без дефекта репликации (replication competent adenovirus, RCA), стерильность, микоплазмы, адвентициальные вирусы, ретровирусы, человеческие вирусе ВИЧ 1/2, Т-лимфотропные вирусы человека 1/2, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус Эпштейна-Барра, парвовирус В19, цитомегаловирус, вирус герпеса 6, 7 и 8 вирусы, коров и свиные, полное секвенирование векторов и функциональное тестирование индуцируемой активирующим препаратом экспрессии IL-12 в клеточных линиях человека.
[0295] Вирус из полного банка вирусов MVB можно применять для получения чистого вируса в лаборатории cGMP, после чего может вновь быть подвергнут тестам выпуска, включая тесты на: целостность, аденовирус без дефекта репликации, стерильность, микоплазму, адвентициальные вирусы, соотношение вирусных частиц и инфекционных единиц, контаминацию ДНК клетки-хозяина, эндотоксин и белки, а также функциональным тестам индуцированной активирующим препаратом экспрессии интерлейкина-12 в клеточных линиях человека.
6.2. Трансдукция аутологичных дендритных клеток аденовирусом, содержащим трансген IL-12 человека и RheoSwitch® Therapeutic System (RTS)
[0296] Дендритные клетки, полученные от человека, подвергли трансдукции ex vivo и ввели в опухоль. Перед вирусной трансдукцией, дендритные клетки характеризовали в отношении жизнеспособности, степени очистки (как правило, более 80% клеток, обладающих фенотипом DC), стерильность, микоплазмы и эндотоксины. После вирусной трансдукции, клетки неоднократно промыли для удаления неабсорбированных вирусов. Надосадочную жидкость после последней промывки протестировали с помощью полимеразной цепной реакции для определения содержания остаточного вируса. Так как дендритные клетки трансдуцировали ex vivo аденовирусным вектором (неинтегрирующим вирусом), а продолжительность жизни дендритных клеток после внутриопухолевой инъекции и последующей миграции в дренирующие лимфатические узлы коротка, предполагается, что вирусная ДНК не попадает в не являющиеся мишенями клетки. Ожидается, что протокол, который применяли для трансдукции дендритных клеток аденовирусами обеспечит 80-90% трансдукцию, поэтому он считается весьма эффективным.
[0297] Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) лейкофорезом: пациентов подвергли стандартному 90-120-минутному лейкофорезу с помощью Аферезного блока UPCI Outpatient. Процедура включила в себя взятие крови из вены одной руки; центрифугирование крови (в сепараторе клеток), где происходит разделение ее компонентов, после которого один или более компонентов удаляются; и возвращение оставшихся компонентов в вену той же или другой руки пациента. За один цикл обработки крови сепаратором клеток у пациента брали не более 15% общего объема крови. В сепараторе клеток кровь разделили на плазму, тромбоциты, лейкоциты и эритроциты. Лейкоциты (белые клетки крови) отделили, а остальные компоненты возвратили в циркуляцию субъекта. Для этой процедуры желательно использовать две периферические линии 4. Если это невозможно, может возникнуть необходимость в использовании центральной линии. Перед лейкофорезом, пациент должен быть осмотрен врачом, также, как правило, берут его основные жизненные показатели (включая АД).
[0298] Обработка: после сбора, лейкоцитарную фракцию вручную перенесли на CPL и сразу же подвергли центрифугальной элютриации в приборе ELUTRA™. Эта закрытая система одобрена для клинического применения. Моноцитарную фракцию восстановили и, после того, как жизнеспособность клеток была установлена, их перенесли в картридж Aastrom для 6-дневной культивировании в присутствии IL-4 and гранулоцитарно-макрофагального колиниестимулирующего фактора GM-CSF. Все этапы обработки и промывки провели в условиях полной стерильности.
[0299] Первичное посев: моноциты, выделенные из одной лейкоцитарной фракции, подсчитали в трипановом синем для определения числа жизнеспособных (живых) клеток. Путем поточной цитометрии оценили чистота моноцитов. Затем, моноциты взвесили при 5-10×106 клеток/мл в не содержащей сыворотку и антибиотики среде CellGenix, в которую входит 1,000 МЕ/мл IL-4 и 1,000 МЕ/мл GM-CSF в SOP-CPL-0166, и перенесли в картридж Aastrom. Минимальный объем загрузки, равный 50 мл, и минимальное количество клеток необходимы для прививки кассеты.
[0300] Культура: картридж Aastrom поместили в инкубатор Replicell System - полностью закрытый, cGMP-совместимый культивационный прибор для генерации незрелых дендритных клеток.
[0301] Сбор незрелых дендритных клеток: на 6 день, картридж Aastrom извлекли из инкубатора, после чего собрали незрелые дендритные клетки. Клетки восстановили центрифугированием при 1,500 об/мин, промыли средой CellGenix, подсчитали в трипановом синем и проверили на морфологические и фенотипические характеристики.
[0302] Жизнеспособность: определили путем подсчета клеток с помощью гемоцитометра в трипановом синем. Как правило, более 95% собранных клеток оказываются живыми, т. е. не окрашиваются трипановым синим. Если жизнеспособность составляет менее 70%, незрелые дендритные клетки отбраковываются.
[0303] Определение фенотипа: культивированные клетки подсчитали путем микроскопирования на гемоцитометре, получив предварительный дифференциальный (DC и лимфоциты) итог с применением трипанового синего. Поточной цитометрией подтвердили дифференциальный подсчет, фокусируясь на разделении дендритных клеток и лимфоцитов и используя высокие характеристики прямого и бокового рассеивания незрелых дендритных клеток в качестве критерия идентификации. Обычно, незрелые дендритные клетки составляют более 80% клеток, обладающих морфологией и фенотипом дендритных клеток.
[0304] Оценка эффективности IL-12p70: установили, что зрелые дендритные клетки (mDC) обладают способностью вырабатывать IL-12р70 самопроизвольно или после активации CD40L с помощью сигналов врожденного иммунитета (например, липополисахаридов) или без нее. Недавно был разработан стандартизированный способ выработки IL-12p70, применимый для получения небольших образцов или больших количеств дендритноклеточных вакцин, получаемых при различных условиях. Современные способы оценки эффективности состоят из двух отдельных стадий, первая из которых включает в себя совместную инкубацию дендритных клеток-респондеров с клетками лимфомы J588, постоянно трансфицируемых геном лиганда CD40 человека в качестве стимулятора.
Вторая стадия включает в себя проверку надосадочной жидкости этих совместных культур на уровень секреции IL-12р70 дендритными клетками, стимулированными J558/CD40L +/- липополисахарид LPS в системе Luminex. В этот способ оценки эффективности также входит промежуточная процедура с 18.5%-ным CV (n=30) и широкой областью динамических значений, облегчающая оценку различных продуктов дендритных клеток, характеризующихся весьма разными степенями выработки IL-12p70. Нормальная область значений процедуры, установленная с применением дендритных клеток, полученных из моноцитов 13 здоровых доноров, составляла 8-999 пг/мл, со средним значением, равным 270 пг/мл Критерия Продукции и Выработки для Дендритных Клеток.
[0305] Каждую группу полученных in vitro дендритных клеток протестировали на наличие контаминации микроорганизмами (аэробные и анаэробные бактерии, грибы и микоплазмы), на эндотоксин и на их фенотипические и функциональные характеристики. Все дендритные клетки, вводимые субъектам, должны быть свежими и не подвергавшимися заморозке.
[0306] Тестирование гарантии качества дендритных клеток: дендритные клетки, полученные, как описано выше, исследуются на стерильность, жизнеспособность, чистоту, эффективность и стабильность. Критерии выпуска клеточного продукта утверждены и тщательно контрол ируются.
[0307] Жизнеспособность: выращенные в культуре клетки подсчитали с помочью микроскопии на гемоцитометре, после чего в трипановом синем осуществили дифференциальный подсчет (дендритные клетки и лимфоциты). Этот подсчет обеспечивает оценку процентного содержания живых клеток. Для соответствия критерию клеточного выпуска, необходимо, чтобы выживаемость клеток была не ниже 70% при исключении трипановом синим, а также более 70% клеток экспрессировали HLA-DR и CD86 как маркеры полученных из моноцитов дендритных клеток. Также, для исследовательского анализа можно применять дополнительные маркеры, как, например, CD83 и CCR7 для оценки статуса зрелости и CD3 и CD19 для оценки лимфоцитарной контаминации.
[0308] Чистота: для определения того, что морфологически идентифицированная популяция дендритных клеток экспрессирует поверхностные антигены, установленные для дендритных клеток, и не несет антигены семейств моноцитов, B- и T-клеток, применили двухцветную поточную цитометрию клеток, окрашенных FITC- и PE-конъюгированными антителами. Для приготовления вакцин, генерированные дендритные клетки должны экспрессировать HLA-DR и CD86 и не должны экспрессировать CD3, CD 19 и CD 14. Для того, чтобы считаться зрелыми дендритными клетками, клетки должны экспрессировать CD83+ и CCR7+.
[0309] Эффективность: для оценки степени эффективности дендритных клеток, определили их способность вырабатывать IL-12p70, как описано выше.
[0310] Стерильность: дендритные клетки тестировали на бактериальные (аэробные и анаэробные) и грибковые культуры с применением системы BD Bactec system (Becton Dickinson Co., Sparks, MD) в Микробиологической Лаборатории Медицинского Центра Питсбургского университета. Окончательные результаты в отношении культур микроорганизмов были получены в течение 14 дней. До выпуска дендритных клеток для применения их в вакцинах, производится окрашивание по Граму. Его результаты на наличие микроорганизмов должны быть отрицательными.
[0311] Тесты IMCPL для выявления микоплазмы, проводимые с применением системы Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture Rapid Detection System (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA), основываются на технологии гибридизации нуклеиновых кислот. Тесты на эндотоксин провели с применением Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Plus assay (Bio Whittaker, Inc., Walkerville, MD). Клеточную культуру исследовали на эндотоксин во время сбора и до выпуска окончательного продукта. Приемлемый уровень эндотоксина составляет менее 5 EU/кг веса тела. Для дальнейшего анализа трансдуцированные и нетрансдуцированные дендритные клетки замораживали.
[0312] Предполагается, что все трансдуцированные клетки экспрессируют трансген. Также предполагается, что более 80% дендритных клеток подверглись удачной трансдукции. Продукт является биологически активным, так как нативные кодирующие последовательности сохранены в трансгене. Трансдуцированные вирусом дендритные клетки, введенные в опухоль, обладают фенотипом незрелых дендритных клеток и не вырабатывают интерлейкин-12 до созревания, поэтому на данном этапе экспрессия IL-12 происходит, в основном, с трансгена. Так как экспрессия трансгена IL-12 индуцируется низкомолекулярным активирующим препаратом RG-115932 в зависимом от дозы режиме, уровень экспрессии трансгена трансдуцированными дендритными клетками может быть контролирован и удержан на нужном уровне. Небольшая часть трансдуцированных дендритных клеток, приготовленных для введения человеку, может быть исследована in vitro на зависимую от активирующего препарата активацию экспрессии IL-12. Процедурой, в данном случае, может быть иммуноферментный анализ с уровнем чувствительности, равном 4 нг/мл.
[0313] In vivo модель опухоли мыши является сходной с исследованиями человека в том аспекте, что мышей, пораженных подкожной меланомой В16, лечили так же, как предложено в протоколе исследования на людях, а именно инъекцией трансдуцированных аденовирусом дендритных клеток и активацией трансгена IL-12 мыши. После выявления регресса опухоли, повторное инфицирование клетками такой же опухоли не привело к опухолевому росту, свидетельствуя о системном противоопухолевом иммунитете.
[0314] Предполагается, что активация выработки IL-12 in vitro клетками, трансдуцированными вектором, применяемым в предложенном исследовании, обеспечивает приблизительно 500 нг IL-12/10 клеток/24 часа, как определено иммуноферментным анализом. В преклинических исследованиях с применением модели меланомы мыши, внутриопухолевое введение 106 или более трансдуцированных дендритных клеток оказалось эффективным. Однако предполагается, что необходимая внутриопухолевая инъекция может быть эффективной при меньших количествах клеток, поэтому инъекции 5×107 трансдуцированных дендритных клеток могут быть взяты как начальная точка для определения, большие или меньшие количества трансдуцированных клеток будут необходимы.
[0315] Так, in vitro клеточные линии человека и мыши, а также первичные дендритные клетки, трансдуцированные рекомбинантным аденовирусным вектором, несущим гены IL-12, характеризовались активацией экспрессии интерлейкина-12 в ответ на действие активирующего препарата в зависимом от дозировки режиме.
[0316] Аденовирусная трансдукция дендритных клеток человека при различном множественном инфицировании MOI и при различной продолжительности вирусной адсорбции оказалась эффективной, когда процесс продолжался 3 часа, а значение множественного инфицирования MOI было равным 500. Активирующий препарат индуцировал экспрессию IL-12 в таких трансдуцированных дендритных клетках человека (Фигура 9).
[0317] В экспериментах in vivo на модели меланомы мыши, описанной выше, мышам C57/BL6 проводили подкожные инъекции клеток В16 для формирования опухоли. Внутриопухолевая инъекция дендритных клеток, трансдуцированных несущим гены IL-12 мыши под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS аденовирусным вектором, с последующим введением активирующего лиганда вызвала возникновение системного опухоль-специфического иммунитета. Лечение привело к регрессу опухоли. Повторное введение клеток В16 через 50 дней мышам, прошедшим терапию, показало, что клетки В16 не сформировали опухоль. Такого рода активация противоопухолевого иммунитета обусловливалась введением активирующего препарата и последующей экспрессии IL-12 трансдуцированными дендритными клетками. Активирующий препарат проявил эффект при введении как внутрибрюшинно, так и орально. См. Фигура 11 и Фигура 14.
6.3. Формы введения активирующего препарата
[0318] Активирующий препарат, в данном описании, может быть в любой из нижеперечисленных форм:
(1) 100% лабразол;
(2) Ароматизированный листерином лабразол (Latitude Pharmaceuticals Inc., USA), содержащий (a) ментол, (b) тимол, (c) эвкалиптол, (d) аспартам, (e) сахарин натрия, (f) лимонная кислота, (g) ароматизатор с запахом перечной мяты, (h) ароматизатор с запахом сливок, (i) лабразол;
(3) Миглиол 812 и фосфолипон 90G (Latitude Pharmaceuticals Inc., USA); или
(4) Миглиол 812, фосфолипон 90G и витамин Е токоферола полиэтиленгликоля сукцинат (Latitude Pharmaceuticals Inc., USA).
6.4. Введение
[0319] В то время, как можно предложить различные концентрации и специфические протоколы, один из вариантов лечения пациентов включает в себя внутриопухолевую(ые) инъекцию(ии) трансдуцированных аутологичных дендритных клеток (AdDCs) в концентрации 5×107, взвешенных в стерильном солевом растворе и модифицированных для экспрессии IL-12 человека (интерлейкина-12 человека) под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS, в комбинации с оральным введением активирующего препарата (RG-115932).
6.4.1. Первичное лечение
[0320] День 1. Осмотр стационарного больного: на 1 день проводят общее физическое обследование (включая жизненные параметры, вес и статус ECOG). Берут мочу и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). Приблизительно за 3 часа до внутриопухолевой инъекции in vitro модифицированных in vitro дендритных клеток, каждому пациенту вводят активирующий препарат (группа 1 - 0.01 мг/кг, 0.3 мг/кг, 1.0 мг/кг и 3 мг/кг) сразу после приема пищи. В 1 день, для оценки фармакокинетики единичной дозы активирующего препарата и его основных метаболитов, кровь берут с определенными временными интервалами (перед дозой активирующего препарата, через 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после введения дозы). Каждому субъекту делают единичную внутриопухолевую инъекцию 5×107 трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток, модифицированных для экспрессии IL-12 человека под контролем RheoSwitch® Therapeutic System RTS. За пациентами тщательно наблюдают на предмет возникновения локальных реакций в месте инъекции и/или реакций гиперчувствительности. Дни 2-14. Осмотр стационарного больного. Со 2 по 14 день каждому субъекту сразу после еды дают дозу активирующего препарата. Ежедневно, со 2 по 14 день протоколируются жизненные параметры и побочные реакции. На день 4±24 часа, у приблизительно половины пациентов берут биоптаты опухоли и/или дренирующих опухоль лимфоузлов для измерения уровня IL-12 человека и клеточной иммунной реакции. На 8 день проводят взвешивание. На день 8±24 часа, у пациентов, не прошедших биопсию на 4 день, берут биоптаты опухоли и/или дренирующих опухоль лимфоузлов для измерения уровня IL-12 человека и клеточной иммунной реакции. Для определения потенциональных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS на 4 день ± 24 часа и 8 день ± 24 берут анализы крови. Также, оценивают цитокиновый профиль сыворотки, чтобы выяснить, повлияло ли введение трансгена IL-12 на экспрессию других цитокинов. На 8 день, берут мочу и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). На 8 день, для оценки фармакокинетики/ADME (всасывания, распределения, метаболизма и выведения) активирующего препарата и его основных метаболитов в стационарной фазе, кровь берется с определенными временными интервалами (перед дозой активирующего препарата, через 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после введения дозы).
[0321] День 14. Осмотр стационарного больного: На 14 день каждый пациент получает дозу активирующего препарата сразу после приема пищи. Каждый субъект проходит физическое обследование (включая жизненные параметры, вес и статус ECOG). берется моча и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). Для определения потенциальных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RTS на 14 день ± 24 часа берут анализы крови. Также, оценивают цитокиновый профиль сыворотки, чтобы выяснить, изменилась ли экспрессия других цитокинов.
[0322] Во время определенных стационарных или амбулаторных осмотров пациенты сдают кровь для определения потенциональных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS. Также, оценивают цитокиновый профиль сыворотки. Для выявления гуморальной иммунной реакции на аденовирусный вектор, применяют блокирующий инфицирующую способность протокол AdVeGFP (Gambotto, Robins et al. 2004). Оценить реакцию антител на компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS можно, применяя вестерн блоттинг или иммуноферментный анализ сыворотки пациента и белков RheoSwitch® Therapeutic System RTS, синтезированных вектором экспрессии. Кроме того, для оценки уровня экспрессии IL- 12, интерферона-гамма, IP-10 и других цитокинов Th1/Th2, как IL-2, фактор некроза опухолей-альфа, IL-4, IL-5 и 1L-10, проводят мультиплексный иммуноанализ с помощью Luminex. Такие исследования антител и цитокинов потребуют около 10 мл крови.
[0323] Анализы на клеточную иммунную реакцию требуют около 50-60 мл крови, из которой выделяют субпопуляции CD4 и CD8 T-клеток. Выделенные T-клетки смешивают с аутологичными дендритными клетками, трансдуцированными пустым вектором AdV, векторами AdV-RTS или AdV-RTS-hIL12 в процедуре иммуноферментного спот-анализа (ELISPOT) для оценки синтеза интерферона-гамма T-клетками, активированными антигенами AdV-RTS, если таковые присутствуют. Подобные же анализы проводят с применением клеток опухоли и/или дендритных клеток, экспрессирующих перекрестно реагирующие антигены меланомы, для выявления раннего противоопухолевого ответа. При необходимости, проводят и другие дополнительные анализы.
[0324] На день 14±24 часа, при наличии доступной для исследования ткани, у всех пациентов берут биоптаты опухоли и/или дренирующих опухоль лимфоузлов для измерения IL-12 человека и клеточной иммунной реакции. Протоколируют побочные реакции. После окончания всех процедур, на 14 день все пациенты выписываются из стационара с просьбой придти на амбулаторный осмотр приблизительно через 3-4 недели.
[0325] Осмотр в целях раннего прекращения исследования: если пациент не может завершить фазу стационарного лечения, перед выпиской будут проведены процедуры ранней выписки. Каждый пациент проходит физическое обследование (включая жизненные параметры, вес и статус ECOG). Берут моча и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). Кровь берут для определения потенциальных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS, как описано выше. Также, кровь берут, чтобы выяснить, изменилась ли экспрессия других цитокинов, оценивают цитокиновый профиль сыворотки, как описано выше. При наличии доступной для исследования ткани, у всех пациентов берут биоптаты опухоли и/или дренирующих опухоль лимфоузлов для измерения уровня IL-12 человека и клеточной иммунной реакции. Протоколируются побочные реакции. После завершения всех процедур ранней терминации, каждый субъект выписывается из стационара с просьбой придти на амбулаторный осмотр через приблизительно 3-4 недели.
[0326] Месяц 1-4. Контрольные посещения: Во время контрольного периода в месяцы 1-4 протоколируют побочные эффекты. Во время посещений в месяцы 1, 2 и 3, пациент проходит физическое обследование (включая жизненные параметры, вес и статус ECOG), также берется моча и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). На 1 и 3 месяце кровь берут для определения потенциальных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS. Также, в 1 месяц кровь берется, чтобы выяснить, изменилась ли экспрессия других цитокинов, оценивают цитокиновый профиль сыворотки. Во время посещения в 1 месяц, при наличии доступной для исследования ткани, у всех пациентов берут биоптаты опухоли и/или дренирующих опухоль лимфоузлов для измерения уровня IL-12 человека и клеточной иммунной реакции. Сканирование позитронной эмиссионной компьютерной томографией СТ/РЕТ проводится на 2 и 4 месяце для оценки общего прогресса или регресса заболевания.
[0327] Месяц 5-6. Контрольные посещения: если на 3 или 4 месяц обнаружены проявления токсичности, связанной с приемом препаратов, на 5 и 6 месяц проводят контрольные посещения. В течение 5 и 6 месяца протоколируются побочные реакции. Состояние каждого пациента может контролироваться по телефону персоналом клиники в течение 5 месяца вплоть до амбулаторного осмотра на 6 месяц. Если токсичность, связанная с приемом препаратов, возникает или продолжается в течение 5 месяца и расценивается лечащим врачом как серьезная, нестабильная или для гарантии дальнейшей адекватной оценки состояния, персонал клиники не только контролирует состояние пациента по телефону, но и просит этого пациента придти в клинику. Во время посещения на 6 месяц, пациент проходит контрольное физическое обследование (включая жизненные параметры, вес и статус ECOG), также берут мочу и кровь для общего химического анализа сыворотки, анализа мочи и гематологического анализа (профиль безопасности). На 6 месяц кровь берут для определения потенциальных антител и клеточной иммунной реакции на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS. Сканирование позитронной эмиссионной космпьютерной томографией СТ/РЕТ проводится для оценки общего прогресса или регресса заболевания.
[0328] Критерии дозировки и прекращения приема активирующего препарата: Если определена лимитруемая дозой токсичность (DLT; т. е. степень токсичности превышает 3 у более 2 из 3 пациентов, взятых из группы 1, по версии 3 общих терминологических критериев побочных эффектов (СТСАЕ)), на данном уровне дозировки следующей группе из 3 пациентов активирующий препарат будет вводиться именно в этой дозировке. Если лимитируемая дозой токсичность DLT наблюдается у 1 или нескольких субъектов в группе повышенной дозировки, повышение дозы приостанавливается, и максимально переносимой дозой (MTD) считается следующая низшая доза, в противном случае повышение дозы возобновляется, пока не достигнет максимально переносимой дозы или максимальной дозы 10 мг/кг (что бы ни произошло раньше).
[0329] Безопасность, переносимость и трансгенная функция для всех пациентов в каждой группе оценивается в течение 1 месяца после инъекции AdDC до приема следующей более высокой дозы активирующего препарата.
[0330] Если степень токсичности у субъекта превышает 3 по СТСАЕ v3.0, и это вероятно, возможно или определенно связано с лечением согласно исследованию, прием активирующего препарата этим субъектом будет прекращен, и пациент будет направлен на процедуры ранней выписки.
[0331] Критерии завершения исследования: Если степень токсичности у более 70% субъектов в группе превышает 3 по СТСАЕ v3.0, и это возможно, вероятно или определенно связано с лечением согласно исследованию, прием активирующего препарата всеми пациентами будет прекращен, и все пациенты будут направлены на процедуры ранней выписки.
[0332] Исследуемый экспериментальный препарат: комбинация двух способов лечения, относящихся к исследованию, оценивается на безопасность, переносимость, функцию трансгена и иммунологические эффекты данного процесса. Субъектам с меланомой 3 или 4 стадии орально, в форме раствора ежедневно, единичными дозами 0.01 мг/кг, 0.1 мг/кг, 1.0 мг/кг and 10.0 мг/кг, в течение 14 дней последовательно вводится низкомолекулярный активирующий препарат в комбинации с единовременной внутриопухолевой инъекцией 5×107 трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток, модифицированных для экспрессии IL-12. Также, у субъектов есть возможность получить дополнительную внутриопухолевую инъекцию аутологичных дендритных клеток в комбинации с 14-дневным приемом активирующего препарата.
6.5. Взаимосвязь оценки безопасности и оценки функции трансгена и иммунологических эффектов
[0333] Клеточную культуру исследовали на эндотоксин во время сбора и до выпуска окончательного продукта. Приемлемый уровень эндотоксина составляет менее 5 EU/кг веса тела. Для дальнейшего анализа трансдуцированные и нетрансдуцированные дендритные клетки замораживали.
[0334] Оценка безопасности: безопасность единичной внутриопухолевой инъекции трансдуцированных аденовирусом аутологичных дендритных клеток в комбинации с орально принимаемым активирующим препаратом оценивается физическим осмотром, жизненными параметрами, химическим анализом сыворотки, анализом мочи, гематологическим анализом, нежелательными реакциями, а также гуморальной и клеточной иммунной реакцией на аденовирус и компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS в течение лечебного курса и последующих 12 месяцев. При наблюдении, женщинам, которые могут быть беременными, делают тесты на беременность. Во время наблюдения, а также в 0 день повторного лечения у субъектов берется список принимаемых лекарственных препаратов для выявления связи между принимаемыми лекарствами и потенциальными нежелательными реакциями. Примерное количество крови, равное 89 чайным ложкам (439 мл) берется у пациентов во время наблюдения и начальной фазы стационарного лечения (26 дней), помимо лейкофореза. Примерное количество крови, равное 75 чайным ложкам (370 мл) берется у пациентов во время фазы повторного стационарного лечения (26 дней, через 5-6 недель после начальной госпитализации), помимо лейкофореза. Примерное количество крови, равное 46 чайным ложкам (227 мл) берут у пациентов во время постамбулаторной фазы (1-6 месяцы).
[0335] Физическое обследование: Во время предусмотренных стационарных и амбулаторных осмотров проводят полное физическое обследование. Во время наблюдения также протоколируют историю болезни и демографические данные каждого пациента.
[0336] Жизненные параметры: В каждое запланированное физическое обследование включена оценка жизненных параметров, однако она проводится также и во время всех стационарных и амбулаторных обследований. К жизненным параметрам относят артериальной давление, пульс, температуру и характеристики дыхания. Во время предусмотренных обследований также измеряются рост и вес. Жизненные параметры (исключая рост и вес) протоколируются каждый час в течение первых двух, а затем каждые 8 часов после приема активирующего препарата.
[0337] Химический анализ крови: Во время каждого стационарного или амбулаторного приема, у каждого пациента не натощак берут произвольный образец крови и сыворотки. Проводится оценка следующих параметров: AST (аспартат аминотрансфераза), ALT (аланин аминотрансфераза), GGT (гаммаглутамил транспептидаза), LDH (лактат дегидрогеназа), LAP (лейцин аминопептидаза), щелочная фосфатаза, креатинин, общий билирубин, общий белок, альбумин, азот мочевины крови, общий холестерин, глюкоза и электролиты.
[0338] Анализ мочи: Во время каждого стационарного или амбулаторного приема, у каждого пациента берется произвольный образец средней струи мочи. Проводится оценка следующих параметров: описание цвета и вида, относительная плотность, рН, глюкоза, кетоновые тела, белок, количество эритроцитов и лейкоцитов и пиролурия.
[0339] Гематологический анализ: Во время каждого стационарного или амбулаторного приема, у каждого пациента не натощак берут произвольный образец крови. Проводится оценка следующих параметров: общий клинический анализ крови, включая количество лейкоцитов, дифференциальный подсчет лейкоцитов, подсчет эритроцитов, гематокрит, гемаглобин, индексы эритроцитов и подсчет тромбоцитов. Также, оцениваются активированное парциальное тромбопластиновое время и протромбиновое время.
[0340] Нежелательные реакции: Для оценки токсичности во время курса и в пост-лечебный 3-6 месячный период применяются общие номенклатурные критерии токсичтости и побочных явлений NCI (СТСАЕ версия 3). Побочный эффект - это любая реакция, эффект или другое нежелательное явление (признаки, симптомы, изменения в лабораторных показателях), связанные с применением тестируемого объекта (препарат, биопрепарат или прибор), имеющий отношение к тестируемому объекту или нет. Серьезный побочный эффект/явление - это любой побочный эффект или явление, вызывающий любое из ниже перечисленных последствий: смерть, угрожающее жизни состояние, врожденная аномалия, госпитализация или продление настоящей госпитализации, либо стойкое или серьезное увечье/нетрудоспособность. Важные связанные с лечение случаи/явления, которые не могут привести к смерти, угрожать жизни или вызвать необходимость госпитализации, могут быть рассмотрены как серьезные нежелательные реакции, если на основании соответствующего медицинского заключения, они могут подвергнуть опасности пациента или могут вызвать необходимость медицинского или хирургического вмешательства во избежание исходов, перечисленных в данном определении.
[0341] Опасность нежелательных реакций классифицируют следующим образом: I степени (легкая), 2 степени (средняя), 3 степень (тяжелая), 4 степени (угрожающая жизни или увечащая), 5 степени (вызвавшая смерть). Связь между нежелательной реакцией и терапией исследования определяется на основе клинического заключения и следующих определений: a) определенно связанная - это нежелательная реакция, следующая согласно логичной временной последовательности после применения терапии исследования, возникшая в соответствии с известной реакцией на терапию исследования и, в случае соответствия протоколу, подтверждается наступлением улучшения после прекращения применения терапии исследования (положительная отмена препарата) и повторным возникновением после возобновления лечения (положительное повторное назначение препарата), но при этом не может быть удовлетворительно объяснена известными характеристиками клинического состояния пациента или другой проводимой терапией, b) вероятная - это нежелательная реакция, следующая согласно временной последовательности после применения терапии исследования, возникшая в соответствии с известной реакцией на терапию исследования и, в случае соответствия протоколу, подтверждается наступлением улучшения после прекращения применения терапии исследования, но при этом не может быть удовлетворительно объяснена известными характеристиками клинического состояния пациента или другой проводимой терапией, c) Возможная - это нежелательная реакция, следующая согласно временной последовательности после применения терапии исследования, возникшая в соответствии с известной реакцией на терапию исследования, но может быть вызвана известными характеристиками клинического состояния пациента или другой проводимой терапией, d) Не связанная - это нежелательная реакция, о которой существует достаточно достоверной информации для утверждения, что ее этиология не связана с механизмом исследования. Две или более из ниже перечисленных переменных применимы к не связанной нежелательной реакции: 1) Нежелательная реакция не следует согласно временной последовательности после применения терапии исследования, 2) Нежелательная реакция легко объяснима клиническим состоянием пациента или другой проводимой терапией, 3) Нежелательная реакция не исчезает после уменьшения дозы или прекращения терапии (предполагая, что резонно ожидать исчезновения нежелательной реакции во время периода наблюдения).
[0342] Все наблюдаемые или подтвержденные нежелательные явления, возникшие после приема пациентов на лечение, протоколируются. Любое состояние, имевшее место при приеме и ухудшившееся, протоколируется как нежелательное явление. Нежелательные явления определяются на основании возникших симптомов и клиническом обследовании во время осмотров. Во время каждого стационарного или амбулаторного осмотра, пациентам задаются непрямые вопросы на предмет нежелательных действий, например: «Как вы себя чувствуете?» Изменения в лабораторных параметрах протоколируются как нежелательные явления, в случае если они сочтутся клинически важными, либо если они вызывают необходимость клинических изменений или действий, как, например, начать соответствующее лечение.
[0343] Потенциальная гуморальная или клеточная иммунная реакция на аденовирус и/или компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS:
Во время определенных стационарных или амбулаторных осмотров, у пациентов берется кровь для оценки потенциальной гуморальной или клеточной иммунной реакции на аденовирус, компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS и опухолевые антигены. Для выявления гуморального иммунного ответа на аденовирусный вектор применяется процедура блокирования инфицирующей способности AdVeGFP (Nwanegbo, et al. 2004). Реакция антител на компоненты RheoSwitch® Therapeutic System RTS оценивается вестерн блоттингом и/или иммуноферментным анализом сыворотки пациентов и белками RheoSwitch® Therapeutic System RTS, синтезированными вектором экспрессии. Кроме того, для оценки уровня IL-12, интерферона- гамма, IP-10 и других цитокинов Th1/Th2, как IL-2, фактор некроза опухолей-альфа, IL-4, IL-5 и IL-10, проводят мультиплексный иммуноанализ с помощью Luminex. На эти анализы цитокинов и антител требуется приблизительно 10 мл крови.
[0344] Анализы на клеточную иммунную реакцию требуют около 50-60 мл крови, из которой выделяют субпопуляции CD4 и CD8 Т-клеток. Выделенные T-клетки смешивают с аутологичными дендритными клетками, трансдуцированными пустым вектором AdV, векторами AdV-RTS или AdV-RTS-hlL12 в процедуре иммуноферментного спот-анализа (ELISPOT) для оценки синтеза интерферона-гамма T-клетками, активированными антигенами AdV-RTS, если таковые присутствуют. Подобные же анализы проводят с применением клеток опухоли и/или дендритных клеток, экспрессирующих перекрестнореагирующие антигены меланомы, для выявления раннего противоопухолевого ответа. При необходимости, проводят дополнительные анализы.
[0345] ТЕСТ НА БЕРЕМЕННОСТЬ: Женщины, способные выносить плод, проходят тест на беременность, сдавая пробу мочи, при наблюдении и перед первым стационарным осмотром на стадии повторного лечения. Тест проводится, по меньшей мере за 72, 48, 24 или 12 часов до приема активирующего препарата, во время как первичной, так и повторной терапии. Если тест мочи дает положительный результат, его подтверждают тестом сыворотки. В случае подтверждения беременности, пациентке не разрешается начинать курс терапии или повторной терапии. Тестирование на беременность может быть повторено столько раз, сколько необходимо.
[0346] ОПРОС О СОПУТСТВУЮЩЕМ ЛЕЧЕНИИ: Во время наблюдения и до первого осмотра на стадии повторной терапии, у каждого пациента запрашивается список принимаемых препаратов и проводимых процедур для определения любой возможной связи с нежелательными реакциями, возникающими во время курса терапии и стадии контроля.
[0347] КРИТЕРИИ ПОВТОРНОЙ ТЕРАПИИ: Если пациент перенес начальную прививку AdDC без ограничивающих нежелательных реакций, а также у него не было замечено прогрессирования заболевания или спада симптомов во время потенциального повторного лечения, может быть рассмотрен вопрос о повторной терапии. Если, по мнению руководителя исследования и лечащего врача, существует потенциальная клиническая польза в проведении дополнительной(ых) внутриопухолевой(ых) инъекции(ий) аутологичных дендритных клеток в комбинации с активирующим препаратом (максимально переносимая доза группы 1) в течение 14 последовательных дней, данному пациенту предлагают повторную терапию, при соответствии следующим критериям:
1. Не было выявлено лимитирующей токсичности,
2. Заболевание пациента устойчиво, либо нет клинических или субъективных признаков улучшения и
3. Не получено подтверждения гуморальной или клеточной иммунной реакции на аденовирусные компоненты RheoSwitch® Therapeutic System.
[0348] ОЦЕНКА ТРАНСГЕННОЙ ФУНКЦИИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ:
Для оценки in vivo трансгенной экспрессии интерлейкина-12 и клеточного иммунного ответа проводятся пункции и биопсии опухоли и дренирующих опухоль лимфоузлов во время наблюдения (дни - 12 - - 7), на 4, 8 и 14 дни курса терапии и на 1 месяце контрольного постстационарного периода. Биоптаты опухоли и инфильтрованных опухолью лимфоузлов берут с помощью аспирации тонкой иглой в дни -12 - -7 и день 14 периода повторной терапии для оценки in vivo трансгенной экспрессии интерлейкина-12 и клеточного иммунного ответа. Биоптаты исследуются микроскопически и иммуногистохимически для оценки клеточной инфильтрации Т-клеток в опухоль и дренирующие лимфоузлы. Срезы биоптатов исследуются патологом, не знающем о сущности объекта исследования. Чтобы различить эндогенную и индуцированную экспрессию интерлейкина-12 дендритными клетками в опухоли и инфильтрованных лимфатических узлах, применяется полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ОТ-ПЦР на РНК с соответственно приготовленными праймерами. Для оценки цитокинового профиля сыворотки, во время наблюдения, на 4, 8 и 14 день курса терапии, через месяц во время постстационарного периода наблюдения, и в - 12, - 7, 8 и 14 день повторной терапии у пациентов берется кровь на анализ. Цитокиновый профиль позволяет выяснить, повлияло ли введение трансгена IL-12 на экспрессию других цитокинов. Для оценки уровня 1L-12, интерферона-гамма, IP-10 и других цитокинов Th1/Th2, как IL-2, фактора некроза опухолей-альфа, IL-4, IL-5 и IL-10, проводят мультиплексный иммуноанализ с помощью Luminex. На эти анализы цитокинов и антител требуется приблизительно 10 мл крови.
[0349] ФАРМАКОКИНЕТИКА АКТИВИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА В СЛУЧАЕ ЕДИНИЧНОЙ ДОЗЫ И В СТАБИЛЬНОМ СОСТОЯНИИ:
Для оценки фармакокинетики/ADME (всасывания, распределения, метаболизма и выведения) единичной дозы, кровь берется в определенные временные фазы (перед приемом препарата, через 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после утреннего приема), для их оценки в стационарном состоянии кровь берется на 8 день курса терапии.
Для получения нижеперечисленных фармакокинетических предельных значений активирующего лиганда и его основных метаболитов в стационарном состоянии плазма исследуется высокоэффективной жидкостной хроматографией:
Cmax (максимальная отмеченная концентрация плазмы), Tmax (время выявления максимальной концентрации плазмы), Ctrough (минимальная отмеченная концентрация плазмы, вычисленная как среднее значение в интервале от 0 до 24 часов), C24h (концентрация плазмы при значении времени, равном 24 часам), AUC24h (площадь области под кривой зависимости концентрации плазмы от времени в интервале от 0 до 24 часов), Ke (наблюдаемая скорость элиминации) и T112 (наблюдаемое время полувыведения). Следует иметь в виду, что приведенные выше примеры являются исключительно иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом, а приведенные пункты охватывают все варианты реализации, описанные в деталях или теоретически осуществимые согласно изобретению.
ЛИТЕРАТУРА
Abdi K., et al. (2006). T-cell control of IL-12p75 production. Scand J Immunol 64: 83-92.
Adorini, L. (1999). Interleukin-12, a key cytokine in Till-mediated autoimmune diseases. Cell Mol Life Sci 55: 1610-25.
Adorini, L., (2001). Interleukin 12 and autoimmune diabetes. Nat Genet 27: 131-2.
Adorini, L., et al. (2002). Understanding autoimmune diabetes: insights from mouse models. Trends Mol Med 8: 31-8.
Adorini, L., et al. (1996). The role of IL-12 in the pathogenesis of Th1 cell-mediated autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci 795: 208-15.
Akhtar, N., et al. (2004). Interleukin-12 inhibits tumor growth in a novel angiogenesis canine hemangiosarcoma xenograft model. Neoplasia 6: 106-16.
Akiyama, Y., et al. (2000). Enhancement of antitumor immunity against B16 melanoma tumor using genetically modified dendritic cells to produce cytokines. Gene Ther 7: 2113-21.
Al-Mohanna, F., et al. (2002). IL-12-dependent nuclear factor-kappaB activation leads to de no vo synthesis and release of IL-8 and TNF-alpha in human neutrophils. J Leukoc Biol 72: 995-1002.
Aliberti, J.C., et al. (1996). Interleukin-12 mediates resistance to Trypanosoma cruzi in mice and is produced by murine macrophages in response to live trypomastigotes. Infect Immun 64: 1961-7.
Allavena, P., et al. (1994). Interleukin-12 is chemotactic for natural killer cells and stimulates their interaction with vascular endothelium. Blood 84: 2261-8.
AlIi, R.S. and Khar, A. (2004). Interleukin-12 secreted by mature dendritic cells mediates activation of NK cell function. FEBS Lett 559: 71-6.
Alzona, M., et al. (1996). Interleukin-12 activates interferon-gamma production by targeted activation of CD30+ T cells. Ann N Y Acad Sci 795: 127-36.
Amemiya, K., et al. (2006). Interleukin-12 induces a Th1-like response to Burkholderia mallei and limited protection in BALB/c mice. Vaccine 24: 1413-20.
Anderson, R.D., et al. (2000). Ad-RTS-hIL-1. A simple method for the rapid generation of recombinant adenovirus vectors. Gene Therapy, 4, 1034-1038.
Araujo, M.I., et al. (2001). Interleukin-12 promotes pathologic liver changes and death in mice coinfected with Schistosoma mansoni and Toxoplasma gondii. Infect Immun 69: 1454-62.
Arthur, F.F., et al. (1997). A comparison of gene transfer methods in human dendritic cells. Cancer Gene Therapy, 4, 17-25.
Arulanandam, B.P., et al. (1999). IL-12 is a potent neonatal vaccine adjuvant. Eur J Immunol 29: 256-64.
Athie, M.V., et al. (2000). IL-12 selectively regulates STAT4 via phosphatidylinositol 3-kinase and Ras-independent signal transduction pathways. Eur J Immunol 30: 1425-34.
Athie-Morales, V., et al. (2004). Sustained IL-12 signaling is required for Th1 development. J Immunol 172: 61-9.
Atkins, M.B., et al. (1999). High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol; 17: 2105-2116.
Atkins, M.B., et al. (1997). Phase I evaluation of intravenous recombinant human interleukin 12 in patients with advanced malignancies. Clin Cancer Res 3: 409-17.
Balch, СМ., et al. (2001). Final version of the American joint committee on cancer staging system for cutaneous melanoma. Journal of Clinical Oncology, 19: 3635-3648, 2001.
Berard, F., et al. (2000). Cross-priming of naive CD8 T cells against melanoma antigens using dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells. J Exp Med 192: 1535-44.
Bertagnolli, M.M., et al. (1992). IL-12 augments antigen-dependent proliferation of activated T lymphocytes. J Immunol 149: 3778-83.
Bhardwaj, N., et al. (1996). IL-12 in conjunction with dendritic cells enhances antiviral CD8+CTL responses in vitro. J CHn Invest 98: 715-22.
Biedermann, Т., et al. (2006). BL-12 instructs skin homing of human Th2 cells. J Immunol 111: 3763-70.
Brunda, MJ, and Gately, M.K. (1994). Antitumor activity of interleukin-12. Clin Immunol Immunopathol 71: 253-5.
Buchanan, J.M., et al. (1995). Interleukin 12 alters the isotype-restricted antibody response of mice to hen eggwhite lysozyme. Int Immunol 7: 1519-28.
Butterfield, L., et al. (2003). Determinant spreading associated with clinical response in dendritic cell-based immunotherapy for malignant melanoma. Clinical Cancer Research, 9, 998-1008.
Cella M., et al, (1999) Maturation, Activation, and Protection of Dendritic Cells Induced by Double stranded РНК. J. Exp. Med. 189, 821-829.
Chada, S., et al. (2003). Cytokine- and chemokine-based gene therapy for cancer. Curr Opin Mot Ther, 5: 463-474.
Faure, F., et al. (1998). Tumor-specific immune response: current in vitro analyses may not reflect the in vivo immune status. Crit Rev Immunol 18: 77-86.
Gambotto, Robins et al. 2004
Gilboa, E. (2007). DC-based Clinical Vaccines. J. Clinic. Invest. 117: 1195-1203.
Gogas, H., et al. (2006). Prognostic significance of autoimmunity during treatment of melanoma with interferon. New England Journal of Medicine, 354, 709-718.
Heinzerling, L., et al. (2005). Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy. Hum Gene Ther 16: 35-48.
Itoh, Т., et al. (1994). Partial purification of murine tumor-associated peptide epitopes common to histologically distinct tumors, melanoma and sarcoma, that are presented by H-2Kb molecules and recognized by CD8+tumor-infiltrating lymphocytes. J Immunol 153: 1202-15.
Kaka, K.S., et al. (2008). Using Dendritic Cell Maturation and IL-12 Producing Capacity as Markers of Functin; A Cautionay Tale. J. Immunother, 31 (4): 359.
Kalinski, P., et al. (2005). Natural killer-dendritic cell cross-talk in cancer immunotherapy. Expert Opinion Biological Therapy, 1303-1315.
Kang, W.K., et al. (2001). Interleukin 12 gene therapy of cancer by peritumoral injection of transduced autologous fibroblasts: outcome of a phase I study. Hum Gene Ther 12: 671-84.
Karzenowski, D., et al. (2005). Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity, robust expression, and reduced size. Biotechniques 39, 191-192.
Kikuchi, T. (2006). Genetically modified dendritic cells for therapeutic immunity. Journal of Experimental Medicine, 208, 1-8.
Kumar, P., and Katakam. A. (2007). RheoSwitch® System: a highly sensitive ecdysone receptor-based gene regulation system induced by synthetic small-molecule ligands. In Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA b Ed. Friedmann, T. and Rossi, J., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 643-651.
Liu, Y., et al. (2002). In situ adenoviral interleukin 12 gene transfer confers potent and long-lasting cytotoxic in glioma. Cancer Gene Therapy, 9, 9-15.
Mazzolini, G., et al. (2005). Intratumoral injection of dendritic cells engineered to secrete interleukin-12 by recombinant adenovirus in patients with metastic gastrointestinal carcinomas. Journal of Clinical Oncology, 23, 999-1010.
Murphy, A., et al. (2005). Gene modification strategies to induce tumor immunity. Immunity, 22, 409-414.
Nagayama, H., et al. (2000). IL-12 Responsiveness and Expression of IL-12 Receptor in Human Peripheral Blood Monocyte-derived Dendritic Cells. J. Immunol. 165: 59-66.
Nwanegbo E., et al. (2004). Prevalence of neutralizing antibodies to adenoviral serotypes 5 and 35 in the adult populations of The Gambia, South Africa, and the United States. Clinical Diagnostic Lab Immunology. March, 11(2), 351-357.
Palli, S.R., et al. (2003). Improved ecdysone receptor-based inducible gene regulation system. European Journal of Biochemistry, 270, 1308-1315.
Philpott, NJ., et al. (2004). Adenovirus-induced maturation of Dendritic Cells through a PI3 kinase-mediated TNF-alpha induction pathway. PNAS 101, 6200-6205.
Ranieri, E., et al. (1999). Dendritic cells transduced with an adenovirus vector encoding epstein-barr virus latent membrane protein 2B: a new modality for vaccination. Journal of Virology, 73, 10416-10425.
Ribas, A., et al. (2002). Cancer immunotherapy using gene-modified dendritic cells. Cancer Gene Therapy, 2, 57-78.
Romani, N., et al. (1994). Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. Journal of Experimental Medicine, 180, 83-93.
Romani L, et al. (1997). Interleukin-12 in infectious diseases. Clin Microbiol Rev 10: 611-36.
Rothe, H., et al. (1996). Interleukin-12 gene expression mediates the accelerating effect of cyclophosphamide in autoimmune disease. Ann N Y Acad Sci 795: 397-9.
Sangro, В., et al. (2004). Phase I trial of intratumoral injection of an adenovirus encoding interleukin-12 for advanced digestive tumors. J CHn Oncol 22: 1389-97.
Sangro, В., et al. (2005). Gene therapy of cancer based on interleukin 12. Curr Gene Ther 5: 573-81.
Satoh, Y., et al. (2002). Local administration of IL-12-transfected dendritic cells induces antitumor immune responses to colon adenocarcinoma in the liver in mice. J Exp Ther Oncol 2: 337-49.
Satoskar, A.R., et al. (2000). IL-12 gene-deficient C57BL/6 mice are susceptible to Leishmania donovani but have diminished hepatic immunopathology. Eur J Immunol 30: 834-9.
Schopf, L.R., et al. (1999). Interleukin-12 is capable of generating an antigen-specific Th1-type response in the presence of an ongoing infection-driven Th2-type response. Infect Immun ol: 2166-71.
Spatz, M., et al., (2000). Immune response to the Herpes Simplex Type I regulatory Proteins ICP8 and VP 16 in Infected Persons. J. Med. Virol. 62, 29-36.
Svane, I.M., et al. (1999). The role of cytotoxic T-lymphocytes in the prevention and immune surveillance of tumors-lessons from normal and immunodeficient mice. Med Oncol 16: 223-38.
Tang, H.L. and Cyster, J. G., (1999). Chemokine up-regulation and activated T cell attraction by maturing dendritic cells. Science, 284, 819-822.
Tatsumi, Т., et al. (2003). Intratumoral delivery of dendritic cells engineered to secrete both interleukin (IL)-12 and IL-18 effectively treats local and distant disease in association with broadly reactive TeI-type immunity. Cancer Res 63: 6378-86.
Thomas, G.R., et al. (2000). IL-12- and IL-2-induced tumor regression in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma is promoted by expression of the CD80 co-stimulatory molecule and interferon-gamma. Int J Cancer 86: 368-74.
Trinchieri, G. (2003). Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol 3: 133-46.
Triozzi, P.L., et al. (2005). Phase I study of the intratumoral administration of recombinant canarypox viruses expressing B7.1 and interleukin 12 in patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res 11: 4168-75.
Tsugawa, Т., et al. (2004). Sequential delivery of interferon-gene and DCs to intracranial gliomas promotes an effective anti-tumor response. Gene Therapy, 11, 1551-1558.
Tsung, K., et al. (1997). IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response. J Immunol 158: 3359-65.
Vujanovic, L., et al. (2006). IL-12p70 and IL-18 gene-modified dendritic cells loaded with tumor antigen-derived peptides о recombinant protein effectively stimulate specific Type-1 CD4(+) T-cell responses from normal donors and melanoma patients in vitro. Cancer Gene Therapy, 13, 798-805.
Wigginton, J.M. and Wiltrout, R.H. (2002). IL-12/IL-2 combination cytokine therapy for solid tumours: translation from bench to bedside. Expert Opin Biol Ther, 2: 513-524.
Wolf, S.F., et al. (1994). Interleukin 12: a key modulator of immune function. Stem Cells 12: 154-68.
Yamanaka, R., et al. (2002). Marked enhancement of antitumor immune responses in mouse brain tumor models by genetically modified dendritic cells producing Semliki Forest virus-mediated interleukin-12. J Neurosurg 97: 611-8.
Yuminamochi, E., et al. (2007). Interleukin-12- and interferon-gamma-mediated natural killer cell activation by Agaricus blazei Murill. Immunology.
Claims (46)
1. Модифицированная in vitro дендритная клетка, содержащая вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, при этом указанный переключатель гена содержит:
(1) первую последовательность транскрипционного фактора и необязательно вторую последовательность транскрипционного фактора, причем каждая из указанных последовательностей транскрипционных факторов кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, содержащий лиганд-связывающий домен рецептора экдизона, и функционально связана с промотором, и
(2) полинуклеотид, кодирующий полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, и который обладает функцией интерлейкина-12, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором,
причем внутриопухолевое введение указанной модифицированной in vitro дендритной клетки млекопитающему, имеющему опухоль, и первое введение указанному млекопитающему лиганда менее чем через 48 часов после введения указанной модифицированной in vitro дендритной клетки обеспечивает значительное уменьшение размера указанной опухоли у указанного млекопитающего.
2. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор.
3. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержит первую последовательность транскрипционного фактора и вторую последовательность транскрипционного фактора под контролем промотора, причем белки, кодируемые указанной первой последовательностью транскрипционного фактора и указанной второй последовательностью транскрипционного фактора, взаимодействуют с образованием белкового комплекса, функционирующего в качестве лиганд-зависимого транскрипционного фактора.
4. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 3, отличающаяся тем, что указанный первый транскрипционный фактор и указанный второй транскрипционный фактор соединены участком внутреннего сайта посадки рибосомы.
5. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержит первую последовательность транскрипционного фактора под контролем первого промотора и вторую последовательность транскрипционного фактора под контролем второго промотора, причем белки, кодируемые указанной первой последовательностью транскрипционного фактора и указанной второй последовательностью транскрипционного фактора, взаимодействуют с образованием белкового комплекса, который функционирует как лиганд-зависимый транскрипционный фактор.
6. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный вектор дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий интерферон-альфа, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
7. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная опухоль представляет собой раковую опухоль молочной железы.
8. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная опухоль представляет собой меланому.
9. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное введение лиганда осуществляют менее чем за один час до введения указанной модифицированной in vitro дендритной клетки или после введения указанной модифицированной in vitro дендритной клетки.
10. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное введение лиганда осуществляют менее чем через 24 часа после введения указанной модифицированной in vitro дендритной клетки.
11. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная дендритная клетка представляет собой дендритную клетку человека.
12. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная дендритная клетка представляет собой аутологичную дендритную клетку.
13. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная дендритная клетка представляет собой дендритную клетку костного мозга.
14. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
15. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный вектор представляет собой rAD.RheoIL12.
16. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный лиганд-связывающий домен рецептора экдизона содержит мутацию в виде замены.
17. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный лиганд-связывающий домен рецептора экдизона представляет собой лиганд-связывающий домен рецептора экдизона Choristoneura fumiferana.
18. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная полинуклеотидная последовательность, кодирующая переключатель гена, содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую лиганд-связывающий домен ретиноидного X-рецептора (RXR).
19. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный лиганд-связывающий домен рецептора RXR выбран из группы, состоящей из лиганд-связывающего домена рецептора RXR позвоночных, лиганд-связывающего домена рецептора RXR беспозвоночных и химерного лиганд-связывающего домена рецептора RXR.
20. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный лиганд-связывающий домен рецептора RXR позвоночных представляет собой лиганд-связывающий домен рецептора RXR человека.
21. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный лиганд представляет собой диацилгидразин.
22. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, по меньшей мере на 90% идентичен последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа.
23. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, по меньшей мере на 95% идентичен последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа.
24. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, по меньшей мере на 99% идентичен последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа.
25. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанный полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, представляет собой человеческий интерлейкин 12.
26. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное введение лиганда осуществляют ежедневно в течение периода по меньшей мере от 5 до 28 дней.
27. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное введение лиганда указанному млекопитающему осуществляют ежедневно в течение периода по меньшей мере 14 дней.
28. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное млекопитающее представляет собой человека.
29. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанную модифицированную in vitro дендритную клетку обнаруживают в указанной опухоли через 72 часа после введения указанному млекопитающему популяции модифицированных in vitro дендритных клеток и указанного лиганда.
30. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что введение указанного лиганда указанному млекопитающему осуществляют перорально.
31. Модифицированная in vitro дендритная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанное млекопитающее представляет собой человека;
причем указанная модифицированная in vitro дендритная клетка является аутологичной дендритной клеткой костного мозга человека;
при этом указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор;
при этом указанный полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, содержит: (1) последовательность первого транскрипционного фактора, кодирующего VP-16 трансактивационный домен и химерный лиганд-связывающий домен рецептора RXR, (2) IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV) и (3) последовательность второго транскрипционного фактора, кодирующую ДНК-связывающий домен GAL4 и лиганд-связывающий домен Choristoneura fumiferana, содержащий мутацию в виде замены;
при этом указанный интерлейкин-12 содержит субъединицу р40 человеческого интерлейкина-12 и субъединицу р35 человеческого интерлейкина-12;
при этом указанный лиганд представляет собой диацилгидразин, который вводят один раз в день в течение 14 дней подряд, начиная с того дня, в который осуществляют введение указанных модифицированных in vitro дендритных клеток.
32. Способ получения модифицированной in vitro дендритной клетки по п. 1, включающий модифицирование дендритной клетки путем введения в указанную дендритную клетку вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий переключатель гена, при этом указанный переключатель гена содержит:
(1) первую последовательность транскрипционного фактора и необязательно вторую последовательность транскрипционного фактора, причем каждая из указанных последовательностей транскрипционных факторов кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, содержащий лиганд-связывающий домен рецептора экдизона, и функционально связана с промотором, и
(2) полинуклеотид, кодирующий полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептидной последовательности человеческого интерлейкина-12 дикого типа, и который обладает функцией интерлейкина-12, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.
33. Фармацевтическая композиция для регулируемой экспрессии полипептида, обладающего функцией интерлейкина-12, причем указанный полипептид регулируемо экспрессируется после введения эффективного количества активирующего лиганда, содержащая эффективное количество модифицированных in vitro дендритных клеток по п. 1.
34. Применение популяции модифицированных in vitro дендритных клеток по п. 1 для ингибирования роста опухоли у млекопитающего, где указанные клетки предназначены для введения млекопитающему с опухолью.
35. Набор для регулируемой экспрессии полипептида, обладающего функцией интерлейкина-12, содержащий модифицированную in vitro дендритную клетку по п. 1 и активирующий лиганд.
36. Применение модифицированных in vitro дендритных клеток по п. 1 для получения лекарственного средства для индуцирования регулируемой экспрессии полипептида, по меньшей мере на 85% идентичного человеческому интерлейкину-12 дикого типа, в дендритных клетках.
Applications Claiming Priority (18)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US97839407P | 2007-10-08 | 2007-10-08 | |
US97822407P | 2007-10-08 | 2007-10-08 | |
US60/978,394 | 2007-10-08 | ||
US60/978,224 | 2007-10-08 | ||
US97850907P | 2007-10-09 | 2007-10-09 | |
US60/978,509 | 2007-10-09 | ||
US97948007P | 2007-10-12 | 2007-10-12 | |
US97948507P | 2007-10-12 | 2007-10-12 | |
US60/979,485 | 2007-10-12 | ||
US60/979,480 | 2007-10-12 | ||
US99016707P | 2007-11-26 | 2007-11-26 | |
US60/990,167 | 2007-11-26 | ||
US99068907P | 2007-11-28 | 2007-11-28 | |
US60/990,689 | 2007-11-28 | ||
US99180707P | 2007-12-03 | 2007-12-03 | |
US60/991,807 | 2007-12-03 | ||
US1908908P | 2008-01-04 | 2008-01-04 | |
US61/019,089 | 2008-01-04 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010118428/10A Division RU2484132C2 (ru) | 2007-10-08 | 2008-10-08 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017146770A Division RU2711606C2 (ru) | 2007-10-08 | 2017-12-28 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013106702A RU2013106702A (ru) | 2014-08-20 |
RU2644210C2 true RU2644210C2 (ru) | 2018-02-08 |
Family
ID=40549463
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010118428/10A RU2484132C2 (ru) | 2007-10-08 | 2008-10-08 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
RU2013106702A RU2644210C2 (ru) | 2007-10-08 | 2013-02-15 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
RU2017146770A RU2711606C2 (ru) | 2007-10-08 | 2017-12-28 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010118428/10A RU2484132C2 (ru) | 2007-10-08 | 2008-10-08 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017146770A RU2711606C2 (ru) | 2007-10-08 | 2017-12-28 | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20090123441A1 (ru) |
EP (2) | EP2674483B1 (ru) |
JP (3) | JP2010539993A (ru) |
KR (3) | KR101740205B1 (ru) |
CN (1) | CN101883845B (ru) |
AU (1) | AU2008311292B9 (ru) |
BR (1) | BRPI0818287A2 (ru) |
CA (1) | CA2702058A1 (ru) |
ES (2) | ES2636460T3 (ru) |
HK (1) | HK1146300A1 (ru) |
HU (2) | HUE024479T2 (ru) |
IL (1) | IL204841A (ru) |
MX (1) | MX2010003720A (ru) |
NZ (1) | NZ585190A (ru) |
RU (3) | RU2484132C2 (ru) |
WO (1) | WO2009048560A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201003163B (ru) |
Families Citing this family (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20100049084A (ko) * | 2007-08-23 | 2010-05-11 | 인트렉손 코포레이션 | 질병 진단을 위한 방법 및 조성물 |
NZ584848A (en) | 2007-09-28 | 2012-09-28 | Intrexon Corp | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
MX2010003720A (es) * | 2007-10-08 | 2010-10-20 | Intrexon Corp | Celulas dendriticas creadas por ingenieria genetica y usos para el tratamiento de cancer. |
WO2010042189A2 (en) | 2008-10-08 | 2010-04-15 | Intrexon Corporation | Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof |
WO2011098516A1 (en) * | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Immunicum Ab | Improved composition for inhibiting tumor cell proliferation |
TW201823463A (zh) * | 2010-03-23 | 2018-07-01 | 美商英翠克頌公司 | 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途 |
EP2555627A4 (en) * | 2010-04-06 | 2013-10-23 | John W Holaday | METHOD FOR TREATING CARCINOMA |
CN102026031B (zh) * | 2010-12-28 | 2013-09-04 | 张朝晖 | 一种机顶盒 |
CN102174479B (zh) * | 2011-03-02 | 2013-04-03 | 北京锤特生物科技有限公司 | 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用 |
EP3450568A3 (en) * | 2011-03-04 | 2019-04-24 | Intrexon Corporation | Vectors conditionally expressing protein |
CA2848222C (en) | 2011-09-08 | 2020-06-16 | Intrexon Corporation | Crystalline diacylhydrazine and the use thereof |
JP6489353B2 (ja) * | 2011-10-11 | 2019-03-27 | ウニヴェルズィテート チューリッヒ | 腫瘍療法のためのil−12とt細胞阻害分子遮断薬とを含む医薬組成物 |
US11951157B2 (en) | 2011-10-11 | 2024-04-09 | Universitat Zurich | Methods of treating malignant tumour with IL-12 and anti-PD-1 antibody |
WO2013148649A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Use of survivin antagonists in polyomavirus-related disease |
WO2016022630A1 (en) * | 2014-08-05 | 2016-02-11 | Jiping Zha | Anti-pd-l1 antibodies |
WO2016050721A1 (en) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | Intervet International B.V. | Pd-l1 antibodies binding canine pd-l1 |
US20190062394A1 (en) | 2015-10-10 | 2019-02-28 | Intrexon Corporation | Improved Therapeutic Control of Proteolytically Sensitive, Destabilized Forms of Interleukin-12 |
KR20180069081A (ko) | 2015-11-11 | 2018-06-22 | 인트렉손 코포레이션 | 심장 이상 및 기타 병리 이상의 치료를 위한 복수의 생물학적으로 활성화된 폴리펩티드를 단일 벡터로부터 발현하기 위한 조성물 및 방법 |
AU2017279548B2 (en) | 2016-06-08 | 2024-08-08 | Precigen, Inc. | CD33 specific chimeric antigen receptors |
UY37343A (es) | 2016-07-25 | 2018-02-28 | Intrexon Corp | Control del fenotipo en plantas |
CA3049652A1 (en) | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Intrexon Corporation | Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems |
US11753619B2 (en) | 2017-02-02 | 2023-09-12 | The Scripps Research Institute | Engineered cells and methods of use |
EP3583113A4 (en) * | 2017-02-17 | 2020-08-26 | George Todaro | USE OF TGF-ALPHA FOR TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS |
RU2645957C1 (ru) * | 2017-04-10 | 2018-02-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения лучевых повреждений мочевого пузыря |
KR20230115343A (ko) | 2017-06-07 | 2023-08-02 | 프레시전 인코포레이티드 | 신규의 세포 태그의 발현 |
RU2663468C1 (ru) * | 2017-09-25 | 2018-08-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы |
CN112135622A (zh) | 2018-03-06 | 2020-12-25 | 普莱西根股份有限公司 | 乙型肝炎疫苗及其用途 |
AU2019288277A1 (en) * | 2018-06-19 | 2021-01-28 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Oncolytic virus or antigen presenting cell mediated cancer therapy using type I interferon and CD40-ligand |
CN113226337A (zh) * | 2018-06-27 | 2021-08-06 | 普莱西根股份有限公司 | 治疗癌症的体内受控联合疗法 |
WO2020180424A1 (en) | 2019-03-04 | 2020-09-10 | Iocurrents, Inc. | Data compression and communication using machine learning |
WO2020206056A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Greenvenus Llc | Peptides and methods of plant protection |
CN110804594B (zh) * | 2019-11-21 | 2020-11-20 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用 |
US20230399370A1 (en) * | 2019-11-22 | 2023-12-14 | Alaunos Therapeutics, Inc. | Methods of treating glioblastoma |
IL310868A (en) * | 2021-08-16 | 2024-04-01 | Univ Yale | Variants of interleukin-12 and methods of their use |
CN114480280B (zh) * | 2022-03-02 | 2023-09-29 | 中国科学院理化技术研究所 | 烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2192263C2 (ru) * | 2000-08-17 | 2002-11-10 | Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова | Способ лечения злокачественных опухолей головного мозга |
US20050191659A1 (en) * | 1998-05-05 | 2005-09-01 | Richard Voellmy | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
Family Cites Families (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5117057A (en) | 1985-10-21 | 1992-05-26 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines |
US4985461A (en) | 1985-10-21 | 1991-01-15 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines |
FR2593630B1 (fr) | 1986-01-27 | 1988-03-18 | Maurice Francois | Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran |
US5225443A (en) * | 1986-05-01 | 1993-07-06 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines |
US4981784A (en) | 1987-12-02 | 1991-01-01 | The Salk Institute For Biological Studies | Retinoic acid receptor method |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5693622A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5399346A (en) * | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
CA2043775A1 (en) | 1990-06-14 | 1991-12-15 | Dat P. Le | Dibenzoylakylcyanohydrazines |
IL100643A (en) | 1991-01-25 | 1996-10-31 | Nippon Kayaku Kk | History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient |
US5530028A (en) * | 1992-11-23 | 1996-06-25 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines |
US6013836A (en) * | 1992-02-28 | 2000-01-11 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines |
US5814618A (en) * | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
US5834441A (en) * | 1993-09-13 | 1998-11-10 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto |
US6652850B1 (en) * | 1993-09-13 | 2003-11-25 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity |
WO1995014091A2 (en) * | 1993-11-18 | 1995-05-26 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for utilizing conditionally lethal genes |
FR2714830B1 (fr) | 1994-01-10 | 1996-03-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
US5573764A (en) * | 1994-01-21 | 1996-11-12 | Genetics Institute, Inc. | Use of interleukin-12 to prevent graft versus host disease |
FR2715847B1 (fr) | 1994-02-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
FR2727679B1 (fr) | 1994-12-05 | 1997-01-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
US6306649B1 (en) * | 1995-06-27 | 2001-10-23 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Heterologous transcription factors |
US7176186B1 (en) * | 1997-09-16 | 2007-02-13 | The University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization |
US6734014B1 (en) | 1996-02-08 | 2004-05-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells |
US6723531B2 (en) * | 1996-04-05 | 2004-04-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
US5922685A (en) * | 1996-06-05 | 1999-07-13 | Powderject Vaccines, Inc. | IL-12 gene therapy of tumors |
PL187846B1 (pl) * | 1996-06-14 | 2004-10-29 | Bayer Ag | Agoniści interleukiny-4 wybiórczy dla limfocytów T |
CA2269642A1 (en) * | 1996-10-29 | 1998-05-07 | Valentis, Inc. | Modified glucocorticoid receptors, glucocorticoid receptors/progesterone receptors hybrids |
DE69737107T2 (de) * | 1996-11-20 | 2007-07-12 | Introgen Therapeutics Inc., Austin | Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren |
US5972986A (en) * | 1997-10-14 | 1999-10-26 | G.D. Searle & Co. | Method of using cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment and prevention of neoplasia |
US6899870B1 (en) * | 1998-03-11 | 2005-05-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery |
US6342596B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-01-29 | Hsf Pharmaceuticals S.A. | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
US6333318B1 (en) | 1998-05-14 | 2001-12-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
US6258603B1 (en) * | 1998-06-17 | 2001-07-10 | Rohm And Haas Company | Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
EP1113821A1 (en) * | 1998-09-15 | 2001-07-11 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | In situ injection of antigen-presenting cells with genetically enhanced cytokine expression |
IL146382A0 (en) * | 1999-05-13 | 2002-07-25 | American Cyanamid Co | Adjuvant combination formulations |
US6630324B1 (en) * | 1999-07-29 | 2003-10-07 | Baylor College Of Medicine | Aldehyde reductase bidirectional promoter and its use |
US6774226B1 (en) * | 1999-11-30 | 2004-08-10 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof |
US20040033600A1 (en) | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
CN1304578C (zh) | 2000-03-22 | 2007-03-14 | 罗姆和哈斯公司 | 新的基于蜕皮激素受体的可诱导的基因表达系统 |
US20020119193A1 (en) * | 2000-08-18 | 2002-08-29 | Le Trang T. | Oral fast-melt formulation of a cyclooxygenase-2 inhibitor |
US8105825B2 (en) * | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
EP1373470B1 (en) * | 2001-02-20 | 2013-04-24 | Intrexon Corporation | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
JP4955904B2 (ja) | 2001-02-20 | 2012-06-20 | イントレキソン コーポレーション | 新規エクジソン受容体/無脊椎動物レチノイドx受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システム |
CA2438119C (en) * | 2001-02-20 | 2014-12-16 | Rheogene Holdings, Inc. | Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
ES2390070T3 (es) | 2001-02-20 | 2012-11-06 | Intrexon Corporation | Nuevos receptores mutantes de sustitución y su uso en un sistema de expresión génica inducible basado en receptores nucleares |
CA2349506C (en) * | 2001-06-14 | 2009-12-08 | Duke University | A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia |
US7375093B2 (en) * | 2002-07-05 | 2008-05-20 | Intrexon Corporation | Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US20080050808A1 (en) * | 2002-10-09 | 2008-02-28 | Reed Thomas D | DNA modular cloning vector plasmids and methods for their use |
US7785871B2 (en) | 2002-10-09 | 2010-08-31 | Intrexon Corporation | DNA cloning vector plasmids and methods for their use |
CA2505403A1 (en) * | 2002-11-07 | 2004-05-27 | Lung-Ji Chang | Modified dendritic cells |
GB0228465D0 (en) * | 2002-12-06 | 2003-01-08 | Univ Belfast | A method of treating disease |
US7304161B2 (en) | 2003-02-10 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex |
US7304162B2 (en) | 2003-02-21 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US7456315B2 (en) | 2003-02-28 | 2008-11-25 | Intrexon Corporation | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
WO2005044881A1 (ja) * | 2003-11-07 | 2005-05-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 核酸分子送達用担体 |
US20050130306A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-16 | Richard Voellmy | Viral vectors whose replication and, optionally, passenger gene are controlled by a gene switch activated by heat in the presence or absence of a small molecule regulator |
US7935510B2 (en) * | 2004-04-30 | 2011-05-03 | Intrexon Corporation | Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
WO2005116231A1 (en) | 2004-05-18 | 2005-12-08 | Intrexon Corporation | Methods for dynamic vector assembly of dna cloning vector plasmids |
US9034650B2 (en) | 2005-02-02 | 2015-05-19 | Intrexon Corporation | Site-specific serine recombinases and methods of their use |
US7833754B2 (en) * | 2006-01-13 | 2010-11-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | IL-12 for expression in mammalian cell |
CA2689137C (en) * | 2007-05-29 | 2017-05-02 | Intrexon Corporation | Chiral diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
NZ584848A (en) * | 2007-09-28 | 2012-09-28 | Intrexon Corp | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
MX2010003720A (es) * | 2007-10-08 | 2010-10-20 | Intrexon Corp | Celulas dendriticas creadas por ingenieria genetica y usos para el tratamiento de cancer. |
-
2008
- 2008-10-08 MX MX2010003720A patent/MX2010003720A/es active IP Right Grant
- 2008-10-08 KR KR1020167010116A patent/KR101740205B1/ko active IP Right Grant
- 2008-10-08 ES ES13175597.7T patent/ES2636460T3/es active Active
- 2008-10-08 CA CA2702058A patent/CA2702058A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-08 ES ES08836827.9T patent/ES2531522T3/es active Active
- 2008-10-08 BR BRPI0818287A patent/BRPI0818287A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-10-08 US US12/247,738 patent/US20090123441A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-08 JP JP2010528876A patent/JP2010539993A/ja not_active Withdrawn
- 2008-10-08 KR KR1020107010283A patent/KR101655487B1/ko active IP Right Grant
- 2008-10-08 CN CN200880119203.5A patent/CN101883845B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-08 HU HUE08836827A patent/HUE024479T2/en unknown
- 2008-10-08 KR KR1020177013507A patent/KR101932027B1/ko active IP Right Grant
- 2008-10-08 HU HUE13175597A patent/HUE035406T2/en unknown
- 2008-10-08 EP EP13175597.7A patent/EP2674483B1/en active Active
- 2008-10-08 RU RU2010118428/10A patent/RU2484132C2/ru active
- 2008-10-08 EP EP08836827.9A patent/EP2207874B1/en active Active
- 2008-10-08 NZ NZ585190A patent/NZ585190A/xx unknown
- 2008-10-08 AU AU2008311292A patent/AU2008311292B9/en not_active Ceased
- 2008-10-08 WO PCT/US2008/011563 patent/WO2009048560A1/en active Application Filing
-
2010
- 2010-04-06 IL IL204841A patent/IL204841A/en active IP Right Grant
- 2010-05-05 ZA ZA2010/03163A patent/ZA201003163B/en unknown
-
2011
- 2011-01-19 HK HK11100527.9A patent/HK1146300A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2011-09-01 US US13/224,091 patent/US20120114620A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-01-09 US US13/737,316 patent/US9675642B2/en active Active
- 2013-02-15 RU RU2013106702A patent/RU2644210C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-12-10 JP JP2014250257A patent/JP5934776B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-01-13 JP JP2016004584A patent/JP6290270B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-05-10 US US15/591,468 patent/US20170312315A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-28 RU RU2017146770A patent/RU2711606C2/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050191659A1 (en) * | 1998-05-05 | 2005-09-01 | Richard Voellmy | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
RU2192263C2 (ru) * | 2000-08-17 | 2002-11-10 | Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова | Способ лечения злокачественных опухолей головного мозга |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KARZENOWSKI D., Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity, robust expression, and reduced size, Biotechniques, 2005, v.39, is.2, p:191-196. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2644210C2 (ru) | Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей | |
US10046049B2 (en) | Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201009 |