DE69737107T2 - Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Zellkultur und Virusherstellung. Insbesondere betrifft sie verbesserte Verfahren zum Kultivieren von Säugetierzellen, zur Infektion von solchen Zellen mit Adenoviren und die Herstellung von infektiösen Adenovirus-Partikeln daraus.
  • 2. Beschreibung des damit in Zusammenhang stehenden Standes der Technik
  • Adenovirale Vektoren, die therapeutische Proteine exprimieren, werden gegenwärtig im klinischen Bereich für die Behandlung von verschiedenen Krebsindikationen, einschließlich Lungen- und Kopf- und Halskrebserkrankungen, ausgewertet. Während die klinischen Studien voranschreiten, nimmt der Bedarf an adenoviralen Vektoren von klinischer Qualität dramatisch zu. Der projizierte jährliche Bedarf für eine klinische Studie an 300 Patienten könnte ungefähr 6 × 1014 PFU erreichen.
  • Traditionell werden Adenoviren in kommerziell erhältlichen Gewebekulturflaschen oder „Cellfactories" hergestellt. Virusinifizierte Zellen werden geerntet und eingefroren und wieder aufgetaut, um die Viren aus den Zellen in Form von rohem Zelllysat freizusetzen. Das hergestellte rohe Zelllysat (CCL) wird dann durch doppelte CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt. Die typischerweise berichtete Virusausbeute aus 100 Einzelschalen-„Cellfactories" beträgt ungefähr 6 × 1012 PFU. Es wird eindeutig undurchführbar, die benötigte Virusmenge unter Verwendung dieses traditionellen Verfahrens herzustellen. Es müssen neue maßstabsmäßig veränderbare und validierbare Herstellungs- und Reinigungsverfahren entwickelt werden, um den steigenden Bedarf zu befriedigen.
  • Der Reinigungsdurchsatz der CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation ist so beschränkt, dass diese den Bedarf an adenoviralen Vektoren für Gentherapie-Anwendungen nicht befriedigen kann. Um eine Herstellung von adenoviralen Vektoren in großem Maßstab zu erzielen, müssen dementsprechend andere Reinigungsverfahren als die CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation entwickelt werden. Berichte über die chromatographische Reinigung von Viren sind trotz der weitverbreiteten Anwendung von Chromatographie für die Reinigung von rekombinanten Proteinen stark begrenzt. Größenausschluss-, Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie sind für die Reinigung von Retroviren, Enzephalitis-Viren aus Zecken und Pflanzenviren mit variierenden Erfolgsgraden ausgewertet worden (Crooks et al., 1990; Aboud et al., 1982; McGrath et al., 1978; Smith und Lee, 1978; O'Neil und Balkovic, 1993). Sogar noch weniger Forschung erfolgte an der chromatographischen Reinigung von Adenoviren. Dieses Fehlen an Forschungsaktivität kann teilweise der Existenz des effektiven, jedoch nicht maßstäblich vergrößerbaren CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugationsreinigungsverfahrens für Adenoviren zuschreibbar sein.
  • Unlängst berichteten Huyghe et al. (1996), siehe auch WO 96/27677, über die Reinigung von adenoviralen Vektoren unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie in Verbindung mit Metallchelat-Affinitätschromatographie. Es wurde über eine Virusreinheit ähnlich zu jener aus einer CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation berichtet. Unglücklicherweise wurden nur 23% der Viren nach dem doppelten Säulenreinigungsverfahren zurückgewonnen. Verfahrensfaktoren, die zu dieser geringen Virusrückgewinnung beitragen, sind der Einfrier/Auftau-Schritt, der durch die Autoren eingesetzt wird, um Zellen zu lysieren, um das Virus aus den Zellen freizusetzen, und die zwei Säulen-Reinigungsprozedur.
  • Nadeau, J. (1996), Biotechnology and Bioengineering, 51, 613–623, und Garnier, A. (1994), Cytotechnology, 15, 145–155 betreffen eine Verbesserung der Herstellung von rekombinanten Proteinen mit dem humanes Adenovirus/293S-Expressionssystem bzw. eine maßstäbliche Vergrößerung des Adenovirus-Expressionssystems für die Herstellung von rekombinantem Protein in menschlichen 293S-Zellen.
  • Graham, F.L., und Prevec, L. (1991), Methods in Molecular Biology, Band 7: Gene Transfer and Expression Protocols, herausgegeben von: E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, NJ, Kapitel 11, S. 109–128 offenbaren die Propagierung, Titration und Reinigung von Adenovirus-Vektoren unter Verwendung einer gefrorenen rohen Virus-Stammlösung, die mit Natriumdesoxycholat und mittels Cäsiumchlorid-Bandenbindung behandelt wird.
  • Es gibt eindeutig einen Bedarf an einem wirksamen und maßstäblich vergrößerbaren Verfahren zur Herstellung von adenoviralen Vektoren, das eine hohe Produktausbeute ergeben wird, um den ständig steigenden Bedarf an solchen Produkten zu befriedigen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Adenoviren, wie in den Ansprüchen angegeben. Dieses neue Herstellungsverfahren bietet nicht nur maßstäbliche Vergrößerbarkeit und Validierbarkeit, sondern auch eine Virusreinheit, die mit jener, die bei Verwendung einer CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation erzielt wird, vergleichbar ist.
  • Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellung eines Adenovirus bereit, welches umfasst, Wirtszellen in Medien bei einer niedrigen Perfusionsrate zu kultivieren, die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren, die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, um ein rohes Zelllysat herzustellen, das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren, Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner, ein Adenovirus-Partikel aus dem Lysat unter Verwendung von Chromatographie zu isolieren. In bestimmten Ausführungsformen besteht die Isolierung im Wesentlichen aus einem einzelnen Chromatographieschritt. In anderen Ausführungsformen ist der Chromatographieschritt Ionenaustauschchromatographie. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die Ionenaustauschchromatographie in einem pH-Bereich zwischen ungefähr 7,0 und ungefähr 10,0 ausgeführt. In mehr bevorzugten Ausführungsformen ist die Ionenaustauschchromatographie Anionenaustauschchromatographie. In bestimmten Ausführungsformen setzt die Anionenaustauschchromatographie DEAE, TMAE, QAE oder PEI ein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen setzt die Anionenaustauschchromatographie Toyopearl Super Q 650M, MonoQ, Source Q oder Fractogel TMAE ein.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Glucosekonzentration in den Medien zwischen ungefähr 0,7 und ungefähr 1,7 g/l gehalten. In bestimmten anderen Ausführungsformen umfasst das Austauschen von Puffer einen Diafiltrationsschritt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Adenovirus einen adenoviralen Vektor, welcher ein exogenes Genkonstrukt kodiert. In bestimmten derartigen Ausführungsformen ist das Genkonstrukt funktionsfähig mit einem Promotor verbunden. In bestimmten Ausführungsformen ist der Promotor SV40 IE, RSV LTR, β-Aktin oder CMV IE, Adenovirus-Major-Late, Polyoma F9-1 oder Tyrosinase. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung ist das Adenovirus ein replikationsinkompetentes Adenovirus. In anderen Ausführungsformen fehlt dem Adenovirus mindestens ein Teil der E1-Region. Bei bestimmten Aspekten fehlt dem Adenovirus mindestens ein Teil der E1A- und/oder E1B-Region. In anderen Ausführungsformen sind die Wirtszellen in der Lage, die Replikation zu komplementieren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Wirtszellen 293-Zellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist beabsichtigt, dass das exogene Genkonstrukt ein therapeutisches Gen kodiert. Das therapeutische Gen kann beispielsweise Antisense-ras, Antisense-myc, Antisense-raf, Antisense-erb, Antisense-src, Antisense-fms, Anti sense-jun, Antisense-trk, Antisense-ret, Antisense-gsp, Antisense-hst, Antisense-bcl, Antisense-abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFv-ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, Thymidinkinase oder p53 kodieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen unter Verwendung eines nicht-denaturierenden Detergens lysiert und geerntet. In bevorzugten Ausführungsformen kann das Detergens Thesit®, NP-40®, Tween-20®, Brij-58®, Triton X®-100 oder Octylglucosid sein. Bei bestimmten anderen Aspekten der Erfindung wird das Zelllysat mit Benzonase® oder Pulmozyme® behandelt.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren einen Konzentrationsschritt unter Verwendung einer Membranfiltration. In bestimmten Ausführungsformen ist die Filtration eine Tangentialflussfiltration. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Filtration eine 100 bis 300 K NMWC aufweisende regenerierte Cellulose- oder Polyethersulfonmembran verwenden.
  • Die Erfindung beschreibt auch ein Adenovirus, welches gemäß einem Verfahren hergestellt wird, welches die Schritte umfasst, Wirtszellen in Medien bei einer niedrigen Perfusionsrate zu kultivieren, die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren, die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, um ein rohes Zelllysat herzustellen, das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren, Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren.
  • Andere Aspekte der Erfindung beschreiben ein Verfahren zur Reinigung eines Adenovirus, welches umfasst, Wirtszellen zu kultivieren, die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren, die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, indem die Zellen mit einem nicht-denaturierenden Detergens in Kontakt gebracht werden, um ein rohes Zelllysat herzustellen, das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren, Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das Detergens Thesit®, NP-40®, Tween-20®, Brij-58®, Triton X-100® oder Octylglucosid sein. In spezielleren Ausführungsformen ist das Detergens in der Lyselösung in einer Konzentration von ungefähr 1% (Gew./Vol.) vorhanden.
  • Bei anderen Aspekten der Erfindung wird ein Adenovirus beschrieben, welches gemäß einem Verfahren hergestellt wird, welches die Schritte umfasst, Wirtszellen zu kultivieren, die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren, die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, indem die Zellen mit einem Detergens in Kontakt gebracht werden, um ein rohes Zelllysat herzustellen, das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren, Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren.
  • In noch einer anderen Ausführungsform beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines Adenovirus, welches die Schritte umfasst, Wirtszellen in serumfreiem Medien zu kultivieren; die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren; die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, um ein rohes Zelllysat herzustellen; das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren; Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen; und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren. In bevorzugten Ausführungsformen können die Zellen unabhängig als eine Zellsuspensionskultur oder als eine Verankerungs-abhängige Kultur kultiviert werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die Wirtszellen an das Wachstum in serumfreien Medien adaptiert. In mehr bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Adaptierung an ein Wachstum in serumfreien Medien eine sequentielle Verringerung des Gehalts an fötalem Rinderserum in dem Wachstumsmedium. Spezieller umfasst das serumfreie Medium einen Gehalt an fötalem Rinderserum von weniger als 0,03% (Vol./Vol.).
  • In anderen Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiter, ein adenovirales Partikel aus dem Lysat unter Verwendung von Chromatographie zu isolieren. In bevorzugten Ausführungsformen besteht die Isolierung im Wesentlichen aus einem einzigen Chromatographieschritt.
  • Durch die Erfindung wird auch ein Adenovirus beschrieben, welches hergestellt wird gemäß einem Verfahren, welches die Schritte umfasst, Wirtszellen in serumfreien Medien zu kultivieren; die Wirtszellen mit einem Adenovirus zu infizieren; die Wirtszellen zu ernten und zu lysieren, um ein rohes Zelllysat herzustellen; das rohe Zelllysat aufzukonzentrieren; Puffer von rohem Zelllysat auszutauschen; und die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem rohen Zelllysat zu reduzieren.
  • Die Erfindung beschreibt weiter eine 293-Wirtszelle, die an ein Wachstum in serumfreiem Medium adaptiert ist. Bei bestimmten Aspekten umfasst die Adaptierung an ein Wachstum in serumfreien Medien eine sequentielle Verringerung des Gehalts an fötalem Rinderserum in dem Wachstumsmedium. In besonderen Ausführungsformen ist die Zelle an ein Wachstum in Suspensionskultur adaptiert. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen der Erfindung als IT293SF-Zellen bezeichnet. Diese Zellen wurden bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) hinterlegt, um die Erfordernisse des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren zu erfül len. Die Zellen wurden von Dr. Shuyuan Zhang im Auftrag von Introgen Therapeutics, Inc. (Houston, Tx.) am 17. November 1997 hinterlegt. Die IT293SF-Zelllinie ist abgeleitet von einer Adaptierung einer 293-Zelllinie an eine serumfreie Suspensionskultur, wie hier beschrieben. Die Zellen können in serumfreiem IS 293-Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, Ca.), welches mit 100 mg/l Heparin und 0,1% Pluronic F-68 ergänzt ist, kultiviert werden und sind für eine Infektion durch humane Adenoviren permissiv.
  • Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der Unterlagen und werden aufgenommen, um bestimmte Aspekte der Erfindung weiter zu demonstrieren. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung von speziellen Ausführungsformen, die hier aufgeführt wird, besser verstanden.
  • 1A und 1B. HPLC-Profile der viralen Lösungen aus Produktionsläufen unter Verwendung von Mediumperfusionsraten, die als „hoch" (1A) und „niedrig" (1B) gekennzeichnet sind.
  • 2. Das HPLC-Profil von rohem Zelllysat (CCL) aus CellCubeTM (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 3A, 3B, 3C, 3D und 3E. Die HPLC-Profile von Lyselösungen aus CellCubeTM unter Verwendung von verschiedenen Detergentien. 3A Thesit®. 3B Triton® X-100. 3C. NP-40®. 3D. Brij® 80. 3E. Tween® 20. Detergenskonzentration: 1% (Gew./Vol.); Lysetemperatur: Raumtemperatur (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 4A und 4B. Die HPLC-Profile einer Viruslösung vor (4A) und nach (4B) Benzonasebehandlung (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 5. Das HPLC-Profil einer Viruslösung nach Benzonasebehandlung in Gegenwart von 1 M NaCl. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 6. Reinigung von AdCMVp53-Virus unter Puffer A-Bedingungen von 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,2 M NaCl, pH = 7,5.
  • 7. Reinigung von AdCMVp53-Virus unter Puffer A-Bedingungen von 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,2 M NaCl, pH = 9,0.
  • 8A, 8B und 8C. HPLC-Analyse von Fraktionen, die während einer Reinigung erhalten werden. 8A Fraktion 3. 8B Fraktion 4, 8C Fraktion 8. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 9. Reinigung von AdCMVp53-Virus unter Puffer A-Bedingungen von 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,3 M NaCl, pH = 9.
  • 10A, 10B, 10C, 10D und 10E. HPLC-Analyse von rohen Virusfraktionen, die während einer Reinigung erhalten werden, und von CsCl-Gradient-gereinigtem Virus. 10A Rohe Viruslösung. 10B Durchfluss. 10C. Peak Nr. 1, 10D. Peak Nr. 2. 10E. CsCl-gereinigtes Virus. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 11. HPLC-Reinigungsprofil aus einer Säule mit 5 cm Innendurchmesser.
  • 12. Die hauptsächlichen Adenovirus-Strukturproteine, die mittels einer SDS-PAGE detektiert werden.
  • 13. Die BSA-Konzentration in dem gereinigten Virus als detektierte Konzentration des Western-Blot-Assays.
  • 14. Das Chromatogramm für rohes Zelllysat-Material, welches aus dem CellCubeTM erzeugt worden ist.
  • 15. Das Elutionsprofil von behandelter Viruslösung, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung unter Verwendung von Toyopearl Super Q-Harz gereinigt worden ist.
  • 16A und 16B. HPLC-Analyse einer Virusfraktion aus dem Reinigungsprotokoll. 16A HPLC-Profile einer Virusfraktion aus dem ersten Reinigungsschritt. 16B HPLC-Profile einer Virusfraktion aus einer zweiten Reinigung. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 17. Reinigung einer unter Verwendung von 1% Tween® gewonnenen Viruslösung bei niedriger Mediumperfusionsrate.
  • 18. HPLC-Analyse der bei niedriger Mediumperfusionsrate hergestellten Virusfraktion.
  • 19A, 19B und 19C. Analyse von säulengereinigtem Virus. 19A SDS-PAGE-Analyse. 19B Western-Blot auf BSA. 19C Nukleinsäure-Slot-Blot, um die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren zu bestimmen.
  • 20A, 20B, 20C, 20D, 20E und 20F. Kapazitätsuntersuchung des Toyopearl SuperQ 650M-Harzes. 20A Durchfluss von einem Beladungsverhältnis von 1:1. 20B. Gereinigtes Virus aus einem Beladungsverhältnis von 1:1. 20C Durchfluss von einem Beladungsverhältnis von 2:1. 20D. Gereinigtes Virus aus dem Beladungsverhältnis von 2:1. 20E Durchfluss von einem Beladungsverhältnis von 3:1. 20F. Gereinigtes Virus aus dem Beladungsverhältnis von 3:1. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 21. Durch eine isopyknische CsCl-Ultrazentrifugationssäule gereinigtes Virus.
  • 22. Die HPLC-Profile von intakten Viren, die in dem säulengereinigten Virus vorhanden sind. A. Intaktes Virus. B. Defektes Virus. (durchgezogene Linie A260; gepunktete Linie A280).
  • 23. Ein Herstellungs- und Reinigungsflussdiagramm für AdCMVp53.
  • BESCHREIBUNG VON DER VERANSCHAULICHUNG DIENENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es ist gezeigt worden, dass adenovirale Vektoren erfolgreich bei der eukaryotischen Genexpression und Impfstoffentwicklung verwendet werden können. Unlängst haben Untersuchungen an Tieren gezeigt, dass rekombinante Adenoviren für eine Gentherapie verwendet werden konnten. Erfolgreiche Untersuchungen bei einer Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe haben die Wirksamkeit von adenoviralen Vektoren im Rahmen einer Therapie bewiesen. Dieser Erfolg hat zu der Verwendung von solchen Vektoren in klinischen Studien am Menschen geführt. Es besteht jetzt ein gestiegener Bedarf für die Herstellung von adenoviralen Vektoren, die im Rahmen von verschiedenen Therapien verwendet werden sollen. Die Techniken, die gegenwärtig zur Verfügung stehen, sind unzureichend, um einen solchen Bedarf zu befriedigen. Die Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von großen Mengen von Adenoviren für eine Verwendung in solchen Therapien bereit.
  • Die Erfindung umfasst ein Verfahren, das für die Herstellung und Reinigung eines replikationsdefizienten rekombinanten Adenovirus entwickelt worden ist. Das Herstellungsverfahren basiert auf der Verwendung eines CellcubeTM-Bioreaktors für die Zellvermehrung und Virusproduktion. Es wurde festgestellt, dass eine gegebene Perfusionsrate, die während der Zellvermehrungs- und Virusproduktionsphasen der Kultivierung verwendet wird, eine signifikante Auswirkung auf die nachfolgend erfolgende Reinigung des Virus hat. Spezieller verbessert eine niedrige bis mittlere Mediumperfusionsrate die Virusproduktion. Zusätzlich verbessert auch die aus gepuffertem Detergens bestehende Lyselösung, die verwendet wird, um Zellen in dem CellcubeTM am Ende der Virusproduktionsphase zu lysieren, das Verfahren. Bei diesen zwei Vorteilen kann die geerntete rohe Viruslösung gereinigt werden unter Verwendung eines einzigen Ionenaus tauschchromatographie-Laufs nach einer Aufkonzentrierung/Diafiltration und Nukleasebehandlung, um die Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in der rohen Viruslösung zu reduzieren. Das säulengereinigte Virus weist eine äquivalente Reinheit bezogen auf jene eines durch einen doppelten CsCl-Gradient gereinigten Virus auf. Die gesamte Verfahrensrückgewinnung des Virusprodukts beträgt 70% ± 10%. Dies ist eine signifikante Verbesserung gegenüber den Ergebnissen, über die von Huyghe et al. (1996) berichtet worden ist. Verglichen mit einer doppelten CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation weist eine Säulenreinigung den Vorteil auf, dass sie konsistenter, maßstäblich vergrößerbar, validierbar, schneller und weniger teuer ist. Dieses neue Verfahren stellt eine signifikante Verbesserung in der Technologie zur Herstellung von adenoviralen Vektoren für die Gentherapie dar.
  • Dementsprechend ist die Erfindung so gestaltet, dass sie einen Vorteil aus diesen Verbesserungen bei in großem Maßstab betriebenen Kultursystemen und bei einer in großem Maßstab erfolgenden Reinigung für den Zweck einer Herstellung und Reinigung von adenoviralen Vektoren zieht. Die verschiedenen Komponenten für ein solches System und Verfahren zur Herstellung von Adenoviren damit werden nachfolgend detailliert erläutert.
  • 1. Wirtszellen
  • A) Zellen
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hängen die Erzeugung und Propagierung der adenoviralen Vektoren von einer einzigen Helferzelllinie ab, welche als 293 bezeichnet wird, die ausgehend von humanen embryonalen Nierenzellen durch Adenovirus Serotyp 5 (Ad5)-DNA-Fragmente transformiert worden ist und konstitutiv E1-Proteine exprimiert (Graham et al., 1977). Da die E3-Region in dem Ad-Genom entbehrlich ist (Jones und Shenk, 1978), tragen die gegenwärtigen Ad-Vektoren, mit der Hilfe von 293-Zellen, fremde DNA in entweder der E1- oder der E3- oder in beiden Regionen (Graham und Prevec, 1991; Bett et al., 1994).
  • Auch offenbart werden rekombinante Zelllinien, die einen Teil des adenoviralen Genoms exprimieren. Diese Zelllinien sind in der Lage, die Replikation von rekombinanten Adenovirus-Vektoren und Helferviren, welche Defekte in bestimmten adenoviralen Genen aufweisen, zu unterstützen, d.h. sie sind „permissiv" für die Vermehrung dieser Viren und Vektoren. Die rekombinante Zelle wird auch als eine Helferzelle bezeichnet aufgrund der Fähigkeit, Defekte in replikationsinkompetenten adenoviralen Vektoren zu komplementieren und deren Replikation zu unterstützen. Der Prototyp für eine adenovirale Helferzelle ist die 293-Zelllinie, die die adenovirale E1-Region enthält. 293-Zellen unterstützen die Replikation von adenoviralen Vektoren, de nen E1-Funktionen fehlen, indem in trans die E1-aktiven Elemente, die für die Replikation erforderlich sind, bereitgestellt werden.
  • Erfindungsgemäße Helferzellen sind von einer Säugetierzelle und vorzugsweise von einer Primatenzelle, wie einer humanen embryonalen Nierenzelle, abgeleitet. Obwohl verschiedene Primatenzellen bevorzugt sind und humane oder sogar humane embryonale Nierenzellen am meisten bevorzugt sind, wäre eine jegliche Art von Zelle, die in der Lage ist, die Replikation des Virus zu unterstützen, bei der praktischen Ausführung der Erfindung akzeptabel. Andere Zellarten könnten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vero-Zellen, CHO-Zellen oder jegliche eukaryotischen Zellen, für welche Gewebekulturtechniken etabliert sind, solange die Zellen Adenovirus-permissiv sind. Der Begriff „Adenovirus-permissiv" bedeutet, dass das Adenovirus oder der adenovirale Vektor in der Lage ist, innerhalb der zellulären Umgebung den gesamten intrazellulären Virus-Lebenszyklus abzuschließen.
  • Die Helferzelle kann von einer existierenden Zelllinie, z.B. von einer 293-Zelllinie, abgeleitet oder de novo entwickelt werden. Solche Helferzellen exprimieren die adenoviralen Gene, die notwendig sind, um in trans Deletionen in einem adenoviralen Genom zu komplementieren, oder die die Replikation eines in anderer Weise defekten adenoviralen Vektors unterstützen, wie die E1-, E2-, E4-, E5 und späten Funktionen. Ein besonderer Teil des Adenovirusgenoms, die E1-Region, ist bereits verwendet worden, um Komplementationszelllinien zu erzeugen. Ob integriert oder episomal werden sich Teile des Adenovirusgenoms, denen ein viraler Replikationsstartpunkt fehlt, wenn sie in eine Zelllinie eingeführt werden, nicht replizieren, sogar wenn die Zelle mit Wildtyp-Adenovirus superinfiziert wird. Da die Transkription der major late-Einheit nach der viralen DNA-Replikation erfolgt, können die späten Adenovirus-Funktionen ausgehend von einer Zelllinie zusätzlich nicht ausreichend exprimiert werden. Dementsprechend werden die E2-Regionen, die mit den späten Funktionen (L1-5) überlappen, durch Helferviren und nicht durch die Zelllinie bereitgestellt. Typischerweise wird eine Zelllinie, die verwendet werden kann, um die Erfindung in der Praxis auszuführen, E1 und/oder E4 exprimieren.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff „rekombinante" Zelle sich auf eine Zelle beziehen, in welche ein Gen, wie ein Gen aus dem adenoviralen Genom oder aus einer anderen Zelle, eingeführt worden ist. Dementsprechend sind rekombinante Zellen von in der Natur vorkommenden Zellen, die ein rekombinant eingeführtes Gen nicht enthalten, unterscheidbar. Rekombinante Zellen sind dementsprechend Zellen, die ein Gen oder Gene aufweisen, das bzw. die durch „Menschenhand" eingeführt worden ist bzw. sind.
  • Replikation wird bestimmt, indem eine Schicht von uninfizierten Zellen oder von Zellen, die mit einem oder mehreren Helferviren infiziert worden sind, mit Viruspartikeln in Kontakt gebracht werden, gefolgt von einer Inkubation der Zellen. Die Bildung von viralen Plaques oder zellfreien Flächen in der Zellschicht ist das Ergebnis einer Zelllyse, die durch die Expression von bestimmten viralen Produkten hervorgerufen wird. Eine Zelllyse zeigt Virusreplikation an.
  • Beispiele für andere nützliche Säugetier-Zelllinien, die mit einem replikationskompetenten Virus verwendet werden können oder in Komplementationswirtszellen für eine Verwendung mit replikationsdefekten Viren umgewandelt werden können, sind Vero- und HeLa-Zellen und Zelllinien des Ovars des chinesischen Hamsters, W138-, BHK-, COS-7-, HepG2-, 3T3-, RIN- und MDCK-Zellen.
  • B) Vermehrung in Selektionsmedien
  • In bestimmten Ausführungsformen kann es nützlich sein, Selektionssysteme einzusetzen, die die Vermehrung von unerwünschten Zellen ausschließen. Dies kann bewerkstelligt werden, indem eine Zelllinie mit einem selektierbaren Marker permanent transformiert wird oder indem eine Zelllinie mit einem viralen Vektor, der einen selektierbaren Marker kodiert, transduziert oder infiziert wird. In jeder Situation wird eine Kultivierung der transformierten/transduzierten Zelle mit einem geeigneten Arzneimittel oder einer geeigneten selektiven Verbindung zu der Verstärkung jener Zellen, die den Marker tragen, in der Zellpopulation führen.
  • Beispiele von Markern umfassen, sind aber nicht beschränkt auf HSV-Thymidinkinase-, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- und Adeninphosphoribosyltransferase-Gene in tk-, hgprt- bzw. aprt-Zellen. Es kann auch eine Antimetabolit-Resistenz als Selektionsgrundlage für dhfr, welches Resistenz gegen Methotrexat verleiht; gtp, welches Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht; neo, welches Resistenz gegen das Aminoglycosid G418 verleiht; und hygro, welches Resistenz gegen Hygromycin verleiht, verwendet werden.
  • C) Vermehrung bei Serumentwöhnung
  • Eine Serumentwöhnungs-Adaptierung von Verankerungs-abhängigen Zellen an serumfreie Suspensionskulturen ist für die Herstellung von rekombinanten Proteinen (Berg, 1993) und viralen Impfstoffen (Perrin, 1995) verwendet worden. Es hat unlängst einige wenige Berichte über die Adaptierung von 293A-Zellen an serumfreie Suspensionskulturen gegeben. Gilbert berichtete über die Adaptierung von 293A-Zellen an serumfreie Suspensionskulturen für die Herstellung von Adenoviren und rekombinantem Protein (Gilbert, 1996). Ein ähnliches Adaptie rungsverfahren ist für die Adaptierung von A549-Zellen an eine serumfreie Suspensionskultur für eine Herstellung von Adenoviren verwendet worden (Morris et al., 1996). Zellspezifische Virusausbeuten in den adaptierten Suspensionszellen sind jedoch ungefähr 5–10-mal geringer als jene, die in den anhaftenden Ausgangszellen erzielt werden.
  • Unter Verwendung der ähnlichen Serumentwöhnungs-Prozedur haben die Erfinder erfolgreich die 293A-Zellen an eine serumfreie Suspensionskultur adaptiert (293SF-Zellen). Bei dieser Vorgehensweise wurden die 293-Zellen an ein kommerziell erhältliches 293-Medium adaptiert, indem die FBS-Konzentration in T-Kolben sequentiell verringert wurde. Kurz zusammengefasst, betrug die anfängliche Serumkonzentration in dem Medium ungefähr 10% FBS (in) DMEM-Medium in T-75-Kolben und die Zellen wurden an serumfreies IS 293-Medium in T-Kolben adaptiert, indem die FBS-Konzentration in dem Medium sequentiell verringert wurde. Nach 6 Passagen in T-75-Kolben wurde der FBS-Prozentsatz auf ungefähr 0,019% geschätzt und die 293-Zellen. Die Zellen wurden zwei weitere Male in den T-Kolben subkultiviert, bevor sie in Spinner-Kolben („Spinner-Flasks") transferiert wurden. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Zellen sich in dem serumfreien Medium (IS293-Medium, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zufriedenstellend vermehren. Durchschnittliche Verdopplungszeiten der Zellen betrugen 18–24 h, wobei stationäre Zellkonzentrationen in der Größenordnung von 4–10 × 106 Zellen/ml ohne Mediumaustausch erzielt wurden.
  • D) Adaptierung von Zellen für eine Suspensionskultur
  • Es sind zwei Methodiken verwendet worden, um 293-Zellen an Suspensionskulturen zu adaptieren. Graham adaptierte 293A-Zellen an eine Suspensionskultur (293N3S-Zellen) durch 3 Reihenpassagen in Nacktmäusen (Graham, 1987). Es wurde festgestellt, dass die 293N3S-Suspensionszellen in der Lage waren, adenovirale E1–-Vektoren zu unterstützen. Jedoch beobachteten Garnier et al. (1994), dass die 293N35-Zellen eine relative lange anfängliche Anlaufphase (Lag-Phase) in Suspension, eine langsame Vermehrungsrate und eine starke Tendenz zur Verklumpung hatten.
  • Das zweite Verfahren, das verwendet wurde, ist eine graduelle Adaptierung von 293A-Zellen an Suspensionsvermehrung (Cold Spring Harbor Laboratories, 293S-Zellen). Garnier et al. (1994) berichteten über die Verwendung von 293S-Zellen für die Herstellung von rekombinanten Proteinen ausgehend von adenoviralen Vektoren. Die Autoren stellten fest, dass 293S-Zellen in Calcium-freiem Medium viel weniger klumpig waren und ein Austausch von frischem Medium zum Zeitpunkt der Virusinfektion die Proteinproduktion signifikant erhöhen konnte. Es wurde festgestellt, dass ohne Mediumaustausch Glucose der limitierende Faktor bei der Kultivierung war.
  • Im Rahmen der Erfindung wurden die an eine Vermehrung unter serumfreien Bedingungen adaptierten 293-Zellen an eine Suspensionskultur adaptiert. Die Zellen wurden in eine serumfreie 250 ml-Spinner-Suspensionskultur (100 ml Arbeitsvolumen) für die Suspensionskultur bei einer anfänglichen Zelldichte zwischen ungefähr 1,18 × 105 vc/ml (lebensfähige Zellen/ml) und 5,22 × 105 vc/ml. transferiert. Die Medien können mit Heparin ergänzt werden, um eine Aggregation von Zellen zu verhindern. Dieses Zellkultursystem erlaubt eine gewisse Erhöhung der Zelldichte, während Zelllebensfähigkeit beibehalten wird. Vermehren sich diese Zellen einmal in Kultur, werden diese Zellen in den Spinner-Kolben ungefähr 7 weitere Passagen subkultiviert. Es kann festgehalten werden, dass die Verdopplungszeit der Zellen fortschreitend verringert wird, bis am Ende der aufeinander folgenden Passagen die Verdopplungszeit ungefähr 1,3 Tage beträgt, d.h. vergleichbar ist mit 1,2 Tagen der Zellen in 10% FSB-Medium in der mit angehefteten Zellen erfolgenden Kultur. In dem mit Heparin ergänzten serumfreien IS 293-Medium existierten nahezu alle Zellen als individuelle Zellen, wobei sie in der Suspensionskultur keine Aggregate von Zellen bildeten.
  • 2. Zellkultursysteme
  • Die Fähigkeit, infektiöse virale Vektoren herzustellen, ist für die pharmazeutische Industrie zunehmend wichtig, speziell im Kontext der Gentherapie. Im Verlauf der letzten 10 Jahre haben Fortschritte in der Biotechnologie zu der Herstellung einer Anzahl von wichtigen viralen Vektoren geführt, die potentielle Verwendungen als Therapien, Impfstoffe und Proteinproduktionsmaschinen haben. Die Verwendung von viralen Vektoren in Säugetierkulturen hat Vorteile gegenüber Proteinen, die in bakteriellen oder anderen niedere Lebensform-Wirten produziert werden, aufgrund von deren Fähigkeit, komplexe Proteinstrukturen posttranslational weiterzuverarbeiten, wie Disulfid-abhängige Faltung und Glycosylierung.
  • Die Entwicklung von Zellkultur für die Herstellung von Virusvektoren ist stark unterstützt worden durch die auf dem Gebiet der Molekularbiologie erfolgte Entwicklung von Techniken für die Gestaltung und Konstruktion von Vektorsystemen, die in Säugetierzellkulturen hochgradig effizient sind, einer Batterie von nützlichen Selektionsmarkern, Genamplifizierungsschemata und einem umfassenderen Verständnis der biochemischen und zellulären Mechanismen, die an der Bereitstellung des endgültigen biologisch aktiven Moleküls ausgehend von dem eingeführten Vektor beteiligt sind.
  • Häufig wurden Faktoren, die die nachgeschaltet ablaufende (in diesem Falle nach der Zelllyse) Seite der maßstäblichen Produktionserhöhung beeinflussen, nicht berücksichtigt, bevor die Zelllinie als der Wirt für das Expressionssystem ausgewählt worden war. Auch wurde die Entwicklung von Bioreaktorsytemen, welche in der Lage sind, Kulturen sehr hoher Dichte für längere Zeitspannen aufrecht zu erhalten, dem steigenden Bedarf an einer erhöhten Produktion zu geringeren Kosten nicht gerecht.
  • Die Erfindung wird einen Vorteil ziehen aus der unlängst verfügbaren Bioreaktor-Technologie. Das Vermehren von Zellen gemäß der Erfindung in einem Bioreaktor erlaubt eine in großem Maßstab erfolgende Herstellung von vollständig biologisch aktiven Zellen, die in der Lage sind, durch die adenoviralen Vektoren der Erfindung infiziert zu werden. Indem das System mit einer niedrigen Perfusionsrate betrieben wird und ein unterschiedliches Schema für die Reinigung der infizierenden Partikel angewendet wird, stellt die Erfindung eine Reinigungsstrategie bereit, die leicht maßstäblich vergrößerbar ist, um große Mengen von hochgradig gereinigtem Produkt herzustellen.
  • Bioreaktoren sind weithin für die Herstellung von biologischen Produkten sowohl aus Suspensionskulturen als auch aus Verankerungs-abhängigen tierischen Zellkulturen verwendet worden. Die am weitesten verbreitet verwendeten Produzentenzellen für die Herstellung von adenoviralen Vektoren sind Verankerungs-abhängige humane embryonale Nierenzellen (293-Zellen). Bioreaktoren, die für die Herstellung von adenoviralen Vektoren entwickelt werden sollen, sollten das Merkmal einer hohen volumenspezifischen Kulturoberfläche aufweisen, um eine hohe Produzentenzelldichte und hohe Virusausbeute zu erzielen. Eine Microcarrier-Zellkultur in Bioreaktoren mit gerührtem Tank bietet eine sehr hohe volumenspezifische Kulturoberfläche und ist für die Herstellung von viralen Impfstoffen verwendet worden (Griffiths, 1986). Darüber hinaus haben sich Bioreaktoren mit gerührtem Tank industriell als maßstäblich vergrößerbar erwiesen. Das von Corning-Costar hergestellte, eine Mehrzahl von Platten aufweisende CellcubeTM-Zellkultursystem bietet ebenfalls eine sehr hohe volumenspezifische Kulturoberfläche. Zellen vermehren sich auf beiden Seiten der Kulturplatten, die in Gestalt eines kompakten Kubus hermetisch zusammengeschweißt sind. Anders als bei Bioreaktoren mit gerührtem Tank ist die CellcubeTM-Kultureinheit ein Einwegartikel. Dies ist bei der in frühem Stadium erfolgenden Herstellung eines klinischen Produkts hochgradig wünschenswert aufgrund der verringerten Kapitalaufwendungen, Qualitätskontroll- und Qualitätssicherungskosten, die mit Einwegsystemen verbunden sind. Unter Berücksichtigung der Vorteile, die die verschiedenen Systeme bieten, wurden sowohl der Bioreaktor mit gerührtem Tank als auch das CellcubeTM-System für die Herstellung von Adenoviren ausgewertet.
  • A) Verankerungs-abhängige gegenüber nicht-Verankerungs-abhängigen Kulturen.
  • Tierische und humane Zellen können in vitro auf zwei Weisen propagiert werden: als nicht-Verankerungs-abhängige Zellen, die sich frei in Suspension innerhalb des gesamten Volumens der Kultur vermehren; oder als Verankerungs-abhängige Zellen, welche eine Anheftung an ein festes Substrat für deren Propagierung benötigen (d.h. eine Monolayer-Art der Zellvermehrung).
  • Nicht-Verankerungs-abhängige oder Suspensionskulturen aus kontinuierlich etablierten Zelllinien sind die am weitesten verbreitet verwendeten Mittel für eine in großem Maßstab erfolgende Herstellung von Zellen und Zellprodukten. Eine auf einer mikrobiellen (bakteriellen oder Hefe-) Fermentationstechnologie basierende Suspensionskultur in großem Maßstab weist klare Vorteile für die Herstellung von Säugetier-Zellprodukten auf. Die Verfahren sind relativ einfach auszuführen und geradlinig maßstäblich zu vergrößern. In dem Reaktor, der eine präzise Überwachung und Steuerung von Temperatur, gelöstem Sauerstoff und pH ermöglicht, können homogene Bedingungen bereitgestellt werden und sicherstellen, dass repräsentative Proben der Kultur genommen werden können.
  • Jedoch können nicht immer in Suspension kultivierte Zellen bei der Herstellung von biologischen Erzeugnissen verwendet werden. Es wird nach wie vor davon ausgegangen, dass Suspensionskulturen tumorigenes Potential haben, und dementsprechend bedingt deren Verwendung als Substrate für die Produktion Einschränkungen für die Verwendung der resultierenden Produkte in humanen und veterinärmedizinischen Anwendungen (Petricciani, 1985; Larsson, 1987). In Suspensionskulturen vermehrte Viren können im Gegensatz zu Verankerungs-abhängigen Kulturen manchmal schnelle Veränderungen bei Virusmarkern verursachen, was zu verringerter Immunogenität führt (Bahnemann, 1980). Schließlich können manchmal sogar rekombinante Zelllinien beträchtlich höhere Mengen von Produkten sekretieren, wenn sie als Verankerungs-abhängige Kulturen vermehrt werden, verglichen mit der gleichen Zelllinie in Suspension (Nilsson und Mosbach, 1987). Aus diesen Gründen werden verschiedene Arten von Verankerungs-abhängigen Zellen in großem Umfang bei der Herstellung von verschiedenen biologischen Produkten verwendet.
  • B) Reaktoren und Verfahren für Suspensionen.
  • Es wurde eine in großem Maßstab erfolgende Kultivierung von Säugetierkulturen in gerührten Tanks vorgenommen. Die Instrumentierung und Kontrollen für Bioreaktoren wurden zusammen mit der Gestaltung der Fermenter ausgehend von verwandten mikrobiellen Anwendungen adaptiert. Jedoch wurden durch das Erkennen des steigenden Bedarfs für eine Kontaminierungskontrolle bei den sich langsamer vermehrenden Säugetierkulturen schnell verbesserte aseptische Gestaltungen implementiert, welche die Zuverlässigkeit von diesen Reaktoren verbesserten. Instrumentierung und Kontrollen sind im Wesentlichen die gleichen, wie sie bei anderen Fermentern gefunden werden, und umfassen Bewegungs-, Temperatur-, gelöster Sauerstoff- und pH-Kontrollen. Fortschrittlichere Sonden und automatische Analysengeräte für on-line- und off-line-Messungen der Trübung (eine Funktion der vorhandenen Partikel), der Kapazität (eine Funktion der vorhandenen lebensfähigen Zellen), von Glucose/Lactat, Carbonat/Bicarbonat und Kohlendioxid stehen zur Verfügung. Maximale Zelldichten, die in Suspensionskulturen erzielbar sind, sind relativ niedrig bei ungefähr 2–4 × 106 Zellen/ml Medium (was weniger als 1 mg Zelltrockengewicht pro ml ist), deutlich unter den Zahlen, die bei einer mikrobiellen Fermentierung erzielt werden.
  • In der Industrie werden am weitesten verbreitet zwei Suspensionskulturreaktor-Gestaltungen aufgrund ihrer Einfachheit und Robustheit im Betrieb verwendet – der gerührte Reaktor und der Airliftreaktor. Die Gestaltung des gerührten Reaktors ist erfolgreich im Maßstab von 8000 l Fassungsvermögen für die Herstellung von Interferon verwendet worden (Phillips et al., 1985; Mizrahi, 1983). Zellen werden in einem Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Höhe:Durchmesser-Verhältnis von 1:1 bis 3:1 vermehrt. Die Kultur wird üblicherweise mittels eines oder mehrerer Rührer, welche auf aus dünnen Lagen bestehenden Scheiben oder Schiffsschrauben-Ausführungen basieren, gemischt. Es sind Rührersysteme, die weniger Scherkräfte als Schaufeln bieten, beschrieben worden. Die Bewegung kann entweder direkt oder indirekt durch magnetisch gekoppelte Antriebe angetrieben werden. Indirekte Antriebe verringern das Risiko einer mikrobiellen Kontamination durch Versiegelungen an Rührerschäften.
  • Der Airliftreaktor, der ebenfalls anfänglich für eine mikrobielle Fermentierung beschrieben und später an eine Säugetierkultur adaptiert worden ist, beruht auf einem Gasstrom, um die Kultur sowohl zu mischen als auch mit Sauerstoff zu versorgen. Der Gasstrom tritt in einen Steigleitungs („Riser")-Abschnitt des Reaktors ein und treibt die Zirkulation an. Gas tritt an der Kulturoberfläche aus, was bewirkt, dass dichtere Flüssigkeit, die frei von Gasblasen ist, nach unten in den Ablaufschacht- oder Fallrohrabschnitt des Reaktors wandert. Der Hauptvorteil dieser Gestaltung ist die Einfachheit und das Fehlen der Notwendigkeit für ein mechanisches Mi schen. Das Verhältnis von Höhe zu Durchmesser beträgt typischerweise 10:1. Der Airliftreaktor kann relativ leicht maßstäblich vergrößert werden, weist einen guten Massetransfer von Gasen auf und erzeugt relativ niedrige Scherkräfte.
  • Die meisten in großem Maßstab ausgeführten Suspensionskulturen werden als Batch- oder Fed-Batch-Verfahren betrieben, da sie am geradlinigsten zu betreiben und maßstäblich zu vergrößern sind. Jedoch stehen kontinuierliche Verfahren, die auf Chemostat- oder Perfusionsprinzipien basieren, zur Verfügung.
  • Ein Batch-Verfahren ist ein geschlossenes System, in welchem ein typisches Vermehrungsprofil festgestellt wird. Einer Anlaufphase (Lag-Phase) folgen exponentielle, stationäre und abnehmende Phasen. In einem solchen System verändert sich die Umgebung fortwährend, da Nährstoffe zu Ende gehen und sich Metaboliten anhäufen. Dies macht eine Analyse von Faktoren, welche Zellvermehrung und Produktivität beeinflussen, und folglich eine Optimierung des Verfahrens zu einer komplexen Aufgabe. Die Produktivität eines Batch-Verfahrens kann erhöht werden durch kontrolliertes Einspeisen von Schlüsselnährstoffen, um den Vermehrungszyklus zu verlängern. Ein solches Fed-Batch-Verfahren ist nach wie vor ein geschlossenes System, da Zellen, Produkte und Abfallprodukte nicht entfernt werden.
  • In dem, was nach wie vor ein geschlossenes System ist, kann eine Perfusion von frischem Medium durch die Kultur erzielt werden, indem die Zellen mit verschiedenen Vorrichtungen (z.B. feinmaschiger Spin-Filter, Hohlfaser- oder flache Plattenmembranfilter, Sedimentationsröhrchen („Settling Tubes")) zurückgehalten werden. Spin-Filter-Kulturen können Zelldichten von ungefähr 5 × 107 Zellen/ml erzeugen. Ein wahres offenes System und das einfachste Perfusionsverfahren ist der Chemostat, in welchem es einen Einstrom von Medium und einen Ausfluss von Zellen und Produkten gibt. Kulturmedium wird in den Reaktor mit einer vorher festgelegten und konstanten Rate eingespeist, die die Verdünnungsrate der Kultur bei einem Wert unter der maximalen spezifischen Vermehrungsrate der Zellen hält (um ein Auswaschen der Zellmasse aus dem Reaktor zu verhindern). Kulturfluid, welches Zellen und Zellprodukte und Nebenprodukte enthält, wird mit derselben Rate entfernt.
  • C) Nicht-perfundierte Anheftungssysteme.
  • Traditionell werden Verankerungs-abhängige Zellkulturen auf dem Boden von kleinen Glas- oder Kunststoffgefäßen propagiert. Das für den Labormaßstab geeignete begrenzte Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, das klassische und traditionelle Techniken bieten, hat einen Engpass bei der Herstellung von Zellen und Zellprodukten in großem Maßstab erzeugt. Beim Versuch, Systeme bereitzustellen, die große zugängliche Oberflächen für die Zellvermehrung in einem kleinen Kulturvolumen bieten, sind verschiedene Techniken vorgeschlagen worden: das Rollerflaschen („roller bottle")-System, die Vermehrungsvorrichtung mit gestapelten Platten („stack plates propagator"), die Spiralfilmflaschen, das Hohlfasersystem, das gepackte Bett, das Plattenaustauschersystem und die Membranschlauch-Spule. Da diese Systeme in ihrer Natur nicht-homogen sind und manchmal auf einer Mehrzahl von Prozessen basieren, leiden sie unter den folgenden Nachteilen – limitiertes Potential für eine maßstäbliche Vergrößerung, Schwierigkeiten bei der Entnahme von Zellproben, begrenztes Potential für das Messen und Steuern von Schüsselverfahrensparametern und Schwierigkeiten, homogene Umgebungsbedingungen innerhalb der gesamten Kultur beizubehalten.
  • Trotz dieser Nachteile ist ein üblicherweise verwendetes Verfahren für eine Verankerungs-abhängige Zellproduktion in großem Maßstab die Rollerflasche. Da sie nur wenig mehr als ein großer unterschiedlich geformter T-Kolben ist, macht die Einfachheit des Systems dieses sehr verlässlich und daher attraktiv. Es stehen vollständig automatisierte Roboter zur Verfügung, die Tausende von Rollerflaschen pro Tag handhaben können, wodurch das Risiko von Kontaminierung und Inkonsistenz, welches mit der ansonsten erforderlichen intensiven Handhabung durch Menschen verbunden ist, eliminiert wird. Bei häufigen Medienwechseln können Rollerflaschenkulturen Zelldichten nahe 0,5 × 106 Zellen/cm2 erzielten (was ungefähr 109 Zellen/Flasche oder nahezu 107 Zellen/ml Kulturmedien entspricht).
  • D) Kultur auf Microcarriern
  • Im Bemühen, die Nachteile der traditionellen Verankerungs-abhängigen Zellkulturverfahren zu überwinden, entwickelte van Wezel (1967) das Konzept der Microcarrier-Kultursysteme. In diesem System werden Zellen auf der Oberfläche von kleinen festen Teilchen, die in dem Vermehrungsmedium durch langsame Bewegung suspendiert werden, vermehrt. Zellen heften sich an die Microcarrier an und vermehren sich auf der Microcarrier-Oberfläche nach und nach bis zur Konfluenz. Tatsächlich verbessert dieses in großem Maßstab eingesetzte Kultursystem die Anheftungs-abhängige Kultur ausgehend von einem Einzelscheiben-Verfahren zu einem Einheits-Verfahren, in welchem sowohl Monolayer- als auch Suspensionskultur zusammengebracht worden sind. Dementsprechend erhöht das Kombinieren der notwendigen Oberfläche, damit eine Zelle sich vermehren kann, mit den Vorteilen der homogenen Suspensionskultur die Produktion.
  • Die Vorteile von Microcarrier-Kulturen gegenüber den meisten anderen Verankerungs-abhängigen, in großem Maßstab ausgeführten Kultivierungsverfahren sind mehrfach. Erstens bieten Microcarrier-Kulturen ein hohes Oberfläche:Volumen-Verhältnis (welches variabel ist, indem die Carrier-Konzentration verändert wird), welches zu hohen Zelldichteausbeuten und einem Potential für die Gewinnung von hochgradig konzentrierten Zellprodukten führt. Zellausbeuten betragen bis zu 1–2 × 107 Zellen/ml, wenn Kulturen in einem perfundierter Reaktor-Modus vermehrt werden. Zweitens können Zellen in eine einzige Einheit darstellenden Verfahrensgefäßen anstelle einer Verwendung von vielen kleinen Gefäßen mit niedriger Produktivität (d.h. Kolben oder Schalen) vermehrt werden. Dies resultiert in einer weit besseren Nährstoff-Ausnutzung und einer beträchtlichen Einsparung von Kulturmedium. Darüber hinaus führt eine Vermehrung in einem einzelnen Reaktor zu einer Verringerung der Notwendigkeit für Raum für Einrichtungen und bei der Anzahl von Handhabungsschritten, die pro Zelle benötigt werden, wodurch Arbeitskosten und Kontaminationsrisiko verringert werden. Drittens macht die gut gemischte und homogene Microcarrier-Suspensionskultur es möglich, Umgebungsbedingungen zu überwachen und zu steuern (z.B. pH, pO2 und Konzentration von Mediumbestandteilen), was zu einer besser reproduzierbaren Zellvermehrung und Produkt-Rückgewinnung führt. Viertens ist es möglich, eine repräsentative Probe für ein Betrachten unter dem Mikroskop, chemisches Testen oder Zählung zu entnehmen. Fünftens können, da Microcarrier sich schnell aus einer Suspension absetzen, die Verwendung eines Fed-Batch-Verfahrens oder das Ernten von Zellen relativ leicht erfolgen. Sechstens macht die Weise der Verankerungs-abhängigen Kulturvermehrung auf den Microcarriern es möglich, dieses System für andere Zellmanipulationen, wie Zelltransfer ohne die Verwendung von proteolytischen Enzymen, Cokultivierung von Zellen, Transplantierung in Tiere und Perfusion der Kultur unter Verwendung von Dekantern, Säulen, Wirbelschichten oder Hohlfasern für ein Zurückhalten der Microcarrier, zu verwenden. Siebtens werden Microcarrier-Kulturen relativ leicht maßstäblich vergrößert unter Verwendung von herkömmlicher Ausrüstung, die für eine Kultivierung von mikrobiellen und tierischen Zellen in Suspension verwendet wird.
  • E) Mikroverkapselung von Säugetierzellen
  • Ein Verfahren, von dem gezeigt worden ist, dass es für die Kultivierung von Säugetierzellen besonders nützlich ist, ist die Mikroverkapselung. Die Säugetierzellen werden innerhalb einer semipermeablen Hydrogelmembran zurückgehalten. Es wird um die Zellen herum eine poröse Membran gebildet, welche den Austausch von Nährstoffen, Gasen und Stoffwechselpro dukten mit dem gesamten Volumen, welches die Kapsel umgibt, erlaubt. Es sind mehrere Methoden entwickelt worden, die sanft, schnell und nicht-toxisch sind und wo die resultierende Membran ausreichend porös und fest ist, um die sich vermehrende Zellmasse während der gesamten Kultivierungszeit zu unterhalten. Diese Methoden basieren allesamt auf löslichem Alginat, welches durch Tröpfchenkontakt mit einer Calcium enthaltenden Lösung geliert wird. Lim (1982, U.S.-Patent 4,352,883) beschreibt Zellen, die in einer ungefähr 1%-igen Lösung von Natriumalginat konzentriert sind, die durch eine kleine Öffnung gepresst werden, wodurch Tröpfchen gebildet werden, und die in eine ungefähr 1%-ige Calciumchlorid-Lösung freigesetzt werden. Die Tröpfchen werden dann zu einer Schicht von Polyaminosäure, die ionisch an das Oberflächen-Alginat bindet, gegossen. Schließlich wird das Alginat erneut verflüssigt durch Behandeln des Tröpfchens mit einem Chelatbildner, um die Calciumionen zu entfernen. Andere Verfahren verwenden Zellen in einer Calciumlösung, die in eine Alginatlösung getropft werden soll, wodurch ein hohles Alginat-Kügelchen erzeugt wird. Ein ähnlicher Ansatz umfasst Zellen in einer Chitosan-Lösung, die in Alginat getropft wird, was ebenfalls hohle Kügelchen erzeugt.
  • Mikroverkapselte Zellen werden in Reaktoren mit gerührtem Tank leicht vermehrt und werden bei Korngrößen im Bereich von 150–1500 μm Durchmesser leicht in einem perfundierten Reaktor unter Verwendung eines feinmaschigen Siebs zurückgehalten. Das Verhältnis von Kapselvolumen zu gesamtem Mediumvolumen kann von so dicht wie 1:2 bis 1:10 gehalten werden. Bei Zelldichten innerhalb der Kapseln von bis zu 108 beträgt die effektive Zelldichte in der Kultur 1–5 × 107.
  • Die Vorteile einer Mikroverkapselung gegenüber anderen Verfahren umfassen den Schutz vor den schädlichen Wirkungen von Scherbeanspruchungen, die aufgrund des Durchperlens von Gasen und der Bewegung auftreten, die Fähigkeit, Körnchen leicht zurückzuhalten für den Zweck einer Verwendung von perfundierten Systemen, die maßstäbliche Vergrößerung erfolgt relativ geradlinig, und die Fähigkeit, die Körnchen für eine Implantierung zu verwenden.
  • Die Erfindung beschreibt Zellen, die von Natur aus Verankerungs-abhängig sind. 293-Zellen sind beispielsweise Verankerungs-abhängig, und wenn sie in Suspension vermehrt werden, werden die Zellen sich aneinander anheften und sich in Klumpen vermehren, wodurch schließlich Zellen im inneren Kern von jedem Klumpen erstickt werden, wenn diese eine Größe erreichen, die die Zellen im Kern durch die Kulturbedingungen nicht länger unterhaltbar zurücklässt. Dementsprechend wird ein effizientes Mittel für eine in großem Maßstab erfolgende Kultur von Verankerungs-abhängigen Zellen benötigt, um diese Zellen effektiv einzusetzen, um große Mengen von Adenovirus zu erzeugen.
  • F) Perfundierte Anheftungssysteme
  • Perfundierte Anheftungssysteme sind eine bevorzugte Form der Erfindung. Perfusion bezieht sich auf einen kontinuierlichen Fluss in einem Fließgleichgewichtszustand („steady state") durch oder über eine Population von Zellen (einer physiologischen Nährstofflösung). Sie impliziert das Zurückhalten der Zellen innerhalb der Kultureinheit im Gegensatz zu einer in einem kontinuierlichen Fluss erfolgenden Kultur, die die Zellen mit dem entnommenen Medium herauswäscht (z.B. Chemostat). Die Idee von Perfusion ist seit dem Beginn des Jahrhunderts bekannt und ist angewendet worden, um kleine Gewebestücke für eine ausgedehnte mikroskopische Beobachtung lebensfähig zu halten. Die Technik wurde initiiert, um das Zellmilieu in vivo nachzuahmen, wo Zellen kontinuierlich mit Blut, Lymphe oder anderen Körperfluiden versorgt werden. Ohne Perfusion durchlaufen Zellen in Kultur alternierende Phasen, wo sie gefüttert werden und hungern, wodurch die vollständige Ausprägung von deren Vermehrung und Stoffwechselpotential begrenzt wird.
  • Die gegenwärtige Verwendung einer perfundierten Kultur erfolgt in Reaktion auf die Herausforderung, Zellen in hohen Dichten (d.h. 0,1–5 × 108 Zellen/ml) zu kultivieren. Um Dichten über 2–4 × 106 Zellen/ml hinaus zu erhöhen, muss das Medium konstant durch eine frische Zufuhr ersetzt werden, um Ernährungsmängel zu kompensieren und toxische Produkte zu entfernen. Perfusion erlaubt eine weit bessere Steuerung der Kulturumgebung (pH, pO2, Nährstoffkonzentrationen u.s.w.) und sie ist ein Mittel zur signifikanten Erhöhung der Verwendung der Oberfläche innerhalb einer Kultur für die Zellanheftung.
  • Die Entwicklung eines perfundierten Reaktors mit gepacktem Bett unter Verwendung einer Bettmatrix aus einem Vliesmaterial hat ein Mittel bereitgestellt, um eine Perfusionskultur bei Dichten, welche 108 Zellen/ml des Bettvolumens übersteigen, aufrechtzuerhalten (Celli-GenTM, New Brunswick Scientific, Edison, NJ; Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et al., 1994). Kurz beschrieben, umfasst dieser Reaktor einen verbesserten Reaktor für die Kultivierung von sowohl Verankerungs- als auch nicht-Verankerungs-abhängigen Zellen. Der Reaktor ist als ein gepacktes Bett mit einem Mittel, um eine interne Rezirkulation bereitzustellen, gestaltet. Vorzugsweise wird ein Fasermatrix-Carrier oder -Träger in einem Korb innerhalb des Reaktorgefäßes platziert. Ein oberer und unterer Abschnitt des Korbs hat Löcher, was es dem Medium erlaubt, durch den Korb zu fließen. Ein speziell gestaltetes Laufrad stellt eine Rezirkulation des Mediums durch den Raum, welcher durch die Fasermatrix eingenommen wird, bereit, um eine gleichförmige Zufuhr von Nährstoffen und die Entfernung von Abfallprodukten sicherzustellen. Dies stellt gleichzeitig sicher, dass eine vernachlässigbare Menge der gesamten Zellmasse in dem Medium suspendiert wird. Die Kombination des Korbs und der Rezirkulation stellt auch einen blasenfreien Fluss von oxygeniertem Medium durch die Fasermatrix bereit. Die Fasermatrix ist ein Vliesmaterial mit einem „Poren"durchmesser von 10 μm bis 100 μm, was ein hohes internes Volumen mit Porenvolumen, welche dem 1- bis 20-fachen des Volumens von individuellen Zellen entspricht, bereitstellt.
  • Im Vergleich zu anderen Kultursystemen bietet dieser Ansatz mehrere signifikante Vorteile. Bei einem Fasermatrix-Carrier sind die Zellen vor mechanischer Beanspruchung aufgrund von Bewegung und Schaumbildung geschützt. Der freie Mediumfluss durch den Korb versorgt die Zellen mit optimal regulierten Sauerstoffkonzentrationen, pH-Werten und Nährstoffkonzentrationen. Produkte können kontinuierlich aus der Kultur entfernt werden und die geernteten Produkte sind frei von Zellen und können in Medium mit geringem Proteingehalt hergestellt werden, was nachfolgende Reinigungsschritte vereinfacht. Auch bietet die einzigartige Gestaltung dieses Reaktorsystems eine leichtere Art und Weise, den Reaktor maßstäblich zu vergrößern. Gegenwärtig stehen Größen bis zu 30 l zur Verfügung. Einhundert Liter- und 300 Liter-Versionen befinden sich in der Entwicklung und theoretische Berechnungen unterstützen einen bis zu 1000 Liter-Reaktor. Diese Technologie wird detailliert in WO 94/17178 (04. August 1994, Freedman et al.) erläutert.
  • Das CellcubeTM (Corning-Costar)-Modul stellt eine große styrolische Oberfläche für die Immobilisierung und Vermehrung von an ein Substrat angehefteten Zellen bereit. Es ist eine integral verkapselte sterile Einweg-Vorrichtung, die eine Reihe von parallelen Kulturplatten aufweist, die miteinander verbunden sind, um dünne versiegelte Laminarströmungsräume zwischen benachbarten Platten zu erzeugen.
  • Das CellcubeTM-Modul weist Einlass- und Auslassöffnungen auf, die einander diagonal gegenüber liegen und dazu beitragen, den Mediumfluss zu regulieren. Während der ersten paar Tage der Vermehrung wird die Kultur im Allgemeinen durch das Medium, welches innerhalb des Systems nach dem anfänglichen Beimpfen enthalten ist, zufriedengestellt. Die Menge an Zeit zwischen dem anfänglichen Beimpfen und dem Beginn der Mediumperfusion ist abhängig von der Dichte von Zellen in dem für das Beimpfen verwendeten Inokulum und der Zellvermehrungsrate. Die Messung der Nährstoffkonzentration in dem zirkulierenden Medium ist ein guter Indikator für den Status der Kultur. Wenn eine Vorgehensweise etabliert wird, kann es erforderlich sein, die Nährstoffzusammensetzung bei einem Spektrum von verschiedenen Perfusionsra ten zu überwachen, um die wirtschaftlichsten und produktivsten Betriebsparameter zu bestimmen.
  • Zellen innerhalb des Systems erreichen eine höhere Lösungsdichte (Zellen/ml) als in traditionellen Kultursystemen. Viele typischerweise verwendete Basismedien sind so gestaltet, dass sie 1–2 × 106 Zellen/ml/Tag unterstützen. Ein typischer CellcubeTM-Lauf mit einer Oberfläche von 85000 cm2 enthält ungefähr 6 l Medium innerhalb des Moduls. Die Zelldichte übersteigt oftmals 107 Zellen/ml in dem Kulturgefäß. Bei Konfluenz werden pro Tag 2–4 Reaktorvolumen Medium benötigt.
  • Der zeitliche Ablauf und die Parameter der Produktionsphase von Kulturen hängen von der Art und der Verwendung einer bestimmten Zelllinie ab. Viele Kulturen benötigen ein unterschiedliches Medium für die Produktion, als es für die Vermehrungsphase der Kultur erforderlich ist. Der Übergang von einer Phase zu der anderen wird wahrscheinlich eine Mehrzahl von Waschschritten in traditionellen Kulturen erfordern. Das CellcubeTM-System setzt jedoch ein Perfusionssystem ein. Einer der Vorteile eines solchen Systems ist die Fähigkeit, einen sanften Übergang zwischen verschiedenen Betriebsphasen bereitzustellen. Das Perfusionssystem negiert die Notwendigkeit für traditionelle Waschschritte, die danach streben, Serumkomponenten in einem Vermehrungsmedium zu entfernen.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform der Erfindung wird das CellCubeTM-System verwendet, um mit AdCMVp53 transfizierte Zellen zu vermehren. 293-Zellen wurden als Inokulum gemäß der Empfehlung des Herstellers in den CellcubeTM eingebracht. Die Inokulationszelldichten lagen im Bereich von 1–1,5 × 104/cm2. Man ließ Zellen 7 Tage bei 37°C unter Kulturbedingungen von pH = 7,20, DO = 60% Luftsättigung sich vermehren. Die Mediumperfusionsrate wurde gemäß der Glucosekonzentration in dem CellcubeTM reguliert. Einen Tag vor der Virusinfektion wurde das Medium für die Perfusion von einem Puffer, welcher 10% FBS umfasste, zu einem Puffer, welcher 2% FBS umfasste, geändert. Am Tag 8 wurden Zellen mit Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 infiziert. Die Mediumperfusion wurde nach der Infektion unverzüglich für 1 h gestoppt, dann für den restlichen Zeitraum der Virusproduktionsphase wieder aufgenommen. Die Kultur wurde 45–48 h nach der Infektion geerntet. Diese Kulturbedingungen sind selbstverständlich beispielhaft und können gemäß den Ernährungserfordernissen und Vermehrungserfordernissen einer bestimmten Zelllinie variiert werden. Eine solche Variation kann ohne unangemessene Experimentierarbeit ausgeführt werden und liegt ohne Weiteres innerhalb der Fachkenntnisse des Fachmanns auf diesem Gebiet.
  • G) Serumfreie Suspensionskultur
  • In bestimmten Ausführungsformen werden adenovirale Vektoren für eine Gentherapie ausgehend von einer Verankerungs-abhängigen Kultur von 293-Zellen (293A-Zellen), wie oben beschrieben, hergestellt. Eine maßstäbliche Vergrößerung der Produktion von adenoviralen Vektoren wird durch die Verankerungsabhängigkeit von 293A-Zellen begrenzt. Um die maßstäbliche Vergrößerung zu vereinfachen und den zukünftigen Bedarf an adenoviralen Vektoren zu erfüllen, sind signifikante Bemühungen der Entwicklung von alternativen Herstellungsverfahren, die einer maßstäblichen Vergrößerung zugänglich sind, gewidmet worden. Verfahren umfassen das Vermehren von 293A-Zellen in Microcarrier-Kulturen und die Adaptierung von 293A-Produzentenzellen an Suspensionskulturen. Microcarrier-Kulturtechniken sind oben beschrieben worden. Diese Technik beruht auf der Anheftung von Produzentenzellen an die Oberflächen von Microcarriern, die in Kulturmedium durch mechanische Bewegung suspendiert sind. Das Erfordernis einer Zellanheftung kann der maßstäblichen Vergrößerung von Microcarrier-Kulturen einige Beschränkungen auferlegen.
  • Darüber hinaus erfordern die berichteten 293-Suspensionszellen das Vorhandensein von 5–10% FBS im Kulturmedium für eine optimale Zellvermehrung und Virusproduktion. Historisch bestanden Bedenken auf der Seite von Verordnungen erlassenden Institutionen hinsichtlich des Vorhandenseins von Proteinen von Rinder-Herkunft in Zellkulturmedien, speziell unlängst aufgrund des Ausbruchs von Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE; bovine spongiforme Enzephalopathie) in einigen Ländern. Es muss ein rigoroses und komplexes nachgeschaltetes Reinigungsverfahren entwickelt werden, um kontaminierende Proteine und jegliche fremde Viren aus dem Endprodukt zu entfernen. Die Entwicklung einer serumfreien 293-Suspensionskultur wird als eine hauptsächliche Verfahrensverbesserung für die Herstellung von adenoviralen Vektoren für die Gentherapie angesehen.
  • Ergebnisse einer Virusproduktion in Spinner-Kolben und einem Bioreaktor mit einem gerührten 3 l-Tank zeigen an, dass die zellspezifische Virusproduktivität der 293SF-Zellen ungefähr 2,5 × 104 vp/Zelle betrug, welche ungefähr 60–90% von jener aus den 293A-Zellen ist. Jedoch ist aufgrund der höheren stationären Zellkonzentration die volumetrische Virusproduktivität ausgehend von der 293SF-Kultur im Wesentlichen äquivalent zu jener der 293A-Zellkultur. Die Erfinder haben auch beobachtet, dass die Virusproduktion signifikant zunahm, indem ein frischer Mediumaustausch zum Zeitpunkt der Virusinfektion ausgeführt wurde. Die Erfinder sind dabei, die limitierenden Faktoren im Medium auszuwerten.
  • Diese Feststellungen ermöglichen ein maßstäblich vergrößerbares, effizientes und leicht validierbares Verfahren für die Herstellung von adenoviralen Vektoren. Dieses Adaptierungsverfahren ist nicht nur auf 293A-Zellen beschränkt und wird in gleicher Weise nützlich sein, wenn es auf andere Produzentenzellen von adenoviralen Vektoren angewendet wird.
  • 3. Verfahren zur Zellernte und -lyse
  • Eine Infektion durch Adenoviren führt zur Lyse der Zellen, die infiziert werden. Die lytischen Merkmale einer Adenovirus-Infektion erlauben zwei unterschiedliche Arten der Virusproduktion. Eine besteht in dem Ernten von infizierten Zellen vor der Zelllyse. Die andere Art und Weise besteht in dem Ernten von Virusüberstand nach vollständiger Zelllyse durch das produzierte Virus. Für die letztgenannte Art und Weise werden längere Inkubationsdauern benötigt, um eine vollständige Zelllyse zu erzielen. Diese verlängerte Inkubationszeit nach der Virusinfektion erzeugt ernsthafte Bedenken über die erhöhte Möglichkeit einer Erzeugung von replikationskompetenten Adenoviren (RCA), insbesondere für die gegenwärtige erste Generation von adenoviralen Vektoren (Vektoren mit E1-Deletion). Dementsprechend wurde das Ernten von infizierten Zellen vor einer Zelllyse als Produktionsweise der Wahl gewählt. Tabelle 1 listet die üblichsten Methoden, die zum Lysieren von Zellen nach der Zellernte verwendet worden sind, auf. TABELLE 1. Für die Zelllyse verwendete Methoden
    Figure 00260001
  • A) Detergentien
  • Zellen werden durch Membranen umgrenzt. Um Komponenten der Zelle freizusetzen, ist es notwendig, die Zellen aufzubrechen. Die vorteilhafteste Weise, auf welche dies bewerkstelligt werden kann, besteht gemäß der Erfindung darin, die Membranen durch Verwendung von De tergentien zu solubilisieren. Detergentien sind amphipathische Moleküle mit einem unpolaren Ende von aliphatischer oder aromatischer Natur und einem polaren Ende, welches geladen oder ungeladen sein kann. Detergentien sind hydrophiler als Lipide und weisen dementsprechend eine größere Wasserlöslichkeit als Lipide auf. Sie ermöglichen die Dispergierung von in Wasser unlöslichen Verbindungen in wässrigen Medien und werden verwendet, um Proteine in einer nativen Form zu isolieren und zu reinigen.
  • Detergentien können denaturierend oder nicht-denaturierend sein. Die Erstgenannten können anionisch, wie Natriumdodecylsulfat, oder kationisch, wie Ethyltrimethylammoniumbromid, sein. Diese Detergentien zerstören Membranen vollständig und denaturieren das Protein durch Zerstören von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Nicht-denaturierende Detergentien können unterteilt werden in nicht-anionische Detergentien, wie Triton® X-100, Gallensalze, wie Cholate, und zwitterionische Detergentien, wie CHAPS. Zwitterionische Detergentien enthalten sowohl kationische als auch anionische Gruppen in demselben Molekül, die positive Ladung wird durch die negative Ladung an demselben oder einem benachbarten Molekül neutralisiert.
  • Denaturierende Mittel, wie SDS, binden an Proteine als Monomere und die Reaktion wird durch ein Gleichgewicht angetrieben, bis sie gesättigt ist. Dementsprechend bestimmt die Konzentration an freien Monomeren die notwendige Detergenskonzentration. Die SDS-Bindung erfolgt kooperativ, d.h. die Bindung von einem Molekül SDS erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein anderes Molekül sich an jenes Protein bindet, und verändert das Protein zu Stäbchen, deren Länge proportional zu deren Molekulargewicht ist.
  • Nicht-denaturierende Mittel, wie Triton® X-100, binden weder an native Konformationen noch haben sie einen kooperativen Bindungsmechanismus. Diese Detergentien haben starre und sperrige apolare Gruppierungen, die in wasserlösliche Proteine nicht eindringen. Sie binden an die hydrophoben Teile von Proteinen. Triton® X-100 und andere nicht-anionische Polyoxyethylen-Detergentien sind unwirksam, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu zerstören, und können künstliche Aggregate von Protein hervorrufen. Diese Detergentien werden jedoch Protein-Lipid-Wechselwirkungen zerstören, sind aber viel sanfter und in der Lage, die native Form und funktionalen Eigenschaften der Proteine zu bewahren.
  • Die Detergentienentfernung kann auf verschiedene Weisen versucht werden. Dialyse funktioniert gut mit Detergentien, die als Monomere vorliegen. Die Dialyse ist in gewissem Maße unwirksam bei Detergentien, die leicht unter Bildung von Micellen aggregieren, da Micellen zu groß sind, um durch die Dialyse hindurchzugehen. Ionenaustauschchromatographie kann eingesetzt werden, um dieses Problem zu umgehen. Die Lösung mit aufgebrochenem Protein wird auf eine Ionenaustauschchromatographiesäule aufgetragen und die Säule wird dann mit Puffer ohne Detergens gewaschen. Das Detergens wird als Ergebnis der Äquilibrierung des Puffers mit der Detergenslösung entfernt werden. Alternativ kann die Proteinlösung durch einen Dichtegradient geleitet werden. Während das Protein durch die Gradienten sedimentiert, wird das Detergens aufgrund des chemischen Potentials entfernt werden.
  • Oftmals ist ein einzelnes Detergens nicht vielseitig genug für die Solubilisierung und Analyse des Milieus von Proteinen, das in einer Zelle gefunden wird. Die Proteine können in einem Detergens solubilisiert werden und dann in ein anderes geeignetes Detergens für eine Proteinanalyse gegeben werden. Die in dem ersten Schritt gebildeten Protein-Detergens-Micellen sollten sich von reinen Detergens-Micellen abtrennen. Wenn diese zu einem Überschuss von Detergens für eine Analyse zugegeben werden, wird das Protein in Micellen mit beiden Detergentien gefunden. Die Abtrennung der Detergens-Protein-Micellen kann mit Ionenaustausch- oder Gelfiltrationschromatographie, Dialyse oder Trennnungen vom Schwebedichten-Typ, bewerkstelligt werden.
  • Triton® X-Detergentien: Diese Familie von Detergentien (Triton® X-100, X114 und NP-40) weist die gleichen grundlegenden Merkmale auf, sie unterscheiden sich aber in ihrer speziellen hydrophoben-hydrophilen Natur. Alle diese heterogenen Detergentien haben eine verzweigte 8-Kohlenstoff-Kette, die an einen aromatischen Ring angeheftet ist. Dieser Abschnitt des Moleküls trägt am meisten zu der hydrophoben Natur des Detergens bei. Triton® X-Detergentien werden verwendet, um Membranproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen zu solubilisieren. Die Wahl des Detergens, um Proteine zu solubilisieren, wird von der hydrophoben Natur des zu solubilisierenden Proteins abhängen. Hydrophobe Proteine erfordern hydrophobe Detergentien, um sie effektiv zu solubilisieren.
  • Triton® X-100 und NP-40 sind in Struktur und Hydrophobizität sehr ähnlich und sind in den meisten Anwendungen, einschließlich Zelllyse, Lipidentfernung, Proteindissoziation und Membranprotein- und Lipidsolubilisierung, gegeneinander austauschbar. Im Allgemeinen werden 2 mg Detergens verwendet, um 1 mg Membranprotein zu solubilisieren, oder 10 mg Detergens/1 mg Lipidmembran. Triton® X-114 ist nützlich, um hydrophobe von hydrophilen Proteinen zu trennen.
  • Brij®-Detergentien: Diese sind in der Struktur ähnlich zu Triton® X-Detergentien, indem sie variierende Längen von Polyoxyethylen-Ketten, die an eine hydrophobe Kette angeheftet sind, aufweisen. Jedoch weisen die Brij®-Detergentien anders als Triton® X-Detergentien keinen aromatischen Ring auf und die Länge der Kohlenstoffketten kann variieren. Die Brij®- Detergentien sind schwierig aus einer Lösung unter Verwendung von Dialyse zu entfernen, sie können aber durch Detergens-entfernende Gele entfernt werden. Brij® 58 ist Triton® X100 in seinen hydrophoben/hydrophilen Merkmalen am ähnlichsten. Brij®-35 ist ein üblicherweise verwendetes Detergens in HPLC-Anwendungen.
  • Dialysierbare nichtionische Detergentien: η-Octyl-β-D-glucosid (Octylglucopyranosid) und η-Octyl-β-D-thioglucosid (Octylthioglucopyranosid, OTG) sind nicht-denaturierende nichtionische Detergentien, die aus einer Lösung leicht durch Dialyse entfernt werden. Diese Detergentien sind nützlich für das Solubilisieren von Membranproteinen und zeigen bei 280 nm geringe UV-Absorption. Octylglucosid weist eine hohe CMC von 23–25 mM auf und ist in Konzentrationen von 1,1–1,2% verwendet worden, um Membranproteine zu solubilisieren.
  • Octylthioglucosid wurde erstmalig synthetisiert, um eine Alternative zu Octylglucosid anzubieten. Octylglucosid ist teuer herzustellen und es gibt einige inhärente Probleme in biologischen Systemen, da es durch β-Glucosidase hydrolysiert werden kann.
  • Tween®-Detergentien: Die Tween®-Detergentien sind nicht-denaturierende, nichtionische Detergentien. Sie sind Polyoxyethylensorbitanester von Fettsäuren. Tween® 20 und Tween® 80-Detergentien werden als Blockierungsmittel in biochemischen Anwendungen verwendet und werden üblicherweise zu Proteinlösungen zugesetzt, um eine nicht-spezifische Bindung an hydrophobe Materialien, wie Kunststoffe oder Nitrocellulose, zu verhindern. Sie sind als Blockierungsmittel in ELISA- und Blotting-Anwendungen verwendet worden. Im Allgemeinen werden diese Detergentien in Konzentrationen von 0,01–1,0% verwendet, um eine nicht-spezifische Bindung an hydrophobe Materialien zu verhindern.
  • Es ist gezeigt worden, dass Tween® 20 und andere nichtionische Detergentien einige Proteine von der Oberfläche von Nitrocellulose entfernen. Tween® 80 ist verwendet worden, um Membranproteine, vorhandene nicht-spezifische Bindung von Protein an eine Mehrzahl von Vertiefungen aufweisende Kunststoff-Gewebekulturplatten zu solubilisieren und um nicht-spezifische Bindung durch Serumproteine und biotinyliertes Protein A an Polystyrolplatten im ELISA zu verringern.
  • Der Unterschied zwischen diesen Detergentien ist die Länge der Fettsäurekette. Tween® 80 leitet sich von Ölsäure mit einer C18-Kette ab, während Tween® 20 sich von Laurinsäure mit einer C12-Kette ableitet. Die längere Fettsäurekette macht das Tween® 80-Detergens weniger hydrophil als das Tween® 20-Detergens. Beide Detergentien sind in Wasser sehr gut löslich.
  • Die Tween®-Detergentien sind aus einer Lösung durch Dialyse schwierig zu entfernen, Tween® 20 kann aber durch Detergentien entfernende Gele entfernt werden. Die in diesen De tergentien gefundene Polyoxyethylenkette macht sie anfällig für eine Oxidation (Peroxid-Bildung), wie dies für die Detergentien der Triton® X- und Brij®-Reihen zutrifft.
  • Zwitterionische Detergentien: Das zwitterionische Detergens CHAPS ist ein Sulfobetain-Derivat von Cholsäure. Dieses zwitterionische Detergens ist nützlich für die Solubilisierung von Membranproteinen, wenn Proteinaktivität wichtig ist. Dieses Detergens ist über einen breiten pH-Bereich (pH 2–12) nützlich und wird aus einer Lösung durch Dialyse leicht entfernt aufgrund von hohen CMCs (8–10 mM). Dieses Detergens weist bei 280 nm geringe Absorption auf, was dieses nützlich macht, wenn eine Protein-Überwachung bei dieser Wellenlänge erforderlich ist. CHAPS ist mit dem BCA Protein Assay verträglich und kann aus einer Lösung durch ein Detergentien entfernendes Gel entfernt werden. Proteine können in Gegenwart von CHAPS iodiert werden.
  • CHAPS ist erfolgreich verwendet worden, um intrinsische Membranproteine und Rezeptoren zu solubilisieren und die Funktionsfähigkeit des Proteins aufrechtzuerhalten. Wenn Cytochrom P-450 in entweder Triton® X-100 oder Natriumcholat solubilisiert wird, werden Aggregate gebildet.
  • B) Nicht-Detergens-Methoden
  • Verschiedene Nicht-Detergens-Methoden werden, wie folgt, beschrieben:
    Einfrieren-Auftauen: Dies ist eine weithin verwendete Technik zur Zelllyse in einer sanften und wirkungsvollen Weise gewesen. Zellen werden im Allgemeinen schnell in beispielsweise einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren, bis sie vollständig gefroren sind, dann werden sie in ein 37°C-Wasserbad transferiert, bis sie vollständig aufgetaut sind. Dieser Zyklus wird einige Male wiederholt, um eine vollständige Zelllyse zu erzielen.
  • Beschallung: Es ist festgestellt worden, dass Hochfrequenz-Ultraschallschwingungen für das Aufbrechen von Zellen nützlich ist. Die Methode, durch welche Ultraschallwellen Zellen aufbrechen, ist nicht vollständig verstanden, es ist aber bekannt, dass hohe vorübergehende Drücke erzeugt werden, wenn Suspensionen Ultraschallschwingung ausgesetzt werden. Der Hauptnachteil bei dieser Technik besteht darin, dass beträchtliche Mengen an Wärme erzeugt werden. Um Wärmeeffekte zu minimieren, werden speziell gestaltete Glasgefäße verwendet, um die Zellsuspension aufzunehmen. Solche Gestaltungen erlauben, dass die Suspension weg von der Ultraschallsonde zu der Außenseite des Gefäßes zirkuliert, wo sie abkühlt, da der Kolben in Eis gestellt ist.
  • Hochdruck-Extrusion: Dies ist eine häufig verwendete Methode, um mikrobielle Zellen aufzubrechen. Die French-Press-Zelle setzt Drücke von 10,4 × 107 Pa (16000 p.s.i.) ein, um Zel len aufzubrechen. Dieser Apparat besteht aus einer Kammer aus rostfreiem Stahl, die sich zu der Außenseite mittels eines Nadelventils öffnet. Die Zellsuspension wird in die Kammer mit dem Nadelventil in geschlossener Position eingebracht. Nach Umkehren der Kammer wird das Ventil geöffnet und der Kolben hineingestoßen, um jegliche Luft in der Kammer herauszudrücken. Mit dem Ventil in geschlossener Position wird die Kammer wieder in ihre Ausgangslage zurückgebracht, auf eine feste Grundlage gesetzt und der erforderliche Druck auf den Kolben durch eine hydraulische Presse ausgeübt. Wenn der Druck erreicht worden ist, wird das Nadelventil teilweise geöffnet, um den Druck geringfügig abzulassen, und während die Zellen expandieren, platzen sie. Das Ventil wird offen gehalten, während der Druck beibehalten wird, so dass es einen Tropfenfall von aufgebrochenen Zellen gibt, der gesammelt werden kann.
  • Feststoff-Scherungsmethoden: Ein mechanisches Scheren mit Schleifmitteln kann erzielt werden in Mickle-Schüttlern, die eine Suspension kräftig in Schwingungen versetzen (300–3000-mal/min) in Gegenwart von Glaskörnchen von 500 nm Durchmesser. Diese Methode kann zu Organellenschädigung führen. Eine besser kontrollierte Methode besteht darin, eine Hughes-Press zu verwenden, wo ein Kolben die meisten Zellen zusammen mit Schleifmitteln oder tiefgefrorener Paste von Zellen durch einen 0,25 mm Durchmesser-Schlitz in der Druckkammer presst. Drücke von bis zu 5,5 × 107 Pa (8000 p.s.i.) können verwendet werden, um Bakterienpräparationen zu lysieren.
  • Flüssigkeits-Scherungsmethoden: Diese Methoden setzen Mischer, die mit hoher Geschwindigkeit hin- und hergehende oder rotierende Blätter oder Schaufeln verwenden, Homogenisatoren, die eine Aufwärts/Abwärtsbewegung eines Plungerkolbens und Balls verwenden, und Microfluidizer oder „Impinging Jet" (auftreffender Strahl)-Vorrichtungen, die eine Passage mit hoher Geschwindigkeit durch Schläuche/Rohre mit kleinem Durchmesser oder ein Auftreffen von zwei Fluidströmen mit hoher Geschwindigkeit verwenden, ein. Die Schaufeln oder Blätter von Mischern sind in unterschiedlichen Winkeln geneigt, um ein effizientes Mischen zu erlauben. Homogenisatoren werden üblicherweise in kurzen Hochgeschwindigkeits-Bursts von einigen wenigen Sekunden betrieben, um örtliche Wärme zu minimieren. Diese Techniken sind nicht generell für mikrobielle Zellen geeignet, aber sogar eine sehr sanfte Flüssigkeitsscherung ist üblicherweise adäquat, um tierische Zellen aufzubrechen.
  • Hypotonische/Hypertonische Methoden: Zellen werden einer Lösung mit einer viel geringeren (hypotonischen) oder höheren (hypertonischen) Konzentration an gelösten Stoffen ausgesetzt. Der Unterschied der Konzentration der gelösten Stoffe erzeugt einen osmotischen Druckgradienten. Der resultierende Einstrom von Wasser in die Zelle in einer hypotonischen Umgebung bewirkt, dass die Zellen quellen und bersten. Der Ausfluss von Wasser aus der Zelle in einer hypertonischen Umgebung bewirkt, dass die Zellen schrumpfen und nachfolgend zerplatzen.
  • 4. Verfahren zur Konzentrierung und Filtration
  • Ein Aspekt der Erfindung setzt Verfahren zur rohen Reinigung von Adenovirus aus einem Zelllysat ein. Diese Methoden umfassen Klärung, Konzentrierung und Diafiltration. Der anfängliche Schritt in diesem Reinigungsverfahren ist eine Klärung des Zelllysats, um großes partikuläres Material, insbesondere Zellkomponenten, aus dem Zelllysat zu entfernen. Eine Klärung des Lysats kann erzielt werden unter Verwendung eines Tiefenfilters (Depth Filter) oder durch Tangentialflussfiltration. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Zelllysat durch einen Tiefenfilter geleitet, welcher aus einer gepackten Säule von relativ nicht-adsorbierendem Material (z.B. Polyesterharze, Sand, Diatomeenerde, Kolloide, Gele und dergleichen) besteht. Bei einer Tangentialflussfiltration (TFF) strömt die Lysatlösung entlang einer Membranoberfläche, die die Rückdiffusion von gelösten Materialien von der Membranoberfläche in die Filtrationslösung (Bulk Solution) vereinfacht. Membranen werden im Allgemeinen innerhalb von verschiedenen Arten von Filterapparaturen angeordnet, einschließlich Platten mit offenen Kanälen und Rahmen, Hohlfasern und Röhrchen.
  • Nach Klärung und Vorfiltration des Zelllysats wird der resultierende Virusüberstand zuerst aufkonzentriert und dann wird der Puffer durch Diafiltration ausgetauscht. Der Virusüberstand wird durch Tangentialflussfiltration entlang einer Ultrafiltrationsmembran von 100–300 K nominalem Molekulargewichtsausschluss aufkonzentriert. Ultrafiltration ist ein Druckmodifiziertes Konvektionsverfahren, das semipermeable Membranen verwendet, um Spezies anhand von Molekülgröße, -gestalt und/oder -ladung zu trennen. Sie trennt Lösemittel von gelösten Stoffen verschiedener Größen unabhängig von der Molekülgröße des gelösten Materials ab. Ultrafiltration ist sanft, wirkungsvoll und kann verwendet werden, um Lösungen gleichzeitig aufzukonzentrieren und zu entsalzen. Ultrafiltrationsmembranen weisen im Allgemeinen zwei unterschiedliche Lagen auf: eine dünne (0,1–1,5 μm) dichte Haut mit einem Porendurchmesser von 10–400 Angström und eine offene Unterstruktur mit fortschreitend größeren Hohlräumen, die überwiegend offen sind zu der Permeat-Seite des Ultrafilters. Dementsprechend kann eine jegliche Spezies, die in der Lage ist, durch die Poren der Haut hindurchzutreten, frei durch die Membran hindurchtreten. Für eine maximale Zurückhaltung von gelöstem Material wird eine Membran ausgewählt, die einen nominalen Molekulargewichtsausschluss deutlich unterhalb von jenem der Spezies, die zurückgehalten wird, aufweist. Bei der Konzentrierung von Makromolekülen reichert die Membran den Gehalt der gewünschten biologischen Spezies an und stellt ein Filtrat, das von zurückgehaltenen Substanzen befreit ist, bereit. Mikrosolute (gelöste Mikrostoffe) werden mit dem Lösemittel konvektiv entfernt. In dem Zuge, wie die Konzentration des zurückgehaltenen gelösten Materials zunimmt, nimmt die Ultrafiltrationsrate ab.
  • Diafiltration oder Pufferaustausch unter Verwendung von Ultrafiltern ist eine ideale Weise für eine Entfernung und einen Austausch von Salzen, Zuckern, nicht-wässrigen Lösemitteln, zur Trennung von freien von gebundenen Spezies, Entfernung von Material von niedrigem Molekulargewicht oder zur schnellen Veränderung von ionischen und pH-Umgebungen. Mikrosolute werden am effizientesten entfernt, indem Lösemittel zu der der Ultrafiltration zu unterziehenden Lösung hinzugesetzt wird mit einer Rate, die gleich der Ultrafiltrationsrate ist. Dies wäscht Mikrospezies aus der Lösung bei konstantem Volumen aus, wodurch die zurückgehaltene Spezies gereinigt wird. Die Erfindung setzt einen Diafiltrationsschritt ein, um den Puffer des Virusüberstands vor einer Benzonase®-Behandlung auszutauschen.
  • 5. Virusinfektion
  • Die Erfindung setzt in einem Beispiel eine adenovirale Infektion von Zellen ein, um therapeutisch signifikante Vektoren zu erzeugen. Typischerweise wird das Virus einfach gegenüber der geeigneten Wirtszelle unter physiologischen Bedingungen, welche eine Aufnahme des Virus erlauben, exponiert.
  • Adenovirus
  • Adenovirus ist für eine Verwendung als Gentransfervektor besonders geeignet aufgrund von dessen DNA-Genom von mittlerer Größe, leichter Handhabung, hohem Titer, breitem Zielzellspektrum und hoher Infektiosität. Das Virusgenom von grob 36 kb wird durch invertierte terminale Sequenzwiederholungen (ITR) von 100–200 Basenpaaren (bp) begrenzt, in welchen cis-wirkende Elemente, die für die Virus-DNA-Replikation und Verpackung erforderlich sind, enthalten sind. Die frühen (E) und späten (L) Regionen des Genoms, die unterschiedliche Transkriptionseinheiten enthalten, werden durch den Beginn der viralen DNA-Replikation unterteilt.
  • Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert Proteine, die für die Regulation der Transkription des Virusgenoms und einiger weniger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zu der Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Dieses Proteine sind an der DNA-Replikation, der Expression der späten Gene und am Abschal ten der Wirtszelle beteiligt (Renan, 1990). Die Produkte der späten Gene (L1, L2, L3, L4 und L5), einschließlich der Hauptmenge der viralen Kapsidproteine, werden nur nach signifikanter Prozessierung eines einzelnen primären Transkripts, welches durch den „major late"-Promotor (MLP) bereitgestellt wird, exprimiert. Der MLP (lokalisiert bei 16,8 Karten-Einheiten) ist während der späten Phase der Infektion besonders effizient und alle ausgehend von diesem Promotor bereitgestellten mRNAs weisen eine dreiteilige 5'-Leader (TL; „tripartite Leader")-Sequenz auf, die sie zu bevorzugten mRNAs für eine Translation macht.
  • Um ein Adenovirus für eine Gentherapie zu optimieren, ist es erforderlich, das Aufnahmevermögen zu maximieren, so dass große DNA-Segmente aufgenommen werden können. Es ist auch sehr wünschenswert, die Toxizität und immunologische Reaktion, die mit bestimmten adenoviralen Produkten verbunden sind, zu verringern. Eine Entfernung von großen Abschnitten des adenoviralen Genoms und das Bereitstellen der deletierten Genprodukte in trans durch Helferviren und/oder Helferzellen erlaubt die Insertion von großen Abschnitten von heterologer DNA in den Vektor. Diese Strategie wird auch zu verringerter Toxizität und Immunogenität der Adenovirus-Genprodukte führen.
  • Das umfängliche Ersetzen von DNA ist möglich, da die cis-Elemente, die für die virale DNA-Replikation erforderlich sind, allesamt in den invertierten terminalen Sequenzwiederholungen (ITR) (100–200 bp) an beiden Enden des linearen viralen Genoms lokalisiert sind. Plasmide, die ITRs enthalten, können in Gegenwart eines nicht-defekten Adenovirus replizieren (Hay et al., 1984). Dementsprechend sollte eine Aufnahme dieser Elemente in einen adenoviralen Vektor eine Replikation erlauben.
  • Zusätzlich befindet sich das Verpackungssignal für die Virus-Einkapselung zwischen 194–385 bp (0,5–1,1 Karten-Einheiten) am linken Ende des Virusgenoms (Hearing et al., 1987). Dieses Signal ahmt die Proteinerkennungsstelle in der Bakteriophage λ-DNA nach, wo eine spezielle Sequenz nahe dem linken Ende, aber außerhalb der Sequenz des kohäsiven Endes, die Bindung an Proteine, die für eine Insertion der DNA in die Kopfstruktur benötigt werden, vermittelt. E1-Substitutionsvektoren von Ad haben gezeigt, dass ein 450 bp (0–1,25 Karten-Einheiten)-Fragment am linken Ende des Virusgenoms eine Verpackung in 293-Zellen dirigieren konnte (Levrero et al., 1991).
  • Zuvor ist gezeigt worden, dass bestimmte Regionen des adenoviralen Genoms in das Genom von Säugetierzellen eingebaut werden können und die dadurch kodierten Gene exprimiert werden können. Diese Zelllinien sind in der Lage, die Replikation eines adenoviralen Vektors zu unterstützen, der hinsichtlich der adenoviralen Funktion, die durch die Zelllinie kodiert wird, defizient ist (einen Mangel aufweist). Es gibt auch Berichte über eine Komplementierung von replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren durch „Hilfs"-Vektoren, z.B. Wildtyp-Virus oder konditional defekte Mutanten.
  • Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren können in trans durch Helferviren komplementiert werden. Diese Beobachtung allein erlaubt jedoch keine Isolierung der replikationsdefizienten Vektoren, da das Vorhandensein von Helferviren, welche benötigt werden, um Replikationsfunktionen bereitzustellen, eine jegliche Präparation kontaminieren würde. Dementsprechend wurde ein zusätzliches Element benötigt, das der Replikation und/oder der Verpackung des replikationsdefizienten Vektors zusätzlich Spezifität verleihen würde. Jenes Element leitet sich, wie im Rahmen der Erfindung vorgesehen, von der Verpackungsfunktion von Adenoviren ab.
  • Es ist gezeigt worden, dass ein Verpackungssignal für Adenovirus in dem linken Ende der herkömmlichen Adenovirus-Karte existiert (Tibbetts, 1977). Spätere Untersuchungen zeigten, dass eine Mutante mit einer Deletion in der E1A (194–358 bp)-Region des Genoms sich sogar in einer Zelllinie, die die frühe (E1A) Funktion komplementierte, schlecht vermehrte (Hearing und Shenk, 1983). Wenn eine kompensierende adenovirale DNA (0–353 bp) durch Rekombination in das rechte Ende der Mutante eingefügt wurde, wurde das Virus normal verpackt. Weitere Mutationsanalysen identifizierten ein kurzes, wiederholtes, positionsabhängiges Element in dem linken Ende des Ad5-Genoms. Es wurde festgestellt, dass eine Kopie der Wiederholungssequenz für eine effiziente Verpackung ausreichend ist, wenn sie an einem der beiden Enden des Genoms vorhanden ist, nicht aber, wenn sie in Richtung des Inneren des Ad5-DNA-Moleküls bewegt wird (Hearing et al., 1987).
  • Durch Verwendung von mutierten Versionen des Verpackungssignals ist es möglich, Helferviren zu erzeugen, die mit variierenden Effizienzen verpackt werden. Typischerweise sind die Mutationen Punktmutationen oder Deletionen. Wenn Helferviren mit geringer Verpackungseffizienz in Helferzellen vermehrt werden, wird das Virus verpackt, obgleich mit verringerten Raten verglichen mit Wildtyp-Virus, wodurch eine Vermehrung der Helferviren erlaubt wird. Wenn diese Helferviren in Zellen zusammen mit Virus, das Wildtyp-Verpackungssignal enthält, vermehrt werden, werden jedoch die Wildtyp-Verpackungssignale präferentiell gegenüber den mutierten Versionen erkannt. Gibt es nur eine limitierende Menge an Verpackungsfaktor, werden die die Wildtyp-Signale enthaltenden Viren verglichen mit den Helferviren selektiv verpackt. Wenn die Präferenz groß genug ist, sollten Stammlösungen, die sich Homogenität annähern, erhalten werden.
  • 6. Gentechnologische Modifizierung von viralen Vektoren
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Erfindung weiter die Manipulation von viralen Vektoren. Solche Verfahren umfassen die Verwendung eines Vektorkonstrukts, welches beispielsweise eine heterologe DNA, die ein Gen von Interesse kodiert, und ein Mittel für deren Expression enthält, ein Replizieren des Vektors in einer geeigneten Helferzelle, das Gewinnen von ausgehend davon produzierten Viruspartikeln und ein Infizieren von Zellen mit den rekombinanten Viruspartikeln. Das Gen könnte einfach ein Protein kodieren, für welches große Mengen des Proteins gewünscht werden, d.h. in großem Maßstab ausgeführte in vitro-Produktionsmethoden. Alternativ könnte das Gen ein therapeutisches Gen sein, um beispielsweise Krebszellen zu behandeln, immunmodulatorische Gene zu exprimieren, um Virusinfektionen zu bekämpfen, oder um die Funktion eines Gens als Ergebnis eine genetischen Defekts zu ersetzen. Im Kontext des Gentherapievektors wird das Gen eine heterologe DNA sein, womit gemeint ist, dass es DNA umfasst, die von einer anderen Quelle als dem Virusgenom, das das Grundgerüst für den Vektor bereitstellt, abgeleitet ist. Schließlich kann das Virus als ein viraler Lebendimpfstoff wirken und ein Antigen von Interesse für die Produktion von Antikörpern gegen dieses exprimieren. Das Gen kann von einer prokaryotischen oder eukaryotischen Quelle, wie einem Bakterium, einem Virus, einer Hefe, einem Parasiten, einer Pflanze oder sogar einem Tier abgeleitet sein. Die heterologe DNA kann auch von mehr als einer Quelle abgeleitet sein, d.h. ein Multigen-Konstrukt oder ein Fusionsprotein. Die heterologe DNA kann auch eine regulatorische Sequenz, die von einer Quelle abgeleitet sein kann, und das Gen aus einer unterschiedlichen Quelle umfassen.
  • A) Therapeutische Gene
  • p53 wird gegenwärtig als ein Tumorsuppressorgen angesehen (Montenarh, 1992). Hohe Konzentrationen von mutiertem p53 sind in vielen Zellen, die durch chemische Kanzerogenese, Bestrahlung mit ultraviolettem Licht und mehrere Viren, einschließlich SV40, transformiert worden sind, gefunden worden. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel für eine durch Mutation hervorgerufene Inaktivierung bei einer großen Vielzahl von humanen Tumoren und ist bereits dokumentiert, das am häufigsten mutierte Gen bei üblichen Krebserkrankungen beim Menschen zu sein (Mercer, 1992). Es ist bei über 50% der humanen NSCLC (Hollestein et al., 1991) und bei einem breiten Spektrum von anderen Tumoren mutiert.
  • Das p53-Gen kodiert ein 393 Aminosäuren-Phosphoprotein, das Komplexe mit Wirtsproteinen, wie dem großen T-Antigen und E1B, bilden kann. Das Protein wird in normalen Geweben und Zellen gefunden, aber in Konzentrationen, die im Allgemeinen sehr gering sind im Vergleich zu transformierten Zellen oder Tumorgewebe. Interessanterweise scheint Wildtyp-p53 bei der Regulation von Zellvermehrung und -teilung wichtig zu sein. Es ist gezeigt worden, dass eine Überexpression von Wildtyp-p53 in einigen Fällen bei humanen Tumorzelllinien antiproliferativ wirken kann. Dementsprechend kann p53 als ein negativer Regulator der Zellvermehrung wirken (Weinberg, 1991) und kann direkt unkontrollierte Zellvermehrung supprimieren oder direkt oder indirekt Gene aktivieren, die diese Vermehrung supprimieren. Dementsprechend kann ein Fehlen oder eine Inaktivierung von Wildtyp-p53 zu Transformation beitragen. Jedoch weisen einige Untersuchungen darauf hin, dass das Vorhandensein von mutiertem p53 für eine vollständige Expression des transformierenden Potentials des Gens erforderlich sein kann.
  • Wildtyp-p53 wird als ein wichtiger Regulator der Vermehrung bei vielen Zellarten angesehen. Missense-Mutationen sind für das p53-Gen üblich und treten bekanntermaßen bei wenigstens 30 unterschiedlichen Codons auf, wobei oftmals dominante Allele erzeugt werden, die Verschiebungen beim Zellphänotyp ohne eine Reduktion zu Homozygotie erzeugen. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert und in der Keimbahn weitergegeben zu werden. Es erweist sich, dass verschiedene mutierte Allele von minimal funktionsgestörten bis zu stark penetrierenden dominanten negativen Allelen reichen (Weinberg, 1991).
  • Casey und Kollegen haben darüber berichtet, dass eine Transfektion von zwei humanen Brustkrebszelllinien mit DNA, welche Wildtyp-p53 kodiert, die Vermehrungssuppressionskontrolle in solchen Zellen wiederherstellt (Casey et al., 1991). Eine ähnliche Wirkung ist auch bei einer Transfektion von humanen Lungenkrebszelllinien mit Wildtyp-, nicht aber mit mutiertem p53 gezeigt worden (Takahasi et al., 1992). P53 erscheint dominant gegenüber dem mutierten Gen und wird eine Selektion gegenüber einer Proliferation ermöglichen, wenn Zellen mit dem mutierten Gen damit transfiziert werden. Eine normale Expression des transfizierten p53 ist für normale Zellen mit endogenem Wildtyp-p53 nicht schädlich. Dementsprechend könnten solche Konstrukte ohne abträgliche Wirkungen durch normale Zellen aufgenommen werden. Es wird dementsprechend vorgeschlagen, dass die Behandlung von mit p53 assoziierten Krebsarten mit Wildtyp-p53-Expressionskonstrukten die Anzahl von malignen Zellen oder deren Vermehrungsrate verringern wird. Darüber hinaus legen neuere Untersuchungen nahe, dass einige p53- Wildtyp-Tumore ebenfalls gegenüber den Wirkungen einer Expression von exogenem p53 empfindlich sind.
  • Die hauptsächlichen Übergänge des eukaryotischen Zellzyklus werden durch Cyclinabhängige Kinasen oder CDKs ausgelöst. Ein CDK, die Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK4), reguliert die Progression durch die G1-Phase. Die Aktivität dieses Enzyms kann darin bestehen, Rb in der späten G1-Phase zu phosphorylieren. Die Aktivität von CDK4 wird kontrolliert durch eine aktivierende Untereinheit, D-Typ-Cyclin, und durch eine inhibitorische Untereinheit, z.B. p16INK4, das biochemisch als ein Protein, das spezifisch an CDK4 bindet und diese hemmt und dementsprechend die Rb-Phosphorylierung regulieren kann, charakterisiert worden ist (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Da das p16INK4-Protein ein CDK4-Inhibitor ist (Serrano, 1993), kann eine Deletion dieses Gens die Aktivität von CDK4 erhöhen, was zu einer Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins führt. p16 reguliert auch bekanntermaßen die Funktion von CDK6.
  • p16INK4 gehört zu einer neu beschriebenen Klasse von CDK-inhibierenden Proteinen, die auch p16B, p21WAF1,CIPI,SDII und p27KIP1 umfasst. Das p16INK4-Gen kartiert auf 9p21, eine Chromosomenregion, die bei vielen Tumorarten häufig deletiert ist. Homozygote Deletionen und Mutationen des p16INK4-Gens sind in humanen Tumorzelllinien häufig. Dieser Hinweis legt nahe, dass das p16INK4-Gen ein Tumorsuppressorgen ist. Diese Interpretation ist jedoch durch die Beobachtung, dass die Häufigkeit der p16INK4-Gen-Veränderungen bei primären unkultivierten Tumoren viel geringer ist als in kultivierten Zelllinien, in Frage gestellt worden (Caldas et al., 1994; Chen et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994a; Kamb et al., 1994b; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). Eine Wiederherstellung von Wildtyp-p16INK4-Funktion durch Transfektion mit einem Plasmid-Expressionsvektor verringerte die Kolonienbildung durch einige humane Krebszelllinien (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
  • C-CAM wird in praktisch allen Epithelzellen exprimiert (Odin und Obrink, 1987). C-CAM mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 105 kD wurde ursprünglich aus der Plasmamembran der Ratten-Leberzelle durch dessen Reaktion mit spezifischen Antikörpern, die die Zellaggregation neutralisieren, isoliert (Obrink, 1991). Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass strukturell gesehen C-CAM zu der Immunglobulin (Ig)-Überfamilie gehört und dessen Sequenz hochgradig homolog zu dem carcinoembryonalen Antigen (CEA) ist (Lin und Guidotti, 1989). Die Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems, Cheung et al., (1993a, 1993b und 1993c) zeigte, dass die erste Ig-Domäne von C-CAM für die Zelladhäsionsaktivität kritisch ist.
  • Zelladhäsionsmoleküle oder CAMs sind bekanntermaßen an einem komplexen Netzwerk von molekularen Wechselwirkungen, die Organentwicklung und Zelldifferenzierung regulieren, beteiligt (Edelman, 1985). Neuere Daten legen nahe, dass eine fehlerhafte Expression von CAMs an der Tumorgenese von mehreren Neoplasmen beteiligt sein kann; beispielsweise ist eine verringerte Expression von E-Cadherin, welches hauptsächlich in Epithelzellen exprimiert wird, mit dem Fortschreiten von mehreren Arten von Neoplasmen verbunden (Edelman und Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). Auch zeigten Giancotti und Ruoslahti (1990), dass ein Erhöhen der Expression von α5β1-Integrin durch Gentransfer die Tumorigenität von Ovarzellen des chinesischen Hamsters in vivo verringern kann. Es ist jetzt gezeigt worden, dass C-CAM Tumorwachstum in vitro und in vivo supprimiert.
  • Andere Tumorsuppressoren, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen RB, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, BRCA1, VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, C-CAM, p27 und BRCA2. Apoptose-Induktoren, wie Bax, Bak, Bcl-X5, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad und ICE-CED3-Proteasen, könnten in ähnlicher Weise gemäß der Erfindung Verwendung finden.
  • Verschiedene Enzymgene sind gemäß der Erfindung von Interesse. Solche Enzyme umfassen Cytosindesaminase, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase, Phenylalaninhydroxylase, Glucocerebrosidase, Sphingomyelinase, α-L-Iduronidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, HSV-Thymidinkinase und humane Thymidinkinase.
  • Hormone sind eine andere Gruppe von Genen, die in den hier beschriebenen Vektoren verwendet werden können. Umfasst werden Wachstumshormon, Prolactin, placentares Lactogen, luteinisierendes Hormon, Follikel-stimulierendes Hormon, Choriongonadotropin, Thyreotropin, Leptin, Adrenocorticotropin (ACTH), Angiotensin I und II, β-Endorphin, β-Melanozyten stimulierendes Hormon (β-MSH), Cholecystokinin, Endothelin I, Galanin, gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP), Glucagon, Insulin, Lipotropine, Neurophysine, Somatostatin, Calcitonin, das mit dem Calcitonin-Gen verwandte Peptid (CGRP; „calcitonin gene related peptide"), das „β-calcitonin gene related peptide", der Hyperkalzämie- oder Malignitätsfaktor (1–40), Parathormon-verwandtes Protein (107–139) (PTH-rP), Parathormon-verwandtes Protein (107–111) (PTH-rP), Glucagon-artiges Peptid (GLP-1), Pankreastatin, pankreatisches Peptid, Peptid YY, PHM, Sekretin, vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Oxytocin, Vasopressin (AVP), Vasotocin, Enkephalinamid, Metorphinamid, das α-Melanozyten stimulierende Hormon (alpha-MSH), der atriale natriuretische Faktor (5–28) (ANF), Amylin, Amyloid P-Komponente (SAP-1), das Corticotropin-freisetzende Hormon (CRH), der Wachstumshormon-freisetzende Faktor (GHRH), das luteinisierendes Hormon freisetzende Hormon (LHRH), Neuropeptid Y, Substanz K (Neurokinin A), Substanz P und das Thyrotropin freisetzende Hormon (TRH).
  • Andere Klassen von Genen, bezüglich derer beabsichtigt wird, dass sie in die Vektoren der Erfindung inseriert werden, umfassen Interleukine und Zytokine. Interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF und G-CSF.
  • Beispiele von Erkrankungen, für die der virale Vektor nützlich sein würde, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenosindesaminase-Mangel, humaner Blutgerinnungsfaktor IX-Mangel bei Hämophilie B und zystische Fibrose, die das Ersetzen des zystische Fibrose-Transmembranrezeptor-Gens umfassen würde. Die im Rahmen der Erfindung realisierten Vektoren könnten auch für eine Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis oder Restenose, durch Transfer von Genen, welche Angiogenese-Inhibitoren oder Zellzyklus-Inhibitoren kodieren, verwendet werden. Ein Transfer von Prodrug-Aktivatoren, wie des HSV-TK-Gens, kann ebenfalls bei der Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen, einschließlich Krebs, verwendet werden.
  • B) Antisense-Konstrukte
  • Onkogene, wie ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl und abl sind ebenfalls geeignete Ziele. Jedoch würden für therapeutischen Nutzen diese Onkogene als eine Antisense-Nukleinsäure exprimiert werden, so dass die Expression des Onkogens gehemmt wird. Der Begriff „Antisense-Nukleinsäure" soll sich auf die Oligonukleotide beziehen, die zu den Basissequenzen von Onkogene kodierender DNA und RNA komplementär sind. Antisense-Oligonukleotide binden, wenn sie in eine Zielzelle eingeführt werden, spezifisch an ihre Zielnukleinsäure und interferieren mit Transkription, RNA-Prozessierung, -Transport und/oder -Translation. Ein Targeting von doppelsträngiger (ds) DNA mit Oligonukleotid führt zu einer Dreifachhelix-Bildung; ein Targeting von RNA wird zu einer Doppelhelix-Bildung führen.
  • Antisense-Konstrukte können so gestaltet werden, dass sie an den Promotor und andere Kontrollregionen, Exons, Introns oder sogar Exon-Intron-Grenzbereiche eines Gens binden. Antisense-RNA-Konstrukte oder solche Antisense-RNAs kodierende DNA können eingesetzt werden, um Gentranskription oder -translation oder beides innerhalb einer Wirtszelle entweder in vitro oder in vivo, wie innerhalb eines Wirtstiers, einschließlich eines humanen Individuums, zu inhibieren. Nukleinsäuresequenzen, welche „komplementäre Nukleotide" umfassen, sind jene, die zu einer Basenpaarung gemäß den Watson-Crick-Komplementaritäts-Standardregeln in der Lage sind. D.h., dass die größeren Purine eine Basenpaarung mit den kleineren Pyrimidinen ausbilden werden, wobei nur Kombinationen von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin gepaart mit entweder Thymin (A:T) im Falle von DNA oder Adenin gepaart mit Uracil (A:(U) im Falle von RNA gebildet werden.
  • Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe „komplementäre" oder „Antisense-Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die über ihre gesamte Länge im Wesentlichen komplementär sind und sehr wenige Basenfehlpaarungen aufweisen. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen von 15 Basen Länge als komplementär bezeichnet werden, wenn sie ein komplementäres Nukleotid an dreizehn oder vierzehn Positionen mit nur einzelnen oder doppelten Fehlpaarungen aufweisen. Natürlich werden Nukleinsäuresequenzen, die „vollständig komplementär" sind, Nukleinsäuresequenzen sein, die über ihre gesamte Länge vollständig komplementär sind und keine Basenfehlpaarungen aufweisen.
  • Obwohl die Gesamtheit oder ein Teil der Gensequenz im Kontext der Antisense-Konstruktion eingesetzt werden kann, sollte eine jegliche 17 Basen lange Sequenz nur einmal in dem menschlichen Genom vorkommen und dementsprechend ausreichen, um eine einmalige Zielsequenz zu spezifizieren. Obwohl kürzere Oligomere einfacher herzustellen sind und die in vivo-Zugänglichkeit erhöhen, sind zahlreiche andere Faktoren an der Bestimmung der Hybridisierungsspezifität beteiligt. Sowohl Bindungsaffinität als auch Sequenzspezifität eines Oligonukleotids an seine komplementäre Zielsequenz nehmen mit zunehmender Länge zu. Es wird beabsichtigt, dass Oligonukleotide von 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Basenpaaren verwendet werden. Man kann leicht bestimmen, ob eine gegebene Antisense-Nukleinsäure wirksam ist, das entsprechende Wirtszellgen zielgerichtet anzusteuern, indem einfach die Konstrukte in vitro getestet werden, um zu bestimmen, ob die Funktion des endogenen Gens beeinflusst wird oder ob die Expression von verwandten Genen, welche komplementäre Sequenzen aufweisen, beeinflusst wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann man wünschen, Antisense-Konstrukte einzusetzen, die andere Elemente umfassen, beispielsweise jene, die C-5-Propinpyrimidine umfassen. Es ist gezeigt worden, dass Oligonukleotide, die C-5-Propin-Analoga von Uridin und Cytidin enthalten, RNA mit hoher Affinität binden und starke Antisense-Inhibitoren der Genexpresson sind (Wagner et al., 1993).
  • Als eine Alternative zu einer zielgerichteten Antisense-Abgabe können mit Zielgerichtetheit ausgestattete Ribozyme verwendet werden. Der Begriff „Ribozym" bezieht sich auf ein auf RNA basierendes Enzym, welches in der Lage ist, zielgerichtet bestimmte Basensequenzen in onkogener DNA und RNA anzusteuern und zu schneiden. Ribozyme können entweder direkt zu Zellen dirigiert werden in Form von RNA-Oligonukleotiden, welche Ribozymsequenzen beinhalten, oder in die Zelle als ein Expressionskonstrukt, welches die gewünschte ribozymale RNA kodiert, eingeführt werden. Ribozyme können auf im Wesentlichen die gleiche Weise, wie sie für Antisense-Nukleinsäuren beschrieben worden ist, verwendet und angewendet werden.
  • C) Antigene für Impfstoffe
  • Andere therapeutische Gene können Gene umfassen, die Antigene kodieren, wie virale Antigene, bakterielle Antigene, pilzliche Antigene oder von Parasiten stammende Antigene. Viren umfassen Picornaviren, Coronaviren, Togaviren, Flaviviren, Rhabdoviren, Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Bunyaviren, Arenviren, Reoviren, Retroviren, Papovaviren, Parvoviren, Herpesviren, Pockenviren, Hepadnaviren und spongiforme Viren. Bevorzugte virale Ziele umfassen Influenza, Herpes simplex-Virus 1 und 2, Masern, Variola, Polio oder HIV. Pathogene umfassen Trypanosomen, Bandwürmer, Rundwürmer, Helminthen. Auf diese Weise können auch Tumormarker, wie fötales Antigen oder Prostata-spezifisches Antigen, zielgerichtet angesteuert werden. Bevorzugte Beispiele umfassen HIV-env-Proteine und Hepatitis B-Oberflächenantigen. Die Verabreichung eines Vektors gemäß der Erfindung für Impfzwecke würde erfordern, dass die Vektor-assoziierten Antigene ausreichend nicht-immunogen sind, um eine Langzeit-Expression des Transgens, für welches eine starke Immunantwort gewünscht würde, zu ermöglichen. Bevorzugt würde eine Impfung eines Individuums nur selten erforderlich sein, wie jährlich oder alle zwei Jahre, und einen immunologischen Langzeitschutz gegen das infektiöse Agens bereitstellen.
  • D) Kontrollregionen
  • Damit der virale Vektor eine Expression eines Transkripts, welches ein therapeutisches Gen kodiert, bewirkt, wird das das therapeutische Gen kodierende Polynukleotid unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors und eines Polyadenylierungssignals stehen. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die durch die Synthesemaschinerie der Wirtszelle oder eine eingeführte Synthesemaschinerie, die erforderlich ist, um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren, erkannt wird. Ein Polyadenylierungssignal bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die durch die Synthesemaschinerie der Wirtszelle oder eine eingeführte Synthesemaschinerie, die erforderlich ist, um das Hinzufügen einer Reihe von Nukleotiden an das Ende des mRNA-Transkripts für eine korrekte Prozessierung und das Dirigieren des Transkripts aus dem Zellkern hinaus in das Zytoplasma für eine Translation zu dirigieren, erkannt wird. Der Ausdruck „unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor sich in der korrekten Position bezogen auf das Polynukleotid befindet, um die RNA-Polymerase-Initiation und Expression des Polynukleotids zu kontrollieren.
  • Der Begriff Promotor wird hier verwendet werden, um auf eine Gruppe von transkriptionellen Kontrollmodulen zu verweisen, die in Gruppen um die Initiationsstelle für RNA-Polymerase II herum angeordnet sind. Viel von den Annahmen darüber, wie Promotoren organisiert sind, leitet sich aus Analysen von mehreren viralen Promotoren, einschließlich jenen für die HSV-Thymidinkinase (tk) und die frühen SV40-Transkriptionseinheiten, ab. Diese Untersuchungen, die durch neuere Arbeiten ergänzt werden, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionalen Modulen gebildet werden, die jeweils aus ungefähr 7–20 bp DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle Aktivator- oder Repressorproteine enthalten.
  • Wenigstens ein Modul in jedem Promotor funktioniert, um die Startstelle für die RNA-Synthese zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie dem Promotor für das terminale Desoxynukleotidyltransferasegen von Säugetieren und dem Promotor für die späten Gene von SV40, hilft ein diskretes Element, das die Startstelle selbst überlagert, dabei, die Initiationsstelle festzulegen.
  • Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz der Transkriptionsinitiation. Diese befinden sich typischerweise in der Region 30–110 bp strangaufwärts von der Startstelle, obwohl unlängst gezeigt worden ist, dass verschiedene Promotoren ebenso funktionale Elemente strangabwärts von der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelemente ist häufig flexibel, so dass Promotorfunktion beibehalten wird, wenn Elemente invertiert oder bezogen aufeinander bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp entfernt erhöht werden, bevor die Aktivität abzunehmen beginnt. Abhängig von dem Promotor scheint es, dass individuelle Elemente ihre Funktion entweder kooperativ oder unabhängig entfalten können, um die Transkription zu aktivieren.
  • Es wird nicht angenommen, dass der jeweilige Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression eines therapeutischen Gens zu steuern, kritisch ist, solange er in der Lage ist, das Polynukleotid in der Zielzelle zu exprimieren. Wenn dementsprechend eine humane Zelle zielgerichtet angesteuert wird, ist es bevorzugt, die Polynukleotid kodierende Region angrenzend an und unter der Kontrolle eines Promotors, der in der Lage ist, in einer humanen Zelle exprimiert zu werden, zu positionieren. Allgemein gesagt, könnte ein solcher Promotor entweder einen humanen oder viralen Promotor umfassen. Eine Liste von Promotoren wird in Tabelle 2 bereitgestellt. TABELLE 2
    Figure 00440001
    Figure 00450001
  • Der Promotor kann weiter als ein induzierbarer Promotor gekennzeichnet sein. Ein induzierbarer Promotor ist ein Promotor, der mit Ausnahme in Gegenwart einer Induktorsubstanz inaktiv ist oder geringe Aktivität zeigt. Einige Beispiele für Promotoren, die als Teil der Erfindung aufgenommen werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das MT II-, MMTV-, Collagenase-, Stromelysin-, SV40-, Murines MX-Gen, α-2-Makroglobulingen, MHC-Klasse I-Gen h-2kb, HSP70-, Proliferin-, Tumornekrosefaktor- oder Thyreotropin α-Gen. Die damit assoziierten Induktoren sind in Tabelle 3 gezeigt. Es versteht sich, dass ein jeglicher induzierbarer Promotor bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden kann und dass alle derartigen Promotoren unter den Geist und Umfang der beanspruchten Erfindung fallen würden. TABELLE 3
    Figure 00450002
    Figure 00460001
  • In verschiedenen Ausführungsformen können der „immediate early"-Genpromotor des humane Zytomegalievirus (CMV), der frühe Promotor von SV40 und die lange terminate Wiederholungssequenz („long terminal repeat") des Rous-Sarkomvirus verwendet werden, um eine auf hohem Niveau erfolgende Expression des Polynukleotids von Interesse zu erhalten. Die Verwendung von anderen viralen oder aus Säugetieren stammenden zellulären oder Bakteriophagen-Promotoren, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, um eine Expression von Polynukleotiden zu erzielen, wird ebenso beabsichtigt mit der Maßgabe, dass die Expressionsniveaus ausreichend sind, um eine die Vermehrung inhibierende Wirkung zu erzeugen.
  • Indem ein Promotor mit wohlbekannten Eigenschaften eingesetzt wird, können das Niveau und das Muster der Expression eines Polynukleotids nach einer Transfektion optimiert werden. Beispielsweise wird die Auswahl eines Promotors, der in speziellen Zellen aktiv ist, wie von Tyrosinase (Melanom), alpha-Fetoprotein und Albumin (Lebertumore), CC10 (Lungentu mor) und Prostata-spezifischem Antigen (Prostatatumor), eine gewebespezifische Expression des therapeutischen Gens erlauben.
  • Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription ausgehend von einem Promotor, der sich an einer entfernten Position auf demselben DNA-Molekül befand, verstärkten. Für diese Fähigkeit, über einen großen Abstand hinweg zu wirken, gab es in klassischen Untersuchungen zur Regulation der prokaryotischen Transkription nur wenige Beispiele. Nachfolgende Arbeiten zeigten, dass DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität in vielen Aspekten wie Promotoren organisiert sind. D.h., sie bestehen aus vielen individuellen Elementen, von denen jedes an ein oder mehrere transkriptionelle(s) Protein(e) bindet.
  • Die grundlegende Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionsbezogen. Eine Enhancerregion muss als Ganzes in der Lage sein, die Transkription in einem Abstand zu stimulieren; dies muss für eine Promotorregion oder deren Komponentenelemente nicht zutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiierung der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Orientierung dirigieren, wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Promotoren und Enhancer überlappen oftmals und grenzen aneinander an, wobei es oftmals scheint, dass sie eine sehr ähnliche modulare Organisation aufweisen.
  • Zusätzlich könnte eine jegliche Promotor/Enhancer-Kombination (wie anhand der Eukaryotic Promoter Data Base (EPDB)) auch verwendet werden, um die Expression eines bestimmten Konstrukts anzutreiben. Die Verwendung eines T3-, T7- oder zytoplasmatischen SP6-Expressionssystems ist eine andere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen können eine zytoplasmatische Transkription ausgehend von bestimmten Bakteriophagen-Promotoren unterstützen, wenn die geeignete Bakteriophagen-Polymerase entweder als Teil des Abgabekomplexes oder als ein zusätzlicher genetischer Expressionsvektor bereitgestellt wird.
  • Wenn ein cDNA-Insert eingesetzt wird, wird man typischerweise wünschen, ein Polyadenylierungssignal mit aufzunehmen, um eine korrekte Polyadenylierung des Gentranskripts zu bewirken. Es wird nicht angenommen, dass die Natur des Polyadenylierungssignals für die erfolgreiche praktische Ausführung der Erfindung entscheidend ist, und es kann eine jegliche derartige Sequenz eingesetzt werden. Es ist festgestellt worden, dass solche Polyadenlierungssignale, wie jene aus SV40, dem Rinder-Wachstumshormon und dem Herpes simplex-Virus-Thymidinkinasegen, in einer Anzahl von Zielzellen gut funktionieren.
  • 7. Gentransfermethoden
  • Um die Helferzelllinien der Erfindung zu erzeugen und um rekombinante Adenovirus-Vektoren für eine Verwendung damit zu erzeugen, müssen verschiedene genetische (d.h. DNA) Konstrukte an eine Zelle abgegeben werden. Ein Weg, um dies zu erzielen, geht über virale Transduktionen unter Verwendung von infektiösen viralen Partikeln, beispielsweise durch Transformation mit einem Adenovirus-Vektor der Erfindung. Alternativ können retrovirale oder Rinderpapillomaviren eingesetzt werden, welche beide eine permanente Transformation einer Wirtszelle mit einem oder mehreren Gen(en) von Interesse erlauben. In anderen Situationen ist die zu transferierende Nukleinsäure nicht infektiös, d.h. in einem infektösen Viruspartikel enthalten. Dieses genetische Material muss auf nicht-virale Methoden für einen Transfer bauen.
  • Mehrere nicht-virale Methoden für den Transfer von Expressionskonstrukten in in Kultur gehaltene Säugetierzellen werden durch die Erfindung ebenfalls beabsichtigt. Diese umfassen Calciumphosphat-Präzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposome (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979), Zellbeschallung (Fechheimer et al., 1987), Genbombardement unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsprojektilen (Yang et al., 1990) und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988).
  • Ist das Konstrukt einmal in die Zelle abgegeben worden, kann die Nukleinsäure, die das therapeutische Gen kodiert, an unterschiedlichen Stellen positioniert und exprimiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die das therapeutische Gen kodierende Nukleinsäure stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann an der Erkennungsposition und in der Erkennungsorientierung über homologe Rekombination erfolgen (Genersatz) oder es kann an einer zufälligen, nicht-spezifischen Position integriert werden (Generhöhung). In noch weiteren Ausführungsformen kann die Nukleinsäure stabil in der Zelle als ein separates episomales DNA-Segment aufrechterhalten werden. Solche Nukleinsäuresegmente oder „Episome" kodieren Sequenzen, die ausreichend sind, um die Aufrechterhaltung und Replikation unabhängig von oder in Synchronisierung mit dem Zellzyklus des Wirts zu erlauben. Wie das Expressionskonstrukt an eine Zelle abgegeben wird und wo in der Zelle die Nukleinsäure verbleibt, ist von dem eingesetzten Typ des Expressionskonstrukts abhängig.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Ein Transfer des Konstrukts kann ausgeführt werden durch eine jegliche der oben erwähnten Methoden, die die Zellmembran physikalisch oder chemisch permeabilisieren. Dies ist besonders anwendbar für einen Transfer in vitro, kann jedoch ebenso für eine Verwendung in vivo angewendet werden. Dubensky et al. (1984) injizierten erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form von CaPO4-Präzipitaten in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, wobei diese aktive Virusreplikation und akute Infektion zeigten. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten ebenfalls, dass eine direkte intraperitoneale Injektion von durch CaPO4 präzipitierten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führt. Es besteht die Vorstellung, dass eine CAM kodierende DNA ebenfalls auf eine ähnliche Weise in vivo transferiert werden und CAM exprimieren kann.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung zum Transferieren eines nackten DNA- Expressionskonstrukts in Zellen kann auch ein Partikelbombardement umfassen. Diese Methode hängt von der Fähigkeit ab, mit DNA beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, was es diesen erlaubt, Zellmembranen zu durchbohren und in Zellen einzudringen, ohne diese zu töten (Klein et al., 1987). Es sind mehrere Vorrichtungen für das Beschleunigen von kleinen Teilchen entwickelt worden. Eine derartige Vorrichtung beruht auf einer Hochspannungsentladung, um einen elektrischen Strom zu erzeugen, der wiederum die antreibende Kraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen, wie Wolfram- oder Goldkörnchen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt in ein Liposom eingeschlossen werden. Liposome sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposome weisen eine Mehrzahl von Lipidschichten, die durch wässriges Medium getrennt sind, auf. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss von wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstumlagerung vor der Bildung von geschlossenen Strukturen und schließen Wasser und gelöste lösliche Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat, 1991).
  • Eine Liposomen-vermittelte Nukleinsäureabgabe und Expression von fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen. Unter Verwendung des β-Lactamasegens demonstrierten Wong et al. (1980) die Durchführbarkeit einer Liposomen-vermittelten Abgabe und Expression von fremder DNA in kultivierten Hühnerembryo-, HeLa- und Hepatomzellen. Nicolau et al. (1987) bewerkstelligten einen erfolgreichen Liposomen-vermittelten Gentransfer in Ratten nach intravenöser Injektion. Auch umfasst werden verschiedene kommerzielle Ansätze, welche die „Lipofection"-Technologie umfassen.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Liposom mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden. Es ist gezeigt worden, dass dies die Fusion mit der Zellmembran vereinfacht und den Zelleintritt von in Liposomen verkapselter DNA fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) eingesetzt werden (Kato et al., 1991). In noch weiteren Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1 eingesetzt werden. Indem solche Expressionskonstrukte erfolgreich beim Transfer und bei der Expression von Nukleinsäure in vitro und in vivo eingesetzt worden sind, sind sie dann für die vorliegende Erfindung anwendbar.
  • Andere Expressionskonstrukte, die eingesetzt werden können, um eine ein therapeutisches Gen kodierende Nukleinsäure in Zellen abzugeben, sind Vehikel für eine Rezeptor-vermittelte Abgabe. Diese ziehen einen Vorteil aus der selektiven Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in nahezu allen eukaryotischen Zellen. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung von verschiedenen Rezeptoren kann die Abgabe hochgradig spezifisch sein (Wu und Wu, 1993).
  • Vehikel für ein Rezeptor-vermitteltes Gen-Targeting bestehen im Allgemeinen aus zwei Bestandteilen: einem Zellrezeptor-spezifischen Ligand und einem DNA-bindenden Mittel. Für einen Rezeptor-vermittelten Gentransfer sind mehrere Liganden verwendet worden. Die am umfassendsten charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1990). Unlängst ist ein synthetisches Neoglycoprotein, das den gleichen Rezeptor wie ASOR erkennt, als Genabgabe-Vehikel verwendet worden (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist ebenfalls verwendet worden, um Gene an Plattenepithelkarzinomzellen abzugeben (Myers, EPA 0273085).
  • In anderen Ausführungsformen kann das Abgabevehikel einen Ligand und ein Liposom umfassen. Beispielsweise setzten Nicolau et al. (1987) Lactosylceramid, ein Asialgangliosid mit Galactose-Endgruppen, inkorporiert in Liposome, ein und beobachteten eine Zunahme bei der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Es ist dementsprechend durchführbar, dass eine ein therapeutisches Gen kodierende Nukleinsäure auch spezifisch in eine Zellart, wie Prostata-, Epithel- oder Tumorzellen, durch eine beliebige Anzahl von Rezeptor-Ligand-Systemen mit oder ohne Liposome abgegeben werden kann. Beispielsweise kann das humane Prostata-spezifische Antigen (Watt et al., 1986) als Rezeptor für eine vermittelte Abgabe einer Nukleinsäure in Prostatagewebe verwendet werden.
  • 8. Entfernen von Nukleinsäure-Kontaminanten
  • Die Erfindung setzt Nukleasen ein, um kontaminierende Nukleinsäuren zu entfernen. Beispielhafte Nukleasen umfassen Benzonase®, Pulmozyme® oder eine jegliche andere DNase oder RNase, die in diesem Fachgebiet üblicherweise eingesetzt wird.
  • Enzyme, wie Benzonase®, bauen Nukleinsäure ab und weisen keine proteolytische Aktivität auf. Die Fähigkeit von Benzonase®, Nukleinsäuren schnell zu hydrolysieren, macht das Enzym ideal für das Verringern der Viskosität eines Zelllysats. Es ist wohlbekannt, dass Nukleinsäuren an von Zellen abgeleiteten Partikeln, wie Viren, anhaften können. Die Adhäsion kann mit einer Abtrennung aufgrund von Agglomeration, Größenänderung des Partikels oder Änderung bei der Partikelladung interferieren, was dazu führt, dass nur wenig, wie überhaupt irgendein Produkt mit einem gegebenen Reinigungsschema rückgewonnen wird. Benzonase® ist gut geeignet, um die Nukleinsäure-Beladung während der Reinigung zu verringern, wodurch die Interferenz beseitigt und die Ausbeute verbessert wird.
  • Wie bei allen Endonukleasen hydrolysiert Benzonase® interne Phosphodiesterbindungen zwischen speziellen Nukleotiden. Nach vollständigem Verdau sind alle freien Nukleinsäuren, die in der Lösung vorhanden sind, auf Oligonukleotide von 2 bis 4 Basen Länge reduziert.
  • 9. Reinigungstechniken
  • A) Dichtegradientenzentrifugation
  • Es gibt zwei Methoden der Dichtegradientenzentrifugation, die „rate zonal"-Technik (Zonenzentrifugationstechnik) und die isopyknische (gleiche Dichte) Technik und beide können verwendet werden, wenn die quantitative Trennung aller Bestandteile einer Mischung von Teilchen erforderlich ist. Sie werden auch für die Bestimmung von Schwebedichten und für die Abschätzung von Sedimentationskoeffizienten verwendet.
  • Die Teilchentrennung durch die „rate zonal"-Technik basiert auf Unterschieden in der Größe oder in Sedimentationsraten. Die Technik umfasst ein vorsichtiges Auftragen einer Probenlösung als Schicht auf einen vorab gebildeten flüssigen Dichtegradienten, dessen höchste Dichte jene der dichtesten Teilchen, die getrennt werden sollen, übersteigt. Die Probe wird dann zentrifugiert, bis das gewünschte Ausmaß an Trennung bewirkt ist, d.h. für eine ausreichende Zeitdauer, damit die Teilchen durch den Gradient wandern können, um diskrete Zonen oder Banden zu bilden, die gemäß den relativen Geschwindigkeiten der Teilchen beabstandet sind. Da Die Technik zeitabhängig ist, muss eine Zentrifugation beendet werden, bevor eine jegliche der getrennten Zonen am Boden des Röhrchens pelletiert. Die Methode ist für die Trennung von Enzymen, Hormonen, RNA-DNA-Hybriden, ribosomalen Untereinheiten, subzellulären Orga nellen, für die Analyse der Größenverteilung von Proben von Polysomen und für Lipoprotein-Fraktionierungen verwendet worden.
  • Die Probe wird als Schicht aufgetragen auf einen kontinuierlichen Dichtegradient, der das gesamte Spektrum der Teilchendichten, die getrennt werden sollen, überspannt. Die maximale Dichte des Gradienten muss dementsprechend stets die Dichte des dichtesten Teilchens übertreffen. Während einer Zentrifugation tritt eine Sedimentation der Teilchen auf, bis die Schwebedichte des Teilchens und die Dichte des Gradienten gleich sind (d.h., wo pp = pm in der Gleichung 2.12). An diesem Punkt tritt keine weitere Sedimentation auf unabhängig davon, wie lange die Zentrifugation andauert, da die Teilchen auf einem Kissen von Material, das eine Dichte hat, die größer als ihre eigene ist, schwimmen.
  • Eine isopyknische Zentrifugation ist im Gegensatz zu der „rate zonal"-Technik eine Gleichgewichtsmethode, wobei die Teilchen jeweils bei ihrer eigenen charakteristischen Schwebedichte Banden unter Bildung von Zonen bilden. In Fällen, wo vielleicht nicht alle Bestandteile in einer Mischung von Teilchen benötigt werden, kann ein Gradientenbereich ausgewählt werden, in welchem unerwünschte Bestandteile der Mischung auf den Boden des Zentrifugenröhrchens sedimentieren werden, während die Teilchen von Interesse zu ihren jeweiligen isopyknischen Positionen sedimentieren werden. Eine solche Technik umfasst eine Kombination sowohl des „rate zonal"- als auch des isopyknischen Ansatzes.
  • Die isopyknische Zentrifugation hängt allein von der Schwebedichte des Teilchens und nicht von dessen Gestalt oder Größe ab und ist unabhängig von der Zeit. Folglich können lösliche Proteine, die eine sehr ähnliche Dichte aufweisen (z.B. p = 1,3 g cm–3 in Sucroselösung) üblicherweise durch diese Methode nicht getrennt werden, wohingegen subzelluläre Organellen (z.B Golgi-Apparat, p = 1,11 g cm–3, Mitochondrien, p = 1,19 g cm–3 und Peroxisomen, p = 1,23 g cm–3 in Sucroselösung) effektiv getrennt werden können.
  • Als eine Alternative zu einem Auftragen der aufzutrennenden Teilchenmischung als Schicht auf einen vorab gebildeten Gradienten wird die Probe zu Beginn mit dem Gradientenmedium gemischt, um eine Lösung von gleichförmiger Dichte zu erhalten, wobei der Gradient sich durch das Sedimentationsgleichgewicht während der Zentrifugation „selbsttätig bildet". Bei dieser Methode (welche als „equilibrium isodensity method"; Gleichgewichts-gleiche Dichte-Methode) bezeichnet wird, wird im Allgemeinen Gebrauch gemacht von Salzen von Schwermetallen (z.B. Cäsium oder Rubidium), Sucrose, kolloidalem Siliciumdioxid oder Metrizamid.
  • Die Probe (z.B. DNA) wird homogen mit beispielsweise einer konzentrierten Lösung von Cäsiumchlorid gemischt. Eine Zentrifugation der konzentrierten Cäsiumchloridlösung führt zu der Sedimentation der CsCl-Moleküle unter Bildung eines Konzentrationsgradienten und daher eines Dichtegradienten. Die Probenmoleküle (DNA), die anfänglich gleichförmig in dem gesamten Röhrchen verteilt waren, steigen jetzt entweder auf oder sedimentieren, bis sie eine Region erreichen, wo die Lösungsdichte gleich ihrer eigenen Schwebedichte ist, d.h. ihre isopyknische Position, wo sie Banden unter Bildung von Zonen bilden werden. Diese Technik leidet unter dem Nachteil, dass oftmals sehr lange Zentrifugationszeiten (z.B. 36 bis 48 h) benötigt werden, um ein Gleichgewicht zu etablieren. Sie wird jedoch üblicherweise bei der analytischen Zentrifugation verwendet, um die Schwebedichte eines Teilchens, die Basenzusammensetzung von doppelsträngiger DNA zu bestimmen und um lineare von zirkulären Formen von DNA zu trennen.
  • Viele der Trennungen können verbessert werden, indem die Dichteunterschiede zwischen den verschiedenen Formen von DNA durch Einbau von schweren Isotopen (z.B. 15N) während der Biosynthese erhöht werden, eine Technik, die von Leselson und Stahl verwendet worden ist, um den Mechanismus der DNA-Replikation in Escherichia coli zu erhellen, oder durch das Binden von Schwermetallionen oder Farbstoffen, wie Ethidiumbromid. Isopyknische Gradienten sind auch verwendet worden, um Viren zu trennen und zu reinigen und humane Plasma-Lipoproteine zu analysieren.
  • B) Chromatographie
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird es wünschenswert sein, gereinigte Adenoviren herzustellen. Reinigungstechniken sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Diese Techniken tendieren dazu, die Fraktionierung des zellulären Milieus zu umfassen, um die Adenovirus-Partikel von anderen Bestandteilen der Mischung abzutrennen. Hat man adenovirale Partikel von den anderen Bestandteilen abgetrennt, kann das Adenovirus unter Verwendung von chromatographischen und elektrophoretischen Techniken gereinigt werden, um eine vollständige Reinigung zu erzielen. Analytische Methoden, die für die Herstellung eines reinen adenoviralen Partikels der Erfindung besonders geeignet sind, sind Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese. Eine besonders effiziente Reinigungsmethode, die in Verbindung mit der Erfindung eingesetzt werden kann, ist die HPLC.
  • Bestimmte Aspekte der Erfindung betreffen die Reinigung und in besonderen Ausführungsformen die substantielle Reinigung eines adenoviralen Partikels. Der Begriff „gereinigt", wie er hier verwendet wird, soll auf eine Zusammensetzung verweisen, die von anderen Bestand teilen isolierbar ist, wobei der adenovirale Partikel bis zu einem jeglichen Ausmaß bezogen auf dessen in der Natur erhältliche Form gereinigt ist. Ein gereinigter adenoviraler Partikel bezieht sich dementsprechend auf eine adenovirale Komponente, die frei ist von der Umgebung, in welcher sie in der Natur vorkommen kann.
  • Allgemein wird sich „gereinigt" auf einen adenoviralen Partikel beziehen, der einer Fraktionierung unterworfen worden ist, um verschiedene andere Komponenten zu entfernen, und dessen Zusammensetzung im Wesentlichen dessen exprimierte biologische Aktivität beibehält. Wenn der Begriff „im Wesentlichen gereinigt" verwendet wird, wird diese Bezeichnung auf eine Zusammensetzung verweisen, in welcher der Partikel, das Protein oder Peptid den Hauptbestandteil der Zusammensetzung bildet, wie indem dieser bzw. dieses ungefähr 50% oder mehr der Bestandteile in der Zusammensetzung ausmacht.
  • Verschiedene Methoden zum Quantifizieren des Reinigungsgrades eines Proteins oder Peptids werden den Fachleuten auf diesem Gebiet im Licht der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Diese umfassen beispielsweise das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder das Bestimmen der Menge von Polypeptiden innerhalb einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse. Eine bevorzugte Methode zum Bestimmen der Reinheit einer Fraktion besteht darin, die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, diese mit der spezifischen Aktivität des anfänglichen Extraktes zu vergleichen und so den Reinheitsgrad zu berechnen, der hier durch eine „-fache Reinigungszahl" bestimmt wird. Die tatsächlichen Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge anzugeben, werden selbstverständlich von der jeweiligen Assaytechnik, die gewählt wird, um die Reinigung zu verfolgen, abhängen und davon, ob das exprimierte Protein oder Peptid eine detektierbare Aktivität aufweist oder nicht.
  • Es gibt kein allgemeines Erfordernis, dass die Adenoviren stets in ihrem am höchsten gereinigten Stadium bereitgestellt werden müssen. Tatsächlich ist beabsichtigt, dass weniger substantiell gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen Nützlichkeit haben werden. Eine teilweise Reinigung kann bewerkstelligt werden durch Verwendung von weniger Reinigungsschritten in Kombination oder durch Verwendung von unterschiedlichen Formen desselben allgemeinen Reinigungsschemas. Methoden, die ein niedrigeres Ausmaß an relativer Reinigung zeigen, können bei der gesamten Rückgewinnung von Proteinprodukt oder bei der Aufrechterhaltung der Aktivität eines exprimierten Proteins Vorteile haben.
  • Es versteht sich selbstverständlich, dass die chromatographischen Techniken und anderen Reinigungstechniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, ebenfalls eingesetzt werden können, um Proteine zu reinigen, die durch die adenoviralen Vektoren der Erfindung exprimiert werden. Ionenaustauschchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sind exemplarische Reinigungstechniken, die bei der Reinigung von adenoviralen Partikeln eingesetzt werden, und werden hier nachfolgend detaillierter beschrieben.
  • Ionenaustauschchromatographie: Das grundlegende Prinzip der Ionenaustauschchromatographie besteht darin, dass die Affinität einer Substanz für den Austauscher sowohl von den elektrischen Eigenschaften des Materials als auch der relativen Affinität von anderen geladenen Substanzen in dem Lösemittel abhängt. Daher kann gebundenes Material eluiert werden, indem der pH verändert wird, wodurch die Ladung des Materials verändert wird, oder durch Zugeben von kompetitierenden Materialien, von denen Salze nur ein Beispiel sind. Da verschiedene Substanzen unterschiedliche elektrische Eigenschaften aufweisen, variieren die Bedingungen für die Freisetzung bei jeder gebundenen Molekülspezies. Um eine gute Trennung zu erhalten, sind die Methoden der Wahl allgemein entweder eine Elution mit einem kontinuierlichen Ionenstärke-Gradienten oder eine schrittweise erfolgende Elution. (Ein pH-Gradient allein wird oftmals nicht verwendet, da es schwierig ist, einen pH-Gradienten zu etablieren, ohne gleichzeitig die Ionenstärke zu erhöhen). Für einen Anionenaustauscher werden entweder pH und Ionenstärke nach und nach erhöht oder die Ionenstärke wird allein erhöht. Für einen Kationenaustauscher werden sowohl pH als auch Ionenstärke erhöht. Die tatsächliche Wahl der Elutionsprozedur ist üblicherweise ein Ergebnis von Versuch und Irrtum und von Stabilitätserwägungen. Beispielsweise ist es für instabile Materialien am besten, einen ziemlich konstanten pH beizubehalten.
  • Ein Ionenaustauscher ist ein Feststoff der chemisch gebundene geladene Gruppen, an welche Ionen elektrostatisch gebunden werden, aufweist; er kann diese Ionen gegen Ionen in wässriger Lösung austauschen. Ionenaustauscher können in einer Säulenchromatographie verwendet werden, um Moleküle nach ihrer Ladung aufzutrennen; tatsächlich sind üblicherweise andere Merkmale des Moleküls wichtig, so dass das chromatographische Verhalten empfindlich ist gegenüber der Ladungsdichte, Ladungsverteilung und Größe des Moleküls.
  • Das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie besteht darin, dass geladene Moleküle sich reversibel an Ionenaustauscher adsorbieren, so dass Moleküle gebunden oder eluiert werden können, indem die ionische Umgebung verändert wird. Eine Trennung an Ionenaustauschern wird üblicherweise in zwei Stufen bewerkstelligt: erstens werden die zu trennenden Substanzen an den Austauscher gebunden unter Verwendung von Bedingungen, die eine stabile und enge Bindung ergeben; dann wird die Säule mit Puffern von unterschiedlichem pH, unterschiedlicher Ionenstärke oder Zusammensetzung eluiert und die Bestandteile des Puffers kompetitieren mit dem gebundenen Material um die Bindungsstellen.
  • Ein Ionenaustauscher ist üblicherweise ein(e) dreidimensionale(s) Netzwerk oder Matrix, das bzw. die kovalent gebundene geladene Gruppen enthält. Wenn eine Gruppe negativ geladen ist, wird sie positive Ionen austauschen und ist ein Kationenaustauscher. Eine typische Gruppe, die in Kationenaustauschern verwendet wird, ist die Sulfonsäuregruppe, SO3 –. Wenn ein H+ an die Gruppe gebunden ist, wird gesagt, dass der Austauscher in der Säureform vorliegt; er kann beispielsweise ein H+ gegen ein Na+ oder zwei H+ gegen ein Ca2+ austauschen. Die Sulfonsäuregruppe wird als stark saurer Kationenaustauscher bezeichnet. Andere üblicherweise verwendete Gruppen sind phenolische Hydroxyl- und Carboxylgruppen, die beide schwach saure Kationenaustauscher sind. Wenn die geladene Gruppe positiv ist – beispielsweise eine quartäre Aminogruppe – ist dies ein stark basischer Anionenaustauscher. Die häufigsten schwach basischen Anionenaustauscher sind aromatische oder aliphatische Aminogruppen.
  • Die Matrix kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden. Üblicherweise verwendete Materialien sind Dextran, Cellulose, Agarose und Copolymer von Styrol und Vinylbenzol, in denen das Vinylbenzol sowohl die Polystyrolstränge vernetzt als auch die geladenen Gruppen enthält. Tabelle 4 gibt die Zusammensetzung von vielen Ionenaustauschern an.
  • Die gesamte Kapazität eines Ionenaustauschers bemisst dessen Fähigkeit, austauschbare Gruppen pro Milligramm Trockengewicht aufzunehmen. Diese Anzahl wird durch den Hersteller bereitgestellt und ist wichtig, da, wenn die Kapazität überschritten wird, Ionen durch die Säule hindurchwandern werden, ohne zu binden. TABELLE 4
    Figure 00570001
  • Die verfügbare Kapazität ist die Kapazität unter bestimmten Versuchsbedingungen (d.h. pH, Ionenstärke). Beispielsweise hängt das Ausmaß, bis zu welchem ein Ionenaustauscher geladen ist, von dem pH ab (die Wirkung des pH ist bei starken Ionenaustauschern geringer). Ein anderer Faktor ist Ionenstärke, da kleine Ionen nahe den geladenen Gruppen mit dem Probenmolekül um diese Gruppen kompetitieren. Diese Kompetition ist relativ wirksam, wenn die Probe ein Makromolekül ist, da der höhere Diffusionskoeffizient der kleinen Ionen eine größere Anzahl von Begegnungen bedeutet. Natürlich wird, wenn die Pufferkonzentration steigt, die Kompetition stärker.
  • Die Porosität der Matrix ist ein wichtiges Merkmal, da die geladenen Gruppen sich sowohl innerhalb als auch außerhalb der Matrix befinden und da die Matrix auch wie ein Molekularsieb wirkt. Große Moleküle sind möglicherweise nicht in der Lage, durch die Poren hindurchzutreten; so wird die Kapazität mit steigenden molekularen Abmessungen abnehmen. Die Porosität der auf Polystyrol basierenden Harze wird bestimmt durch das Ausmaß an Vernetzung durch das Divinylbenzol (Porosität nimmt mit steigenden Mengen von Divinylbenzol ab). Bei den Dowex- und AG-Reihen wird der Prozentsatz von Divinylbenzol durch eine Zahl nach einem X angegeben – daher ist Dowex 50-X8 8% Divinylbenzol.
  • Ionenaustauscher sind in verschiedenen Teilchengrößen, welche als „mesh size" (Maschengrößen) bezeichnet werden, erhältlich. Feinere Maschen bedeuten ein erhöhtes Oberfläche:Volumen-Verhältnis und dementsprechend eine erhöhte Kapazität und eine verringerte Zeit, damit ein Austausch für ein gegebenes Volumen des Austauschers auftritt. Andererseits bedeuten feine Maschen eine langsame Flussrate, welche eine diffusionsbedingte Ausbreitung verstärken kann. Die Verwendung von sehr feinen Teilchen, von ungefähr 10 μm Durchmesser, und hohem Druck, um einen adäquaten Fluss aufrechtzuerhalten, wird als Hochleistungs- oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder einfach HPLC bezeichnet.
  • Eine solche Sammlung von Austauschern, welche solche unterschiedlichen Eigenschaften – Ladung, Kapazität, Porosität, Maschen – aufweisen, macht die Auswahl des geeigneten, um eine bestimmte Trennung zu bewerkstelligen, schwierig. Wie eine Entscheidung hinsichtlich der Art des Säulenmaterials und der Bedingungen für das Binden und die Elution getroffen werden kann, wird in den folgenden Beispielen beschrieben.
  • Es gibt verschiedene Wahlen, die man treffen muss, wenn man Ionenaustauschchromatographie als Technik einsetzt. Die erste Wahl, die zu treffen ist, ist, ob der Austauscher anionisch oder kationisch sein soll. Wenn die Materialien, die an die Säule gebunden werden sollen, eine einzelne Ladung (d.h. entweder plus oder minus) aufweisen, ist die Wahl klar. Jedoch tragen viele Substanzen (z.B. Proteine, Viren) sowohl negative als auch positive Ladungen und die Nettoladung hängt von dem pH ab. In solchen Fällen ist der primäre Faktor die Stabilität der Substanz bei verschiedenen pH-Werten. Die meisten Proteine haben einen pH-Stabilitätsbereich (d.h. in welchem sie nicht denaturieren), in welchem sie entweder positiv oder negativ geladen sind. Wenn ein Protein bei pH-Werten oberhalb des isoelektrischen Punkts stabil ist, sollte daher ein Anionenaustauscher verwendet werden; wenn es bei Werten unterhalb des isoelektrischen Punkts stabil ist, wird ein Kationenaustauscher benötigt.
  • Die Wahl zwischen starken und schwachen Austauschern basiert auch auf der Wirkung des pH auf Ladung und Stabilität. Wenn beispielsweise eine schwach ionisierte Substanz, welche einen sehr niedrigen oder hohen pH für eine Ionisierung benötigt, chromatographiert wird, wird ein starker Ionenaustauscher benötigt, da er über den gesamten pH-Bereich funktioniert. Wenn die Substanz jedoch labil ist, sind schwache Ionenaustauscher zu bevorzugen, da starke Austauscher oftmals in der Lage sind, ein Molekül zu deformieren, so dass das Molekül denaturiert. Der pH, bei welchem die Substanz stabil ist, muss selbstverständlich mit dem engen pH-Bereich, in welchem ein bestimmter schwacher Austauscher geladen ist, zusammenpassen. Schwache Ionenaustauscher sind auch hervorragend für die Trennung von Molekülen mit einer hohen Ladung von jenen mit einer kleinen Ladung, da die schwach geladenen Ionen üblicherweise nicht binden werden. Schwache Austauscher zeigen auch eine größere Auflösung von Substanzen, wenn Ladungsunterschiede sehr gering sind. Wenn ein Makromolekül eine sehr starke Ladung hat, ist es möglicherweise unmöglich, dieses von einem starken Austauscher zu eluieren, und es kann erneut ein schwacher Austauscher zu bevorzugen sein. Im Allgemeinen sind schwache Austauscher nützlicher als starke Austauscher.
  • Die Sephadex- und Bio-gel-Austauscher bieten einen besonderen Vorteil für Makromoleküle, die bei geringer Ionenstärke instabil sind. Da die Vernetzungen in diesen Materialien die Unlöslichkeit der Matrix sogar dann aufrecht erhalten, wenn die Matrix hochgradig polar ist, kann die Dichte von ionisierbaren Gruppen um ein Mehrfaches höher gemacht werden, als dies bei Cellulose-Ionenaustauschern möglich ist. Die erhöhte Ladungsdichte bedeutet eine erhöhte Affinität, so dass die Adsorption bei höheren Ionenstärken ausgeführt werden kann. Andererseits bewahren diese Austauscher einige von ihren Molekularsieb-Eigenschaften, so dass manchmal Molekulargewichtsunterschiede die durch die Ladungsunterschiede verursachte Verteilung aufheben; dieser Molekularsieb-Effekt kann die Trennung auch verstärken.
  • Kleine Moleküle werden am besten auf Matrices mit kleiner Porengröße (hohem Vernetzungsgrad) getrennt, da die verfügbare Kapazität hoch ist, wohingegen Makromoleküle große Porengrößen benötigen. Jedoch bieten mit Ausnahme des Sephadex-Typs die meisten Ionenaustauscher nicht die Möglichkeit, die Porosität an das Molekulargewicht anzupassen.
  • Die Cellulose-Ionenaustauscher haben sich als die besten für das Reinigen von großen Molekülen, wie Proteinen und Polynukleotiden, erwiesen. Dies ist so, da die Matrix faserförmig ist und folglich sich alle funktionellen Gruppen an der Oberfläche befinden und sogar den größ ten Molekülen zur Verfügung stehen. In vielen Fällen sind jedoch körnchenförmige Formen, wie DEAE-Sephacel und DEAE-Biogel P, nützlicher, da es eine bessere Flussrate gibt und der Molekularsieb-Effekt zur Trennung beiträgt.
  • Das Auswählen einer Maschengröße ist stets schwierig. Kleine Maschengrößen verbessern die Auflösung (Auftrennung), verringern aber die Flussrate, was die Zonenausbreitung erhöht und die Auflösung verringert. Folglich wird die geeignete Maschengröße üblicherweise empirisch bestimmt.
  • Da Puffer selbst aus Ionen bestehen, können auch sie Austausche eingehen und das pH-Gleichgewicht kann beeinflusst werden. Um diese Probleme zu vermeiden, wird die „rule of buffers" (Pufferregel) herangezogen: Verwende kationische Puffer mit Anionenaustauschern und anionische Puffer mit Kationenaustauschern. Da die Ionenstärke ein Faktor bei der Bindung ist, sollte ein Puffer gewählt werden, der eine hohe Pufferkapazität hat, so dass dessen Ionenstärke nicht zu noch sein muss. Darüber hinaus ist für die beste Auflösung allgemein festgestellt worden, dass die ionischen Bedingungen, die verwendet werden, um die Probe auf die Säule aufzutragen (die sogenannten Ausgangsbedingungen), nahe bei jenen, die für das Eluieren der Säule verwendet werden, sein sollten.
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist durch eine sehr schnelle Trennung mit einer außerordentlichen Auflösung von Peaks gekennzeichnet. Dies wird erzielt durch die Verwendung von sehr feinen Teilchen und hohem Druck, um eine adäquate Flussrate aufrechtzuerhalten. Eine Trennung kann in einer Angelegenheit von Minuten oder höchstens einer Stunde bewerkstelligt werden. Darüber hinaus wird nur ein sehr kleines Volumen der Probe benötigt, da die Teilchen so klein und dicht gepackt sind, dass das Hohlraumvolumen ein sehr geringer Bruchteil des Bettvolumens darstellt. Auch muss die Konzentration der Probe nicht sehr hoch sein, da die Banden so eng sind, dass es eine sehr geringe Verdünnung der Probe gibt.
  • 10. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Formulierungen
  • Wenn sie gemäß den oben erläuterten Verfahren gereinigt worden sind, werden die viralen Partikel der Erfindung verabreicht werden; es wird in vitro, ex vivo oder in vivo beabsichtigt. Es wird dementsprechend wünschenswert sein, den Komplex als eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für die beabsichtigte Anwendung geeignet ist, herzustellen. Allgemein wird dies ein Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit sich bringen, die im Wesentlichen frei von Pyrogenen wie auch von jeglichen anderen Verunreinigungen, die für Menschen oder Tiere schädlich sein könnten, ist. Auch wird man im Allgemeinen wünschen, geeignete Salze und Puffer einzusetzen, um den Komplex stabil zu machen und eine Aufnahme des Komplexes durch Zielzellen zu ermöglichen.
  • Wässrige Zusammensetzungen können eine wirksame Menge des Expressionskonstrukts und von Nukleinsäure, gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder wässrigen Medium, umfassen. Solche Zusammensetzungen können auch als Inokula bezeichnet werden. Die Ausdrücke „pharmazeutisch oder pharmakologisch annehmbar" beziehen sich auf molekulare Entitäten und Zusammensetzungen, die keine abträgliche, allergische oder andere ungünstige Reaktion erzeugen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen, wie geeignet, verabreicht werden. Wie hier verwendet, umfasst ein „pharmazeutisch annehmbarer Träger" jegliche und alle Lösemittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung von solchen Medien und Mitteln für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Abgesehen davon, dass ein jegliches herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff unverträglich ist, ist dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen beabsichtigt. Ergänzende Wirkstoffe können in die Zusammensetzungen ebenfalls eingebracht werden.
  • Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbare Salze können in Wasser, geeignet gemischt mit einem grenzflächenaktiven Mittel, wie Hydroxypropylcellulose, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Bedingungen von Aufbewahrung und Verwendung enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um die Vermehrung von Mikroorganismen zu verhindern.
  • Die viralen Partikel können klassische pharmazeutische Zubereitungen für eine Verwendung in Therapieplänen, welche deren Verabreichung an Menschen mit einschließen, umfassen. Die Verabreichung von therapeutischen Zusammensetzungen kann über eine jegliche übliche Route erfolgen, solange das Zielgewebe über jene Route erreichbar ist. Dies umfasst oral, nasal, bukkal, rektal, vaginal oder topisch. Alternativ wird eine Verabreichung durch orthotopische, intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Solche Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, die physiologisch annehmbare Träger, Puffer oder andere Vehikel umfassen, verabreicht werden. Für eine Anwendung gegen Tumore wird eine direkte intratumorale Injektion, die Injektion in ein Tumorbett nach Resektion, eine regionale (d.h. lymphatische) oder generelle Verabreichung beabsichtigt. Es kann auch gewünscht sein, eine kontinuierliche Perfusion über Stunden oder Tage über einen Katheter an einem Erkrankungsort, z.B. einem Tumor oder einer Tumorstelle, auszuführen.
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen können in vorteilhafter Weise in Form von injizierbaren Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen verabreicht werden; feste Formen, die für eine Lösung in oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Diese Zubereitungen oder Präparate können auch emulgiert werden. Eine typische Zusammensetzung für einen solchen Zweck umfasst einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Zusammensetzung kann beispielsweise ungefähr 100 mg humanes Serumalbumin pro Milliliter Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung enthalten. Andere pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen wässrige Lösungen, nicht-toxische Vehikel, einschließlich Salzen, Konservierungsmitteln, Puffern und dergleichen, können verwendet werden. Beispiele von nicht-wässrigen Lösemitteln sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliches Öl und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch/wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Vehikel, wie Natriumchlorid, Ringer'-Dextrose u.s.w. Intravenöse Vehikel umfassen Fluid- und Nährstoffersatzpräparate. Konservierungsmittel umfassen antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und inerte Gase. Der pH und die genaue Konzentration der verschiedenen Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß wohlbekannten Parametern eingestellt.
  • Zusätzliche Formulierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind. Orale Formulierungen umfassen solche typischen Vehikel, wie beispielsweise pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Die Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen für eine länger andauernde Freisetzung oder Pulvern an. Wenn die Route topisch ist, kann die Form eine Creme, Salbe, ein Unguentum oder ein Spray sein.
  • Eine wirksame Menge des therapeutischen Mittels wird basierend auf dem beabsichtigten Ziel, beispielsweise (i) Inhibition von Tumorzellproliferation, (ii) Eliminierung oder Töten von Tumorzellen, (iii) Impfung oder (iv) Gentransfer für eine Langzeitexpression eines therapeutischen Gens, bestimmt. Der Begriff „Einheitsdosis" bezieht sich auf physisch diskrete Einheiten, die für eine Verwendung in einem Individuum geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorher festgelegte Menge der therapeutischen Zusammensetzung enthält, die so berechnet ist, dass die gewünschten Reaktionen, die oben diskutiert wurden, in Verbindung mit deren Verabreichung, d.h. der geeigneten Route und dem geeigneten Behandlungsplan, erzeugt werden. Die zu verab reichende Menge, sowohl gemäß der Anzahl von Behandlungen als auch der Einheitsdosis, hängt von dem zu behandelnden Individuum, dem Zustand des Individuums und dem gewünschten Ergebnis ab. Speziell für Adenoviren werden mehrfache Gentherapiepläne erwartet.
  • Ein adenoviraler Vektor, welcher ein Tumorsuppressorgen kodiert, kann verwendet werden, um Krebspatienten zu behandeln. Typische Mengen eines Adenovirus-Vektors, die im Rahmen einer Gentherapie von Krebs verwendet werden, sind 103–1015 PFU/Dosis, (103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015), wobei die Dosis in mehrere Injektionen an unterschiedlichen Stellen innerhalb eines soliden Tumors aufgeteilt werden kann. Der Behandlungsplan kann auch mehrere Verabreichungszyklen des Gentransfervektors über einen Zeitraum von 3–10 Wochen umfassen. Eine Verabreichung des Vektors für längere Zeitspannen von Monaten bis zu Jahren kann für einen andauernden therapeutischen Nutzen erforderlich sein.
  • Ein adenoviraler Vektor, der ein therapeutisches Gen kodiert, kann verwendet werden, um Menschen oder andere Säugetiere zu impfen. Typischerweise würde eine Menge von Virus, die wirksam ist, um die gewünschte Wirkung, in diesem Falle eine Impfung, zu erzeugen, an einen Mensch oder ein Säugetier verabreicht werden, so dass eine Langzeitexpression des Transgens erzielt wird und sich eine starke Immunantwort des Wirts entwickelt. Es wird beabsichtigt, dass eine Reihe von Injektionen, beispielsweise eine primäre Injektion, gefolgt von zwei Booster-Injektionen, ausreichend sein würde, um eine Langzeit-Immunantwort zu induzieren. Eine typische Dosis würde 106 bis 1015 PFU/Injektion abhängig von dem gewünschten Ergebnis darstellen. Niedrige Dosen von Antigen induzieren im Allgemeinen eine starke zellvermittelte Immunantwort, wohingegen hohe Dosen von Antigen im Allgemeinen eine Antikörper-vermittelte Immunantwort induzieren. Genaue Mengen der therapeutischen Zusammensetzung hängen auch von der Beurteilung des praktizierenden Arztes ab und sind für jedes Individuum besonders.
  • 11. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele werden aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte sich für die Fachleute auf diesem Gebiet verstehen, dass die in den Beispielen, die folgen, offenbarten Techniken Techniken darstellen, bezüglich deren durch den Erfinder entdeckt worden ist, dass sie bei der praktischen Ausführung der Erfindung gut funktionieren, und dementsprechend so angesehen werden können, dass sie bevorzugte Weisen für deren praktische Ausführung bilden.
  • BEISPIEL 1
  • Materialien und Methoden
  • A) Zellen
  • Es wurden 293-Zellen (humane epitheliale embryonale Nierenzellen) von der Master Cell Bank für die Untersuchungen verwendet.
  • B) Medien
  • Für die Zellvermehrungsphase wurde Dulbecco's modified Eagle's-Medium (DMEM, 4,5 g/l Glucose) + 10% fötales Rinderserum (FBS) verwendet. Für die Virusproduktionsphase wurde die FBS-Konzentration in DMEM auf 2% verringert.
  • C) Virus
  • AdCMVp53 ist ein durch Gentechnologie modifiziertes replikationsinkompetentes humanes Typ 5-Adenovirus, welches das humane Wildtyp-p53-Protein unter der Kontrolle des „immediate early"-Promotors des Zytomegalievirus (CMV) exprimiert.
  • D) Celligen-Bioreaktor
  • Es wurde ein Celligen-Bioreaktor (New Brunswick Scientific Co., Inc.) mit 5 l Gesamtvolumen (3,5 l Arbeitsvolumen) verwendet, um Virusüberstand unter Verwendung einer Microcarrier-Kultur herzustellen. 13 g/l mit Glas beschichteter Microcarrier (SoloHill) wurde für das Kultivieren von Zellen in dem Bioreaktor verwendet.
  • E) Herstellung von Virusüberstand in dem Celligen-Bioreaktor
  • 293-Zellen aus der Master Cell Bank (MCB) wurden aufgetaut und in Cellfactories (Nunc) vermehrt. Zellen wurden im Allgemeinen bei einer Konfluenz von ungefähr 85–90% aufgeteilt. Zellen wurden als Inokulum in den Bioreaktor mit einer Inokulationskonzentration von 1 × 105 Zellen/ml eingebracht. Man ließ die Zellen sich an die Microcarrier durch intermittierende Bewegung anheften. Eine kontinuierliche Bewegung mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm wurde 6–8 h nach der Inokulation der Zellen begonnen. Die Zellen wurden 7 Tage kultiviert mit Verfahrensparametern, die auf pH = 7,20, gelöster Sauerstoff (DO) = 60% Luftsättigung, Temperatur = 37°C festgelegt worden waren. Am Tag 8 wurden Zellen mit AdCMVp53 mit einer MOI von 5 infiziert. Fünfzig Stunden nach der Virusinfektion wurde die Bewegungsgeschwindigkeit von 30 Upm auf 150 Upm erhöht, um die Zelllyse zu vereinfachen und das Virus in den Überstand freizusetzen. Der Virusüberstand wurde 74 h nach der Infektion geerntet. Der Virusüberstand wurde dann für eine weitere Konzentration/Diafiltration filtriert.
  • F) CellcubeTM-Bioreaktorsystem
  • Ein CellcubeTM Bioreaktorsystem (Corning-Costar) wurde ebenfalls für die Herstellung von AdCMVp53-Virus verwendet. Es besteht aus einem Einweg-Zellkulturmodul, einem Oxygenierapparat, einer Mediumrezirkulationspumpe und einer Mediumpumpe für die Perfusion. Das verwendete Zellkulturmodul weist eine Kulturoberfläche von 21.550 cm2 (1-mer; 1 Exemplar) auf.
  • G) Herstellung von Virus in dem CellcubeTM
  • 293-Zellen aus der Master Cell Bank (MCB) wurden aufgetaut und in Cellfactories (Nunc) vermehrt. Zellen wurden im Allgemeinen bei einer Konfluenz von ungefähr 85–90% aufgeteilt. Zellen wurden als Inokulum in den CellcubeTM gemäß der Empfehlung des Herstellers eingebracht. Inokulationszelldichten lagen im Bereich von 1–1,5 × 104/cm2. Man ließ Zellen 7 Tage bei 37°C unter Kulturbedingungen von pH = 7,20, DO = 60% Luftsättigung, sich vermehren. Die Mediumperfusionsrate wurde entsprechend der Glucosekonzentration in dem CellcubeTM reguliert. Einen Tag vor der Virusinfektion wurde das Medium für die Perfusion von DMEM + 10% FBS auf DMEM + 2% FBS geändert. Am Tag 8 wurden Zellen mit AdCMVp53-Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 infiziert. Die Mediumperfusion wurde unmittelbar nach der Infektion für 1 h gestoppt, dann für den verbleibenden Zeitraum der Virusproduktionsphase wieder aufgenommen. Die Kultur wurde 45–48 h nach der Infektion geerntet.
  • H) Lyselösung
  • Es wurde Tween-20 (Fisher Chemical) in einer Konzentration von 1% (Vol./Vol.) in 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 7,50, -Puffer verwendet, um Zellen am Ende der Virusproduktionsphase in dem CellcubeTM zu lysieren.
  • I) Klärung und Filtration
  • Virusüberstand aus dem Celligen-Bioreaktor und Viruslösung aus dem CellcubeTM wurden zuerst unter Verwendung eines Depth Filter (Preflow, GelmanSciences) geklärt, dann wurde durch einen 0,8/0,22 μm-Filter (SuporCap 100, Gelman Sciences) filtriert.
  • J) Konzentration/Diafiltration
  • Tangentialflussfiltration (TFF) wurde verwendet, um den Virusüberstand aus dem Celligen-Bioreaktor und die Viruslösung aus dem CellcubeTM zu konzentrieren und einen Pufferaustausch vorzunehmen. Eine „Pellicon II mini cassette" (Millipore) von 300 K nominalem Molekulargewichtsausschluss (NMWC) wurde für die Konzentration und Diafiltration verwendet. Die Viruslösung wurde zuerst 10-fach aufkonzentriert. Dem folgten 4 Probenvolumen Pufferaustausch gegen 20 mM Tris + 1,0 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 9,00, -Puffer unter Verwendung der bei einem konstanten Volumen arbeitenden Diafiltrationsmethode.
  • Eine ähnliche Konzentration/Diafiltration wurde für das mittels Säule gereinigte Virus ausgeführt. Eine „Pellicon II mini cassette" von 100 K NMWC wurde anstelle der 300 K-NMWC-Kassette verwendet. Eine Diafiltration erfolgte gegen 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH 9,00, -Puffer oder Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS).
  • K) Benzonasebehandlung
  • Die konzentrierte/diafiltrierte Viruslösung wurde mit BenzonaseTM (American International Chemicals) bei einer Konzentration von 100 u/ml, Raumtemperatur über Nacht behandelt, um die Konzentration von kontaminierenden Nukleinsäuren in der Viruslösung zu reduzieren.
  • L) CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation
  • Rohe Viruslösung wurde unter Verwendung einer doppelten CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation unter Verwendung eines SW40-Rotors in einer Beckman-Ultrazentrifuge (XL-90) gereinigt. Als erstes wurden 7 ml rohe Viruslösung unter Überschichtung auf einen stufenweisen CsCl-Gradient, der aus gleichen 2,5 ml-Volumen von 1,25 g/ml bzw. 1,40 g/ml CsCl-Lösung hergestellt worden war, aufgetragen. Der CsCl-Gradient wurde bei 35000 Upm 1 h bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Virusbande an der Gradientengrenzfläche wurde gewonnen. Das gewonnene Virus wurde dann durch einen isopyknischen CsCl-Gradienten weiter gereinigt. Dies erfolgte durch Mischen der Viruslösung mit einem wenigstens 1,5-fachen Volumen von 1,33 g/ml CsCl-Lösung. Die CsCl-Lösung wurde bei 35000 Upm wenigstens 18 h bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die untere Bande wurde als das intakte Virus gewonnen. Das Virus wurde unverzüglich gegen 20 mM Tris + 1 mM MgCl2, pH = 7,50, -Puffer dialysiert, um CsCl zu entfernen. Das dialysierte Virus wurde bei –70°C für eine zukünftige Verwendung aufbewahrt.
  • M) Ionenaustauschchromatographie (IEC)-Reinigung
  • Die mit Benzonase behandelte Viruslösung wurde unter Verwendung von IEC gereinigt. Für die Reinigung wurde das starke Anionenharz Toyopearl SuperQ 650 M (Tosohaas) verwen det. Es wurde ein FPLC-System (Pharmacia) mit einer XK16-Säule (Pharmacia) für die anfängliche Verfahrensentwicklung verwendet. Weitere Untersuchungen zur maßstäblichen Vergrößerung wurden ausgeführt unter Verwendung eines BioPilot-Systems (Pharmacia) mit einer XK 50-Säule (Pharmacia). Kurz zusammengefasst, wurde das Harz in die Säulen gepackt und mit 1 N NaOH desinfiziert, dann mit Puffer B beladen, welchem eine Konditionierung mit Puffer A folgte. Die Puffer A und B bestanden aus 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCL2, pH = 9,00, bzw. 20 mM Tris + 2 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 9,00. Viruslösungsprobe wurde auf die konditionierte Säule aufgeladen, gefolgt von einem Waschen der Säule mit Puffer A, bis die UV-Absorption die Grundlinie erreichte. Das gereinigte Virus wurde von der Säule durch Verwendung von 10 Säulenvolumen eines linearen NaCl-Gradienten eluiert.
  • N) HPLC-Analyse
  • Es wurde eine HPLC-Analysenprozedur entwickelt, um die Effizienz der Virusproduktion und -reinigung auszuwerten. Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) wurde von Fisher Biotech (Kat.Nr. BP154-1; Fair Lawn, New Jersey, U.S.A.) erhalten; Natriumchlorid (NaCl) wurde von Sigma (Kat.Nr. S-7653, St. Louis, MO, U.S.A.) erhalten. Beide wurden direkt ohne weitere Reinigung verwendet. HPLC-Analysen wurden ausgeführt an einem Analytical Gradient System von Beckman mit Gold Workstation-Software (binäre Pumpe 126 und Diodenanordnungsdetektor 168), ausgerüstet mit einer Anionenaustauschersäule von TosoHaas (7,5 cm × 7,5 mm ID, 10 μm Teilchengröße, Kat. Nr. 18257). Es wurde eine 1 ml-Resource Q (Pharmacia)-Anionenaustauschersäule verwendet, um die durch Huyghe et al. entwickelte Methode unter Verwendung von deren HEPES-Puffersystem auszuwerten. Diese Methode wurde nur für das Bioreaktor-System versucht.
  • Die in dem vorliegenden HPLC-System verwendeten Puffer waren Puffer A: 10 mM Tris-Puffer, pH 9,0. Puffer B: 1,5 M NaCl in Puffer A, pH 9,0. Die Puffer wurden durch einen 0,22 μm „bottle top"-Filter von Corning (Kat.Nr. 25970-33) filtriert. Alle Proben wurden vor der Injektion durch einen 0,8/0,22 μm-Acrodisc PF von Gelman Sciences (Kat.Nr. 4187) filtriert.
  • Die Probe wird in die HPLC-Säule in einem Volumen von 60–100 μl injiziert. Nach der Injektion wird die Säule (TosoHaas) mit 20% B 3 min mit einer Flussrate von 0,75 ml/min gewaschen. Dann wird der Gradient gestartet, in welchem B von 20% auf 50% über 6 min erhöht wird. Dann wird der Gradient über 3 min von 50% auf 100% B geändert, gefolgt von 100% B für 6 min. Die Salzkonzentration wird dann schrittweise zurück auf 20%, erneut über 4 min, verändert und weitere 6 min bei 20% gehalten. Die Retentionszeit des Adp53 beträgt 9,5 ± 0,3 min mit A260/A280 ≌ 1,26 ± 0,03. Das Reinigen der Säule nach jedem Chromatographielauf wird bewerkstelligt, indem 100 μl 0,15 M NaOH injiziert werden und dann der Gradient gefahren wird.
  • BEISPIEL 2
  • Auswirkung der Mediumperfusionsrate im CellcubeTM auf die Virusproduktion und -reinigung
  • Für ein Perfusionszellkultursystem, wie den CellcubeTM, spielt die Mediumperfusionsrate eine wichtige Rolle bei der Ausbeute und Qualität des Produkts. Es wurden zwei unterschiedliche Mediumperfusionsstrategien untersucht. Eine Strategie bestand darin, die Glucosekonzentration in dem CellcubeTM ≥ 2 g/l zu halten (hohe Perfusionsrate). Die andere bestand darin, die Glucosekonzentration ≥ 1 g/l zu halten (niedrige Perfusionsrate).
  • Es wurden zwischen den zwei unterschiedlichen Perfusionsraten keine signifikanten Veränderungen bei den Kulturparametern, wie pH, DO, beobachtet. Nach einem Ernten unter Verwendung von 1% Tween-20-Lyselösung wurden ungefähr äquivalente Mengen an rohen Viren (vor der Reinigung) hergestellt, wie in Tabelle 5 gezeigt. Jedoch wurde ein dramatischer Unterschied auf den HPLC-Profilen der Viruslösungen aus den Produktionsläufen mit hoher und niedriger Mediumperfusionsrate festgestellt. TABELLE 5. Auswirkung der Mediumglucosekonzentration auf die Virusausbeute
    Figure 00680001
  • Wie in 1 gezeigt, wurde ein sehr gut abgetrennter Viruspeak (Retentionszeit 9,39 min) ausgehend von einer Viruslösung unter Verwendung der niedrigen Mediumperfusionsrate hergestellt. Es wurde festgestellt, dass Virus mit adäquater Reinheit und biologischer Aktivität nach einem einzigen Schritt einer ionenaustauschchromatographischen Reinigung der unter niedriger Mediumperfusionsrate hergestellten Viruslösung erhalten wurde. Andererseits wurde kein abgetrennter Viruspeak in der Retentionszeit von 9,39 min ausgehend von einer Viruslösung, die unter Verwendung der hohen Mediumperfusionsrate hergestellt worden war, beobachtet. Dies legt nahe, dass Kontaminanten, die das gleiche Elutionsprofil wie das Virus haben, unter hoher Mediumperfusionsrate produziert worden waren. Obwohl die Natur der Kontaminanten noch nicht klar ist, wird erwartet, dass die Kontaminanten in Verbindung stehen mit der erhöhten Produktion von extrazellulären Matrixproteinen unter hoher Mediumperfusionsrate (hohe Serum-Einspeisung) ausgehend von den Produzentenzellen. Diese schlechte Trenncharakteristik, die in der HPLC festgestellt wird, erzeugte Schwierigkeiten für eine IEC-Verfahrensreinigung, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird. Als Ergebnis hat die Mediumperfusionsrate, die während den Zellvermehrungs- und Virusproduktionsphasen in dem CellcubeTM verwendet wird, eine signifikante Auswirkung auf die nachgeschaltet erfolgende IEC-Reinigung des Virus. Es wird eine niedrige Mediumperfusionsrate empfohlen. Dies erzeugt nicht nur ein leicht zu reinigendes Rohprodukt, sondern ermöglicht auch eine kosteneffektivere Produktion aufgrund des verringerten Mediumverbrauchs.
  • BEISPIEL 3
  • Zellernte- und Lysemethoden
  • Basierend auf früheren Erfahrungen werteten die Erfinder zuerst die Einfrier-Auftau-Methode aus. Zellen wurden aus dem CellcubeTM 45–48 h nach der Infektion geerntet. Als erstes wurde der CellcubeTM aus dem Kultursystem isoliert und man ließ das verbrauchte Medium ablaufen. Dann wurde 50 mM EDTA-Lösung in den Cube gepumpt, um die Zellen von der Kulturoberfläche abzulösen. Die so erhaltene Zellsuspension wurde bei 1500 Upm 10 min zentrifugiert (Beckman GS-6KR). Das resultierende Zellpellet wurde in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde 5 Zyklen von Einfrieren/Auftauen zwischen einem 37°C-Wasserbad und einem Trockeneis-Ethanol-Bad unterworfen, um Viren aus den Zellen freizusetzen. Das so erzeugte rohe Zelllysat (CCL) wurde mittels HPLC analysiert.
  • 2 zeigt das HPLC-Profil. Bei der Retentionszeit von 9,32 min wird kein Viruspeak beobachtet. Stattdessen werden zwei Peaks mit Retentionszeiten von 9,11 und 9,78 min produziert. Dieses Profil legt nahe, dass die anderen Kontaminanten, welche eine ähnliche Elutionszeit wie das Virus aufweisen, in dem CCL vorkommen und mit der Reinigung des Virus interferieren. Als Ergebnis wurde eine sehr niedrige Reinigungseffizienz beobachtet, wenn das CCL durch IEC unter Verwendung von FPLC gereinigt wurde.
  • Zusätzlich zu der niedrigen Reinigungseffizienz gab es einen signifikanten Produktverlust während des Zellernteschritts in die EDTA-Lösung, wie in Tabelle 6 angegeben. Ungefähr 20% des Produkts ging in der EDTA-Lösung, die verworfen wurde, verloren. Zusätzlich sind ungefähr 24% des rohen Virusprodukt in dem verbrauchten Medium, das ebenfalls verworfen wurde, vorhanden. Dementsprechend befinden sich nur 56% des rohen Virusprodukts in dem CCL. Darüber hinaus ist das Einfrieren/Auftauen ein Verfahren mit großer Variation und sehr begrenzter maßstäblicher Vergrößerbarkeit. Es muss ein effizienteres Zelllyseverfahren mit weniger Produktverlust entwickelt werden. TABELLE 6. Verlust von Virus während EDTA-Ernte von Zellen aus dem CellcubeTM
    Figure 00700001
    • Die Daten wurden ausgehend von 1 Exemplar von CellcubeTM erzeugt.
  • Figure 00710001
  • Detergentien sind verwendet worden, um Zellen zu lysieren, um intrazelluläre Organellen freizusetzen. Folglich werteten die Erfinder die Detergens-Lysemethode für die Freisetzung von Adenoviren aus. Tabelle 7 listet die 5 unterschiedlichen nicht-ionischen Detergentien auf, die für die Zelllyse ausgewertet wurden. Zellen wurden aus dem CellcubeTM 48 h nach der Infektion unter Verwendung von 50 mM EDTA geerntet. Das Zellpellet wurde in den verschiedenen Detergentien in verschiedenen Konzentrationen, die in Tabelle 7 aufgelistet sind, resuspendiert.
  • Die Zelllyse wurde entweder bei Raumtemperatur oder auf Eis für 30 min ausgeführt. Eine klare Lyselösung wurde nach Zentrifugation, um das Präzipitat und Zellrückstände zu entfernen, erhalten. Die Lyselösungen wurden mit Benzonase behandelt und dann durch HPLC analysiert. 3 zeigt die HPLC-Profile von Lyselösungen ausgehend von den verschiedenen Detergentien. Thesit und NP-40 ergaben ein ähnliches Ergebnis wie Triton X-100. Eine Lyselösung, die ausgehend von 1% Tween-20 erzeugt worden war, ergab die beste Virusauftrennung, wobei die schlechteste Virusauftrennung mit Brij-58 beobachtet wurde. Bei einer Detergenskonzentration von 1% (Gew./Vol.) wurde eine effizientere Zelllyse festgestellt. Die Lysetemperatur trug bei den untersuchten Detergenskonzentrationen nicht signifikant zu der Virusauftrennung bei. Zum Zwecke der Einfachheit des Verfahrens wird eine Lyse bei Raumtemperatur empfohlen. Es wurde eine aus 1% Tween-20 in 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 7,50, bestehende Lyselösung für die Zelllyse und Virusernte in dem CellcubeTM eingesetzt.
  • BEISPIEL 4
  • Auswirkungen der Konzentration/Diafiltration auf die Virusrückgewinnung
  • Viruslösung aus dem Lyseschritt wurde vor einer Konzentration/Diafiltration geklärt und filtriert. Für eine effiziente Konzentration/Diafiltration wurden TFF-Membranen mit unterschiedlichen NMWCs, einschließlich 100 K, 300 K, 500 K und 1000 K, ausgewertet. Der höchste Mediumfluss mit minimalem Virusverlust an das Filtrat wurde mit einer Membran von 300 K NMWC erhalten. Größere NMWC-Membranen boten einen höheren Mediumfluss, führten aber zu einem höheren Virusverlust an das Filtrat, während kleinere NMWC-Membranen einen unzureichenden Mediumfluss erzielten. Die Viruslösung wurde zuerst 10-fach aufkonzentriert, gefolgt von 4 Probenvolumen Diafiltration gegen 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 9,00, -Puffer unter Verwendung der bei konstantem Volumen ausgeführten Methode. Während des Konzentrations/Diafiltrationsverfahrens wurde der Druckabfall quer durch die Membran ≤ 5 psi gehalten. Während des Konzentrations/Diafiltrationsschritts wurde eine konsistente hochgradige Virusrückgewinnung demonstriert, wie in Tabelle 8 angegeben.
  • Figure 00730001
  • BEISPIEL 5
  • Auswirkung einer Salzzugabe auf die Benzonasebehandlung
  • Viruslösung wurde nach Konzentration/Diafiltration mit Benzonase (Nuklease) behandelt, um die Konzentration von kontaminierender Nukleinsäure in der Viruslösung zu reduzieren. Es wurden unterschiedliche Arbeitskonzentrationen von Benzonase, die 50, 100, 200, 300 Einheiten/ml umfassten, für die Reduzierung der Nukleinsäurekonzentrationen ausgewertet. Für den Zweck der Einfachheit des Verfahrens wurde die Behandlung bei Raumtemperatur über Nacht ausgeführt. Es wurde nach Benzonasebehandlung eine signifikante Verringerung der kontaminierenden Nukleinsäure, die mit einer humanen genomischen DNA-Sonde hybridisierbar ist, festgestellt.
  • Tabelle 9 zeigt die Reduzierung der Nukleinsäurekonzentration vor und nach Benzonasebehandlung. Viruslösung wurde vor und nach der Benzonasebehandlung mittels HPLC analysiert. Wie in 4A und 4B gezeigt, wurde nach einer Benzonasebehandlung eine dramatische Verringerung des Peaks der kontaminierenden Nukleinsäure beobachtet. Dies steht in Übereinstimmung mit dem Ergebnis des Nukleinsäurehybridisierungsassays. Aufgrund der Wirksamkeit wurde eine Benzonasekonzentration von 100 u/ml für die Behandlung der rohen Viruslösung eingesetzt. Tabelle 9. Reduzierung der Konzentration von kontaminierenden Nukleinsäuren in der Viruslösung
    Figure 00740001
    • Behandlungsbedingungen: Benzonasekonzentration 100 u/ml, Temperatur: Raumtemperatur, Dauer: über Nacht.
  • Es wurde vor und nach der Benzonasebehandlung eine signifikante Veränderung in dem HPLC-Profil festgestellt. Bei einer Retentionszeit von 9,33 min wurde nach der Benzonasebehandlung kein abgetrennter Viruspeak detektiert. Zugleich entwickelte sich ein größerer Peak mit hoher 260 nm-Absorption bei einer Retentionszeit von 9,54 min. Titer-Assayergebnisse zeig ten an, dass die Benzonasebehandlung den Virustiter nicht abträglich beeinflusste und Virus nach der Benzonasebehandlung intakt und infektös blieb. Es wurde geschlossen, dass während des Zelllyseschritts freigesetzte zelluläre Nukleinsäure mit Virus wechselwirkte und entweder Aggregate mit dem Virus bildete oder während der Benzonasebehandlung an die Virusoberfläche adsorbierte.
  • Um die mögliche Nukleinsäure-Virus-Wechselwirkung während einer Benzonasebehandlung zu minimieren, wurden unterschiedliche Konzentrationen von NaCl zu der Viruslösung vor der Benzonasebehandlung zugesetzt. Nach einer Benzonasebehandlung in Gegenwart von 1 M NaCl in der Viruslösung trat keine dramatische Veränderung in dem HPLC-Profil auf. 5 zeigt das HPLC-Profil einer Viruslösung nach Benzonasebehandlung in Gegenwart von 1 M NaCl. Anders als in 4B gezeigt, existiert nach der Benzonasebehandlung nach wie vor der Viruspeak bei der Retentionszeit von 9,35 min. Dieses Ergebnis zeigt an, dass das Vorhandensein von 1 M NaCl die Wechselwirkung von Nukleinsäure mit Virus während einer Benzonasebehandlung verhindert und die weitere Reinigung von Virus von kontaminierender Nukleinsäure vereinfacht.
  • BEISPIEL 6
  • Ionenaustauschchromatographische Reinigung
  • Das Vorhandensein einer negativen Ladung auf der Oberfläche von Adenoviren bei physiologischen pH-Bedingungen veranlasste eine Auswertung von Anionenaustauschern für die Reinigung von Adenoviren. Der starke Anionenaustauscher Toyopearl Super Q 650M wurde für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens verwendet. Die Auswirkungen der NaCl-Konzentration und des pHs des Beladungspuffers (Puffer A) auf die Virusreinigung wurden unter Verwendung des FPLC-Systems ausgewertet.
  • A) Methodenentwicklung
  • Für eine Ionenaustauschchromatorgraphie ist der Puffer-pH einer der wichtigsten Parameter und kann dramatischen Einfluss auf die Reinigungseffizienz haben. Unter Bezugnahme auf den Medium-pH und die Leitfähigkeit, die während der Virusproduktion verwendet werden, formulierten die Erfinder 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,2 M NaCl, pH = 7,50, als Puffer A. Eine mit Toyopearl SuperQ 650M gepackte XK16-Säule mit einer Höhe von 5 cm wurde mit Puffer A konditioniert.
  • Eine Probe von 5 ml Benzonase-behandeltem konzentriertem/diafiltriertem Virusüberstand aus dem Celligen-Bioreaktor wurde auf die Säule aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde eine Elution mit einem linearen Gradient von über 10 Säulenvolumen von Puffer B-Formulierung, um mM Tris + 1 mM MgCl2 + 2 M NaCl, pH = 7,50, zu erreichen, ausgeführt.
  • 6 zeigt das Elutionsprofil. Während der Elution wurden drei Peaks ohne zufriedenstellende Trennung zwischen diesen beobachtet. Eine mit mit 293-Zellen konditioniertem Medium (ohne Virus) ausgeführte Kontrolluntersuchung zeigte, dass die ersten beiden Peaks mit dem Virus in Zusammenhang stehen. Um die Trennungseffizienz weiter zu verbessern, wurde die Auswirkung des Puffer-pH ausgewertet. Der Puffer-pH wurde auf 9,00 erhöht, während andere Bedingungen konstant gehalten wurden. Es wurde eine stark verbesserte Trennung, wie in 7 gezeigt, beobachtet verglichen mit jener eines Puffers mit pH 7,50. Die Fraktionen Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 8 wurden mittels HPLC analysiert.
  • Wie in 8 gezeigt, wurde die Hauptmenge des Virus in der Fraktion Nr. 4 gefunden, wobei kein Virus in den Fraktionen Nr. 3 und Nr. 8 detektiert wurde. Es wurde festgestellt, dass die Fraktion Nr. 8 hauptsächlich aus kontaminierender Nukleinsäure bestand. Jedoch war die Reinigung noch nicht optimal. Es gibt eine Überlappung zwischen den Fraktionen Nr. 3 und Nr. 4, wobei in Fraktion Nr. 4 nach wie vor Kontaminanten detektiert werden.
  • Basierend auf dem Chromatogramm in 7 wurde geschlossen, dass eine weitere Verbesserung der Virusreinigung erzielt werden könnte, indem die Salzkonzentration im Puffer A erhöht würde. Als Ergebnis können die Kontaminanten, die in der Fraktion Nr. 3, die dem Viruspeak vorangeht, vorhanden sind, in Richtung der Durchflussfraktion verschoben werden. Die NaCl-Konzentration im Puffer A wurde auf 0,3 M erhöht, während andere Bedingungen konstant gehalten wurden. 9 zeigt das Elutionsprofil unter der Bedingung von 0,3 M NaCl in Puffer A.
  • Es wurde eine dramatische Verbesserung bei der Reinigungseffizienz erzielt. Wie erwartet, wurde der kontaminierende Peak, der in 7 beobachtet wurde, unter der Bedingung von erhöhtem Salz eliminiert. Proben von rohem Virusüberstand, Durchfluss, Peak Nr. 1 und Peak Nr. 2 wurden mittels HPLC analysiert und die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. In der Durchflussfraktion wurde kein Virus detektiert. Die Hauptmenge der in dem Rohmaterial vorhandenen Kontaminanten wurde in dem Durchfluss gefunden. Eine HPLC-Analyse von Peak Nr. 1 zeigte einen einzigen gut definierten Viruspeak. Dieses HPLC-Profil ist äquivalent zu jenem, das ausgehend von einem mittels doppeltem CsCl-Gradient gereinigten Virus erhalten wird. Peaks, die bei Retentionszeiten von 3,14 und 3,61 min bei dem mittels CsCl-Gradient gereinigten Virus beobachtet werden, sind mit Glycerol in Zusammenhang stehende Peaks. Das gereinigte Virus hat ein A260/A280-Verhältnis von 1,27 ± 0,03. Dies ist ähnlich zu dem Wert eines mittels dop peltem CsCl-Gradient gereinigten Virus wie auch zu den Ergebnissen, über die von Huyghe et al (1996) berichtet worden ist. Peak Nr. 2 besteht hauptsächlich aus kontaminierender Nukleinsäurek. Basierend auf dem Reinigungsergebnis schlugen die Erfinder die folgende Methode für eine IEC-Reinigung von Adenovirus-Überstand aus dem Bioreaktor vor.
    Puffer A: 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,3 M NaCl, pH = 9,00
    Puffer B: 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 2 M NaCl, pH = 9,00
    Elution: 10 Säulenvolumen linearer Gradient.
  • B) Maßstäbliche Vergrößerung der Methode
  • Nach der Entwicklung der Methode wurde die Reinigung unter Verwendung des gleichen Reinigungsverfahrens maßstäblich von der XK16-Säule (1,6 cm I.D.) zu einer XK 50-Säule (5 cm I.D.; 10-fache maßstäbliche Vergrößerung) vergrößert. Es wurde an der XK50-Säule ein ähnliches Elutionsprofil erzielt, wie in 11 gezeigt. Die Virusfraktion wurde mittels HPLC analysiert, die eine äquivalente Virusreinheit zu jener, die ausgehend von der XK16-Säule erhalten wird, anzeigte.
  • Während der Untersuchungen zur maßstäblichen Vergrößerung wurde festgestellt, dass es bequemer und konsistenter war, Leitfähigkeit zu verwenden, um die Salzkonzentration in Puffer A zu quantifizieren. Die optimale Leitfähigkeit von Puffer A liegt im Bereich von 25 ± 2 mS/cm bei ungefähr Raumtemperatur (21°C). Während des Reinigungsverfahrens erzeugte Proben wurden zusammen mit doppelt CsCl-gereinigtem Virus mittels SDS-PAGE analysiert.
  • Wie in 12 gezeigt, werden alle hauptsächlichen Adenovirus-Strukturproteine mittels der SDS-PAGE detektiert. Das IEC-gereinigte Virus zeigt eine äquivalente Anfärbung wie jene des doppelt CsCl-gereinigten Virus. Es wurde während der Reinigung eine signifikante Verringerung der Rinderserumalbumin (BSA)-Konzentration erzielt. Die BSA-Konzentration in dem vereinigten Virus war unterhalb der Nachweisgrenze des Western-Blot-Assays, wie in 13 gezeigt.
  • Die Verringerung der Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in der Viruslösung während des Reinigungsverfahrens wurde unter Verwendung eines Nukleinsäure-Slot-Blots bestimmt. 32P-markierte humane genomische DNA wurde als Hybridisierungssonde verwendet (da 293-Zellen humane embryonale Nierenzellen sind). Tabelle 10 zeigt die Nukleinsäurekonzentration in unterschiedlichen Stadien des Reinigungsverfahrens. Die Nukleinsäurekonzentration in der endgültigen gereinigten Viruslösung war auf 60 pg/ml verringert, eine ungefähr 3,6 × 106-fache Verringerung verglichen mit dem anfänglichen Virusüberstand. Virustiter und das Verhältnis von infektiösen zu gesamten Teilchen wurden für das gereinigte Virus bestimmt und die Ergebnisse wurden mit jenen aus einer doppelten CsCl-Reinigung in Tabelle 9 verglichen. Sowohl Virusrückgewinnung als auch Partikel/PFU-Verhältnis sind zwischen den beiden Reinigungsverfahren sehr ähnlich. Der Titer der mittels einer Säure gereinigten Viruslösung kann weiter erhöht werden, indem ein Konzentrationsschritt ausgeführt wird. TABELLE 10. Entfernung von kontaminierenden Nukleinsäuren während der Reinigung
    Figure 00780001
  • BEISPIEL 7
  • Andere Reinigungsmethoden
  • Zusätzlich zu der starken Anionenaustauschchromatographie wurden auch andere Weisen von chromatographischen Methoden für die Reinigung von AdCMVp53-Virus ausgewertet (z.B. Größenausschlusschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, Kationenaustauschchromatographie oder Metallionenaffinitätschromatographie). Verglichen mit Toyopearl Super Q boten alle diese Reinigungsweisen eine viel weniger effiziente Reinigung mit geringer Produktrückgewinnung. Dementsprechend wird Toyopearl Super Q-Harz für die Reinigung von AdCMVp53 empfohlen. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass andere auf der quartären Ammoniumchemie basierende starke Anionenaustauscher bei einigen Verfahrensmodifizierungen für die Reinigung von AdCMVp53 geeignet wein werden.
  • BEISPIEL 8
  • Reinigung von rohem AdCMVp53-Virus, welches ausgehend von CellcubeTM erzeugt worden ist
  • Es wurden zwei unterschiedliche Herstellungsmethoden entwickelt, um AdCMVp53-Virus herzustellen. Eine basierte auf einer Microcarrier-Kultur in einem Bioreaktor mit gerührtem Tank. Die andere basierte auf einem CellcubeTM-Bioreaktor. Wie oben beschrieben, wurde das Reinigungsverfahren entwickelt unter Verwendung eines rohen Virusüberstands, der ausgehend von dem Bioreaktor mit gerührtem Tank erzeugt worden ist. Es wurde festgestellt, dass, obwohl das gleiche Medium, die gleichen Zellen und Viren für die Virusproduktion sowohl in dem Bioreaktor als auch dem CellcubeTM verwendet worden waren, die Kulturoberfläche, an welche die Zellen sich anhefteten, unterschiedlich war.
  • In dem Bioreaktor wurden Zellen auf einem mit Glas beschichteten Microcarrier kultiviert, während in dem CellcubeTM Zellen auf einer patentrechtlich geschützten behandelten Polystyrol-Kulturoberfläche vermehrt wurden. In dem CellcubeTM wurde eine konstante Mediumperfusion verwendet, andererseits wurde in dem Bioreaktor keine Mediumperfusion verwendet. In dem CellcubeTM wurde das rohe Virusprodukt in Form von virusinfizierten Zellen geerntet, was sich von dem aus dem Bioreaktor geernteten Virusüberstand unterscheidet.
  • Rohes Zelllysat (CCL), das nach 5 Zyklen von Einfrieren-Auftauen der geernteten virusinfizierten Zellen hergestellt wird, wurde durch IEC unter Verwendung der oben beschriebenen Methode gereinigt. Anders als bei dem Virusüberstand aus dem Bioreaktor wurde für das ausgehend von dem CellcubeTM erzeugte CCL-Material keine zufrieden stellende Reinigung erzielt. 14 zeigt das Chromatogramm. Das Ergebnis legt nahe, dass rohe Viruslösung, die ausgehend von dem CellcubeTM durch Einfrieren-Auftauen von geernteten Zellen erzeugt wird, nicht leicht durch die IEC-Methode gereinigt wird.
  • Andere Reinigungsmethoden, einschließlich hydrophobe Wechselwirkungs- und Metallchelatchromatographie, wurden für die Reinigung von Virus in CCL untersucht. Unglücklicherweise wurde bei jedem der beiden Verfahren keine Verbesserung bei der Reinigung beobachtet. Unter Berücksichtigung der Schwierigkeiten einer Reinigung von Virus in CCL und der mit einem Einfrier-Auftau-Schritt in dem Herstellungsverfahren verbundenen Nachteile entschieden sich die Erfinder, andere Zelllysemethoden zu erforschen.
  • A) Reinigung von roher Viruslösung in Lysepuffer
  • Wie in den Beispielen 1 und 3 beschrieben, wurde eine HPLC-Analyse verwendet, um verschiedene Detergens-Lysemethoden zu screenen. Basierend auf den HPLC-Ergebnissen wurde 1% Tween-20 in 20 mM Tris + 0,25 M NaCl + 1 mM MgCl2, pH = 7,50, -Puffer als Lysepuf fer eingesetzt. Am Ende der Virusproduktionsphase wurde anstelle eines Erntens der infizierten Zellen der Lysepuffer in den CellcubeTM gepumpt, nachdem man das verbrauchte Medium hatte ablaufen lassen. Die Zellen wurden lysiert und Virus in den Lysepuffer freigesetzt, indem 30 min inkubiert wurde.
  • Nach Klärung und Filtration wurde die Viruslösung konzentriert/diafiltriert und mit Benzonase behandelt, um die Konzentration an kontaminierender Nukleinsäure zu reduzieren. Die behandelte Viruslösung wurde durch die oben unter Verwendung von Toyopearl SuperQ-Harz entwickelte Methode gereinigt. Es wurde eine zufrieden stellende Auftrennung ähnlich zu jener, die unter Verwendung von Virusüberstand aus dem Bioreaktor erhalten worden war, während der Elution erzielt. 15 zeigt das Elutionsprofil. Wenn die Virusfraktion jedoch mittels HPLC analysiert wurde, wurde ein anderer Peak zusätzlich zu dem Viruspeak detektiert. Das Ergebnis ist in 16A gezeigt.
  • Um das Virus weiter zu reinigen, wurde die gesammtelte Virusfraktion erneut unter Verwendung der gleichen Methode gereinigt. Wie in 16B gezeigt, verbesserte sich die Reinheit der Virusfraktion nach der zweiten Reinigung beträchtlich. Es wurde auch eine Metallchelat-Chromatographie als ein Kandidat für die zweite Reinigung ausgewertet. Es wurde eine ähnliche Verbesserung bei der Virusreinheit, wie sie bei der zweiten IEC festgestellt wird, erzielt. Jedoch ist eine IEC aufgrund von ihrer Einfachheit als die Methode der Wahl für die zweite Reinigung bevorzugt.
  • Wie oben in Beispiel 2 beschrieben, hat die Mediumperfusionsrate, die während der Zellvermehrungs- und Virusproduktionsphasen eingesetzt wird, einen beträchtlichen Einfluss auf das HPLC-Auftrennungsprofil der rohen Tween-20-Virus-Ernte. Für eine rohe Viruslösung, die bei einer hohen Mediumperfusionsrate hergestellt worden ist, werden zwei Ionenaustauschersäulen benötigt, um die erforderliche Virusreinheit zu erzielen.
  • Basierend auf der stark verbesserten Auftrennung, die bei einer HPLC für eine Viruslösung, die bei niedriger Mediumperfusionsrate hergestellt worden ist, beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, dass eine Reinigung durch eine Ionenaustauschersäule die erforderliche Virusreinheit erzielen könnte. 17 zeigt das Elutionsprofil unter Verwendung einer rohen Viruslösung, die bei niedriger Mediumperfusionsrate hergestellt worden ist. Während der Elution wurde ein scharfer Viruspeak erhalten. Eine HPLC-Analyse der Virusfraktion zeigt eine Virusreinheit an, die äquivalent zu jener eines durch einen CsCl-Gradient gereinigten Virus nach einem Ionenaustauschchromatographieschritt ist. 18 zeigt das HPLC-Analysenergebnis.
  • Das gereinigte Virus wurde weiter durch SDS-PAGE, Western-Blot auf BSA und Nukleinsäure-Slot-Blot analysiert, um die Konzentration von kontaminierenden Nukleinsäuren zu bestimmen. Die Analysenergebnisse sind in 19A, 19B bzw. 19C angegeben. Alle jene Analysen zeigen an, dass das Säulen-gereinigte Virus eine äquivalente Reinheit aufweist verglichen mit dem durch einen doppelten CsCl-Gradient gereinigtem Virus. Tabelle 11 zeigt den Virustiter und die Virusrückgewinnung vor und nach der Säulenreinigung. Zu Vergleichszwecken wurde auch die typische Virusrückgewinnung, die durch doppelte CsCl-Gradientenreinigung erzielt wird, mit aufgenommen. Durch beiden Methoden wurden ähnliche Virusrückgewinnungen erzielt. TABELLE 11. Vergleich von IEC- und doppelter CsCl-Gradient-Ultrazentrifugationsreinigung von AdCMVp53 aus CellcubeTM
    Figure 00810001
  • A) Harzkapazitätsuntersuchungen
  • Die dynamische Kapazität des Toyopearl Super Q-Harzes wurde für die Reinigung der mittels Tween-20 geernteten Viruslösung, die bei niedriger Mediumperfusionsrate hergestellt worden ist, ausgewertet. Einhundert Milliliter Harz wurden in eine XK50-Säule gepackt. Durch die Säule wurden unterschiedliche Mengen von roher Viruslösung unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden gereinigt.
  • Virus-Durchbruch und Reinigungseffizienz wurden mittels HPLC analysiert. 20 zeigt die HPLC-Analysenergebnisse. Bei einem Säulenbeladungsfaktor, welcher größer als ein Probe/Säulenvolumen-Verhältnis von 2:1 war, wurde die Reinheit der Virusfraktion verringert. Kontaminanten coeluierten mit dem Virus. Bei einem Beladungsfaktor über 3:1 wurde ein Durchbruch des Virus in den Durchfluss beobachtet. Es wurde dementsprechend vorgeschlagen, dass die Arbeitsbeladungskapazität des Harzes im Bereich eines Probe/Säulenvolumen-Verhältnisses von 1:1 liegt.
  • B) Konzentration/Diafiltrations-Nachreinigung
  • Ein Konzentrations/Diafiltrationsschritt nach der Säulenreinigung dient nicht nur dazu, den Virustiter zu erhöhen, sondern, sofern notwendig, um einen Austausch zu dem Puffersystem, das für das Virusprodukt spezifiziert worden ist, vorzunehmen. Für den Konzentrationsschritt wurde eine 300 K NMWC-TFF-Membran eingesetzt. Aufgrund des Fehlens von proteinartigen und Nukleinsäure-Kontaminanten in dem gereinigten Virus wurde ein sehr hoher Pufferfluss ohne bemerkenswerten Druckabfall quer über die Membran erzielt.
  • Es wurde während dieses Schritts eine ungefähr 100%-ige Virusrückgewinnung erzielt, indem der Puffer zu 20 mM Tris + 1 mM MgCl2 + 0,15 M NaCl, pH = 7,50, gewechselt wurde. Bei dem gereinigten Virus wurde auch erfolgreich ein Pufferaustausch zu DPBS während des Konzentrations/Diafiltrationsschritts vorgenommen. Der Konzentrationsfaktor kann bestimmt werden durch den Virustiter, der in dem Endprodukt gewünscht wird, und den Titer der Viruslösung, die von der Säule eluiert. Diese Flexibilität wird dazu beitragen, die Konsistenz des abschließenden gereinigten Virusprodukts beizubehalten.
  • C) Auswertung von defekten Adenoviren in den IEC-gereinigten AdCMVp53
  • Aufgrund der weniger als 100%-igen Verpackungseffizienz von Adenoviren in Produzentenzellen existieren in einer rohen Viruslösung im Allgemeinen einige defekte Adenoviren. Defekte Viren weisen keine DNA verpackt innerhalb des Viruskapsids auf und können dementsprechend von intaktem Virus mittels einer CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation basierend auf dem Dichteunterschied getrennt werden. Es ist wahrscheinlich, dass es schwierig sein würde, die defekten von den intakten Viren basierend auf Ionenaustauschchromatographie zu trennen, da angenommen wird, dass beide Viren eine ähnliche Oberflächenchemie aufweisen. Das Vorhandensein einer übermäßigen Menge von defekten Viren wird die Qualität des gereinigten Produkts beeinträchtigen.
  • Um den Prozentsatz von vorhandenen defekten Viruspartikeln auszuwerten, wurden die gereinigten und aufkonzentrierten Viren einer isopyknischen CsCl-Ultrazentrifugation unterworfen. Wie in 21 gezeigt, wurde eine schwache Bande oberhalb der Bande mit den intakten Viren nach der Zentrifugation beobachtet. Beide Banden wurden rückgewonnen und gegen 20 mM Tris + 1 mM MgCl2, pH = 7,50, -Puffer dialysiert, um CsCl zu entfernen. Die dialysierten Viren wurden mittels HPLC analysiert und die Ergebnisse sind in 22 gezeigt. Beide Viren zeigen eine ähnliche Retentionszeit. Jedoch weist das defekte Virus ein kleiners A260/A280-Verhältnis auf als jenes der intakten Viren. Dies zeigt weniger virale DNA in dem defekten Virus an.
  • Die bei Retentionszeiten zwischen 3,02 und 3,48 min festgestellten Peaks werden durch Glycerol erzeugt, das zu den Viren vor dem Einfrieren bei –70°C zugesetzt wird (10%, Vol.,/Vol.). Der Prozentsatz der defekten Viren war geringer als 1% der gesamten Viren. Es ist unwahrscheinlich, dass dieser niedrige Prozentsatz von defekten Viren das Verhältnis von gesamten Partikeln zu infektiösen Viren (PFU) in dem gereinigten Virusprodukt beeinflusst. Beide Viren wurden durch SDS-PAGE analysiert (gezeigt in 19A). Verglichen mit den intakten Viren fehlt defekten Viren die mit DNA assoziierten Kernproteine, die eine Bande bei 24 und 48,5 kD bilden. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit dem Fehlen von DNA in defekten Viren.
  • D) Verfahrensübersicht über die Herstellung und Reinigung von AdCMVp53-Virus
  • Basierend auf den obigen Ergebnissen aus der Verfahrensentwicklung schlagen die Erfinder ein Herstellungs- und Reinigungsflussdiagramm für AdCMVp53 vor, wie in 23 gezeigt. Die auf den jeweiligen Schritt bezogene und sich aufsummierende Virusrückgewinnung ist mit der entsprechenden Virusausbeute basierend auf einem monomeren CellcubeTM mit aufgenommen. Die endgültige Virusrückgewinnung beträgt ungefähr 70 ± 10%. Diese ist ungefähr 3-mal höher als die Virusrückgewinnung, über die von Huyghe et al. (1996) unter Verwendung eines DEAE-Ionenaustauschers und eines Metallchelatchromatographie-Reinigungsverfahrens für die Reinigung von p53-Protein kodierenden Adenoviren berichtet worden ist. Es wurden ausgehend von einem monomeren CellcubeTM ungefähr 3 × 1012 PFU von endgültigem gereinigtem Virusprodukt hergestellt. Dies repräsentiert eine ähnliche Endprodukt-Ausbeute verglichen mit dem gegenwärtigen Herstellungsverfahren unter Verwendung einer doppelten CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation für die Reinigung.
  • E) Maßstäbliche Vergrößerung
  • Mit dem tetrameren CellcubeTM-System sind erfolgreiche Untersuchungen zur maßstäblichen Vergrößerung ausgeführt worden und es werden gegenwärtig solche unternommen, um die Virusproduktion in dem 16-meren CellcubeTM-System auszuwerten. Die hergestellte rohe Viruslösung wird filtriert, konzentriert und diafiltriert werden unter Verwendung einer größeren Pellicon-Kassette. Die Qualität und Rückgewinnung des Virus wird bestimmt werden. Nach Benzonasebehandlung wird die rohe Viruslösung unter Verwendung einer 20 cm- und einer 30 cm-BioProcess-Säule für das Tetramer bzw. 16-mer gereinigt werden.
  • BEISPIEL 9 (Referenzbeispiel)
  • Verbesserte Ad-p53-Herstellung in serumfreier Suspensionskultur
  • Adaptierung von 293-Zellen
  • 293-Zellen wurden an ein kommerziell erhältliches serumfreies IS293-Medium (Irvine Scientific; Santa Ana, CA) adaptiert, indem die FBS-Konzentration sequentiell in T-Kolben gesenkt wurde. Die gefrorenen Zellen in einer Ampulle von PDWB wurden aufgetaut und in 10% FBS-DMEM-Medium in einem T-75-Kolben gegeben und die Zellen wurden an serumfreies IS 293-Medium in T-Kolben adaptiert, indem die FBS-Konzentration in dem Medium sequentiell verringert wurde. Nach 6 Passagen in T-75-Kolben wurde der Prozentsatz von FBS auf ungefähr 0,019% geschätzt. Die Zellen wurden zwei weitere Male in den T-Kolben subkultiviert, bevor sie in Spinner-Kolben transferiert wurden.
  • Serumfrei adaptierte 293-Zellen in T-Kolben wurden an eine Suspensionskultur adaptiert
  • Die obigen serumfrei adaptierten Zellen in T-Kolben wurden zu einer serumfreien 250 ml-Spinner-Suspensionskultur (100 ml Arbeitsvolumen) für die Suspensionskultur transferiert. Die anfängliche Zelldichte betrug 1,18 × 105 vc (lebensfähige Zellen)/ml. Während der Zellkultur nahm die Lebensfähigkeit ab und es wurden große Klumpen von Zellen beobachtet. Nach 2 weiteren Passagen in T-Kolben wurde die Adaptierung an eine Suspensionskultur erneut versucht. In einem zweiten Versuch wurde das Medium mit Heparin in einer Konzentration von 100 mg/l ergänzt, um die Aggregation von Zellen zu verhindern, und die anfängliche Zelldichte wurde auf 5,22 × 105 vc/ml erhöht. Während der Zellkultur gab es eine gewisse Zunahme der Zelldichte und Zelllebensfähigkeit wurde beibehalten. Danach wurden die Zellen in den Spinner-Kolben 7 weitere Passagen lang subkultiviert und während der Passagen verringerte sich die Verdopplungszeit der Zellen fortschreitend und am Ende von sieben Passagen betrug sie ungefähr 1,3 Tag, was vergleichbar ist mit 1,2 Tag für die Zellen in 10% FBS-Medium bei der angehefteten Zellkultur. In dem mit Heparin ergänzten serumfreien IS 293-Medium existierten nahezu alle Zellen als individuelle Zellen, wobei sie keine Aggregate von Zellen in der Suspensionskultur bildeten (Tabelle 12). TABELLE 12. Serumfreie Suspensionskultur: Adaptierung an Suspension
    Figure 00850001
  • Virusproduktion und Vermehrung von Zellen in serumfreier Suspensionskultur in Spinner-Kolben
  • Um die Produktion von Ad5-CMVp53-Vektoren in der serumfreien Suspensionskultur zu testen, wurden die obigen Zellen, die an die serumfreie Suspensionskultur adaptiert worden waren, in 100 ml serumfreiem IS293-Medium, ergänzt mit 0,1% Pluronic F-68 und Heparin (100 mg/l), in 250 ml-Spinner-Kolben kultiviert. Die Zellen wurden mit 5 MOI infiziert, wenn die Zellen am Tag 3 1,36 × 106 lebensfähige Zellen/ml erreichten. Der Überstand wurde jeden Tag nach der Infektion durch HPLC auf virale Partikel/ml getestet. Es wurden keine Viren außer in der Tag 3-Probe detektiert. Am Tag 3 betrugen sie 2,2 × 109 vps/ml. Die pfu/ml am Tag 6 betrug 2,6 +/– 0,6 × 107 pfu/ml. Die pfu-Produktion pro Zelle wurde zu 19 geschätzt, welche ungefähr 46-mal unter der angehefteten Kultur in dem mit Serum ergänzten Medium liegt. Als Kontrolle wurde die Vermehrung von Zellen in Abwesenheit einer Infektion überprüft. TABELLE 13. Serumfreie Suspensionskultur: Virusproduktion und Zellvermehrung
    Figure 00860001
  • Herstellung von an eine serumfreie Suspension adaptierten 293-Zellbanken
  • Wie oben beschrieben, wurden die Zellen, nachdem gezeigt worden war, dass Zellen die Ad-p53-Vektoren produzierten, in dem serumfreien IS293-Medium mit 0,1% F-68 und 100 mg/l Heparin in den Spinner-Kolben vermehrt, um an eine serumfreie Suspension adaptierte Zellbänke, die 1,0 × 107 lebensfähige Zellen/ml/Ampulle enthalten, herzustellen. Um die Zellen zu sammeln, wurden sie abzentrifugiert, wenn sie sich in der mittleren log-Phase der Vermehrung befanden und die Lebensfähigkeit über 90% betrug, und sie wurden in serumfreiem, ergänztem IS293-Medium resuspendiert und erneut abzentrifugiert, um die Zellen auszuwaschen. Dann wurden die Zellen erneut in dem Tieftemperaturkonservierungsmedium, welches kaltes IS293 mit 0,1% F-68, 100 mg/l Heparin, 10% DMSO und 0,1% Methylcellulose ist, resuspendiert, was zu 1 × 107 lebensfähige Zellen/ml führte. Die Zellsuspension wurde in sterile Tieftemperaturkonservierungsgefäße transferiert und diese wurden versiegelt und in einem Kryobehälter bei –70°C über Nacht eingefroren. Die Gefäße wurden in einen Aufbewahrungstank mit flüssigem Stickstoff transferiert. Der Mycoplasma-Test war negativ.
  • Um die gefrorenen Zellen erneut zum Leben zu erwecken, wurde ein Gefäß in 50 ml serumfreiem IS293-Medium mit 0,1% F-68 und 100 mg/l Heparin in einem T-150 aufgetaut. Seit damals wurden die Kulturen dreimal in 250 ml-Spinnerkolben subkultiviert. In der anderen Untersuchung wurde ein Gefäß in 100 ml serumfreiem ergänztem IS293-Medium in einem 250 ml-Spinner-Kolben aufgetaut. Seit damals wurden diese in serumfreien Spinner-Kolben 2-mal subkultiviert. In beiden Untersuchungen vermehrten sich die Zellen sehr gut.
  • Mediumsersatz unds Virusproduktion in serumfreier Suspensionskultur in Spinner-Kolben
  • Bei der vorherigen serumfreien Virusproduktion in der Suspensionskultur im Spinner-Kolben war die Virusproduktion pro Zelle zu gering, als dass die Produktion in serumfreier Suspension in der Praxis hätte ausgeführt werden können. Es wurde vermutet, dass dies auf die Erschöpfung von Nährstoffen und/oder die Produktion von inhibitorischen Nebenprodukten zurückzuführen sein könnte. Um das verbrauchte Medium durch frisches serumfreies ergänztes IS293-Medium zu ersetzen, wurden die Zellen am Tag 3 abzentrifugiert und in einem frischen serumfreien IS-293-Medium, welches mit F-68 und Heparin (100 mg/l) ergänzt war, resuspendiert und die resultierende Zelldichte betrug 1,20 × 106 vc/ml und die Zellen wurden mit Ad5-CMVp53-Vektoren mit einer MOI von 5 infiziert. Die extrazellulären HPLC-vps/ml betrugen 7,7 × 109 vps/ml am Tag 3, 1,18 × 1010 vps/ml am Tag 4, 1,2 × 1010 vps/ml am Tag 5 und 1,3 × 1010 vps/ml am Tag 6 und die pfu/ml am Tag 6 betrug 2,75 +/– 0,86 × 108 tvps/ml. Das Verhält nis von mittels HPLC bestimmten viralen Partikeln zu pfus betrug ungefähr 47. Die Zellen sind auch abzentrifugiert und mit der gleichen Art des Detergens-Lysepuffers, wie er bei der Ernte des Cellcube verwendet worden war, lysiert. Die zellulären HPLC-vps/ml betrugen 1,6 × 1010 vps/ml am Tag 2, 6,8 × 109 vps/ml am Tag 3, 2,2 × 109 vps/ml am Tag 4, 2,24 × 109 vps/ml am Tag 5 und 2,24 × 109 vps/ml am Tag 6.
  • Das Ersetzen des verbrauchten Mediums durch ein frisches, serumfreies, ergänztes IS 293-Medium führte zu der signifikanten Zunahme der Produktion von Ad-p53-Vektoren. Das Ersetzen des Mediums erhöhte die Produktion von mittels HPLC ermittelten extrazellulären viralen Partikeln 3,6-mal über das vorige Niveau am Tag 3 und die Produktion des extrazellulären pfu-Titers auf das 10-fache über dem vorigen Niveau am Tag 6. Pro Zelle wurde die Produktion von Ad-p53-Vektoren auf ungefähr 1,33 × 104 HPLC-vps geschätzt.
  • Die mittels HPLC bestimmten intrazellulären viralen Partikel zeigten einen Spitzenwert am Tag 2 nach der Infektion und dann nahmen die Partikelzahlen ab. Im Gegenzug nahmen die extrazelluären viralen Partikel fortschreitend bis zum dem Tag 6 der Ernte zu. Nahezu die gesamten Ad-p53-Vektoren wurden an den 2 Tagen nach der Infektion produziert und waren intrazellulär lokalisiert und dann wurden die Viren aus den Zellen freigesetzt. Nahezu die Hälfte der Viren wurde aus den Zellen in den Überstand zwischen Tag 2 und Tag 3 nach der Infektion freigesetzt und die Freisetzungsrate nahm ab, als die Zeit fortschritt.
  • Alle mit Ad-p53-Vektor infizierten Zellen verloren ihre Lebensfähigkeit am Ende von 6 Tagen nach der Infektion, während die Zellen in Abwesenheit einer Infektion zu 97% lebensfähig waren. In Gegenwart einer Infektion betrug der pH des verbrauchten Mediums ohne Mediumaustausch und mit dem Mediumaustausch 6,04 bzw. 5,97, während derjenige, der in Abwesenheit der Infektion beobachtet wurde, 7,00 betrug (Tabelle 12).
  • Virusproduktion und Zellkultur in einem gerührten Bioreaktor mit Mediumsersatz und Gas-Überschichtung
  • Um die Produktion von Ad-p53-Vektoren zu erhöhen, wurde ein 5 l-CelliGen-Bioreaktor verwendet, um eine stärker kontrollierte Umgebung bereitzustellen. In dem 5 l-CelliGen-Bioreaktor wurden der pH und der gelöste Sauerstoff wie auch die Temperatur gesteuert. Sauerstoff und Kohlendioxidgas wurden mit dem Solenoidventil für eine Sauerstoffzufuhr bzw. die pH-Einstellung verbunden, Für ein besseres Mischen, während eine Umgebung mit geringer Scherung erzeugt wurde, wurde ein Schiffsschrauben-Flügelrad implementiert. Luft wurde wäh rend des gesamten Zeitraums des Betriebs zugeführt, um einen positiven Druck innerhalb des Bioreaktors zu halten.
  • Um den Bioreaktor zu inokulieren, wurde eine Ampulle von Zellen in 100 ml serumfreiem Medium in einem 250 ml-Spinner-Kolben aufgetaut und die Zellen wurden in 250- oder 500 ml-Spinner-Kolben vermehrt. 800 ml-Zellinokulum, welche in 500 ml-Kolben kultiviert worden waren, wurden mit 2700 ml frischem Medium in einem 10 l-Glasballon gemischt und zu dem CelliGen-Bioreaktor durch Gasdruck transferiert. Das anfängliche Arbeitsvolumen des CelliGen-Bioreaktors betrug ungefähr 3,5 l Kultur. Die Rührgeschwindigkeit des Schiffsschrauben-Flügelrads wurde während der gesamten Zeitspanne des Laufs auf 80 Upm, die Temperatur auf 37°C, der pH auf 7,1 am Beginn und 7,0 nach der Infektion und die OD auf 40% eingestellt.
  • Die anfängliche Zelldichte betrug 4,3 × 105 vc/ml (97% Lebensfähigkeit) und 4 Tage später, wenn die Zelldichte 2,7 × 106 vc/ml (93% Lebensfähigkeit) erreichte, wurden die Zellen abzentrifugiert und die Zellen wurden in frischem Medium resuspendiert und in den CelliGen-Bioreaktor transferiert. Nach dem Mediumaustausch betrug die Zelldichte 2,1 × 106 vc/ml und die Zellen wurden mit einer MOI von 10 infiziert. Seit diesem Zeitpunkt fiel die DO auf unter 40% ab. Um die DO über 40% zu halten, wurden ungefähr 500 ml Kultur aus dem CelliGen-Bioreaktor abgezogen, um den Sauerstoffbedarf durch die Zellkultur zu verringern, und das obere Schiffsschaufelrad wurde nahe der Grenzfläche zwischen dem Gas und der flüssigen Phase positioniert, um den Sauerstofftransfer durch Erhöhung der Oberflächenerneuerung zu verbessern. Seit damals konnte die DO bis zum Ende des Laufs über 40% gehalten werden.
  • Zur pH-Kontrolle wurde CO2-Gas verwendet, um die Zellkultur anzusäuern, und 1 N NaHCO3-Lösung, um die Zellkultur alkalisch zu machen. Die pH-Kontrolle wurde anfänglich auf 7,10 festgelegt. Der anfängliche pH der Zellkultur betrug ungefähr pH 7,41. Ungefähr 280 ml 1 N NaHCO3-Lösung wurden verbraucht, bis der pH der Zellkultur sich im Bereich von pH 7,1 stabilisiert hatte. Nach der Virusinfektion der Zellkultur wurde die pH-Kontrolle auf pH 7,0 gesenkt und die CO2-Gas-Zufuhrleitung wurde geschlossen, um den Verbrauch an NaHCO3-Lösung zu verringern. Der Verbrauch von zu viel NaHCO3-Lösung zur pH-Einstellung würde das Zellkulturvolumen in einer unerwünschten Weise erhöhen. Seit damals wurden 70 ml 1 N NaHCO3-Lösung verbraucht und der pH lag im Bereich zwischen 7,0 und 7,1 die meisten Zeit während des Laufs. Die Temperatur wurde auf zwischen 35°C und 37°C kontrolliert.
  • Nach der Infektion nahm die Lebensfähigkeit der Zellen stetig bis zum Tag 6 der Ernte nach der Infektion ab. Am Erntetag war keine der Zellen lebensfähig. Die volumetrische Virusproduktion des CelliGen-Bioreaktors betrug 5,1 × 1010 HPLC-vps/ml verglichen mit den 1,3 × 1010 vps/ml in dem Spinner-Kolben. Die kontrollierte Umgebung in dem CelliGen-Bioreaktor erhöhte die Produktion von Ad-p53-Vektor um das 4-fache verglichen mit den Spinner-Kolben mit Mediumsersatz. Dies ist beides zurückzuführen auf die Zunahme der Zelldichte zum Zeitpunkt der Infektion von 1,2 × 106 auf 2,1 × 106 vc/ml und die Zunahme der Produktion pro Zelle von 1,3 × 104 auf 2,5 × 104 vps/ml. Die 2,5 × 104 vps/ml sind vergleichbar mit den 3,5 × 104 vps/Zelle in der mit Serum ergänzten, anhaftendenen Zellkultur.
  • Virusproduktion und Zellkultur in einem gerührten und mit Gasblasen durchperlten Bioreaktor
  • In der ersten Untersuchung wurden die Zellen in einem gerührten Bioreaktor erfolgreich für die Virusproduktion kultiviert und der Sauerstoff und das CO2 wurden durch Gas-Überschichtung im Kopfraum eines Bioreaktors zugeführt. Jedoch wird diese Methode das maßstäbliche Vergrößern des Zellkultursystems aufgrund von dessen ineffizientem Gastransfer limitieren. Dementsprechend wurden in der zweiten Untersuchung, um die Durchführbarkeit der maßstäblichen Vergrößerung der serumfreien Suspensionskultur zu testen und die Vermehrung von Zellen und die Ad-p53-Produktion in einem mit Gasblasen durchperlten Reaktor zu untersuchen, reiner Sauerstoff und CO2-Gase zugeführt, indem sie in Blasen durch das serumfreie IS293-Medium, ergänzt mit F68 (0,1%) und Heparin (100 mg/l), hindurchgeleitet wurden.
  • Reiner Sauerstoff wurde in Blasen durch das flüssigen Medium geleitet, um den Zellen den gelösten Sauerstoff bereitzustellen, und die Zufuhr von reinem Sauerstoff wurde durch ein Solenoid-Ventil gesteuert, um den gelösten Sauerstoff über 40% zu halten. Für eine effiziente Sauerstoffzufuhr, während die Schädigungen an den Zellen minimiert werden, wurde ein gesinterter Luftdiffusor aus rostfreiem Stahl, dessen nominale Porengröße ungefähr 0,22 μm beträgt, für die Abgabe von reinem Sauerstoff verwendet. Das CO2-Gas wurde ebenfalls dem flüssigen Medium zugeführt, indem es in Blasen aus demselben Diffusor und derselben Leitung wie der reine Sauerstoff zugeführt wurde, um den pH um 7,0 zu halten. Für die pH-Kontrolle wurde auch Na2CO3-Lösung (106 g/l) an dem Bioreaktor angeschlossen. Luft wurde in den Kopfraum des Bioreaktors zugeführt, um einen positiven Druck innerhalb des Reaktors zu halten. Die übrige Konfiguration des Bioreaktors war die gleiche wie bei der ersten Untersuchung.
  • Inokulumzellen wurden ausgehend von einer gefrorenen Ampulle entwickelt. Eine Ampulle von gefrorenen Zellen (1,0 × 107 vc) wurde in 50 ml Medium in einem T-150-Kolben aufgetaut und dreimal in 200 ml Medium in 500 ml-Spinner-Kolben subkultiviert. 400 ml Inokulum, die in 2 500 ml-Spinner-Kolben kultiviert worden waren, wurden mit IS293-Medium mit F- 68 und Heparin in einem 10 l-Glasballon gemischt, um 3,5 l Zellsuspension herzustellen, und diese wurden zu dem 5 l CelliGen-Bioreaktor transferiert.
  • Die anfängliche Zelldichte in dem Bioreaktor betrug 3,0 × 104 vc/ml. Die anfängliche Zelldichte ist geringer als in der ersten Untersuchung. In der ersten Untersuchung wurden vier 500 ml-Spinner-Kolben als Inokulum verwendet. Sogar bei der niedrigeren anfänglichen Zelldichte vermehrten sich die Zellen bis zu 1,8 × 106 vc/ml am Tag 7 in der von Gasblasen durchperlten Umgebung und die Lebensfähigkeit betrug 98%. Während der siebentägigen Vermehrung nahm die Glucosekonzentration von 5,4 g/l auf 3,0 g/l ab und Lactat nahm von 0,3 g/l auf 1,8 g/l zu.
  • Am Tag 7, wenn die Zelldichte 1,8 × 106 vc/ml erreichte, wurden die Zellen in dem Bioreaktor abzentrifugiert und in 3,5 l frischem serumfreiem IS293-Medium mit F-68 und Heparin in einem 10 l-Glasballon resuspendiert. Die 293-Zellen wurden mit 1,25 × 1011 pfu Ad-p53 infiziert und zu dem CelliGen-Bioreaktor transferiert. In dem Bioreaktor betrug die Zelllebensfähigkeit 100%, aber die Zelldichte betrug nur 7,2 × 105 vc/ml. Es gab einen Verlust von Zellen während des Vorgangs des Mediumaustauschs. Der Virustiter in dem Medium wurde zu 2,5 × 1010 HPLC-vps/ml am Tag 2, 2,0 × 1010 am Tag 3, 2,8 × 1010 am Tag 4, 3,5 × 1010 am Tag 5 und 3,9 × 1010 HPLC-vps/ml am Tag 6 der Ernte gemessen. Die erste CelliGen-Bioreaktor-Studie mit Gas-Überschichtung erzeugte 5,1 × 1010 HPLC-vps/ml. Die niedrigere Viruskonzentration in dem zweiten Lauf war wahrscheinlich auf die geringere Zelldichte zu dem Zeitpunkt der Infektion zurückzuführen. Verglichen mit 7,2 × 105 vc/ml in dem zweiten Lauf wurden 2,1 × 106 vc/ml in dem ersten Lauf verwendet. Aktuell wird geschätzt, dass die Produktion von Ad-p53 pro Zelle in dem zweiten, mit Gasblasen durchperlten CelliGen-Bioreaktor 5,4 × 104 vps/Zelle beträgt, was die höchste Produktion pro Zelle ist, die bislang erzielt worden ist. Die Produktion pro Zelle in dem ersten serumfreien CelliGen-Bioreaktor ohne Durchperlen von Gasblasen und dem mit Serum ergänzten T-Kolben betrug 2,5 × 104 vps/Zelle bzw. 3,5 × 104 vps/Zelle.
  • Nach der Virusinfektion nahm die Lebensfähigkeit der Zellen von 100% auf 13% am Tag 6 der Ernte ab. Während jener 6 Tage nach der Infektion nahm die Glucosekonzentration von 5,0 g/l auf 2,1 g/l ab und das Lactat stieg von 0,3 g/l auf 2,9 g/l an. Während des gesamten Verfahrenszeitraums wurden ungefähr 20 ml Na2CO3 (106 g/l)-Lösung verbraucht.
  • Das Versuchsergebnis zeigt, dass es technisch und wirtschaftlich durchführbar ist, Ad-p53 in dem von Gasen durchperlten und gerührten Bioreaktor herzustellen. Eine maßstäbliche Vergrößerung und ein Betrieb eines von Gasen durchperlten und gerührten Bioreaktors in Form einer in großem Maßstab betriebenen Einheit werden gut etabliert.
    • Aboud et al., Arch. Virol., 71:185–195, 1982.
    • Arap et al., Cancer Res., 55:1351–1354, 1995.
    • Bahnemann et al., Abs. Pap. ACS, 180:5. 1980.
    • Baichwal und Sugden, In: Gene transfer, Kucherlapati R, Hrsg., New York: Plenum Press, S. 117–148, 1986.
    • Benvenisty und Neshif, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 83:9551–9555, 1986.
    • Berg et al., BioTechniques, 14(6):972–978, 1993.
    • Bett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(19):8802–8806, 1994.
    • Bussemakers et al., Cancer Res., 52:2916–2922, 1992.
    • Caldas et al., Nat. Genet., 8:27–32, 1994.
    • Casey et al, Oncogene, 6:1791–1797, 1991.
    • Chen und Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745–2752, 1987.
    • Cheng et al., Cancer Res., 54:5547–5551, 1994.
    • Cheung et al., Biochem. J., 295:427–435, 1993c.
    • Cheung et al., J. Biol. Chem., 268:24303–24310, 1993a.
    • Cheung et al., J. Biol. Chem., 268:6139–6146, 1993b.
    • Coffin, In: Virology, Fields BN, Knipe DM, Hrsg., New York: Raven Press, S. 1437– 1500, 1990.
    • Coupar et al., Gene, 68:1–10, 1988.
    • Crooks et al., J. Chrom., 502:59–68, 1990.
    • Dubensky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529–7533, 1984.
    • Edelman und Crossin, Annu. Rev. Biochem., 60:155–190, 1991
    • Edelman, Annu. Rev. Biochem., 54:135–169, 1985.
    • Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463–8467, 1987.
    • Ferkol et al., FASEB J. 7:1081–1091, 1993.
    • Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348–3352, 1979.
    • Freedman et al., WO 94/17178 (August 4, 1994).
    • Frixen et al., J. Cell Biol., 113:173–185, 1991.
    • Garnier et al., Cytotechnol., 15:145–155, 1994.
    • Ghosh und Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C Hrsg., New York; Marcel Dekker. S. 87–104, 1991;
    • Giancotti und Ruoslahti, Cell, 60:849–859, 1990.
    • Gilbert, "Adaptation of cells to serum free culture for production of adenovirus vectors and recombinant proteins," Williamsburg BioProcessing Conference, Nov. 18–21, 1996.
    • Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188–1190, 1985.
    • Graham und Prevec, In: Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, Murray, E.J., (Hrsg.), Clifton, NJ: Ilumana Press, 109– 128 und 205–225, 1991.
    • Graham und Van Der Eb, Virology, 52:456–467, 1973.
    • Graham et al, J. Gen. Virol., 36:59–74, 1977.
    • Graham, J. Gen. Virol., 68:937–940, 1987.
    • Griffiths, In: Animal Cell Biotechnology, Band 3, S. 179–220, (Hrsg., Spier, R.E. und Griffiths, J.B.), Academic Press, London., 1986
    • Harland und Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094–1099, 1985.
    • Hay et al., Journal of Molecular Biology, 175:493–510, 1984.
    • Hearing und Shenk, Journal of Molecular Biology, 167:809–822, 1983.
    • Hearing et al., Journal of Virology, 67:2555–2558, 1987.
    • Hermonat und Muzycska, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6466–6470, 1984.
    • Hollestein et al., Science, 253:49–53 1991.
    • Hussussian et al., Nature Genetics, 15–21, 1994.
    • Huyghe et al., Human Gene Therapy, 6:1403–1416, 1996.
    • Jones und Shenk, Cell, 13:181–188, 1978.
    • Kamb et al., Nature Genetics, 8:22–26, 1994.
    • Kamb et al., Science, 2674:436–440, 1994.
    • Kaneda et al., Science, 243:375–378, 1989.
    • Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361–3364, 1991.
    • Klein et al., Nature, 327:70–73, 1987.
    • Larsson und Litwin, Dev. Biol. Standard., 66:385–390, 1987.
    • Levrero et al., Gene, 101:195–202, 1991.
    • Lim, US Patent 4,352,883, Oktober 5, 1982.
    • Lin und Guidotti, J. Biol. Chem., 264:14408–14414, 1989.
    • Mann et al., Cell, 33:153–159, 1983.
    • Matsura et al., Brit. J. Cancer, 66:1122–1130, 1992.
    • McGrath et al., J. Virol., 25:923–927, 1978.
    • Mercer, Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2:251–263, 1992.
    • Mizrahi, Process Biochem., (August):9–12, 1983.
    • Montenarh, Crit. Rev. Oncogen, 3:233–256, 1992.
    • Mori et al., Cancer Res., 54:3396–3397, 1994.
    • Morris et al., "Serum-free production of adenoviral vectors for gene therapy," Williamsburg BioProcessing Conference, Nov. 18–21, 1996.
    • Myers, EPO 0273085
    • Nicolas und Rubenstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez RL, Denhardt DT, Hrsg., Stoneham: Butterworth, S. 493–513, 1988.
    • Nicolau und Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185–190, 1982.
    • Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157–176, 1987.
    • Nilsson und Mosbach, Dev. Biol. Standard., 66:183–193, 1987
    • Nobri et al., Nature (London), 368:753–756, 1995.
    • O'Neil und Balkovic, Bio/Technol., 11:173–178, 1993.
    • Obrink, BioEssays., 13:227–233, 1991.
    • Odin und Obrink, Exp. Cell Res., 171:1–15, 1987.
    • Okamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11045–11049, 1994.
    • Orlow et al., Cancer Res., 54:2848–2851, 1994.
    • Paskind et al., Virology, 67:242–248, 1975.
    • Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086–4090, 1994.
    • Perrin et al., Vaccine, 13(13):1244–1250, 1995.
    • Petricciani, Dev. Biol. Standard., 66:3–12, 1985.
    • Phillips et al., In: Large Scale Mammalian Cell Culture (Feder, J. und Tolbert, W. R., Hrsg.), Academic Press, Orlando, FL, U.S.A., 1985.
    • Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161–7165, 1984.
    • Renan, Radiother. Oncol., 19:197–218, 1990.
    • Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez RL, Denhardt DT, Hrsg., Stoneham: Butterworth, S. 467–492, 1988.
    • Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689–695, 1990.
    • Roux et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA, 86:9079–9083, 1989.
    • Serrano et al., Nature, 366:704–707, 1993.
    • Serrano et al., Science, 267:249–252, 1995.
    • Smith und Lee, Analytical Biochem., 86:252–263, 1978.
    • Takahashi et al., Cancer Res., 52:2340–2342, 1992.
    • Temin, In: Gene transfer, Kucherlapati R, Hrsg., New York: Plenum Press, S. 149–188, 1986.
    • Tibbetts, Cell, 12:243–249, 1977.
    • Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716–718, 1986.
    • Umbas et al., Cancer Res., 52:5104–5109, 1992.
    • van Wezel, Nature, 216:64–65, 1967.
    • Wagner et al., Proc. Natl. Acad Sci., 87(9):3410–3414, 1990.
    • Wagner et al., Science, 260:1510–1513, 1993.
    • Wang et al., In: Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, S. Kaminogawa et al., (Hrsg.), Band 5, S. 463–469, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1993.
    • Wang et al., Cytotechnology, 9:41–49, 1992.
    • Wang et al., Proceeding of the Japanese Society for Animal Cell Technology, 1994.
    • Watt et al., Proc. Natl Acad Sci., 83(2):3166–3170, 1986.
    • Weinberg, Science, 254:1138–1146, 1991.
    • Wong et al., Gene, 10:87–94, 1980.
    • Wu und Wu, J. Biol. Chem., 262:4429–4432, 1987.
    • Wu und Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159–167, 1993.
    • Wu und Wu, Biochemistry, 27:887–892, 1988.
    • Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87:9568–9572, 1990.

Claims (40)

  1. Verfahren zum Herstellen einer Adenoviruszusammensetzung enthaltend: a) Wachsen lassen von Wirtszellen durch Bereitstellen von Nährstoffen für die Wirtszellen durch Perfusion mit einem Glucose-enthaltenden Medium, wobei die Mediumperfusionsgeschwindigkeit reguliert wird, um die Glucosekonzentration zu kontrollieren; b) Infizieren der perfundierten Wirtszellen mit einem Adenovirus; c) Lysieren der infizierten Wirtszellen unter Verwenden eines nicht-denaturierenden Detergens, um eine Adenovirus enthaltende Roh-Lysatzusammensetzung herzustellen; und d) Reinigen des Adenovirus aus dem Lysat durch einen Prozess, das einen oder mehrere Chromatographieschritte einschließt, wobei mindestens ein Schritt eine Anionenaustauscherchromatographie einschließt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Wirtszellen vor der Lyse geerntet werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen durch das Detergens Thesit®, NP-40®, Tween-20®, Brij-58®, Triton X-100® oder Octylglucosid lysiert werden.
  4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Detergens in der Lysislösung in einer Konzentration von etwa 1% (Gew/Vol) vorhanden ist.
  5. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem in Schritt a) die Zellen in einem Bioreaktor wachsen gelassen werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Bioreaktor ein Airliftreaktor oder ein gerührter Reaktor ist.
  7. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem in Schritt a) die Zellen auf Microcarriers kultiviert werden.
  8. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem in Schritt a) die Zellen durch Mikroverkapselung kultiviert werden.
  9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem in Schritt a) die Zellen in einem perfundierten Anheftungssystem kultiviert werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Zellen in einem Schüttbettreaktor kultiviert werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Schüttbettreaktor einen Fasermatrixträger umfasst.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Zellen in einem Glucose-enthaltenden Medium bei einer Geschwindigkeit perfundiert werden, die eine Glucosekonzentration von weniger als 2,0 g/l, vorzugsweise zwischen etwa 0,7 und 1,7 g/l bereitstellt.
  13. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem zur Zeit der Virusinfektion ein Austausch mit frischem Medium vor der Virusinfektion durchgeführt wird.
  14. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem das Lysat einem Diafiltrationsschritt unterworfen wird.
  15. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem die Chromatographie einen einzigen Chromatographieschritt umfasst.
  16. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem Schritt d) ferner einen Prozess umfasst, der das Reduzieren des Spiegels an kontaminierenden Nukleinsäuren einschließt.
  17. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem die Anionenaustauscherchromatographie DEAE, TMAE, QAE oder PEI verwendet.
  18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem die Anionenaustauscherchromatographie Toyopearl Super Q 650M®, MonoQ®, Source Q® oder Fractogel TMAE® verwendet.
  19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 oder 18, bei dem die Ionenaustauschchromatographie in einem pH-Bereich zwischen etwa 7,0 und etwa 10,0 durchgeführt wird.
  20. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, ferner enthaltend die Schritte des Konzentrierens des Roh-Zelllysats, Austauschens des Puffers des Roh-Zelllysats und Reduzierens der Konzentration an kontaminierenden Nukleinsäuren in dem Roh-Zelllysat.
  21. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem die Wirtszellen an das Wachstum in serumfreiem Medium adaptiert sind.
  22. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem die Wirtszellen in serumfreiem Medium wachsen gelassen werden.
  23. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem die Wirtszellen Suspensionszellen sind oder für die Verwendung als Suspensionszellen adaptiert sind.
  24. Verfahren nach irgendeinem vorherigen Anspruch, bei dem der Adenovirus einen adenoviralen Vektor enthält, der ein exogenes Genkonstrukt enthält.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem das exogene Genkonstrukt ein therapeutisches Gen kodiert.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das therapeutische Gen Antisense-ras, Antisense-myc, Antisense-raf, Antisense-erb, Antisense-src, Antisense-fms, Antisense-jun, Antisense-trk, Antisense-ret, Antisense-gsb, Antisense-hst, Antisense-bcl, Antisense-abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV-ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, Thymidinkinase oder p53, vorzugsweise p53 kodiert.
  27. Verfahren nach den Ansprüchen 24, 25 oder 26, bei dem das Genkonstrukt funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Promotor SV40 IE, RSV LTR, β-Actin, CMV IE, Adenovirus-Major-Late, Polyoma F9-1 oder Tyrosinase ist.
  29. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem der Adenovirus ein replikationsinkompetenter Adenovirus ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem dem Adenovirus mindestens ein Teil der E1-Region, vorzugsweise mindestens ein Teil der E1A- und/oder E1B-Region fehlt.
  31. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Wirtszellen in der Lage sind, die Replikation zu komplementieren.
  32. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Wirtszellen 293-Zellen sind.
  33. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das Medium einer Diafiltration unterworfen wird.
  34. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das Reinigen ferner die Behandlung des Zelllysats mit einer Nuklease einschließt.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die Nuklease Benzonase® oder Pulmozyme® ist.
  36. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, ferner enthaltend einen Konzentrierungsschritt, vorzugsweise unter Einsatz von Membranfiltration.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem die Filtration eine Tangetialflussfiltration ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem die Filtration eine 100 bis 300 K NMWC, regenerierte Cellulose oder Polyethersulfonmembran verwendet.
  39. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend die Schritte: a) Herstellen einer Adenoviruszusammensetzung entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 bis 38 und b) Formulieren der Adenoviruszubereitung von Schritt a), um eine therapeutische Adenoviruszusammensetzung bereitzustellen.
  40. Verfahren nach Anspruch 39, bei dem die therapeutische Adenoviruszusammensetzung 103 bis 1015 PFU/Dosis enthält.
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Families Citing this family (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2625279A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
US20020088014A1 (en) * 1996-05-31 2002-07-04 Xiangming Fang Minimal adenovirus mediated recombinant vaccine
AU3447097A (en) 1996-07-01 1998-01-21 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant adenovirus
CN1244215B (zh) * 1996-11-20 2010-11-03 荷兰克鲁塞尔公司 改进的腺病毒载体生产和纯化方法
US7732129B1 (en) * 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
US6544769B1 (en) 1996-12-13 2003-04-08 Schering Corporation Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US6995006B2 (en) * 1997-09-05 2006-02-07 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO1999021977A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
US7705602B2 (en) * 1997-11-03 2010-04-27 Midtronics, Inc. Automotive vehicle electrical system diagnostic device
US20040204381A1 (en) * 1997-11-12 2004-10-14 Moskal Joseph R Detection and treatment of glyco-enzyme-related disease
US6899870B1 (en) * 1998-03-11 2005-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery
SK15682000A3 (sk) * 1998-04-22 2001-05-10 Genvec, Inc. Účinné čistenie adenovírusu
WO2000022152A1 (en) * 1998-10-13 2000-04-20 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
US7691370B2 (en) * 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
US6689600B1 (en) * 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
DE69940354D1 (de) * 1998-11-16 2009-03-12 Introgen Therapeutics Inc Adenovirus-formulierungen zur gentherapie
US7148035B1 (en) * 1998-11-18 2006-12-12 Oxford Biomedica (Uk) Limited Polypeptide
US6210922B1 (en) * 1998-11-30 2001-04-03 National Research Council Of Canada Serum free production of recombinant proteins and adenoviral vectors
JP2003523169A (ja) 1998-12-31 2003-08-05 アバンテイス・フアルマ・エス・アー ウイルス粒子の分離法
FR2788064B1 (fr) * 1998-12-31 2003-01-31 Aventis Pharma Sa Methode de separation de particules virales
CA2364934C (fr) 1999-02-22 2011-10-18 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee
US6795585B1 (en) 1999-07-16 2004-09-21 Eastman Kodak Company Representing digital images in a plurality of image processing states
JP2003518380A (ja) * 1999-12-29 2003-06-10 ジェンザイム・コーポレイション 核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法
US6168941B1 (en) * 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
AU2001257420A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 Zengen, Inc. A gene therapy system and method using alpha-MSH and its derivatives
US6783939B2 (en) * 2000-07-07 2004-08-31 Alphavax, Inc. Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines
TWI289158B (en) * 2000-08-10 2007-11-01 Oncolytics Biotech Inc Method of producing infectious reovirus
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20020064860A1 (en) * 2000-11-29 2002-05-30 Schering Corporation Method for purifying adenoviruses
BR0207527A (pt) * 2001-03-16 2004-02-25 Oncolytics Biotech Inc Método para produzir vìrus de uma cultura de células, composição, e, método para produzir reovìrus infeccioso
US20040146590A1 (en) * 2001-03-22 2004-07-29 Iadarola Michael J Molecular neurochirurgie for pain control administering locally capsaicin or resinferatoxin
JP4499990B2 (ja) * 2001-03-27 2010-07-14 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖ感染に有用な組成物および方法
WO2003014367A1 (en) 2001-08-08 2003-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for purification of viral vectors having proteins which bind sialic acid
AU2002332736A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of New adenovirus type 7 vectors
ATE437222T1 (de) * 2001-09-06 2009-08-15 Alphavax Inc Alphavirus replikon-vektorsysteme
WO2003039459A2 (en) * 2001-11-05 2003-05-15 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
HU227507B1 (hu) * 2001-12-20 2011-07-28 Bavarian Nordic As Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl
KR100451308B1 (ko) * 2001-12-28 2004-10-06 선바이오(주) 단백질 의약품 정제 방법에서의 바이러스 제거 방법
AU2003213060A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of chimeric virus-like particles for expression in insect cells
ATE324467T1 (de) * 2002-02-20 2006-05-15 Merck & Co Inc Verfahren zur konzentrationsbestimmung von adenoviruspartikeln
US20030175688A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Rukmini Pennathur-Das Method for the purification and production of oncolytic adenoviruses
US20030186832A1 (en) * 2002-03-15 2003-10-02 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Isotropic liquid detergents with improved anti-redeposition
US20030180936A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
CA2478932A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-16 Merck & Co., Inc. Large scale methods of producing adenovirus and adenovirus seed stocks
CA2482512C (en) * 2002-04-30 2011-09-20 Oncolytics Biotech Inc. Improved viral purification methods
EP1506287B1 (de) * 2002-05-14 2007-04-25 Merck & Co., Inc. Verfahren zur reinigung von adenovirus
US20030224354A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-04 Introgen Therapeutics Inc. Quantifying viral particles with intrinsic fluorescence
EP1371723A1 (de) * 2002-06-12 2003-12-17 Procorde GmbH Verfahren zur Herstellung von einer Adenoviruszubereitung
EP1543128A4 (de) * 2002-07-18 2008-02-20 Invitrogen Corp Virusvektoren mit rekombinationsstellen
AU2003268210A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Introgen Therapeutics Inc. Chromatographic methods for adenovirus purification
JP4560483B2 (ja) * 2002-10-03 2010-10-13 ターゲジェン インコーポレーティッド 血管静態化物質およびそれらの使用法
US20050282814A1 (en) * 2002-10-03 2005-12-22 Targegen, Inc. Vasculostatic agents and methods of use thereof
US7319021B2 (en) * 2002-11-01 2008-01-15 Promega Corporation Cell lysis composition, methods of use, apparatus and kit
WO2004055167A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 Alphavax, Inc. Alphavirus particles and methods for preparation
ES2618309T3 (es) * 2002-12-13 2017-06-21 Alphavax, Inc. Partículas de replicón de alfavirus multi-antigénico y métodos
JP2006516548A (ja) 2002-12-30 2006-07-06 アンジオテック インターナショナル アクツィエン ゲゼルシャフト 迅速ゲル化ポリマー組成物からの薬物送達法
CA2513251C (en) 2003-01-14 2013-03-19 Dana-Farber Cancer Institute Cancer therapy sensitizer
KR101518309B1 (ko) * 2003-03-20 2015-05-08 알파벡스, 인크. 개선된 알파바이러스 레플리콘 및 헬퍼 구축물
DK1620549T3 (da) * 2003-05-01 2007-11-05 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til fremstilling af biologiske stoffer ved perfusionsdyrkning af suspenderede dyreceller
US20040229335A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-18 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the production of adenoviral vectors
AU2004249199B2 (en) * 2003-06-18 2008-07-24 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Method for purifying virus
DE602004021260D1 (de) * 2003-07-11 2009-07-09 Alphavax Inc Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren
EP1648931B1 (de) 2003-07-21 2011-02-09 Transgene S.A. Multifunktionelle cytokine
EP2287341B1 (de) 2003-12-01 2013-02-13 Life Technologies Corporation Rekombinationsstellen enthaltende Nukleinsäuremoleküle und Verfahren zur Verwendung davon
CA2551026A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Schering Corporation Methods for producing a549 cell lines stable in serum-free medium suspension culture
ES2329607T3 (es) * 2004-02-23 2009-11-27 Crucell Holland B.V. Metodos de purificacion de virus.
CN100333797C (zh) * 2005-01-26 2007-08-29 彭朝晖 重组腺病毒p53制品在肿瘤治疗中的新用途
AU2005231507B2 (en) * 2004-04-08 2012-03-01 Targegen, Inc. Benzotriazine inhibitors of kinases
MXPA06013124A (es) * 2004-05-18 2007-05-23 Alphavax Inc Vectores de alfavirus derivados de tc-83, particulas y metodos.
US7704721B2 (en) * 2004-06-01 2010-04-27 Genzyme Corporation Compositions and methods to prevent AAV vector aggregation
US20050287616A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Gross Adam F Method of assaying denaturation of proteins
JP5275628B2 (ja) 2004-08-25 2013-08-28 ターゲジェン インコーポレーティッド 複素環式化合物および使用方法
DE202004014949U1 (de) * 2004-09-25 2004-11-18 Techno-Grafica Gmbh Vorrichtung zum Wärmebehandeln einer Beschichtung von Flachoffset-Druckplatten
DE102004049290A1 (de) * 2004-10-09 2006-04-20 Bayer Healthcare Ag Verfahren zur Herstellung von Virusmaterial
US7901921B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-08 Oncolytics Biotech Inc. Viral purification methods
AU2005305347A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying of adenoviral vectors
CN100497640C (zh) * 2004-11-26 2009-06-10 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种高效生产重组腺病毒载体的方法
US20060166364A1 (en) * 2004-12-22 2006-07-27 Introgen, Inc. Use of flexible bag containers for viral production
WO2006071563A2 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 Medimmune Vaccines, Inc. Non-tumorigenic mdck cell line for propagating viruses
US20060205080A1 (en) * 2005-03-01 2006-09-14 David Frey Formulations for therapeutic viruses having enhanced storage stability
SG10201912554TA (en) 2005-03-23 2020-02-27 Genmab As Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
CA2602944C (en) * 2005-04-11 2015-08-11 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
CN101184780B (zh) * 2005-05-05 2012-10-03 森馨香料公司 β-葡聚糖和甘露聚糖的制备
NZ563984A (en) * 2005-06-08 2011-11-25 Targegen Inc Methods and compositions for the treatment of ocular disorders
WO2007005885A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 David Nance Energy recovery within a fluid distribution network using geographical information
US8133900B2 (en) * 2005-11-01 2012-03-13 Targegen, Inc. Use of bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
US8604042B2 (en) * 2005-11-01 2013-12-10 Targegen, Inc. Bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
DK1951684T3 (en) 2005-11-01 2016-10-24 Targegen Inc BIARYLMETAPYRIMIDIN kinase inhibitors
CA2646391A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Viral Logic Systems Technology Corp. Methods for identifying polypeptide targets and uses thereof for treating immunological diseases
US7691858B2 (en) * 2006-04-25 2010-04-06 Targegen, Inc. Kinase inhibitors and methods of use thereof
KR20140075022A (ko) * 2006-09-15 2014-06-18 메디뮨 엘엘씨 높은 역가로 바이러스 증식을 지원하는 ｍｄｃｋ 세포주 및 이를 이용한 생물반응기 공정
DK2118292T3 (da) 2007-01-30 2011-10-24 Transgene Sa Papillomavirus E2-polypeptid der anvendes til vaccination
US20080299624A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Edward Heslop Continuous fermentation apparatus and method
CA2689588C (en) 2007-06-21 2016-08-23 Alphavax, Inc. Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins
JP2010539993A (ja) * 2007-10-08 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
PL2612868T3 (pl) 2007-11-01 2018-12-31 Astellas Pharma Inc. Immunosupresyjne polipeptydy i kwasy nukleinowe
US20090253184A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line
EP2806037B1 (de) * 2008-05-13 2016-09-21 Gen-Probe Incorporated Inaktivierbare Target-Capture-Oligomere zur Verwendung bei der selektiven Hybridisierung und beim Fangen von Zielnukleinsäuresequenzen
ES2762864T3 (es) * 2008-06-18 2020-05-26 Oxford Biomedica Ltd Purificación de virus
CN102216450B (zh) * 2008-09-24 2014-05-14 米迪缪尼有限公司 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法
KR20110074563A (ko) * 2008-09-24 2011-06-30 메디뮨 엘엘씨 바이러스의 정제 방법
WO2010060719A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
WO2010062757A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Improved methods for isolating enveloped virus-based vlps free of infectious agents
US9523344B2 (en) * 2009-05-26 2016-12-20 Leviathan Energy Hydroelectric Ltd. Hydroelectric in-pipe turbine uses
US8891084B2 (en) * 2009-07-07 2014-11-18 Sony Corporation Microfluidic device
EP2461826A2 (de) 2009-08-07 2012-06-13 Transgene SA Zusammensetzung zur behandlung von hbv-infektionen
JP5393896B2 (ja) 2009-10-15 2014-01-22 クルセル ホランド ベー ヴェー アデノウイルス粒子の精製方法
US8470585B2 (en) 2009-10-15 2013-06-25 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
JP6151515B2 (ja) 2010-01-05 2017-06-21 バスキュラー バイオジェニックス リミテッド 神経膠芽腫ｇｂｍを治療するための組成物および方法
EP3159405B8 (de) 2010-01-05 2018-11-07 Vascular Biogenics Ltd. Verfahren zur verwendung eines spezifischen adenovirenmittels gegen angiogenese
SG182490A1 (en) * 2010-01-12 2012-08-30 Vascular Biogenics Ltd Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby
PL2536829T3 (pl) 2010-02-15 2016-09-30 Sposób wytwarzania wektorów adenowirusowych Ad26
BR112012026095A2 (pt) 2010-04-14 2015-09-15 Emd Millipore Corp métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos.
CN103052399B (zh) 2010-08-12 2016-06-29 依生生物制药控股有限公司 用于减少病毒组合物中dna杂质的方法
CN103118702A (zh) 2010-09-20 2013-05-22 克鲁塞尔荷兰公司 活动性结核病的治疗性接种
MX354752B (es) 2010-09-27 2018-03-20 Janssen Vaccines & Prevention Bv Regimen de vacunacion de sensibilizacion y refuerzo heterologo contra malaria.
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
WO2012060847A1 (en) 2010-11-07 2012-05-10 Targegen, Inc. Compositions and methods for treating myelofibrosis
EP2461162A1 (de) 2010-12-03 2012-06-06 Texcell, . Verfahren zur Bestimmung des Titers von Viren durch Verwendung von infektiösen Standardsubstanzen
BR112013014457A8 (pt) 2010-12-09 2017-12-19 Pasteur Institut usos da enzima 6-metilguanina-dna-metiltrasferase (mgmt, ec 2.1.1.63) para aumentar a produção de proteína heteróloga, bem como vetor de expressão, células recombinantes e polipeptídeo de fusão compreendendo sinal de secreção peptídica e proteína snap
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
WO2013135615A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
MY169331A (en) 2012-03-22 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
CA2878898C (en) * 2012-07-26 2023-01-17 Vectalys Method for detecting or measuring the impact of a viral vector composition on eukaryotic cells and biomarkers used thereof
US9657076B2 (en) 2012-10-23 2017-05-23 Emory University GM-CSF and IL-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
KR102236497B1 (ko) 2013-04-25 2021-04-06 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
EP2992553A4 (de) 2013-05-03 2017-03-08 Honeywell International Inc. Leiterrahmenkonstrukt für bleifreie lötverbindungen
US10294279B2 (en) 2013-06-17 2019-05-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides
US9956166B2 (en) 2013-09-18 2018-05-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Methods for administration and methods for treating cardiovascular diseases with resiniferatoxin
WO2015062699A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Merck Patent Gmbh Method for isolating microorganisms from a complex sample
JP2017509489A (ja) 2014-02-20 2017-04-06 ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド 鉛フリーはんだ組成物
JP6783143B2 (ja) 2014-03-25 2020-11-11 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 培地の受動的補充
SG11201608725YA (en) 2014-04-25 2016-11-29 Shire Human Genetic Therapies Methods for purification of messenger rna
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN105316296A (zh) * 2014-06-13 2016-02-10 亚宝药业太原制药有限公司 一种纯化腺病毒颗粒的方法
CN107074969A (zh) 2014-09-09 2017-08-18 优努姆治疗公司 嵌合受体及其在免疫治疗中的应用
GB201417042D0 (en) * 2014-09-29 2014-11-12 Fkd Therapies Oy Method
JP6401871B2 (ja) 2014-11-05 2018-10-10 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病の治療のためのａａｄｃポリヌクレオチド
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
EP3218484A4 (de) 2014-11-14 2018-05-30 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von amyotropher lateralsklerose (als)
EP3230441A4 (de) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von scaav
CN107428799A (zh) 2015-01-13 2017-12-01 阿尔法韦士曼公司 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液
EP3054007A1 (de) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Reinigung von rekombinanten, adeno-assoziierten viren mit einem immunaffinen reinigungsschritt
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
AU2016249798B2 (en) 2015-04-14 2022-05-26 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
PL3319633T3 (pl) 2015-07-07 2021-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Szczepionka przeciwko rsv
EP3319634B1 (de) 2015-07-07 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilisierte lösliche präfusionierte rsv-f-polypeptide
US9663766B2 (en) 2015-07-24 2017-05-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for purifying adenovirus vectors
EP3362472B1 (de) 2015-10-16 2023-08-30 The Trustees of Columbia University in the City of New York Zusammensetzungen und verfahren zur hemmung von zelllinienspezifischen antigenen
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
SI3439672T1 (sl) 2016-04-05 2021-02-26 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabiliziran topen pre-fuzijski F protein RSV za uporabo v profilaksi okužbe z RSV
JP7233928B2 (ja) 2016-04-05 2023-03-07 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
US11261416B2 (en) * 2016-04-14 2022-03-01 Trizell Ltd. Fixed-bed bioreactor with constant-flow pump / tubing system
EP3604547A1 (de) * 2016-04-14 2020-02-05 Trizell Ltd. Festbettbioreaktor mit konstantflusspumpen-/-rohrleitungssystem
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (de) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen zur behandlung einer erkrankung
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
EP3458588A4 (de) 2016-05-18 2020-01-15 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatorische polynukleotide
WO2017201258A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3464565A4 (de) 2016-05-25 2020-01-01 Terumo BCT, Inc. Zellexpansion
EA039124B1 (ru) 2016-05-30 2021-12-08 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные f-белки rsv до слияния
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
EP3472327B1 (de) 2016-06-20 2020-08-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potenter und ausbalancierter bidirektionaler promotor
EP3484506A1 (de) 2016-07-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hpv-impfstoffe
EP3831281A1 (de) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Verfahren für biomedizinisches targeting und freisetzung sowie vorrichtungen und systeme zur ausführung davon
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
WO2018080573A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
CN108085301B (zh) * 2016-11-22 2021-10-26 贺道耀 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒
US10294452B2 (en) 2016-11-22 2019-05-21 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
WO2018106888A1 (en) * 2016-12-08 2018-06-14 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Small animal models for in vivo testing of polyomavirus therapeutics
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
JP7393945B2 (ja) 2017-03-31 2023-12-07 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞増殖
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3808849A1 (de) 2017-08-03 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur aav-freisetzung
CN107384873A (zh) * 2017-09-05 2017-11-24 成都汇宇生物技术有限公司 重组腺病毒的纯化方法
AU2018333566A1 (en) 2017-09-15 2020-02-27 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the safe induction of immunity against RSV
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
AU2018352236A1 (en) 2017-10-16 2020-04-23 The Curators Of The University Of Missouri Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3707250A1 (de) * 2017-11-08 2020-09-16 Blue Sky Vaccines GmbH So3-chromatographie zur verwendung in einem verfahren zur virusreinigung
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
JP2021521852A (ja) 2018-04-27 2021-08-30 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ａａｄｃウイルスベクターの効力を測定する方法
CA3099306A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
WO2019222441A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
EP3793615A2 (de) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Gerichtete entwicklung von aav zur verbesserung des tropismus für zns
JP2021529513A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
EP3826719A1 (de) 2018-07-24 2021-06-02 Voyager Therapeutics, Inc. Systeme und verfahren zur herstellung von gentherapieformulierungen
JP2022520138A (ja) 2018-08-28 2022-03-29 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド 遺伝子操作された造血幹細胞およびそれらの使用
WO2020072683A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2020123524A1 (en) * 2018-12-11 2020-06-18 Erbi Biosystems, Inc. Methods of manufacturing cell based products using small volume perfusion processes
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
WO2020172509A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. Oncolytic adenoviral vector and methods of use
CN110093455B (zh) * 2019-04-27 2020-03-17 中国医学科学院病原生物学研究所 一种呼吸道病毒的检测方法
WO2020223274A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BACULOVIRAL INFECTED INSECT CELLS (BIICs) IN BIOREACTORS
EP3966227A1 (de) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur vektorisierten vermehrung von proteinzerstörung, -expression und/oder -regulierung
CN112175996A (zh) * 2019-07-05 2021-01-05 杭州荣泽生物科技有限公司 一种基因治疗载体的制备方法和用途
EP4010465A1 (de) 2019-08-09 2022-06-15 Voyager Therapeutics, Inc. Zellkulturmedium zur verwendung bei der herstellung von gentherapieprodukten in bioreaktoren
WO2021041485A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20220333133A1 (en) 2019-09-03 2022-10-20 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
US20220389361A1 (en) * 2019-11-15 2022-12-08 City Of Hope System, device and method for production of bioproduct including high density cell respirator for intensified production of adeno-associated viruses
CN110894494B (zh) * 2019-11-22 2022-09-27 广西梧州制药（集团）股份有限公司 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法
US20230131352A1 (en) 2020-04-01 2023-04-27 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
BR112022020753A2 (pt) 2020-04-15 2022-12-20 Voyager Therapeutics Inc Compostos de ligação a tau
GB202005732D0 (en) 2020-04-20 2020-06-03 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
CA3182970A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
EP4192514A1 (de) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Zellkulturmedium zur verwendung bei der herstellung von gentherapieprodukten in bioreaktoren
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
CN112226418B (zh) * 2020-09-25 2022-07-08 阜外华中心血管病医院 重组腺相关病毒纯化方法
IL301955A (en) 2020-10-07 2023-06-01 Asklepios Biopharmaceutical Inc Therapeutic delivery of an adeno-related protein-related protein (FKRP) virus for the treatment of dystroglycanopathy disorders, including limb girdle 21
CN112293394B (zh) * 2020-10-30 2022-11-25 海南德安欣有害生物防治科技有限公司 一种捕鼠装置及捕鼠方法
IL302128A (en) 2020-11-02 2023-06-01 Biomarin Pharm Inc A process for the enrichment of adeno-associated virus
GB202019454D0 (en) * 2020-12-10 2021-01-27 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Method for purifying virus
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2023034980A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Bomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034997A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034990A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034989A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034996A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034994A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
AU2022349103A1 (en) 2021-09-27 2024-03-28 Sotio Biotech Inc. Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules that re-direct glucose metabolites out of the glycolysis pathway and therapeutic uses thereof
CA3235632A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023091909A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Sotio Biotech Inc. Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients
WO2023091948A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023111580A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 University Of Dundee Targeted degradation of alpha-synuclein
WO2023147374A2 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Voyager Therapeutics, Inc. Baculovirus expression system
WO2023154693A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
GB202201713D0 (en) 2022-02-10 2022-03-30 Univ Dundee An affinity directed phosphatase system for targeted protein dephosphorylation
CN115354033A (zh) * 2022-03-25 2022-11-18 上海碧博生物医药科技有限公司 一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获aav的应用
WO2023235791A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024006741A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024011112A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024040208A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Sotio Biotech Inc. Genetically engineered immune cells with chimeric receptor polypeptides in combination with multiple trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof
WO2024040207A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Sotio Biotech Inc. Genetically engineered natural killer (nk) cells with chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024064863A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
WO2024064856A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
CN117551624A (zh) * 2024-01-11 2024-02-13 深圳源兴基因技术有限公司 一种基于无血清悬浮扩增的高效回收腺病毒的方法

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789244A (en) * 1902-10-01 1905-05-09 Hans Thormeyer Steam-turbine.
US824544A (en) * 1905-12-04 1906-06-26 George Hossege Pipe-hanger.
US4222743A (en) 1978-07-20 1980-09-16 Wang Wei Kung Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4539020A (en) 1983-07-10 1985-09-03 Kawasaki Steel Corporation Methods for obtaining high-purity carbon monoxide
JPS6147187A (ja) 1984-08-10 1986-03-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst 狂犬病ウイルスの精製方法
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5173418A (en) * 1985-05-10 1992-12-22 Benzon Pharma, A/S Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5106841A (en) * 1986-05-13 1992-04-21 Chai-Tech Corporation Antiviral compositions and method for their use
EP0273085A1 (de) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation Verfahren zur Einführung fremder Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen
US5591624A (en) * 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
JPH0761955B2 (ja) 1988-04-28 1995-07-05 国立予防衛生研究所長 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン
US5219752A (en) * 1988-05-25 1993-06-15 Teijin, Limited Process for continuously culturing adherent animal cells
JPH04502995A (ja) 1989-01-16 1992-05-28 テレフンケン　フェルンゼー　ウント　ルントフンク　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング コンパチブルな周波数多重テレビジョン方式
US5221958A (en) * 1989-05-01 1993-06-22 Wolfram Bohnenkamp Reflection fluorometer
DE69023488T2 (de) 1989-12-12 1996-05-09 Lidak Pharmaceuticals BESTIMMUNG FREIER FETTSäUREN.
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
NO312681B1 (no) 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
IT1248075B (it) 1991-06-18 1995-01-05 Sclavo Spa Processo per la purificazione del virus dell'epatite a (hav), virus cosi` purificato e composizioni vaccinali che lo contengono.
EP0552108B1 (de) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Phasenmodulationsenergieübertragungsfluoroimmunassay
US5323008A (en) 1992-03-23 1994-06-21 Diatron Corporation Fluorometer detection system
EP0713397B1 (de) 1992-03-24 2002-12-11 United Cancer Research Institute Impfstoff enthaltend lebendes virus
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
US5733720A (en) * 1992-06-18 1998-03-31 Washington University Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor
WO1994002638A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Aprogenex, Inc. Free radical scavengers useful for reducing autofluorescence in fixed cells
AU676204B2 (en) 1992-09-18 1997-03-06 Canji, Inc. Gene therapy by retroviral vector with tumor suppressive gene
US5733721A (en) 1992-11-20 1998-03-31 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Cell analysis method using quantitative fluorescence image analysis
EP0682697A4 (de) 1993-01-29 1997-07-30 New Brunswick Scientific Co Methode und gerät zur verankerung und suspension von zellkulturen.
US5604096A (en) 1993-03-04 1997-02-18 Schaeffer; Warren I. Fluorometric quantitation of mycoplasmas
US5994314A (en) 1993-04-07 1999-11-30 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung
AU6945694A (en) 1993-05-06 1994-12-12 Dade International Inc. Human papillomavirus detection assay
US5421339A (en) 1993-05-12 1995-06-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnosis of dysplasia using laser induced fluoroescence
US6686200B1 (en) * 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
CA2158935A1 (en) 1993-10-12 1995-04-20 Chiron Viagene, Inc. Methods for preserving recombinant viruses
TW442569B (en) * 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
EP0738319A4 (de) * 1994-01-12 2000-03-29 Genetic Therapy Inc Reinigung von retroviralen Vektoren
HRP950097A2 (en) 1994-03-08 1997-06-30 Merck & Co Inc Hepatitis a virus culture process
US5498537A (en) * 1994-03-09 1996-03-12 Cellco, Inc. Serum-free production of packaged viral vector
JP3313117B2 (ja) 1994-03-22 2002-08-12 ザ イミューン リスポンス コーポレイション ウイルス粒子の効率の高い生産および単離
US5521083A (en) * 1994-05-13 1996-05-28 The Research Foundation Of State University Of New York Et Al. Large granular lymphocyte leukemia associated virus
AU3551195A (en) * 1994-09-23 1996-04-09 Somatix Therapy Corporation Chimeric adenovirus for gene delivery
US5552309A (en) * 1994-09-30 1996-09-03 Indiana University Foundation Use of polyols for improving the introduction of genetic material into cells
US6348343B2 (en) * 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US5837520A (en) * 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5744304A (en) * 1995-05-30 1998-04-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inflammation-induced expression of a recombinant gene
US5772888A (en) 1995-07-27 1998-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Separation and/or concentration of an analyte from a mixture using a two-phase aqueous micellar system
CA2228128C (fr) * 1995-08-01 2011-03-29 Pasteur Merieux Serums & Vaccins Procede de production industrielle d'un vaccin contre l'encephalite japonaise et vaccin obtenu
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
CZ296810B6 (cs) 1995-11-30 2006-06-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Léciva pro lécbu nádoru
US5910434A (en) * 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US5789244A (en) * 1996-01-08 1998-08-04 Canji, Inc. Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems
AR006240A1 (es) * 1996-03-14 1999-08-11 Fuller H B Licensing Financ Adhesivo de fusion caliente que comprende interpolimeros, articulo no tejido que lo comprende, procedimiento de polimerizacion para preparlo y caja, envase, bandeja y libro unidos con dicho adhesivo
JPH09262099A (ja) * 1996-03-28 1997-10-07 Aisin Seiki Co Ltd フルオレセイン誘導体リン酸エステルによる核酸等の検出方法
AU3447097A (en) * 1996-07-01 1998-01-21 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant adenovirus
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
CN1244215B (zh) 1996-11-20 2010-11-03 荷兰克鲁塞尔公司 改进的腺病毒载体生产和纯化方法
JP2001506126A (ja) 1996-12-13 2001-05-15 シェーリング コーポレイション ウイルスの精製方法
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
US6168944B1 (en) * 1997-01-31 2001-01-02 Schering Corporation Methods for cultivating cells and propagating viruses
BR9807418A (pt) 1997-02-18 2002-01-22 Canji Inc Terapia de gene supressor de tumor combinado e quimioterapia no tratamento de neoplasmas
US6210683B1 (en) 1997-09-05 2001-04-03 Merck & Co., Inc. Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines
US6130313A (en) 1997-10-02 2000-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Rapidly degrading GFP-fusion proteins
CN100374551C (zh) 1998-02-17 2008-03-12 先灵公司 含有病毒的组合物以及浓缩病毒制剂的方法
US5922576A (en) 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
AU754999B2 (en) 1998-03-10 2002-11-28 Large Scale Proteomics Corporation Detection and characterization of microorganisms
US6265151B1 (en) 1998-03-27 2001-07-24 Seroptix, Inc. Apparatus and method for infectious disease detection
SK15682000A3 (sk) * 1998-04-22 2001-05-10 Genvec, Inc. Účinné čistenie adenovírusu
US6171790B1 (en) 1998-05-01 2001-01-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human protease associated proteins
AU4188599A (en) 1998-05-15 1999-12-06 Geron Corporation Method and apparatus for detecting hazardous agents
ATE268470T1 (de) * 1998-06-30 2004-06-15 Lamina Inc Zytologische und histologische fixier- zusammensetzung und verfahren zur verwendung
EP1102977A1 (de) 1998-08-08 2001-05-30 Imperial Cancer Research Technology Limited Fluoreszenz-assay für biologische systeme
US5965358A (en) 1998-08-26 1999-10-12 Genvec, Inc. Method for assessing the relative purity of viral gene transfer vector stocks
US6689600B1 (en) * 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US6225289B1 (en) 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
JP2003523169A (ja) 1998-12-31 2003-08-05 アバンテイス・フアルマ・エス・アー ウイルス粒子の分離法
US6316185B1 (en) 1999-09-29 2001-11-13 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Quantitation of viruses by light scattering
JP2002054561A (ja) 2000-08-08 2002-02-20 Toyota Industries Corp 容量可変型圧縮機の制御弁及び容量可変型圧縮機
US6447995B1 (en) * 2000-10-04 2002-09-10 Genvec, Inc. Utilizing intrinsic fluorescence to detect adenovirus
DE10050114A1 (de) 2000-10-09 2002-04-25 Wolf Gmbh Richard Verwendung einer Gelmasse
AU2003268210A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 Introgen Therapeutics Inc. Chromatographic methods for adenovirus purification
US20040229335A1 (en) 2003-05-15 2004-11-18 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the production of adenoviral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
EP1760151B1 (de) 2012-03-21
ES2383640T3 (es) 2012-06-25
KR100503701B1 (ko) 2005-07-26
US20020177215A1 (en) 2002-11-28
CN1244215B (zh) 2010-11-03
US6726907B1 (en) 2004-04-27
CN1244215A (zh) 2000-02-09
ATE550429T1 (de) 2012-04-15
NO992389L (no) 1999-07-19
EP0968284B1 (de) 2006-12-13
US20100055763A1 (en) 2010-03-04
US20050089999A1 (en) 2005-04-28
US20030008375A1 (en) 2003-01-09
AU732703B2 (en) 2001-04-26
JP4492826B2 (ja) 2010-06-30
JP2001504701A (ja) 2001-04-10
WO1998022588A3 (en) 1998-10-15
CA2272820C (en) 2012-09-11
US20070155008A1 (en) 2007-07-05
US7510875B2 (en) 2009-03-31
EP1760151A1 (de) 2007-03-07
US7445930B2 (en) 2008-11-04
ES2278399T3 (es) 2007-08-01
BR9713368A (pt) 2001-09-18
US6194191B1 (en) 2001-02-27
EP1707631A2 (de) 2006-10-04
KR20000057160A (ko) 2000-09-15
HK1107116A1 (en) 2008-03-28
DE69737107D1 (de) 2007-01-25
EP0968284A2 (de) 2000-01-05
NO992389D0 (no) 1999-05-19
CA2272820A1 (en) 1998-05-28
NZ335947A (en) 2000-12-22
AU5361798A (en) 1998-06-10
ATE348155T1 (de) 2007-01-15
EP1707631A3 (de) 2006-12-27
WO1998022588A2 (en) 1998-05-28

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