CN110894494B - 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法 - Google Patents

一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，先进行无血清293SFM培养，再开始CD培养基培养生产病毒，采用灌流技术和截流技术相结合，同时控制细胞培养和病毒感染的温度变化。本发明实现了细胞培养密度的扩大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，增加病毒产量，减少成本，截流过程减少细胞死亡损耗，培养过程中质量均一稳定，生产过程衔接紧密，易操控，保证批次质量稳定。

Description

一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法。
背景技术
HEK293细胞是最常用的腺病毒载体包装细胞，它是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾细胞，是由加拿大McMaster University的F.L Graham与J.s.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。HEK293细胞是贴壁依赖性上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，该细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其内增殖。HEK293细胞为人亚三倍体细胞系，可以在无Ca2+或含Ca2+培养基中生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中，也可经驯化使用于悬浮培养。
现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对293细胞单层培养方式下细胞的生长以及腺病毒载体的表达量产生了明显的影响。如中国专利CN103468638B提供一种293细胞的大规模悬浮培养方法，该方法先在T形组织培养瓶中对293细胞种子进行传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到5L容积生物反应器中进行培养，而后将培养得到的细胞转移接种至250L容积生物反应器中进行培养，过程中定期补加新鲜培养基用于维持培养环境适宜细胞生长。
又如中国专利CN104450607B公开了一种用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法，培养基组成包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和其他有机分子；在36.5～37℃，pH7.2～7.4，溶氧浓度45～65％条件下悬浮培养。
但该技术细胞生产腺病毒、腺相关病毒基因载体病毒等生产受限于细胞密度低和细胞产毒少导致产量少，细胞密度低细胞培养技术受营养供给、氧气、代谢影响很难得培养得到高密度的细胞，除本身以外受感染细胞与细胞生长、代谢等竞争导致产毒不高。
发明内容
本发明的目的在于克服批次产毒量少的不足，提供一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，获得高产量的病毒。
本发明的目的是通过下述方案来实现的：
一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法，其特征在于，先进行无血清293SFM培养，再开始CD培养基培养，所述无血清293SFM培养的条件为：培养温度在36～38℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度为30％～50％，培养时间为72～120h；所述CD培养基培养的条件为：培养温度为34～36℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度30％～50％，感染48～96h收获病毒；
优选地，所述无血清293SFM培养的第45～52h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内；
优选地，所述灌流的培养速度为3～8L/d；
优选地，所述CD培养基培养8h～12h后，灌流5L～10LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流；
优选地，所述灌流的搅拌速度为100～140rpm；
优选地，所述无血清293SFM培养的搅拌速度为80～160rpm；
优选地，所述无血清293SFM培养在第1天搅拌速度为80～100rpm，自培养第2天开始在120～160rpm的范围内逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒；
优选地，所述CD培养基培养的搅拌速度为100～140rpm；
优选地，所述无血清293SFM培养前，用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养再转移到罐内培养；
优选地，无血清293SFM培养前，取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞；
本发明为克服批次产毒量少，采用无血清293SFM和CD培养基相结合的培养细胞生产病毒，采用灌流技术和截流技术相结合，同时控制细胞培养和病毒感染的温度变化。
在培养期间采用驯化293系列由贴壁转化为悬浮无血清培养技术，采用高营养的无血清EX-CELL 293SFM类培养基进行培养，细胞灌流技术，活细胞截流技术和匀速搅拌氧气供给，保证细胞生产需要的物质、营养和氧气供给，截流和灌流技术保证营养供给和代谢物的排出，保证罐体内一直保持细胞生长最佳环境，使细胞可以达到高密度培养。到进行病毒感染时，降低培养温度并更换成CD培养基，降低温度和细胞生长所需物质，提高代谢所需物质，最终能有效达到高产量病毒。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的技术方案是一种新的293细胞大规模高密度培养和高产腺相关病毒技术方法，所选培养条件合适293细胞生长和病毒感染，无血清293SFM提供细胞生长扩增所需物质营养，实现了细胞高密度培养，减少了细胞培养损耗，减少时间成本，CD培养基提供病毒在细胞体内增殖的所需物质营养，同是病毒繁殖的温度即保证病毒体内的增殖有可以降低细胞内代谢活性，降低能耗，简化操作，保证批次质量稳定，生产过程衔接紧密，易操控。
2.本发明在细胞培养和病毒增殖过程中进行不同培养基的培养，根据细胞生长和病毒繁殖不同的营养物质要求特性，选择最优结合方法保证了细胞增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本，增大病毒产量。
3.实现了细胞培养密度的扩大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度；增加病毒产量，减少成本
4.截流过程减少细胞死亡损耗，培养过程中质量均一稳定，生产过程衔接紧密，易操控。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在36℃；pH维持在7.0；溶氧浓度在30％；搅拌速度在80rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为80rpm，自培养第2天开始在120rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第45h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度3L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，72h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为60rpm，培养温度调节成34℃；pH维持在7.0，溶氧浓度在30％，8h后，搅拌速度设置为100rpm，并灌流5L CD培养基，48h终止培养灌流，感染48h收获病毒。
实施例2
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在38℃；pH维持在7.4；溶氧浓度在50％；搅拌速度在160rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为100rpm，自培养第2天开始在160rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第52h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度8L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，120h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为80rpm，培养温度调节成36℃；pH维持在7.4，溶氧浓度在50％，12h后，搅拌速度设置为140rpm，并灌流10L CD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染96h收获病毒。
实施例3
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在37℃；pH维持在7.2；溶氧浓度在40％；搅拌速度在120rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为90rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第48h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度5L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，96h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为70rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.2之间，溶氧浓度在40％之间，10h后，搅拌速度设置为120rpm，并灌流8LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
实施例4
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在36℃；pH维持在7.4；溶氧浓度在30％；搅拌速度在160rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为80rpm，自培养第2天开始在160rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第45h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度8L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，100h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为80rpm，培养温度调节成34℃；pH维持在7.0，溶氧浓度在50％，8h后，搅拌速度设置为140rpm，并灌流5L CD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染60h收获病毒。
实施例5
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在38℃；pH维持在7.2；溶氧浓度在40％之间；搅拌速度在130rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为900rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第45h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度8L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，86h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为70rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.4，溶氧浓度在45％，10h后，搅拌速度设置为130rpm，并灌流6L CD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染80h收获病毒。
实施例6
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在37℃；pH维持在7.1；溶氧浓度在45％之间；搅拌速度在160rpm之间，在培养的第1天搅拌速度设置为80rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第50h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度6L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，110h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为65rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.3之间，溶氧浓度在35％之间，10h后，搅拌速度设置为110rpm，并灌流8LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染85h收获病毒。
实施例7
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在38℃；pH维持在7.4；溶氧浓度在30％；搅拌速度在150rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为80rpm，自培养第2天开始在120rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第47h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度4L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，96h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为60～80rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.1，溶氧浓度在35％，8h后，搅拌速度设置为130rpm，并灌流8L CD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
对比例1～2用与评价无血清293SFM培养和CD培养基培养相结合对病毒产量的影响
对比例1：与实施例3相比，不使用CD培养基培养，其他条件相同，具体如下：
对比例1
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在37℃；pH维持在7.2；溶氧浓度在40％；搅拌速度在120rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为90rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第48h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度5L/d，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，96h开始感染病毒，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
对比例2：与实施例3相比，不使用无血清293SFM培养，其他条件相同，具体如下：
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、使用CD培养基培养，搅拌速度设置为70rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.2之间，溶氧浓度在40％之间，10h后，搅拌速度设置为120rpm，并灌流8L CD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
对比例3～4用与评价灌流技术和截流技术结合对病毒产量的影响
对比例3：与实施例3相比，不使用灌流，其他条件相同，具体如下：
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在37℃；pH维持在7.2；溶氧浓度在40％；搅拌速度在120rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为90rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第48h开始进行增加新鲜无血清293SFM，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内，96h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为70rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.2之间，溶氧浓度在40％之间，10h后，搅拌速度设置为120rpm，并灌流8LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
对比例4：与实施例3相比，不使用截流，其他条件相同，具体如下：
1、取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
2、用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养到一定浓度，然后转移到罐内培养，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为:培养温度在37℃；pH维持在7.2；溶氧浓度在40％；搅拌速度在120rpm，在培养的第1天搅拌速度设置为90rpm，自培养第2天开始在140rpm逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
3、在罐内培养的第48h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，要求的培养速度5L/d，96h开始感染病毒。
4、开始进行病毒感染时更换成CD培养基，搅拌速度设置为70rpm，培养温度调节成35℃；pH维持在7.2之间，溶氧浓度在40％之间，10h后，搅拌速度设置为120rpm，并灌流8LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流，感染72h收获病毒。
结果与分析
对实施例1～7及对比例1～4采用采用常规方法检测细胞活力，紫外分光光度计法测定病毒颗粒数，高压液相色谱法测定腺病毒滴度，具体结果如下：
Figure BDA0002285371370000111
对比例1-2在评价无血清293SFM培养和CD培养基培养相结合对病毒产量的影响时，对比例1单独采用无血清293SFM培养时，细胞活力没有明显变化，但细胞密度出现了明显的下降，同时病毒滴度、单细胞产毒量、总病毒产量均下滑；对比例2单独采用CD培养基培养时，细胞活力、细胞密度出现了明显的下降，同时病毒滴度、单细胞产毒量、总病毒产量相应的减少；本发明(实施例3)细胞密度最高可达3.07E+06个/m1，此时的细胞活力达到了99％左右。本发明(实施例1-7)通过优化无血清293SFM和CD培养基相结合的培养细胞生产病毒的工艺，控制细胞培养和病毒感染的温度变化，实现了大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒，进一步提高病毒滴度和单细胞病毒滴度，没有出现病毒滴度下降，解决了“细胞密度效应”问题。
在对比例3～4评价灌流技术和截流技术结合对病毒产量的影响时，对比例3、4不使用灌流、截流技术时，细胞活力、细胞密度出现了明显的下降，同时病毒滴度、单细胞产毒量、总病毒产量相应的减少；本发明(实施例1-7)优化了灌流技术和截流技术相结合培养细胞的工艺参数，采用细胞灌流技术，活细胞截流技术和匀速搅拌氧气供给，保证细胞生产需要的物质、营养和氧气供给，截流和灌流技术保证营养供给和代谢物的排出，保证罐体内一直保持细胞生长最佳环境，使细胞可以达到高密度培养。到进行病毒感染时，降低培养温度并更换成CD培养基，降低温度和细胞生长所需物质，提高代谢所需物质，最终能有效达到高产量病毒。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，先进行无血清293SFM培养，开始进行病毒感染时更换成CD培养基培养，所述无血清293SFM培养的条件为：培养温度在36～38℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度为30％～50％，培养时间为72～120h；所述CD培养基培养的条件为：培养温度为34～36℃，pH7.0～7.4，溶氧浓度30％～50％，感染48～96h收获病毒。
2.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述无血清293SFM培养的第45～52h开始进行灌流增加新鲜无血清293SFM，同时用细胞截流器把排除液中的细胞截流在罐体内。
3.如权利要求2所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述灌流的培养速度为3～8L/d。
4.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述CD培养基培养8h～12h后，灌流5L～10LCD培养基，在收取病毒的前24h终止培养灌流。
5.如权利要求4所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述灌流的搅拌速度为100～140rpm。
6.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述无血清293SFM培养的搅拌速度为80～160rpm。
7.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述无血清293SFM培养在第1天搅拌速度为80～100rpm，自培养第2天开始在120～160rpm的范围内逐步提高搅拌速度持续培养直到感染病毒。
8.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述CD培养基培养的搅拌速度为100～140rpm。
9.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，所述无血清293SFM培养前，用无血清293SFM培养基悬浮培养，先在摇瓶中培养再转移到罐内培养。
10.如权利要求1所述的一种大规模高密度悬浮培养293细胞腺病毒的方法，其特征在于，无血清293SFM培养前，取贴293壁细胞通过无血清293SFM+血清梯度递降培养方式驯化最终成无血清悬浮细胞。
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