CN102337311A - 基于土豆废渣的细菌纤维素培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌纤维素的培养方法，具体为：将木醋杆菌菌种接种于培养基中复苏，复苏后的木醋杆菌菌种按2-20%接种量接种于培养基中，在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2-5天，得细菌纤维素，所述培养温度为26-31℃，培养时通气量为0.3-0.6vvm；所述培养基为土豆培养液；本发明首次将生产淀粉之后的土豆废渣作为培养基原料，用最为简单的方法对土豆废渣进行处理后得到用于培养细菌纤维素培养基，该培养基成本低廉，收率高，同时解决了土豆废渣的再利用问题，培养时间短；另外，本发明为细菌纤维素稳定的大规模细菌纤维素培养提供了重要条件。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及细菌纤维素的培养方法。
背景技术
土豆是一种分布广泛，适应性强，产量高的易栽培作物，除了作为粮食之外，土豆主要用于淀粉加工。利用土豆每生产一吨淀粉将会产生7.5吨土豆废渣。土豆废渣中主要含有蛋白质、氨基酸及少量糖类物质，是可回收利用的资源。目前，土豆废渣可回收用于生产酒精、饲料、可降解塑料及提取果胶和制备膳食纤维等。但是，在回收利用中，土豆废渣常常面临如下问题：1）土豆废渣粘性高，不易固液分离；2）回收前对土豆废渣的灭菌费时费钱。
细菌纤维素是除植物纤维素之外的另一类纤维素，为细菌合成的天然惰性材料，细菌纤维素( bacterial cellulose ,BC) 具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性,是世界上公认的性能优异的新型生物学材料。目前对BC 应用主要集中在高附加值的生物医用材料上, 如组织工程支架、人造血管及人造皮肤等方面。能够产生以细菌纤维素的细菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中产量最高的为木醋杆菌，Acetobacter xylinus，属革兰氏阴性(少数可变)；严格好氧，呼吸代谢从不发酵；传统观点认为：乙醇、甘油和乳酸是最好的碳源。虽然木醋杆菌产量较高，但仍不能解决细菌纤维素生产成本居高不下的问题。众所周知，在微生物工程领域中，从小规模的实验筛选到中试规模以上的产业化生产，每个环节的条件都必须得到优化，其中，也包括培养基的优化，如未经优化，将小试实验条件机械地扩大于规模化生产，将面临pH值、温度及培养所需气体等可控性问题导致规模化生产无法实施。目前，细菌纤维素产业化的主要技术障碍在于发酵水平较低，产量低、成本高、价格不抵普通植物纤维素；再是进一步研究和利用细菌纤维素的成膜和成型的工艺技术还没有解决。如何进一步提高纤维素产量，降低成本，寻找更为廉价且更好的细菌纤维素生产原料以达到上述目的，仍将是细菌纤维素研究面临的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供细菌纤维素的培养方法，该方法操作简单，周期短，成本低，适用于中试以上规模的生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
基于土豆废渣的细菌纤维素培养方法，将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得木醋杆菌菌种按2-20%接种量接种于培养基中，在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2-5天，得细菌纤维素，所述培养温度为26-31℃，培养时通气量为0.3-0.6vvm；所述培养基为土豆培养液，具体为取土豆废渣加水在80-100℃条件下加温不低于1小时，使土豆废渣和蒸馏水的质量比为2-11:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为4.0-7.5，所述土豆废渣为制备土豆淀粉所剩下的土豆废渣。
进一步，将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为30℃。
进一步，所述培养基为土豆培养液，具体为取土豆废渣加水在100℃条件下加温1小时，使土豆废渣和水的质量比为7:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为6.8。
本发明的有益效果在于：本发明首次将生产淀粉之后的土豆废渣作为培养基原料，用最为简单的方法对土豆废渣进行处理后得到用于培养细菌纤维素的培养基，该培养基成本低廉，用于培养细菌纤维素收率高，本发明同时解决了土豆废渣的再利用问题。将土豆废渣培养液和甘油在一定的配比下联合用于培养细菌纤维素，其产率高，成本低，且可缩短培养时间。另外，本发明为细菌纤维素稳定的大规模细菌纤维素培养提供了重要条件。
具体实施方式
下述实施例中的木醋杆菌（gluconacetobacter xylium），购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为1.2378。
下述细菌纤维素冷冻干燥过程：是将细菌纤维素平铺于冷冻干燥盘中，进行从-30℃---25℃逐级控温冷冻真空干燥，直至细菌纤维素完全干燥。冷冻干燥法利用深低温冷冻方法使细菌纤维素湿膜内的水变为固态,然后在真空冷冻干燥机内，利用控制其真空度的方法,使膜内固态的水升华。并用冷凝方法捕获并冷凝升华的水汽，致使物质脱水干燥。真空冷冻干燥过程在极低的温度和高真空的条件下进行，对材料的热变性小，在最大限度上保持了材料的生物学活性。同时，在升华的过程中，不会破坏它的物理结构，化学结构的变化也很小，因此可以很好地保存细菌纤维素膜的三维网状结构。
下述实施例中，细菌纤维素培养基的成本为0.09元/平方厘米。
实施例1 土豆废渣的制备
本发明中所述土豆废渣为土豆鲜品提取淀粉后的剩余物。具体制备方法为:取土豆，清洗土豆表面的泥土，去掉石块和铁屑等异物。用粉碎机将洗净的土豆粉碎成糊浆至用手捻无颗粒感。适量的注入清水，加速土豆粕的流动，使淀粉和土豆粕更好的分离。将土豆粕用振动次数为130次/分，筛孔从前至后为30目、50目、60目、80目渐小的平筛过筛，淀粉流入筛下，土豆废渣从筛上流出，其湿度为75%。也可以采用其他方法分离土豆中的淀粉，进而获得土豆废渣。
去土豆废渣在100℃（80℃也可）条件下加温1小时，得土豆废渣培养液。
实施例2 培养基的制备
配方一：取土豆废渣加水在80℃条件下加温1小时，使土豆废渣和蒸馏水的质量比为2:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为4.0。
对比配方一：取土豆废渣加水在80℃条件下加温1小时，使土豆废渣和蒸馏水的质量比为2:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为3.5。
配方二：取土豆废渣加水在100℃条件下加温1小时，使土豆废渣和蒸馏水的质量比为11:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为7.5。
对比配方二：取土豆废渣加水在100℃条件下加温1小时，使土豆废渣和蒸馏水的质量比为11:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为8.0。
配方三：具体为取土豆废渣加水在100℃条件下加温1小时，使土豆废渣和水的质量比为7:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为6.8。
实施例3 一步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在180rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在静态条件下培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为31℃，培养时通气量为0.3vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表1 细菌纤维素膜的产率
| 配方 | 重量1(g/L) | 重量2(g/L) |
| 配方一 | 27.9 | 3.1 |
| 对比配方一 | 11.7 | 1.3 |
| 配方二 | 27 | 3.0 |
| 对比配方二 | 8.1 | 0.9 |
| 配方三 | 30.3 | 3.3 |
实施例4 二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在100rpm条件下摇床培养2天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在100rpm条件下摇床培养2天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2天，得细菌纤维素，所述培养温度为26℃，培养时通气量为0.6vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表2中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表2 细菌纤维素膜的产率
| 配方 | 重量1(g/L) | 重量2(g/L) |
| 配方一 | 35.81 | 3.77 |
| 对比配方一 | 11.4 | 1.2 |
| 配方二 | 34.67 | 3.65 |
| 对比配方二 | 8.1 | 0.9 |
| 配方三 | 36.1 | 3.8 |
实施例5 二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在180rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按15%接种量接种于培养基中，在180rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为31℃，培养时通气量为0.3vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表3 细菌纤维素膜的产率
| 配方 | 重量1(g/L) | 重量2(g/L) |
| 配方一 | 37.81 | 3.98 |
| 对比配方一 | 12.31 | 1.3 |
| 配方二 | 36.1 | 3.8 |
| 对比配方二 | 10.45 | 1.1 |
| 配方三 | 37 | 4.01 |
实施例6二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按20%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为30℃。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表4 细菌纤维素膜的产率
| 配方 | 重量1(g/L) | 重量2(g/L) |
| 配方一 | 36.1 | 3.8 |
| 对比配方一 | 8.1 | 0.9 |
| 配方二 | 35.51 | 3.7 |
| 对比配方二 | 34.2 | 3.6 |
| 配方三 | 39.42 | 4.15 |
本发明中的接种量是指种子液占含有种子液培养基的体积比，其中种子液中含有木醋杆菌106cuf/mL。采用2%的接种量也可实现细菌纤维素的培养，再次不再例举。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (3)
1.基于土豆废渣的细菌纤维素培养方法，其特征在于：将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得木醋杆菌菌种按2-20%接种量接种于培养基中，在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2-5天，得细菌纤维素，所述培养温度为26-31℃，培养时通气量为0.3-0.6vvm；所述培养基为土豆培养液，具体为取土豆废渣加水在80-100℃条件下加温不低于1小时，使土豆废渣和水的质量比为2-11:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为4.0-7.5,所述土豆废渣为土豆制备土豆淀粉所剩下的土豆废渣。
2.根据权利要求1所述的细菌纤维素培养方法，其特征在于，将木醋杆菌菌种接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为30℃。
3.根据权利要求1所述的细菌纤维素培养方法，其特征在于，所述培养基为土豆培养液，具体为取土豆废渣加水在100℃条件下加温1小时，使土豆废渣和水的质量比为7:50，得土豆培养液，所述土豆培养液的pH为6.8。
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