CN115927155A - 一种木质纤维素衍生抑制剂耐受菌株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木质纤维素衍生抑制剂耐受菌株的筛选方法。将木质纤维素水解液中最典型的抑制剂成分配制成复合抑制剂，用不同浓度的复合抑制剂培养基进行梯度适应性驯化，逐级提升菌株木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性，通过比较木葡萄糖酸醋杆菌产细菌纤维素膜的速度表征菌株耐受性的提升。本发明建立的筛选方法，提高了菌株木质纤维素水解液耐受性，菌株能够高效利用木质纤维素水解液生产细菌纤维素膜，节约了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及菌株的筛选技术领域，具体涉及一种木质纤维素衍生抑制剂耐受菌株的筛选方法的筛选方法。
背景技术
木质纤维素是最丰富的绿色可再生资源，包括农林废弃物、谷物残渣、干草、城市有机固体垃圾等，可以转化为其他形式后被利用。具有来源广泛、价格低廉和可再生性等优点，有巨大的发展潜力。有效利用农林废弃物等木质纤维素资源是降低生物基产品生产成本和绿色生物制造的关键途径。
木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素等，这些成分相互交联在一起，形成了非常复杂的复合物结构，这种生物顽抗性使木质纤维素难以被直接利用。通过对木质纤维素预处理，可以消除其生物顽抗性，破坏纤维素和半纤维素之间的交联结构。但是木质纤维素水解过程中会产生各种抑制剂性副产物，例如：糠醛，苯酚，乙酸。微生物受到培养环境中抑制剂的影响，严重制约着微生物对纤维素水解液的利用。
目前通过设计-改造-测试-学习的循环已经大大改善菌种的开发，但是由于抑制剂耐受性涉及到复杂的代谢和调控网络，它不能完美地被单一基因或少数基因控制。通过理性设计来改造微生物的效率难以满足需要。驯化因其有效性和普适性是改善微生物应对抑制剂耐受性的有效手段。驯化可以在多种尺度上，提高微生物对环境胁迫的耐受性，是微生物加强胁迫反应、克服生存限制的常用手段，微生物经过长期驯化可以筛选出具有基因组突变的优势菌株，这些菌株适应压力环境，以提高产品的产量或菌株的生长速度。随着低成本、高通量DNA测序以及生物信息学的不断发展，驯化得到的菌株可以利用生物信息学技术，分析引起菌株变化的原因。总之，微生物在压力环境中，经过长时间驯化可能发生基因突变，通过获得全新表型来适应新的环境。因此，通过驯化可以简单有效的增强微生物对环境的适用能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对木质纤维素水解液抑制菌株生长问题，提供一种具有木质纤维素水解液耐受性菌株的筛选方法。
为解决上述问题，本发明提供一种木质纤维素衍生抑制剂耐受菌株的筛选方法
本发明的技术方案概述如下：
S1：培养基准备：按照配方配制HS液体培养基，将木质纤维素水解液中的抑制剂成分配制成复合抑制剂，并对需要使用的装置进行处理。
S2：菌株准备：活化菌株，获得二级种子液。
S3：发酵：二级种子液30℃，静置发酵。
S4：梯度驯化：进行多组连续多轮梯度驯化。
S5：传代退化：对驯化后的菌株进行连续传代退化。
S6：测定：对退化后菌株木质纤维素水解液中抑制剂耐受性进行测定。
优选的，所述步骤S1中HS液体培养基的成分包括：蛋白胨10g/L、酵母浸出粉7.5g/L、磷酸氢二钠10g/L、葡萄糖25g/L，使用pH为5.0,115℃灭菌15min。
优选的，所述S1中复合抑制剂的成分包括：苯酚0.5g/L、糠醛1.3g/L和乙酸5.3g/L(简称为FAP),过滤除菌。
优选的，所述S2中菌株活化为将单菌落接种于5ml HS液体培养基中于30℃，200rpm过夜培养获得一级种子液，取3ml一级种子液转接至新鲜的30ml HS液体培养基于30℃，200rpm培养48h。
优选的，所述S3中静置发酵条件为30℃培养箱静置培养至膜的厚度为2mm。
优选的，所述S4中多组为3组选取产膜速度较快的一组进行下一轮驯化。
优选的，所述S4中连续多轮为将产膜速度较快的一组，取其膜的八分之一将其转移至相同浓度抑制剂培养基中进行下一轮驯化，这样连续驯化6次。
优选的，所述S4中梯度驯化为在低浓度驯化6轮后将其膜的八分之一转移至较高浓度的抑制剂培养基直至抑制剂浓度达到100％。
优选的，所述S5中连续传代退化为将在100％浓度培养基中驯化的菌株转移至无抑制剂的HS培养基中静置培养至膜的厚度为2mm，取膜的八分之一转移至新鲜的无抑制剂HS培养基中，重复此步骤5次。
优选的，所述S6中菌株耐受性测定为菌株在规定时间内产细菌纤维素膜量的测定，并以原始菌株为对照，比较耐受性的变化。
本发明的效果是：
1.本发明所筛选出的菌株，在木质纤维素水解液中发酵60h细菌纤维素产量为3.4g/L，而相同培养时间内出发菌株细菌纤维素产量为1.1g/L。
2.本发明采用梯度迭代驯化的方法，逐级提升菌株木质纤维素水解液耐受性，且多组同时进行筛选，选择其中生长速度快的进行下一轮驯化，提高了菌株筛选的效率。
3.本发明采用了传代退化的方法稳定菌株耐受表型，提高了菌株筛选的准确性。
4.本发明对木葡萄糖酸醋杆菌产细菌纤维素的量进行测定，提高了筛选的可信度。
5.本发明显著提高了菌株耐受性从而提升了细菌纤维素膜的产量。有效利用了农林废弃物等木质纤维素资源，有效降低了细菌纤维素的生产成本。
附图说明
图1为耐受菌株与原始菌株60h产细菌纤维素的结果。
图2为菌株筛选流程。
具体实施方式
本发明所使用的木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)菌株CGMCC2955，中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center)保藏。(2018年6月，购于CGMCC，网址：https://cgmcc.net/)
以下通过实施例对本发明做进一步的阐述，但不应理解为对本发明的限制，在不背离发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换都属于本发明范围。
实施例1：木质纤维素水解液中抑制剂耐受性菌株筛选
1)培养基准备
按照配方配制HS液体培养基成分包括蛋白胨10g/L、酵母浸出粉7.5g/L、磷酸氢二钠
10g/L、葡萄糖25g/L，调节pH为5，调节后于115℃环境中灭菌15min。复合抑制剂的成分包括：苯酚0.5g/L、糠醛1.3g/L和乙酸5.3g/L，过滤除菌。将复合抑制剂FAP按照20％、40％、60％、80％、100％浓度比例分别加入到30ml HS培养基中。
2)菌株准备
选取3个木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)菌株CGMCC 2955的单菌落分别接种至5ml HS培养基，于30℃摇床，200rpm过夜培养，获得一级种子液。将一级种子液以10％的接种量转接3ml至30ml液体HS培养基中，于30℃摇床，200rpm培养48h，获得二级种子液。
3)发酵
将二级种子液以10％的接种量转接3ml至30ml液体HS培养基中,于30℃培养箱，静置培养至膜厚度为2mm。
4)梯度驯化
在超净台内用灭过菌的剪刀剪八分之一大小的膜，将其转移至含有20％复合抑制剂浓度的30ml HS液体培养中，培养至膜的厚度为2mm，分3组进行。每次选取产膜速度较快的一组，在含有20％复合抑制剂浓度的30ml HS液体培养中连续培养5次。以同样的方法依次在含有40％、60％、80％、100％复合抑制剂浓度的30ml HS液体培养中驯化，将最终培养的膜中菌液用移液枪吸出，即为获得的耐受100％复合抑制剂的菌株。
5)传代退化
将最终培养耐受100％复合抑制剂的膜的八分之一转移至30ml HS液体培养基中于30℃培养箱，静置培养至膜厚度为2mm。取膜的八分之一转接至30ml HS液体培养基中于30℃培养箱，静置培养至膜厚度为2mm。连续培养5次后，将膜中菌液用移液枪吸出，即为表型稳定的耐受菌株。
6)木质纤维素水解液制备
取10g干重秸秆置于反应釜内衬中，加入氢氧化钠溶液，混合均匀，固液比为1:9(g:mL)，氢氧化钠负载为100mg/g干重秸秆。将反应釜密封后置于高温高压灭菌锅中，反应条件为：130℃，30min.反应完成后将反应釜取出，用冷水进行快速冷却降温30min用两层纱布进行固液分离，得到玉米秸秆水洗液。使用4M H2SO4调节水洗液pH至7.5。使用超速离心机12000rpm离心15min。沉淀去除后，在高温高压灭菌锅中121℃灭菌20min，室温下保存。
7)细菌纤维素产量测定
分别挑取传代退化后的耐受菌株和亲本菌株CGMCC 2955的单菌落于5ml HS培养基中，30℃摇床，200rpm过夜培养。以10％的接种量转接至木质纤维素水解液中，30℃培养箱，静置培养60h。取出培养60h后摇瓶中的细菌纤维素膜，用蒸馏水反复清洗，除去纤维素膜表面的发酵液和菌体残留。将纤维素膜浸泡于0.1M NaOH水溶液中，反复浸泡至膜呈乳白色。用蒸馏水继续浸泡至中性，用抄片机在95℃的条件下将细菌纤维素膜制成干燥恒重的薄片。
8)结果和讨论
由图1可知，耐受菌株的细菌纤维素产量为3.4g/L,原始菌株的膜产量为1.1g/L，耐受菌株膜产量提高了209％。耐受菌株可以较快的利用木质纤维素水解液转化为细菌纤维素膜，说明耐受菌株克服了木质纤维素水解液对其生长和产物转化的抑制作用。
Claims (9)
1.一种木质纤维素衍生抑制剂耐受菌株的筛选方法，其特征在于，包括:以下步骤：
S1：准备：按照配方配制HS液体培养基，将木质纤维素水解液中的抑制剂成分配制成复合抑制剂，并对需要使用的装置进行处理；
S2：菌株准备：活化菌株，获得二级种子液；
S3：发酵：二级种子液30℃，静置发酵；
S4：梯度驯化：进行连续多轮梯度驯化；
S5：传代退化：对驯化后的菌株进行连续传代退化；
S6：测定：对退化后菌株木质纤维素水解液中抑制剂耐受性进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中，HS液体培养基成分包括蛋白胨10g/L、酵母浸出粉7.5g/L、磷酸氢二钠10g/L、葡萄糖25g/L，调节pH为4.9-5.1，调节后于115℃环境中灭菌15min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中，将木质纤维素水解液中的抑制剂成分配制成复合抑制剂，典型抑制剂成分包括糠醛、苯酚、乙酸，不限制于复合抑制剂且不限制于上述3种成分。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中，将单菌落接种于5mlHS液体培养基30℃过夜培养获得一级种子液，转接部分一级种子液至30mlHS液体培养基，30℃培养48h获得二级种子液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中，转接部分二级种子液至30ml HS液体培养基，30℃静置发酵.获得细菌纤维素膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中，每个浓度进行多轮的驯化，每轮驯化至膜厚度生长至1-3mm结束。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每轮驯化多组同时进行，选取其中产细菌纤维素膜速度较快的进行下一轮驯化。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中，将驯化后的菌株在HS液体培养基连续传代稳定耐受表型。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S6中，通过对木葡萄糖酸醋杆菌在规定时间内产细菌纤维素膜的量进行测定，并与原始菌株进行对比，来判断菌株耐受性的提升。
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