CN101831396A - 土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，采用全麦粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.3％、琼脂1.5～2.5％、余量为水的比例配制平板培养基，进行单菌落的培养，将培养好的单菌落制备成单菌落冷冻菌，通过摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落冷冻菌，最终制备成生产用冻干管菌种。该平板培养基可以培养出菌落直径大、分生孢子数量多的单菌落。单菌落孢子悬液直接用于单菌落冷冻菌的制备，它减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，防止菌种退化，增加了保藏效果，最终达到提高工作效率和增产降耗的目的。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体的说是涉及一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺。
背景技术
土霉素(Oxytetracycline)为四环类广谱抗生素，国内从20世纪60年代开始规模化发酵生产，至今已经成为我国规模最大的抗生素发酵产品之一，在医疗、畜牧业和农业方面有着广泛的用途。土霉素产品的市场前景广阔，生产企业众多，市场竞争激烈，因此改进生产工艺、降低生产成本是该产品面临的重大课题。
土霉素的产生菌种是龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus Sobinetal)。目前国内企业土霉素发酵生产的菌种选育、制备及保藏工艺仍然沿用传统的工艺方法。在以上菌种选育过程中，从单菌落经摇瓶初筛和摇瓶复筛到沙土斜面要靠斜面传代来维持菌种的新鲜和活性，同时初筛斜面和复筛斜面要放置4℃冰箱保藏，最终沙土斜面要埋制成沙土管用于长期保藏菌种。以上工艺的缺点是菌种在斜面传代及保藏过程中产量会下降，沙土管保藏菌种保藏期短、死亡率高、菌种容易退化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供减少菌种传代次数，防止菌种退化，保持菌种优良高产性状，减少菌种在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证菌种发酵生产的稳定的一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺。
本发明的目的是这样实现的：一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，包括以下步骤：
a.平板培养基的制备：按照全麦粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.3％、琼脂1.5～2.5％、余量为水的比例配制平板培养基，将平板培养基经过灭菌装入灭菌后的培养皿中；
b.单孢子悬液的制备：取预先选定的出发菌种，接种3～5只茄瓶斜面，培养出发斜面孢子，然后选取外观质量合格的出发斜面孢子制成单孢子悬液；
c.单菌落的培养：将单孢子悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-7、10-8、10-9；将以上三个浓度的单孢子悬液分别接种到不同培养皿的平板培养基上，在温度为36～37℃、相对湿度为40～50％的条件下培养；
d.单菌落孢子悬液的制备：选择菌落直径较大、白色、孢子丰满、边缘整齐的主型单个菌落，制成单菌落孢子悬液，分装在4只试管中，塞上棉塞、包好封口膜并编号；
e.单菌落冷冻菌的超低温冻存：将装好单菌落孢子悬液的试管按照编号顺序摆放在铝制的试管架上，浸入-70℃丙酮中预冻，再迅速放入-70℃的超低温冰箱保藏；
f.摇瓶初筛和摇瓶复筛：取步骤e中单菌落冷冻菌中的其中2只试管，采用与生产相近的培养基和培养条件，进行单菌落冷冻菌的摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落冷冻菌；
g.生产用冻干管菌种的制备：根据步骤f摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择生产能力强的单菌落冷冻菌编号对应的另外2只单菌落冷冻菌试管，制备生产用的冻干管菌种。
所述平板培养基的制备，包括全麦粉的加工方法，该方法是选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上。
所述平板培养基的制备，培养基的配方更优化的方案是全麦粉4％、酵母浸膏粉0.2％、磷酸二氢钾0.2％、琼脂2％、余量为水。
所述的平板培养基的制备，平板培养基的灭菌方法是在0.1MPa、120～122℃的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温。
所述的单菌落的培养更进一步的方案是在恒温室或生化培养箱内进行，培养1天后将培养皿翻转培养，培养温度36.5℃、相对湿度42～48％、培养周期5天。
所述的单菌落孢子悬液的制备更进一步的方案是，单菌落孢子悬液的制备过程是用接种环挑下选择的单个主型菌落，放入预先加有灭菌玻璃珠的规格为18×180mm的试管中，振荡打下孢子，再加2ml 10％的甘油保护剂，摇动制成单菌落孢子悬液；用0.5ml灭菌移液管将悬液分别吸入4只规格为12×120mm的试管中，平均每只约装0.5ml。
本发明的优点在于：本发明是通过优化土霉素菌种的单菌落培养基，发明了全新的培养基配方，使单菌落平均直径从Φ3.2mm增大到Φ6.3mm、分生孢子数量增加，为实现单菌落冷冻菌的制备提供了基本条件。
本发明单菌落孢子悬液分装于四只试管中，置于超低温冰箱中成为单菌落冷冻菌。其中两只试管的单菌落冷冻菌分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，另外两只试管的单菌落冷冻菌直接用于生产用冻干管菌种的制备，它减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，提高了土霉素的发酵单位；防止菌种的生产能力在菌种保藏过程中发生退化，最大限度地保持了菌种的优良高产性状；减少和减慢了菌种分生孢子在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证了对车间的菌种供应及土霉素发酵生产的稳定；减少了菌种制备过程中的许多无菌操作环节，从而大大降低了菌种的染菌率。
本发明把菌种的超低温保藏和冷冻干燥保藏两项新技术应用到土霉素的菌种选育及制备工艺中，增加了菌种的选育、制备和保藏效果，最终达到提高工作效率和增产降耗的目的。
具体实施方式
实施例1：一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，包括以下步骤：
a.平板培养基的制备：
(1)选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上制备成全麦粉；
(2)按照全麦粉4％、酵母浸膏粉0.2％、磷酸二氢钾0.2％、琼脂2％、余量为水的比例配制平板培养基；
(3)将上面配制好的培养基一边摇匀一边分装于规格为500ml三角瓶内，每瓶培养基装量200ml；在0.1MPa、121℃的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温；
(4)将灭菌的平板分离培养基趁热摇匀，待冷却至60℃左右一边摇一边分别倒入规格为Φ90mm灭菌培养皿中，每只培养皿大约倒25ml培养基；倒好的培养皿放平加盖，待培养基冷却凝固后备用。
b.单孢子悬液的制备：
取预先选定菌号的冻干管1只做出发菌种，接种茄瓶斜面3-5只，按照要求培养成斜面孢子，保藏备用；
选取外观质量合格的出发斜面孢子1支，用灭菌移液管加入20ml无菌水，再用灭菌接种环将分生孢子轻轻刮下，摇动制成孢子悬液。用灭菌移液管吸出孢子悬液加入装有灭菌玻璃珠的三角烧瓶中摇动3-5分钟，倒入灭菌漏斗加脱脂棉或滤纸过滤制成单孢子悬液。
c.单菌落的培养：
用灭菌移液管吸取单孢子悬液，按10倍的浓度梯度稀释至10-7、10-8、10-9。分别吸取以上三个浓度的悬液加在平板培养基上，每个平板加0.1～0.3ml，然后用灭菌接种耙涂布均匀，接种好的平板加盖，正面向上集中用牛皮纸包扎。
将牛皮纸包扎好的平板正面向上水平放置在恒温培养室或生化培养箱内，温度36.5℃、相对湿度40～50％，1天后将培养皿翻转培养，培养周期5天。
d.单菌落孢子悬液的制备：
取12×120mm的试管，放入1％的盐酸溶液中浸泡12小时，用自来水清洗干净，再用去离子水冲洗至中性，烘干，用脱脂棉做棉塞，包扎、灭菌备用。
取培养好的平板单菌落，选择菌落直径较大、白色、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有灭菌玻璃珠的规格为18×180mm的试管中，振荡打下孢子，再加2ml 10％的甘油保护剂，摇动制成单菌落孢子悬液。用0.5ml灭菌移液管将悬液分别吸入4只12×120mm的试管中，平均每只约装0.5ml，塞上棉塞包好封口膜并编号。
e.单菌落冷冻菌的超低温冻存：
将装好单菌落孢子悬液的试管按照编号顺序摆放在铝制的试管架上，浸入-70℃丙酮中预冻，再迅速放入-70℃的超低温冰箱保藏。
f.摇瓶初筛和摇瓶复筛：
取步骤e中单菌落冷冻菌中的其中2只试管，采用与生产相近的培养基和培养条件，进行单菌落冷冻菌的摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落冷冻菌。
g.生产用冻干管菌种的制备：
根据步骤f摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与生产能力强的单菌落冷冻菌编号对应的另外2只单菌落冷冻菌试管制备供生产使用的冻干管菌种。
Claims (6)
1.一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，包括以下步骤：
a.平板培养基的制备：首先选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上制备成全麦粉，再按照全麦粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.3％、琼脂1.5～2.5％、余量为水的比例配制平板培养基，将平板培养基经过灭菌倒入灭菌后的培养皿中；
b.单孢子悬液的制备：取预先选定的出发菌种，接种3～5只茄瓶斜面，培养出发斜面孢子，然后选取外观质量合格的出发斜面孢子制成单孢子悬液；
c.单菌落的培养：将单孢子悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-7、10-8、10-9；将以上三个浓度的单孢子悬液分别接种到不同培养皿的平板培养基上，在温度为36～37℃、相对湿度为40～50％的条件下培养；
d.单菌落孢子悬液的制备：选择菌落直径较大、白色、孢子丰满、边缘整齐的主型单个菌落，制成单菌落孢子悬液，分装在4只试管中，塞上棉塞、包好封口膜并编号；
e.单菌落冷冻菌的冻存：将装好单菌落孢子悬液的试管按照编号顺序摆放在铝制的试管架上，浸入-70℃丙酮中预冻，再迅速放入-70℃的超低温冰箱保藏；
f.摇瓶初筛和摇瓶复筛：取步骤e中单菌落冷冻菌中的其中2只试管，采用与生产相近的培养基和培养条件，进行单菌落冷冻菌的摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落冷冻菌；
g.单菌落冷冻菌的制备：根据步骤f摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与生产能力强的单菌落冷冻菌编号对应的另外2只单菌落冷冻菌试管，制备生产用冻干管菌种。
2.按照权利要求1所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，包括全麦粉的加工方法，该方法是选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上。
3.按照权利要求2所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，平板培养基的配方是全麦粉4％、酵母浸膏粉0.2％、磷酸二氢钾0.2％、琼脂2％、余量为水。
4.按照权利要求3所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，还包括平板培养基的灭菌方法，该方法是在0.1MPa、120～122℃的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温。
5.按照权利要求1、2、3或4所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述的单菌落的培养是在恒温室或生化培养箱内进行，培养1天后将培养皿翻转培养，培养温度36.5℃、相对湿度42～48％、培养周期5天。
6.按照权利要求1、2、3或4所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述的单菌落孢子悬液的制备过程是用接种环挑下选择的主型单个菌落，放入预先加有灭菌玻璃珠的规格为18×180mm的试管中，振荡打下孢子，再加2ml的10％甘油保护剂，摇动制成单菌落孢子悬液，用0.5ml灭菌移液管将悬液分别吸入4只规格为12×120mm的试管中，平均每只约装0.5ml。
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