CN102329832A - 细菌纤维素培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细菌纤维素的培养基及其制备方法,细菌纤维素的培养基为甘油培养液，由醋酸缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为8g/L-24g/L，所述甘油培养液的pH值为5.0-7.5；或按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油8-24份，K2HPO41-9份，酵母膏4-20g，余量为醋酸缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为5.0-7.5；本发明首次将甘油作为培养基原料，该培养基成本低廉，用于培养细菌纤维素收率高，且可缩短培养时间；另外，本发明为细菌纤维素稳定的大规模细菌纤维素培养提供了重要条件；将培养基结合特有的动、静结合培养，可明显提高细菌纤维素收率，缩短细菌纤维素培养时间。

Description

细菌纤维素培养基及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及细菌纤维素的培养基及其制备方法。
背景技术
细菌纤维素是除植物纤维素之外的另一类纤维素，为细菌合成的天然惰性材料，细菌纤维素( bacterial cellulose ,BC) 具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性,是世界上公认的性能优异的新型生物学材料。目前对BC 应用主要集中在高附加值的生物医用材料上, 如组织工程支架、人造血管及人造皮肤等方面。能够产生以细菌纤维素的细菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中产量最高的为木醋杆菌，Acetobacter xylinus，属革兰氏阴性(少数可变)；严格好氧，呼吸代谢从不发酵；传统观点认为：乙醇、甘油和乳酸是最好的碳源。虽然木醋杆菌产量较高，但仍不能解决细菌纤维素生产成本居高不下的问题。《巴氏醋杆菌合成细菌纤维素的研究》一文中公开了以甘油的培养基培养细菌纤维素的方法，通过正交试验筛选出：以7%的巴氏醋杆菌接种量在31℃条件下培养，主要碳源为质量分数为3%的甘油，其细菌纤维素的最高产量为2.326g。但是，该方法中采用了价格较高的牛肉膏和蛋白胨作为培养基的主要成分，且仅进行10mL体系的小规模培养。众所周知，在微生物工程领域中，从小规模的实验筛选到中试规模以上的产业化生产，每个环节的条件都必须得到优化，其中，也包括培养基的优化，如未经优化，将小试实验条件机械地扩大于规模化生产通常是无法实施的。另外，该文章中，甘油仅作为复合培养基中的碳源使用。而传统观点认为，细菌纤维素的培养需要碳源、氮源、无机盐及生产因子等复合调配才能实现。另外，培养基还得满足产物最经济的合成的基本要求。此外，细菌纤维素的技术障碍主要在于发酵水平较低，产量低、成本高、价格不抵普通植物纤维素；二是进一步研究和利用细菌纤维素的成膜和成型的工艺技术还没有解决。如何提高纤维素产量，降低成本，寻找更廉价更好的细菌纤维素生产原料从而进一步提高其产量，仍将是细菌纤维素研究的基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供两种细菌纤维素培养基，该培养基成本低廉，来源广泛，用于细菌纤维素的培养其产率高。
     为实现上述目的，本发明的技术方案为：
甘油培养液，所述甘油培养液为缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为8g/L-24g/L，所述甘油培养液的pH值为5.0-7.5。
进一步，所述甘油培养液为缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为12g/L，所述甘油培养液的pH值为7.0。
进一步，所述缓冲液为醋酸缓冲液。
含有所述的甘油培养液的细菌纤维素培养基，按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油8-24份，K2HPO4 1-9份，酵母膏4-20g，余量为缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为5.0-7.5。
进一步，按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油124份，K2HPO4 5份，酵母膏13g，余量为缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为7.0。
本发明的目的之二在于提供细菌纤维素的培养方法，该方法操作简单，周期短，适用于中式以上规模的生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
细菌纤维素的制备方法，具体为：将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得木醋杆菌菌种按2-20%接种量接种于培养基中，在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2-5天，得细菌纤维素，所述培养基为所述甘油培养液或所述含有甘油培养液的细菌纤维素培养基，所述培养温度为26-31℃，培养时通气量为0.3-0.6vvm。
进一步，将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养基为所述甘油培养液或所述含有甘油培养液的细菌纤维素培养基，所述培养温度为30℃。
 
本发明的有益效果在于：本发明首次将甘油作为核心培养基原料，用浓度为8g/L-24g/L的甘油用于培养细菌纤维素培养基，该培养基成本低廉，用于培养细菌纤维素收率高，且可缩短培养时间。另外，本发明为细菌纤维素稳定的大规模细菌纤维素培养提供了重要条件。将培养基结合特有的动、静结合培养，可明显提高细菌纤维素收率，缩短细菌纤维素培养时间。
具体实施方式
  下述实施例中的木醋杆菌（gluconacetobacter xylium），购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为1.2378。
下述细菌纤维素冷冻干燥过程：是将细菌纤维素平铺于冷冻干燥盘中，进行从-30℃---25℃逐级控温冷冻真空干燥，直至细菌纤维素完全干燥。冷冻干燥法利用深低温冷冻方法使细菌纤维素湿膜内的水变为固态,然后在真空冷冻干燥机内，利用控制其真空度的方法,使膜内固态的水升华。并用冷凝方法捕获并冷凝升华的水汽，致使物质脱水干燥。真空冷冻干燥过程在极低的温度和高真空的条件下进行，对材料的热变性小，在最大限度上保持了材料的生物学活性。同时，在升华的过程中，不会破坏它的物理结构，化学结构的变化也很小，因此可以很好地保存细菌纤维素膜的三维网状结构。
实施例1 甘油培养液及含有所述甘油培养液的细菌纤维素培养基
配方一：甘油培养液，所述甘油培养液为醋酸缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为8g/L，所述甘油培养液的pH值为5.0。
配方二：甘油培养液，其特征在于：所述甘油培养液为醋酸缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为24g/L，所述甘油培养液的pH值为7.5。
配方三：所述甘油培养液为醋酸缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为12g/L，所述甘油培养液的pH值为7.0。
配方四：按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油8份，K2HPO4 1份，酵母膏4g，余量为含有醋酸缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为5.0。
对比配方四：同配方四的唯一区别在于将甘油以等重的葡萄糖替代。
配方五：按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油24份，K2HPO4 9份，酵母膏20g，余量为含有醋酸缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为7.5。
对比配方五：同配方五的唯一区别在于将甘油以等重的D-果糖替代。
配方六：按重量份计每1000份由以下组分组成：甘油12份，K2HPO4 5份，酵母膏13g，余量为含有醋酸缓冲液，所述细菌纤维素培养基的pH值为7.0。
对比配方六：同配方六的唯一区别在于将甘油以等重的可溶性淀粉替代。
 
实施例2制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在180rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按2%接种量接种于培养基中，在静态条件下培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为31℃，培养时通气量为0.3vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表1 细菌纤维素膜的产率
配方 重量1(g/L) 重量2(g/L)
配方一 21.09 2.22
配方二 23.37 2.46
配方三 21.16 2.3
配方四 24.96 2.63
对比配方四 7.79 0.82
配方五 26.79 2.82
对比配方五 8.55 0.9
配方六 28.215 2.97
对比配方六 2.85 0.30
实施例3 二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中，在100rpm条件下摇床培养2天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在100rpm条件下摇床培养2天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2天，得细菌纤维素，所述培养温度为26℃，培养时通气量为0.6vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
本发明中的接种量是指种子液占含有种子液培养基的体积比，其中种子液中含有木醋杆菌106cuf/mL。
 
表2 细菌纤维素膜的产率
配方 重量1(g/L) 重量2(g/L)
配方一 28.25 2.97
配方二 30.21 3.18
配方三 30.59 3.22
配方四 32.59 3.43
对比配方四 8.47 0.92
配方五 37.43 3.94
对比配方五 7.50 0.79
配方六 36.67 3.86
对比配方六 0.94 0.32
实施例4 二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在180rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按15%接种量接种于培养基中，在180rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为31℃，培养时通气量为0.3vvm。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
表3 细菌纤维素膜的产率
配方 重量1(g/L) 重量2(g/L)
配方一 25.65 2.70
配方二 27.64 2.91
配方三 29.45 3.10
配方四 31.54 3.23
对比配方四 1.45 1.1
配方五 36.86 3.88
对比配方五 11.4 1.2
配方六 37.24 3.92
对比配方六 15.2 0.28
实施例5二步法制备细菌纤维素
将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按20%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养温度为30℃。将所得细菌纤维素放入90°C去离子水中杀菌2 小时，取出后用去离子水清洗2次；用沸腾的0.5 mol/L的NaOH溶液煮15 min；放入质量分数为1%的NaOH溶液中静置2天；放置在去离子水中浸泡至中性，进行称重，称重结果详见表1中对应的“重量1”对应栏。另外将所得细菌纤维素进行冷冻干燥，对冷冻干燥的细菌纤维素进行称重，结果详见表3中对应的“重量2”对应栏。
 
表4 细菌纤维素的产率
配方 重量1(g/L) 重量2(g/L)
配方一 21.78 2.42
配方二 28.1 2.96
配方三 25.85 2.78
配方四 30.49 3.21
对比配方四 9.4 0.99
配方五 35.91 3.78
对比配方五         6.93 0.73
配方六 36.43 3.96
对比配方六 10.2 1.1
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

Claims (7)

1.甘油培养液，其特征在于：所述甘油培养液为缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为8g/L-24g/L，所述甘油培养液的pH值为5.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的甘油培养液，其特征在于：所述甘油培养液为缓冲液和甘油组成，所述甘油培养液中甘油的浓度为12g/L，所述甘油培养液的pH值为7.0。
3.根据权利要求1所述的甘油培养液，其特征在于:所述缓冲液为醋酸缓冲液。
4.含有权利要求1-3任一项所述的甘油培养液的细菌纤维素培养基，其特征在于：所述细菌纤维苏培养基由以下组分组成：甘油培养液，K2HPO4，酵母膏，所述甘油培养液中甘油与K2HPO4和酵母膏的质量比为8-24:1-9:4-20；所述细菌纤维素培养基的pH值为5.0-7.5。
5.根据权利要求4所述的细菌纤维素培养基，其特征在于：所述甘油培养液中甘油与K2HPO4和酵母膏的质量比为15:3:8；所述细菌纤维素培养基的pH值为6.0。
6.细菌纤维素的制备方法，其特征在于，具体为：将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得木醋杆菌菌种按2-20%接种量接种于培养基中，在100-180rpm条件下摇床培养2-3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养2-5天，得细菌纤维素，所述培养基为所述甘油培养液或所述含有甘油培养液的细菌纤维素培养基，所述培养温度为26-31℃，培养时通气量为0.3-0.6vvm。
7.根据权利要求6所述的细菌纤维素的制备方法，其特征在于，将木醋杆菌菌种接种于培养基中， 在150rpm条件下摇床培养3天，所得木醋杆菌菌种按7%接种量接种于培养基中，在150rpm条件下摇床培养3天，所得发酵液转移至浅盘中静态培养5天，得细菌纤维素，所述培养基为所述甘油培养液或所述含有甘油培养液的细菌纤维素培养基，所述培养温度为30℃。
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