CN105671115B - 一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法。所述方法是将木醋杆菌(Acetobacter xylinum NUST4.2)与衣藻(Chlamydomonas)分别进行种子扩增培养，利用微流控技术将衣藻细胞固定于海藻酸钙中，随后进行共培养；培养完毕，除去木醋杆菌细胞和衣藻，获得纯净的细菌纤维素。本发明中利用的衣藻是一种产氧的微生物，在发酵后期，为细菌产纤维素生产提供氧气，能解决粘度带来的溶氧问题。除此，木醋杆菌在在发酵过程中会分泌乙酸，衣藻是以乙酸为碳源的微生物，能消耗发酵液中的乙酸，使环境pH维持在适宜的水平。本发明方案为解决发酵后期粘度过高造成的溶氧问题及维持发酵过程中pH稳定提供了可行的解决方法，提供了一种产细菌纤维素的微生物共培养体系的方法。

Description

一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明是通过构建木醋杆菌Acetobacter xylinum NUST4.2(简称Ax.4.2)和衣藻(Chlamydomonas)共培养体系，提高细菌纤维素的产率，并实现对纤维素微纳米尺度组装过程进行精密调控，具体涉及微生物共培养体系的构建。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是由木醋杆菌(Acetobacter xylinum)生物合成的一种新型高性能微生物合成材料，与其他形式形成的纤维素相比，尽管具有相同的化学成分，但其还具有特殊的物理化学和生物学特性，特别是发酵过程的可调控发酵底物的多样性、微生物的多样性等。
作为一种新兴的生物功能材料，细菌纤维素的生产虽然已实现工业化。但迄今为止，在细菌纤维素的工业化生产过程中依然存在很多问题亟待解决，这些问题的存在也严重阻碍了细菌纤维素作为优良生物材料的广泛使用。其中，最严峻的工艺难题是在发酵后期，细胞会向环境中分泌一种水溶性多糖，acetan。这种物质会使发酵液粘度增加。Acetobacter xylinum是一种严格的好氧菌，常用于细菌纤维素的制备，在制备过程发酵液中acetan的累积，不仅影响了细胞对氧气的摄取，使胞内代谢反应减缓，同时作为主要的副产物，消耗了底物，使目标产物的产率下降，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供了一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法。该方法通过利用木醋杆菌在发酵过程中会分泌乙酸，衣藻是以乙酸为碳源的微生物，能消耗发酵液中的乙酸，使环境pH维持在适宜的水平，两种微生物共培养能实现互利共生，解决了发酵后期粘度过高造成的溶氧问题，同时能维持发酵过程中pH稳定，提高了细菌纤维素的产率，产率从3.67g/L提高到5.21g/L。
实现本发明目的的技术解决方案为：
第一步：木醋杆菌与衣藻分别进行种子培养；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，通过控制微流控技术，利用海藻酸钙固定衣藻，最终制备成线状凝胶；
第三步：木醋杆菌接种至发酵培养基中后，加入第二步中制备的衣藻，进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束，除去木醋杆菌细胞和衣藻，获得纯净的细菌纤维素。
本发明与现有技术相比其显著优点是：
1、衣藻作为一种产氧的微生物，与木醋杆菌共同培养，在发酵后期，为细菌产纤维素提供氧气，能解决粘度带来的溶氧问题；
2、木醋杆菌在发酵过程中会分泌乙酸，衣藻是以乙酸为碳源的微生物，能消耗发酵液中的乙酸，使环境pH维持在适宜的水平，有利于细菌纤维素的产生积累，两种微生物共培养能实现互利共生
3、本发明涉及构建微生物共培养体系产细菌纤维的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产，能极大地降低用于提高溶解氧含量而带来的动力消耗，并优化了木醋杆菌的生长条件，有利于缩短其生产周期。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是本发明木醋杆菌Acetobacter xylinum NUST4.2-衣藻Chlamydomonas共培养体系构建的流程图。
图2是对比例中木醋杆菌单独发酵过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。
图3是实施例3中木醋杆菌-衣藻共培养过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。
具体实施方式
结合附图，构建木醋杆菌-衣藻共培养体系的方法，步骤如下：
第一步：木醋杆菌与衣藻分别在不同的生长条件下进行种子培养，其中木醋杆菌种子培养条件为：温度25-32℃，摇床转速90-250rpm，培养时间6-72h；衣藻种子培养条件：温度20-25℃，摇床转速80-270rpm，光照培养箱中培养6-48h；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，加入0.3-1.0％(w/v)的海藻酸钠溶胶中，通过控制微流控技术，利用注射泵注射至浓度为0.3-1.0％(w/v)氯化钙溶液中进行固定化，衣藻固定于线状凝胶中；
第三步：木醋杆菌以2-20％接种量接种至发酵培养基中后，加入第二步中制备的衣藻，在光照条件下进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束，获得的产物放入0.8-1.2mol/L pH7左右的磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去海藻酸钙，随后用含质量分数1-10‰(w/v)NaOH、1-10‰(v/v)H2O2的溶液在70-100℃条件下处理0.5-3.0小时，去离子水洗涤至pH中性，即可获得纯净的细菌纤维素。
为了更好地理解本发明，下面通过具体的实施例来具体说明本发明的技术方案。
实施例1：
本发明为一种通过构建微生物共培养体系提高细菌纤维素产量的方法：
第一步：将两种微生物各自在种子液中进行扩大培养。木醋杆菌放在30℃160rpm摇床培养36h，衣藻放在22℃160rpm光照培养箱中培养36h用于制备各微生物种子液；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，加入10mL0.8％(w/v)的海藻酸钠溶胶中，均匀混合后，用注射泵控制流速为200mL/h注射至浓度为1％(w/v)氯化钙溶液中进行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器针头容量10mL，内径为0.4mm，衣藻固定于线状凝胶中；
第三步：木醋杆菌以8％接种量接种至发酵培养基中后，摇瓶动态发酵培养24h后加入第二步的固定化衣藻，进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束后，将获得的产物放入0.1mol/L pH＝7.8磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去固定化衣藻凝胶，然后用质量分数3‰(w/v)的NaOH和3‰(v/v)的H2O2在85℃条件下处理1小时，获得的纤维素用去离子水洗涤至pH中性为止。
实施例2：
本发明为一种通过构建微生物共培养体系提高细菌纤维素产量的方法：
第一步：将两种微生物各自在种子液中进行扩大培养。木醋杆菌放在29℃150rpm摇床培养36h，衣藻放在23℃160rpm光照培养箱中培养36h用于制备各微生物种子液；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，加入10mL1.0％(w/v)的海藻酸钠溶胶中，均匀混合后，用注射泵控制流速为200mL/h注射至浓度为0.8％(w/v)氯化钙溶液中进行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器针头容量10mL，内径为0.4mm，衣藻固定于线状凝胶中；
第三步：木醋杆菌以4％接种量接种至发酵培养基中后，摇瓶动态发酵培养24h后加入第二步的固定化衣藻，进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束后，将获得的产物放入0.1mol/L pH＝7.8磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去固定化衣藻凝胶，然后用质量分数3‰(w/v)的NaOH和3‰(v/v)的H2O2在100℃条件下处理0.5小时，获得的纤维素用去离子水洗涤至pH中性为止。
实施例3：
本发明为一种通过构建微生物共培养体系提高细菌纤维素产量的方法：
第一步：将两种微生物各自在种子液中进行扩大培养。木醋杆菌放在29℃ 160rpm摇床培养36h，衣藻放在22℃160rpm光照培养箱中培养36h用于制备各微生物种子液；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，加入10mL0.8％(w/v)的海藻酸钠溶胶中，均匀混合后，用注射泵控制流速为200mL/h注射至浓度为1.0％(w/v)氯化钙溶液中进行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器针头容量10mL，内径为0.4mm，衣藻固定于线状凝胶中；
第三步：木醋杆菌以10％接种量接种至发酵培养基中后，摇瓶动态发酵培养36h后加入第二步的固定化衣藻，进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束后，将获得的产物放入0.1mol/L pH＝8.0磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去固定化衣藻凝胶，然后用质量分数3‰(w/v)的NaOH和3‰(v/v)的H2O2在90℃条件下处理0.7小时，获得的纤维素用去离子水洗涤至pH中性为止。
对比例：
木醋杆菌单独培养生产细菌纤维素的方法：
第一步：木醋杆菌种子液扩增培养。木醋杆菌放在29℃160rpm摇床培养36h，获得木醋杆菌种子液；
第二步：木醋杆菌以10％接种量接种至发酵培养基中后，摇瓶动态发酵培养4天；
第三步：发酵结束后，将获得的产物质量分数3‰(w/v)的NaOH和3‰(v/v)的H2O2在90℃条件下处理0.7小时，获得的纤维素用去离子水洗涤至pH中性为止。
图2是对比例中木醋杆菌单独发酵过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。图3是实施例3中木醋杆菌-衣藻共培养过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。对比发现，木醋杆菌单独发酵培养，经24h，pH开始大幅下降，至48h，pH降至最低3.38。木醋杆菌单独培养至24h时，发酵液中溶解氧(DO)降至4％，直至发酵末期，DO值才稍有回升。在木醋杆菌-衣藻共培养体系中，pH一直维持在4.40以上，DO值也维持在35％以上，说明该体系能较好地维持发酵pH，衣藻能为发酵过程提供氧气。对于BC的生产，木醋杆菌单独发酵培养96h，BC产量为3.67g/L。在共培养体系条件下，经96h发酵，BC产量达5.21g/L。
综上所述，通过构建微生物共培养体系生产细菌纤维素的方法，实现两种微生物互利共生，能有效解决BC发酵后期粘度过高造成的溶氧问题，同时维持发酵过程中pH相对稳定，细菌纤维素的产量也获得大幅提升。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：采用木醋杆菌与衣藻两种微生物共培养的方法，构建共培养体系，步骤如下：
第一步：木醋杆菌与衣藻分别进行种子培养；
第二步：将衣藻种子液经离心浓缩后，获得衣藻细胞，衣藻种子液浓缩液加入浓度0.3-1.0 % (w/v)的海藻酸钠溶胶中，再注射至浓度为0.3-1.0 % (w/v)氯化钙溶液中进行固定化，经微流控技术固定于海藻酸钙中，最终制备成线状凝胶；
第三步：木醋杆菌接种至发酵培养基中后，加入第二步中制备的衣藻凝胶，进行发酵动态培养；
第四步：发酵结束，除去木醋杆菌细胞和衣藻，获得纯净的细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第一步木醋杆菌与衣藻用各自的种子液在不同培养条件下进行种子扩增培养。
3.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第一步木醋杆菌培养条件：温度25-32℃，摇床转速90-250 rpm，培养时间6-72 h。
4.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第一步衣藻培养条件：温度20-25℃，摇床转速80-270 rpm，光照培养箱中培养6-48 h。
5.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第二步用注射泵控制流速为200mL/h。
6.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第三步木醋杆菌接种量为2-20%。
7.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第四步除去固定化衣藻凝胶的方法：将获得的产物放入0.5-1.2 mol/L pH 7的磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液。
8.根据权利要求1所述的微生物共培养体系产细菌纤维素的方法，其特征在于：第四步除去木醋杆菌细胞的方法：用1-10 ‰ (w/v)的NaOH和1-10‰(v/v)的H2O2在70-100℃条件下处理0.5-3.0小时，去离子水洗涤至pH中性为止。
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