CN110835619A - 一株巴氏醋杆菌突变菌株及其诱变和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株巴氏醋杆菌突变菌株及其诱变和筛选方法，涉及微生物技术领域。巴氏醋杆菌突变菌株，其命名为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)MNYB‑4，保藏编号为CGMCC No.18687。其诱变方法为采用地面模拟空间环境的诱变方式，再进行筛选；其筛选方法为利用含有醋酸代谢终产物的培养基进行筛选。该突变菌株比出发菌株醋酸纤维素膜的产量提高了8％以上，最高可达15％。诱变及筛选方法效率高。

Description

一株巴氏醋杆菌突变菌株及其诱变和筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是一株诱变后能生产更多醋酸纤维素膜的巴氏醋杆菌突变菌株及其诱变和筛选方法。
背景技术
醋酸杆菌属的重要特征是能将乙醇氧化成醋酸，并可将醋酸和乳酸氧化成CO2和H2O。巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)还能够合成纤维素，其纤维素组成细胞壁外的基质，而细菌则埋置于纤维索微丝缠结的片层中。当这些种的细菌生长在静止的液体培养基中，它们就会在表面形成一层纤维素薄膜。用醋酸菌合成的纤维素纯净度高，且与天然纤维素的结构非常接近，都是由葡萄糖β-1,4-糖苷键连接而成的高分子化合物，所产生的纤维素呈独立的丝状纤维形态，不同于一般的植物纤维。巴氏醋杆菌的纤维素膜呈凝胶膜状，长期食用可优化消化系统，是康普茶最重要的功能性成分之一。
巴氏醋杆菌发酵生产纤维素膜，一般由两方面的特性决定：一是菌株的生长能力；二是菌株产纤维素膜的能力。由于微生物变异快，因此微生物发酵工程一直受到生物工程学科的重视。微生物的诱变方法一直受到广大科研人员的重视，是微生物发酵工程领域的重点研究方向之一。诱变方法一直是一个只有更好，没有最好的研究课题；同时高效的诱变方法以及从众多的突变菌株中筛选出需要的目的菌株，一直是微生物诱变工作的难点。
二十多年的科研实践证明，空间诱变是一种良好的获得农作物新品种以及微生物新菌株的高科技手段。但空间诱变代价较高，次数有限，必须依靠国家发射返回式飞行器才可以实施，不宜作为普通科研手段进行操作。目前我国可以模拟除微重力外所有空间环境条件，用地面模拟空间诱变手段进行菌株改良不失为一个新型、有效的菌株改良手段。
模拟空间诱变技术作为巴氏醋杆菌新的诱变手段具有诱变有益突变率高等显著特点，筛选模式简便，不失为获得高效菌株的新手段之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株能生产更多醋酸纤维素膜的巴氏醋杆菌突变菌株，其命名为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)MNYB-4，其产生醋酸纤维素膜的能力比出发菌株的能力增强了8％以上，最高可达15％。相应地还提供了上述突变菌株的诱变方法和筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一株巴氏醋杆菌突变菌株，其命名为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)MNYB-4，保藏编号为CGMCC No.18687。
上述菌株在细菌培养基中，形态特征为：菌体椭圆，Gˉ，单个，成对或成短链，运动，无芽胞，严格好氧。接触酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，产醋酸性能较强，发酵法产醋酸平均含量可达5.0g/100ml。
该菌种已于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18687，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
一种上述巴氏醋杆菌突变菌株的诱变方法：是采用地面模拟空间诱变的方法。
地面模拟空间诱变的方法按如下步骤进行：
(1)菌株准备：将出发菌株巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)SBL-CSGJ-10(实验室编号)接种在含有固体培养基的平板上进行培养，当菌株长满整个平板后待用；
(2)地面模拟空间诱变试验：对平板上的菌株进行以下一组或几组诱变试验：
模拟飞行器飞行时的振动试验：将长满菌株的平板固定在双振动台上，在0-400kN下振动1h，其中前0.5小时为低频正弦振动试验，后0.5小时为随机振动试验；
真空低能粒子辐照试验：将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中，在10-3-10-6Pa真空度下辐照30-180分钟后回收，辐射剂量为1×1014eV-4×1014eV；
重力加速度试验：选取4g的重力加速度，进行超重试验30min；
(3)培养：在无菌条件下取地面模拟空间诱变样品进行培养，选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步筛选试验。
优选的，步骤(1)中，含有固体培养基的平板的制作方法如下：1)培养基：葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂1.5-2.0％，调节pH至5.0；2)在120℃下灭菌20min；3)每个平皿倒培养基20-30ml，33-37℃培养24小时无菌可以使用；4)将出发菌株接种后，在25-35℃恒温培养，1-10天筛选出生长速度更快的菌株待用。
优选的，步骤(3)培养中，包括如下步骤：在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的模拟空间诱变样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10-4和10-5稀释液涂布到含有固体培养基的平板上，每块平板上涂50-250微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中25-35℃倒置培养2-7天。选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步筛选试验。
一种上述巴氏醋杆菌突变菌株的筛选方法，按如下步骤进行：
(1)在固体培养基中加入代谢终产物，组成筛选培养基；
(2)将筛选培养基灭菌并倒在平板中，冷凝后制得筛选平板；
(3)将经地面模拟空间诱变过的菌株均匀涂布、划线或点种在筛选平板上；
(4)将接种好的平板于霉菌培养箱中，25-35℃恒温培养3-5天，依照生长速度、菌落大小筛选生长较快、菌落形态变化较大的菌株作为备选菌株，进入发酵流程，最终依靠静置培养4-10天后，产生纤维素膜的情况确定高产菌株。
优选的，步骤(1)中，固体培养基为：葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂1.5％-2.0％，调节pH至5.0。
优选的，步骤(1)中，代谢终产物为无水乙醇、乙酸、丁酸和己酸其中的一种或几种的混合物。
优选地，步骤(4)中，发酵流程按如下步骤进行：
1)种子液体培养基为：葡萄糖10-20g，鱼蛋白胨2.5-5g，酵母浸粉2.5-5g，磷酸氢二钠1.0-2.7g，一水合柠檬酸0.5-1.15g，自来水配制1L，调节pH至4.5-5.5；
2)醋酸纤维素膜生长培养基为：蔗糖:绿茶水＝40g-50g:1000ml；硫酸铵0.05-0.15％，磷酸氢二钠0.1％；其中，绿茶水提取方法为：将4g-10g绿茶叶用纱布包裹，扎紧，用1000ml纯化水120-125℃灭菌20-25min，制得绿茶水；
3)种子液制备：
a取诱变前、诱变后单菌落，接种于上述种子液体培养基中；
b每瓶接种1环菌种；
c诱变前、诱变后的菌株各做3-5组平行；
d空白培养基预留3-5瓶；
4)种子液摇床培养：
30-35℃、160-200r/min培养36-48h；空白培养基与菌液同时培养；
5)醋酸纤维素膜静置培养：
将种子液加入装有10L上述醋酸纤维素膜生长培养基的培养瓶中，接种量为液体的1.5-2.5％，接种完成后搅拌均匀，恒温培养箱中30-35℃静置培养，4-10天后收集醋酸纤维素膜称重。
出发菌株巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)SBL-CSGJ-10(实验室编号)为发明人自然采集所得，初始菌株经培养与野生菌株相比，就有较高的产醋酸纤维素膜的能力，但仍然没有达到十分理想的状态。
本发明将出发菌株——巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)SBL-CSGJ-10在地面经过地面模拟空间诱变试验后，回收诱变材料，从回收样品中筛选得到十余株能产生更多醋酸纤维膜的菌株，从其中筛选出一株发酵水平最稳定的菌株——巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)MNYB-4进行了保藏，达到了本发明的目的。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
(1)本发明提供的巴氏醋杆菌突变菌株MNYB-4，其产生醋酸纤维素膜的能力比出发菌株的能力增强了8％以上，最高可达15％。
(2)本发明地面模拟空间诱变的方法作为巴氏醋杆菌新的诱变手段具有诱变有益突变率高等显著特点。
(3)本发明筛选方法基于微生物代谢途径中代谢产物反馈抑制原理，将高浓度代谢终产物加入到普通培养平板中，在这样平板中生长状况良好的菌株，通常都是生长更快速、代谢效率更高的菌株。因此只要挑出在这种平板上生长良好的单菌落，一般就是生产上需要的菌株，因此这是一种高效、简便的优良菌株平板筛选方法。
(4)本发明方法实现了高产菌株的单独培养平板筛选，和传统筛选方法比较，降低了工作量50％-100％，并大大降低了筛选的盲目性。
(5)本发明方法操作过程简单，所需试剂和材料均为实验室常见的普通试剂。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
(1)菌株准备
将出发菌株巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)SBL-CSGJ-10(实验室编号)接种在含有固体培养基的平板上进行培养，当菌株长满整个平板后待用；含有固体培养基的平板的制作方式如下：1)葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂2.0％，调节pH至5.0；2)在120℃下灭菌20min；3)每个平皿倒培养基20ml，35℃培养24小时无菌可以使用；4)将菌株接种后在30℃恒温培养，7天筛选出生长速度更快的菌株待用。
(2)地面模拟空间诱变试验：对平板上的菌株进行以下一组或几组诱变试验：
真空低能粒子诱变：将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中进行真空低能粒子辐照试验，在10-5Pa真空度下辐照120分钟后回收，辐射剂量为2.6×1014eV。
模拟飞行器飞行时的振动试验：将培养好的巴氏醋杆菌平板(Φ9cm)固定在400kN双振动台上，试验1h，开始0.5小时为低频正弦振动试验，后0.5小时为随机振动试验。本试验模拟飞行器发射和返回时所受振动的情况。
重力加速度试验：选取4g的重力加速度，进行超重试验30min。
(3)培养
回收诱变材料。在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的模拟空间诱变样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10-4和10-5稀释液涂布到含有固体培养基的平板上(此平板的制作方式与步骤(1)菌株准备中的含有固体培养基的平板的制作方式相同)，每块平板上涂100微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中32℃倒置培养3天。选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步筛选试验。
(4)筛选
1)筛选平板的制作
a筛选平板由以下几种物质组成：葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂1.5％，调节pH至5.0，1ml“乙酸:己酸＝1:20”的混合液，混合浓度为10ml/L，自然pH；
b 120℃灭菌20min；
c取灭好菌的直径为90mm的培养皿，每个培养皿倒培养基30ml，32℃培养24小时，选取无菌平板进入下一个工作环节，污染平板灭菌销毁。
2)接种
挑选经地面模拟空间诱变后生长迅速的单菌落，划线法接种于预先制备好的筛选平板上。
3)培养
将接种好的平板于霉菌培养箱中，32℃恒温培养3天。
4)菌落挑选
将平板上生长速度快的单菌落挑出。
(5)发酵验证
1)种子液体培养基的配方
葡萄糖20g，鱼蛋白胨5g，酵母浸粉5g，磷酸氢二钠2.7g，一水合柠檬酸1.15g，自来水配制1L，调节pH至5.0。
2)醋酸纤维素膜生长培养基
蔗糖:绿茶水＝50g:1000ml；硫酸铵0.1％，磷酸氢二钠0.1％；
其中，绿茶水提取方法为：将4g绿茶叶用2层纱布包裹，扎紧，用1000ml纯化水121℃灭菌20min，除去绿茶纱布包，制得绿茶水。
3)种子液制备：
a取诱变前、诱变后单菌落平板，接种于上述种子液体培养基中；
b每瓶接种1环菌种；
c诱变前、诱变后的菌株各做3组平行；
d空白培养基预留3瓶。
4)种子液摇床培养：
32℃、160r/min培养40h；空白培养基与菌液同时培养。
5)醋酸纤维素膜静置培养：
将种子液加入装有10L上述醋酸纤维素膜生长培养基的培养瓶中，接种量为液体的2％，接种完成后搅拌均匀，恒温培养箱中32℃静置培养，7天后收集醋酸纤维素膜称重。
(6)检测
1)检测方法
将培养基表层形成的醋酸纤维素膜取出，用蒸馏水反复冲洗后用0.1mol/l的氢氧化钠溶液在80℃的条件下浸泡2h，以除去菌体蛋白和残余的培养基，然后再用纯化水和5.0％的乙酸反复冲洗，直至醋酸纤维素膜呈中性。80℃烘箱中烘至恒重，则得到醋酸纤维素膜的重量。
2)检测结果
Figure BDA0002300314630000061
Figure BDA0002300314630000071
(7)结论
经发酵结果验证，诱变菌株比原始菌株的醋酸纤维素膜增重了13.28％。

Claims (8)

1.一株巴氏醋杆菌突变菌株，其特征在于：其命名为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)MNYB-4，保藏编号为CGMCC No.18687。
2.一种如权利要求1所述的巴氏醋杆菌突变菌株的诱变方法，其特征在于：是采用地面模拟空间诱变的方法。
3.根据权利要求2所述的巴氏醋杆菌突变菌株的诱变方法，其特征在于，所述地面模拟空间诱变的方法按如下步骤进行：
(1)菌株准备：将出发菌株接种在含有固体培养基的平板上进行培养，当菌株长满整个平板后待用；
(2)地面模拟空间诱变试验：对平板上的菌株进行以下一组或几组诱变试验：
模拟飞行器飞行时的振动试验：将长满菌株的平板固定在双振动台上，在0-400kN下振动1h，其中前0.5小时为低频正弦振动试验，后0.5小时为随机振动试验；
真空低能粒子辐照试验：将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中，在10-3-10-6Pa真空度下辐照30-180分钟后回收，辐射剂量为1×1014eV-4×1014eV；
重力加速度试验：选取4g的重力加速度，进行超重试验30min；
(3)培养：在无菌条件下取地面模拟空间诱变样品进行培养，选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步筛选试验。
4.根据权利要求3所述的巴氏醋杆菌突变菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(1)中，含有固体培养基的平板的制作方法如下：1)培养基：葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂1.5-2.0％，调节pH至5.0；2)培养基在120℃下灭菌20min；3)每个平皿倒培养基20-30ml，33-37℃培养24小时无菌使用；4)将出发菌株接种后，在25-35℃恒温培养，1-10天筛选出生长速度更快的菌株待用。
5.一种如权利要求1所述的巴氏醋杆菌突变菌株的筛选方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)在固体培养基中加入代谢终产物，组成筛选培养基；
(2)将筛选培养基灭菌并倒在平板中，冷凝后制得筛选平板；
(3)将经地面模拟空间诱变过的菌株均匀涂布、划线或点种在筛选平板上；
(4)将接种好的平板于霉菌培养箱中，25-35℃恒温培养3-5天，依照生长速度、菌落大小筛选生长较快、菌落形态变化较大的单菌落作为备选菌株，进入发酵流程，最终依靠静置培养4-10天后，产生醋酸纤维素膜的情况确定高产菌株。
6.根据权利要求5所述的巴氏醋杆菌突变菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，固体培养基为：葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂1.5％-2.0％，调节pH至5.0。
7.根据权利要求5所述的巴氏醋杆菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中，代谢终产物为无水乙醇、乙酸、丁酸和己酸其中的一种或几种的混合物。
8.根据权利要求5所述的巴氏醋杆菌突变菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，发酵流程按如下步骤进行：
1)种子液体培养基为：葡萄糖10-20g，鱼蛋白胨2.5-5g，酵母浸粉2.5-5g，磷酸氢二钠1.0-2.7g，一水合柠檬酸0.5-1.15g，自来水配制1L，调节pH至4.5-5.5；
2)醋酸纤维素膜生长培养基为：蔗糖:绿茶水＝40g-50g:1000ml；硫酸铵0.05-0.15％，磷酸氢二钠0.1％；其中，绿茶水提取方法为：将4g-10g绿茶叶用纱布包裹，扎紧，用1000ml纯化水120-125℃灭菌20-25min，制得绿茶水；
3)种子液制备：
a取诱变前、诱变后单菌落，接种于上述种子液体培养基中；
b每瓶接种1环菌种；
c诱变前、诱变后的菌株各做3-5组平行；
d空白培养基预留3-5瓶；
4)种子液摇床培养：
30-35℃、160-200r/min培养36-48h；空白培养基与菌液同时培养；
5)醋酸纤维素膜静置培养：
将种子液加入装有10L上述醋酸纤维素膜生长培养基的培养瓶中，接种量为液体的1.5-2.5％，接种完成后搅拌均匀，恒温培养箱中30-35℃静置培养，4-10天后收集醋酸纤维素膜称重。
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