CN102172174B - 一种基于无性孢子的樟芝快速液态发酵工艺 - Google Patents
一种基于无性孢子的樟芝快速液态发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于无性孢子的樟芝快速液态发酵生产工艺。其特征在于：以樟芝(Antrodia camphorata)为出发菌株，在发酵罐中发酵并产生无性孢子；发酵完成后取出部分含有樟芝无性孢子的发酵液至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐继续发酵。该去料、补料再发酵循环可根据需要重复若干次。本发明所用快速发酵工艺可使樟芝发酵周期较分批发酵工艺至少能够缩短40％，具有提高生产强度、减少染菌几率、稳定樟芝发酵产品质量等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于无性孢子的樟芝(Antrodia camphorata)的快速液态发酵工艺。
背景技术
樟芝(Antrodia camphorata)，俗名牛樟芝、牛樟菇，是台湾特有的一种药用真菌(多孔菌科，非褶菌目)，具有高度的寄主专一性，只腐生于台湾特有的常绿阔叶乔木牛樟树的芯材内部。长期以来，樟芝被民间用于解酒保肝、治疗肝痛、食物中毒、腹痛、腹泻、炎症、皮肤瘙痒和肝癌等病症，具有良好疗效。现代药理研究证实樟芝子实体及发酵产物在保肝、抗氧化、治疗肝癌方面具有独特的功效。迄今为止，从樟芝的子实体和发酵产物中已经分离得到70多种化合物，包括多糖、二萜类、三萜类、甾体类、苯环衍生物等，由于樟芝良好的药用功能和野生数量稀少且生长十分缓慢，使得其市场价格极高，被称为世界上最昂贵的药用真菌。
目前研究学者和开发商都非常关注樟芝人工培养技术的研究。人工培养樟芝的技术主要有两种途径：一是人工栽培子实体。这固然是最理想的方法，但樟芝固体栽培时间长达数月之久，难以商业化生产；二是利用无性型菌株进行菌丝体发酵，再从发酵产物中提取功能组分。这是目前较为现实，最经济环保的一条樟芝开发途径。多家研究单位已对樟芝深层培养技术进行了研究。从研究结果来看，现有的樟芝深层培养技术主要存在下述问题：1)与其它微生物相比，樟芝的发酵周期较长。樟芝菌丝体发酵阶段的时间大多需要十余天，若加上菌种活化、发酵种子制备的时间则更久；2)发酵种子的质量不稳定容易导致樟芝发酵过程的可控性较差。传统樟芝发酵均采用斜面菌丝挖块法进行接种，该法容易造成接种不均匀，种子批次质量不稳定等问题。另外，樟芝丝状菌丝在发酵过程中易缠绕形成菌丝球，普遍存在菌球内外传质、传热、溶氧不一的情况。因此，整个樟芝发酵过程可控性较差，最终导致樟芝发酵产物质量的不稳定；3)因为樟芝发酵时间长，当发酵完成出罐后再进行清洗、空消、配置培养基、实消、冷却以后再接种，非生产的清理时间占用过长，影响生产效率。同时由于生产周期长，工艺环节多，导致发酵过程中容易发生污染，对发酵设备要求较高，因此生产成本高，也影响发酵产物的质量。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有樟芝深层发酵技术的不足，提供了一种基于无性孢子的樟芝快速液态发酵工艺，其特征在于：包括：
本发明的目的通过以下方案实现：
1.将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，25-32℃培养168-312小时。
斜面培养基(g/L)：马铃薯150-200，葡萄糖10-20，琼脂15-25，pH自然。
2.将步骤1中的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，26-30℃培养，转速100-180rpm，培养48-72小时。
摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖20-30，蛋白胨2-4，硫酸镁0.5-1，磷酸二氢钾1-2，麸皮2-4，pH4.5。
3.将步骤2中的樟芝发酵液按10％-20％的接种量转接入装有种子培养基的种子罐中，26-30℃培养，转速50-150rpm，通气量0.5-2vvm，培养48-72小时。
种子罐培养基与摇瓶培养基相同。
4.将步骤3中的樟芝发酵液按10％-20％的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，26-30℃培养，转速50-150rpm，通气量0.5-2vvm，培养120-192小时。显微镜检验樟芝发酵液中可观察大量的无性孢子存在。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20-40，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，硫酸镁0.5-2，磷酸二氢钾1-4，pH4.5。
5.步骤4的发酵完成后，取出部分含有樟芝无性孢子的发酵液至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐继续发酵。发酵温度26-30℃，转速50-150rpm，通气量0.5-2vvm。
更具体的，上述工艺的所述步骤5中的再发酵循环可根据需要重复若干次。
上述步骤5中所述的取出发酵液转移至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐后，无性孢子的终浓度为104-106个/mL。
本发明的有益效果是：采用本发明的基于无性孢子的快速发酵工艺可使樟芝发酵周期较原有分批发酵工艺至少能够缩短40％，发酵产物质量提高，杂菌污染机会减少，成本降低。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。例如，本发明所述的基于无性孢子的樟芝快速液态发酵工艺可应用于所有的樟芝菌种。又如，可用于樟芝发酵过程中产生无性孢子的发酵培养基组成均属于本发明的范畴。
以下通过实例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
樟芝摇瓶快速发酵工艺
1.菌种：以樟芝(Antrodia camphorata)保藏号为ATCC No.200183的菌株作为出发菌种。
2.斜面培养：将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，28℃培养288小时。
斜面培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。
3.种子摇瓶培养：斜面菌种转接入装有100mL摇瓶培养基的500mL摇瓶中，26℃培养，转速100rpm，培养72小时。
摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0.75，磷酸二氢钾1.5，麸皮2，pH 4.5。
4.发酵摇瓶培养：樟芝发酵液按15％的接种量转接入装有100mL发酵培养基的500mL发酵摇瓶中，28℃培养，转速100rpm，培养192小时。发酵完成后，显微镜检验樟芝发酵液中可观察到大量的无性孢子存在。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖25，蛋白胨2，酵母粉1，硫酸镁1，磷酸二氢钾2，pH4.5。
5.发酵摇瓶连续培养：发酵完成后取出5％发酵液转接入另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐中，孢子浓度为1.5×105个/mL。转速100rpm，28℃条件下培养168小时。
本实施例进入摇瓶快速连续发酵程序后，无性孢子循环产生，每次发酵周期为168小时，与原有采用斜面菌丝体作为接种物的分批发酵相比至少缩短40％，发酵成本降低。由于在发酵罐中樟芝无性孢子统一萌发并形成菌丝体，进而所得到的菌球形状大小较为均匀，因此樟芝发酵过程重复性好、产品质量稳定。
实施例2
樟芝发酵罐快速发酵工艺
1.菌种：以樟芝(Antrodia camphorata)保藏号为BCRC No.35398的菌株作为出发菌种。
2.斜面培养：将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，26℃培养312小时。
斜面培养基(g/L)：马铃薯180，葡萄糖18，琼脂18，pH自然。
3.种子摇瓶培养：将樟芝斜面菌种转接入装有100mL摇瓶培养基的500mL摇瓶中，26℃培养，转速100rpm，培养48小时。
摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，麸皮2，pH4.5。
4.种子罐发酵：将樟芝发酵液按15％的接种量转接入装有种子培养基的种子罐中，26℃培养，转速150rpm，通气量1vvm，培养48小时。
种子罐培养基与摇瓶培养基相同。
5.发酵罐发酵：樟芝发酵液按15％的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，26℃培养，转速100rpm，通气量1vvm，培养192小时。显微镜检验樟芝发酵液中可观察大量的无性孢子存在。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，硫酸镁0.5-2，磷酸二氢钾1-4，pH4.5。
6.发酵罐连续培养：发酵完成后取出部分含有樟芝无性孢子的发酵液至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐，孢子浓度为1.5×105个/mL，继续发酵。发酵温度26℃，转速100rpm，通气量1vvm。
本实施例进入发酵罐快速连续发酵程序后，孢子萌发形成菌丝体，进一步形成菌球，进而又产生无性孢子。无性孢子循环产生，每次发酵周期为168小时，与原有采用斜面菌丝体作为接种物的分批发酵相比至少缩短50％，发酵成本降低。由于在发酵罐中樟芝无性孢子统一萌发并形成菌丝体，进而所得到的菌球形状大小较为均匀，因此樟芝发酵过程重复性好、产品质量稳定。另外，由于减少了发酵步骤，减少了染菌的机会。
Claims (2)
1.一种基于无性孢子的樟芝快速发酵工艺，其特征在于：
A．将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，26℃培养312小时；
斜面培养基，单位g/L：马铃薯 180，葡萄糖18，琼脂18，pH自然；
B．将樟芝斜面菌种接入液体摇瓶在26℃培养48小时得到种子液，在种子罐扩大培养48小时；
种子罐培养基与摇瓶培养基均为，单位g/L：葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，麸皮2，pH4.5；
C．26℃条件下，在发酵罐中发酵192小时；
D．步骤C的发酵完成后，取出部分含有无性孢子的樟芝发酵液并转移至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐继续发酵；
E．步骤D中所述的发酵工艺，可根据需要重复若干次，即取出部分含有樟芝无性孢子的发酵液至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐继续发酵；
F．步骤C中所用的发酵培养基组成为，单位g/L：葡萄糖30，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，硫酸镁0.5-2，磷酸二氢钾1-4，pH4.5。
2.根据权利要求1所述的快速发酵工艺，其特征在于：步骤C发酵结束时樟芝发酵液中含有无性孢子。
3. 根据权利要求1所述的快速发酵工艺，其特征在于：步骤Ｄ中所述的取出发酵液转移至另一装有新鲜发酵培养基的发酵罐后，无性孢子的终浓度为1.5×105个/mL。
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