CN106361780A - 一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法 - Google Patents

一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，包括：取樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，经25‑28℃培养，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶培养，转速100‑120rpm，培养温度25‑28℃，培养时间10‑12天，摇瓶接种于种子罐，种子罐培养8‑10天后接种于发酵罐进行发酵培养，接种量8‑10％；其中，发酵罐培养基内添加相对于发酵液体积3‑8ml/L的茶油、花生油或茶油和花生油的混合物，或发酵后期流加茶油、花生油或茶油和花生油的混合物。本发酵方法能有效提高樟芝中樟芝三萜类化合物的含量，且工艺简单、有效，缩短了发酵周期，提高了生产效率，并成功实现了工业化生产的嫁接。

Description

一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高樟芝总三萜化合物含量的发酵方法。
背景技术
樟芝，学名为Antrodia Camphorata，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇等，因其疗效特殊神奇、活人无数，在民间甚至有“阴阳对口菇”之称。因樟芝具有解毒保肝、抗癌、强化免疫、抗过敏、降血脂等神奇功效，素有“药芝之王”、“台湾森林中之红宝石”的美誉。
樟芝中含有的三萜类化合物种类是所有真菌产品中最多的，一般认为是樟芝萃取物中苦味成分的主要来源。其中多达10多种新发现三萜类为樟芝所独有，试验证实：这些三萜类化合物能抑制肝癌细胞的增殖、毒杀老鼠血癌细胞活性、抗副交感神经作用、抗血清素活性、活化神经细胞生长能力等功能；其具备的生理活性功能为抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降低胆固醇等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高樟芝总三萜化合物含量的发酵方法，本发酵方法能有效提高樟芝中樟芝三萜类化合物的含量，且工艺简单、有效，缩短了发酵周期，提高了生产效率，并成功实现了工业化生产的嫁接。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，包括：
取樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，经25-28℃培养，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶培养，转速100-120rpm，培养温度25-28℃，培养时间10-12天，摇瓶接种于种子罐，种子罐培养8-10天后接种于发酵罐进行发酵培养，接种量8-10％；其中，发酵罐培养基内添加相对于发酵液体积3-8ml/L的茶油、花生油或茶油和花生油的混合物，或发酵后期流加茶油、花生油或茶油和花生油的混合物。
所述的斜面培养时间为10-15天。
所述的摇瓶培养基为：葡萄糖1％-2％、酵母粉0.1％-0.2％、蛋白胨0.1％-0.2％、磷酸
二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％。
所述的种子罐培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.1％-0.2％、麸皮0.3％-0.6％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％；其中，麸皮的处理方法为称取麸皮，加入麸皮10倍重量的水，煮沸0.5h，过滤，取滤液添加至发酵罐。
所述的种子罐培养条件为：发酵风量15～20m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间8-10天，发酵温度25-28℃。
所述的发酵罐培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.3％-0.7％、麸皮0.4％-1％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％、茶油和花生油混合物3-8ml/L。
所述的发酵罐中发酵风量160～260m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间4-5天，发酵温度25-28℃。
所述的茶油和花生油的混合重量比例为：0:1-1:0。
所述的后期流加时间为发酵1天或2天后。
发酵结束后，离心进行菌丝和滤液的分离，菌丝在65℃-75℃温度条件下烘干3-4h。。
一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，该方法具体包括以下步骤：
(1)樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，经25-28℃培养10-15天，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶；
(2)摇瓶培养：培养基为：葡萄糖1％-2％、酵母粉0.1％-0.2％、蛋白胨0.1％-0.2％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％。摇瓶培养转速100-120rpm，培养时间10-12天，培养温度25-28℃；
(3)种子培养：培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.1％-0.2％、麸皮0.3％-0.6％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％，发酵风量15～20m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间8-10天，发酵温度25-28℃；
(4)发酵培养：培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.3％-0.7％、麸皮0.4％-1％(煮沸0.5h，取滤液)、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％、茶油和花生油混合物3-8ml/L。茶油和花生油混合比例为0:1-1:0，加入方式为发酵前加入或发酵1-2天后流加。接种量8％-10％，风量160～260m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间4-5天，发酵温度25-28℃。
(5)发酵结束后，通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行菌丝和滤液的分离，菌丝65℃-75℃烘干3-4h。烘干后粉碎至80目即得高总三萜含量的樟芝菌丝体粉。
步骤(1)所述的樟芝菌株(JNPF-AC01)由江南大学提供，经中国科学院微生物研究所菌种保藏中心鉴定。
本发明的有益效果为：通过加入茶油和/或花生油能显著提高樟芝菌丝体粉中总三萜的含量，由原来的4％-5％提高到6％-7％，工艺简单、有效，且明显缩短了发酵周期，由原来的7-8天缩短到4-5天，提高了生产效率，并成功实现了工业化生产的嫁接。
具体实施方式
以下通过具体实验例对本发明进行进一步说明，但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下实施例所述“麸皮”是由以下方法制备得到的：取麸皮，加入麸皮10倍重量的水，煮沸0.5h，取滤液，即得。
实施例1：
(1)樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，28℃培养15天，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶。
(2)摇瓶培养：培养基为：葡萄糖2％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。摇瓶培养转速120rpm，培养时间12天，培养温度28℃。
(3)种子罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、麸皮0.6％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。发酵风量20m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间10天，发酵温度28℃。
(4)发酵罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.7％、麸皮1％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、茶油和花生油混合物8ml/L，茶油和花生油的混合比例为3:2，加入方式为发酵前加入，接种量10％，风量260m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间5天，发酵温度28℃。
(5)发酵结束后，通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行菌丝和滤液的分离，菌丝75℃烘干4h。烘干后粉碎至80目即得高总三萜含量的樟芝菌丝体粉。通过检测总三萜含量为7.34％。
实施例2：
(1)樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，经25℃培养10天，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶。
(2)摇瓶培养：培养基为：葡萄糖1％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％。摇瓶培养转速100rpm，培养时间10天，培养温度25℃。
(3)种子罐培养：培养基为：葡萄糖1％、蛋白胨0.1％、麸皮0.3％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％。发酵风量15m3/h，罐压0.02MPa，发酵时间8天，发酵温度25℃。
(4)发酵罐培养：培养基为：葡萄糖1％、蛋白胨0.3％、麸皮0.4％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、茶油和花生油混合物6ml/L，茶油和花生油的混合重量比例为1:1；接种量9％，风量160m3/h，罐压0.02MPa，发酵时间4天，发酵温度25℃。
(5)发酵结束后，通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行菌丝和滤液的分离，菌丝70℃烘干3.5h。烘干后粉碎至80目即得高总三萜含量的樟芝菌丝体粉。通过检测总三萜含量为7.59％。
实施例3
(1)樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，28℃培养15天，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶。
(2)摇瓶培养：培养基为：葡萄糖2％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。摇瓶培养转速120rpm，培养时间12天，培养温度28℃。
(3)种子罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、麸皮0.6％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。发酵风量20m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间10天，发酵温度28℃。
(4)发酵罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.7％、麸皮1％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、茶油8ml/L。混合比例为0.6:0.4，加入方式为发酵前加入，接种量10％，风量260m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间5天，发酵温度28℃。
(5)发酵结束后，通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行菌丝和滤液的分离，菌丝75℃烘干4h。烘干后粉碎至80目即得高总三萜含量的樟芝菌丝体粉。通过检测总三萜含量为6.78％。
实施例4
(1)樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，28℃培养15天，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶。
(2)摇瓶培养：培养基为：葡萄糖2％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。摇瓶培养转速120rpm，培养时间12天，培养温度28℃。
(3)种子罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、麸皮0.6％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％。发酵风量20m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间10天，发酵温度28℃。
(4)发酵罐培养：培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨0.7％、麸皮1％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、花生油8ml/L。混合比例为0.6:0.4，加入方式为发酵前加入，接种量10％，风量260m3/h，罐压0.05MPa，发酵时间5天，发酵温度28℃。
(5)发酵结束后，通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行菌丝和滤液的分离，菌丝75℃烘干4h。烘干后粉碎至80目即得高总三萜含量的樟芝菌丝体粉。通过检测总三萜含量为7.21％。
上述樟芝菌株(JNPF-AC01)由江南大学提供，经中国科学院微生物研究所菌种保藏中心鉴定。
上述实施例中樟芝总三萜含量检测方法如下：
(1)香草醛-冰醋酸溶液的配制
准确称取0.5g香草醛粉末于10mL容量瓶中，用冰醋酸溶解并定容至10mL，该溶液现配现用。
(2)标准曲线的绘制
精确称取2mg齐墩果酸标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10mL，即得0.2mg/mL的齐墩果酸标准品溶液。
分别吸取上述标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80及0.90mL于10mL具塞试管中，60℃水浴蒸干，加0.3mL新配制的5％香草醛-冰醋酸溶液和1mL高氯酸，60℃反应20min，冰水冷却，加10mL冰醋酸，摇匀，于550nm波长下测定吸光度，并以齐墩果酸质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线。
(3)三萜含量的检测
准确称取干燥并粉碎后的樟芝菌粉0.5g于2mL EP管中，加入500μL甲醇，50HZ超声15min后过夜，取甲醇提取液100μL于10mL具塞试管中，水浴蒸干，加0.3mL新配制的5％香草醛-冰醋酸溶液和1mL的高氯酸，60℃反应20min，冰水冷却，加10mL冰醋酸，摇匀，在550nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算总三萜的含量。

Claims (10)

1.一种提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，包括：
取樟芝菌株转接到PDA培养基斜面上，经25-28℃培养，待斜面菌丝由乳白色转变为橙红色时转接摇瓶培养，转速100-120rpm，培养温度25-28℃，培养时间10-12天，摇瓶接种于种子罐，种子罐培养8-10天后接种于发酵罐进行发酵培养，接种量8-10％；其中，发酵罐培养基内添加相对于发酵液体积3-8ml/L的茶油、花生油或茶油和花生油的混合物，或发酵后期流加茶油、花生油或茶油和花生油的混合物。
2.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的斜面培养时间为10-15天。
3.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的摇瓶培养基为：葡萄糖1％-2％、酵母粉0.1％-0.2％、蛋白胨0.1％-0.2％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％。
4.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的种子罐培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.1％-0.2％、麸皮0.3％-0.6％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％；其中，麸皮的处理方法为称取麸皮，加入麸皮10倍量的水，煮沸0.5h，过滤，取滤液添加至发酵罐。
5.根据权利要求4所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的种子罐培养条件为：发酵风量15～20m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间8-10天，发酵温度25-28℃。
6.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的发酵罐培养基为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨0.3％-0.7％、麸皮0.4％-1％、磷酸二氢钾0.1％-0.3％、七水硫酸镁0.1％-0.3％、茶油和花生油混合物3-8ml/L。
7.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的发酵罐中发酵风量160～260m3/h，罐压0.02～0.05MPa，发酵时间4-5天，发酵温度25-28℃。
8.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的茶油和花生油的混合重量比例为：0:1-1:0。
9.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于所述的后期流加时间为发酵1天或2天后。
10.根据权利要求1所述的提高樟芝总三萜化合物产量的发酵方法，其特征在于发酵结束后，离心进行菌丝和滤液的分离，菌丝在65℃-75℃温度条件下烘干3-4h。
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