CN109207371B - 一种生产灵芝的分段发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产灵芝的分段发酵方法，涉及真菌发酵技术领域。本发明方法包括以下步骤：1)红色红曲霉摇床培养，得红曲菌种子液；2)红曲菌种子液扩大培养，得红曲菌发酵种；3)四川灵芝摇床培养，得灵芝种子液；4)灵芝种子液扩大培养，得灵芝发酵种；5)红曲菌发酵种接种到乙酸薏米仁粉培养基中进行第一发酵，再接种灵芝发酵种，进行第二发酵，得复合发酵液；6)将复合发酵液经压滤压干后，得固体初产物；7)将固体初产物真空干燥后粉碎，得灵芝。本发明得到的降血糖灵芝含灵芝多糖6～8％，含灵芝三萜类4～5％，含洛伐他汀550～970mg/1000g，可显著增强灵芝的降脂降糖功能。
Description
技术领域
本发明属于真菌发酵技术领域，具体涉及一种生产灵芝的分段发酵方法。
背景技术
灵芝(学名：Ganoderma Lucidum Karst)，又称灵芝草、仙草，别称赤芝、红芝、木灵芝、菌灵芝、万年蕈、灵芝草，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形。灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍贵药材，具有补气安神，止咳平喘的功效，用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。灵芝具备很高的药用价值，经过科研机构数十年的现代药理学研究证实，灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，降低血脂，软化血管，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。灵芝多糖是灵芝药用功能的主要有效成分之一，主要存在于灵芝细胞壁内壁，大部分为β-葡聚糖，其单糖组成除含有大量葡萄糖外，还含有少量阿拉伯糖、木糖、岩藻糖，鼠李糖，半乳糖和甘露糖等，它们大多以(1-3)、(1-4)和(1-6)等糖苷键连接，具有广泛的生物活性，如增强免疫力、清除人体自由基、降低血脂、保护心血管、抗辐射、保护肝脏、抗肿瘤等作用。三萜类也是灵芝的有效成分之一，灵芝所含三萜类不下百余种，其中以四环三萜类为主，灵芝的苦味与所含三萜类有关，对人体肝癌细胞具有细胞毒作用，也能抑制组织胺的释放，具有保肝和抗过敏等作用。
虽然已有研究表明，灵芝为具有明显药理活性的药用真菌，具有增强免疫力、降血脂、降血糖、降血压、保肝护肝、排毒、降胆固醇、抗肿瘤等作用，但是目前并没有一种具有显著降脂降糖功能的灵芝药剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产灵芝的分段发酵方法，进一步加强灵芝在增强免疫力、降血糖、降血压、降血脂、降胆固醇、抗肿瘤等药理活性方面的功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种生产灵芝的分段发酵方法，包括以下步骤：
1)将红色红曲霉(Monascus ruber)进行摇床培养30～35h，得红曲菌种子液；所述红色红曲霉(Monascus ruber)的保藏编号为CGMCC NO.16261；
2)将步骤1)得到的所述红曲菌种子液扩大培养，得红曲菌发酵种；
3)将四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)进行摇床培养48～60h，得灵芝种子液；所述四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)的保藏编号为CGMCC No.16094；
4)将步骤3)得到的所述灵芝种子液扩大培养，得灵芝发酵种；
5)将步骤2)得到的所述红曲菌发酵种接种到乙酸薏米仁粉培养基中进行第一发酵40～55h后，再接种步骤4)得到的所述灵芝发酵种，进行第二发酵40～55h，得复合发酵液；所述乙酸薏米仁粉培养基包括以下重量分数的原料：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、薏米仁粉2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、乙酸0.5％～1％、维生素B150～100PPm，余量为水；
6)将步骤5)得到的所述复合发酵液经压滤压干后，得固体初产物；
7)将步骤6)得到的所述固体初产物真空干燥后粉碎，得灵芝；
所述步骤1)、2)和步骤3)、4)之间不存在时间先后顺序的限定。
优选的，步骤1)和步骤3)所述摇床培养对应的接种量独立地为8～12％。
优选的，步骤1)和步骤3)所述摇床培养用培养基独立地为PDA液体培养基。
优选的，步骤1)所述摇床培养的温度为27～30℃，搅拌速度为300～400r/min。
优选的，步骤2)所述扩大培养的接种量为6～8％。
优选的，步骤2)所述扩大培养为有氧培养，通气量为1:0.5(L/L·min)，温度为27～30℃，搅拌速度为200～300r/min。
优选的，步骤3)所述摇床培养的温度为25～26℃，搅拌速度为250～350r/min。
优选的，步骤4)所述扩大培养的接种量为6～8％。
优选的，步骤4)所述扩大培养为有氧培养，通气量为1:0.5(L/L·min)，温度为25～26℃，搅拌速度为200～300r/min。
优选的，步骤5)所述第一发酵和第二发酵的温度独立地为26～27℃，通气量为1:0.5(L/L·min)，搅拌速度为200～300r/min。
本发明提供了一种生产灵芝的分段发酵方法，灵芝在深层液体培养时复合功能性红曲菌的培养，在生物合成功效活性成份时产物中含红曲的降血脂功效成份洛伐他汀，协同灵芝的降血糖功能，使灵芝的降脂降糖功能大大增强，服用产生的灵芝两周后，高血脂血糖模型的血脂值和血糖值就能降低到正常水平。且灵芝的生产过程简单可控，可实现批量生产。
附图说明
图1为本发明分段发酵方法的流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种生产灵芝的分段发酵方法，包括以下步骤：
1)将红色红曲霉(Monascus ruber)进行摇床培养30～35h，得红曲菌种子液；所述红色红曲霉(Monascus ruber)的保藏编号为CGMCC NO.16261；
2)将步骤1)得到的所述红曲菌种子液扩大培养，得红曲菌发酵种；
3)将四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)进行摇床培养48～60h，得灵芝种子液；所述四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)的保藏编号为CGMCC No.16094；
4)将步骤3)得到的所述灵芝种子液扩大培养，得灵芝发酵种；
5)将步骤2)得到的所述红曲菌发酵种接种到乙酸薏米仁粉培养基中进行第一发酵40～55h后，再接种步骤4)得到的所述灵芝发酵种，进行第二发酵40～55h，得复合发酵液；所述乙酸薏米仁粉培养基包括以下重量分数的原料：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、薏米仁粉2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、乙酸0.5％～1％、维生素B150～100PPm，余量为水；
6)将步骤5)得到的所述复合发酵液经压滤压干后，得固体初产物；
7)将步骤6)得到的所述固体初产物真空干燥后粉碎，得灵芝；
所述步骤1)、2)和步骤3)、4)之间不存在时间先后顺序的限定。
本发明在进行所述灵芝的分段发酵时，需要将红色红曲菌进行摇床培养30～35h，得红曲菌种子液；所述红色红曲霉(Monascus ruber)的保藏编号为CGMCC NO.16261，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年08月06日。本发明所述摇床培养的红色红曲菌接种量优选为8～12％，更优选为9～11％，最优选为10％。本发明所述摇床培养的培养基优选为PDA液体培养基，所述摇床培养的温度优选为27～30℃，更优选为27.5～29.5℃，最优选为28.5℃。本发明所述摇床培养的搅拌速度优选为300～400r/min，更优选为330～380r/min，最优选为350r/min。本发明所述摇床培养的时间优选为30～35h，更优选为32～34h，最优选为33h。
本发明所述红色红曲菌由M.ruber GM011诱变获得，所述诱变的步骤包括：a.将M.ruber GM011菌种在PDA固体培养基上培养5～10d，得菌丝；b.将所述菌丝在PDA固体培养基上活化培养1～5d，得活化菌；c.将所述活化菌在PCA固体培养基上扩大培养6～7d，得孢子；d.将所述孢子与生理盐水混合后震荡，过滤菌丝后，得孢子悬液；e.紫外诱变所述孢子悬液，得诱变孢子；f.将所述诱变孢子在PDA培养基上暗培养2～5d，得诱变菌；g.将所述诱变菌发酵后，检测Monacolin K含量，将Monacolin K含量最高的诱变菌命名为红曲菌HX01。
在本发明中，将M.ruber GM011菌种在PDA固体培养基上培养5～10d，得菌丝。本发明所述培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为25～37℃，更优选为28～35℃，最优选为30℃。本发明所述培养的时间优选为6～9d，更优选为6.5～8d，最优选为7d。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面试管培养基，本发明对M.ruber GM011菌种与PDA固体培养基的比例关系并没有特殊限定，利用本领域的常规用量即可。本发明在培养7d时，菌丝可长满斜面。本发明对所述M.ruber GM011菌种的来源没有特殊限定，优选来源于浙江工业大学河姆渡红曲研究所。
得菌丝后，本发明将所述菌丝在PDA固体培养基上活化培养1～5d，得活化菌。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面培养基。本发明所述活化培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为25～37℃，更优选为28～35℃，最优选为30℃。本发明所述活化培养的时间优选为2～3d，更优选为2.3～2.8d，最优选为2.6d。
得活化菌后，本发明将所述活化菌在PDA固体培养基上扩大培养6～7d，得孢子。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面培养基。本发明所述扩大培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为25～37℃，更优选为28～35℃，最优选为30℃。本发明所述扩大培养的时间优选为6～7d，更优选为6.2～6.8d，最优选为6.5d。
得孢子后，本发明将所述孢子与生理盐水混合后震荡，过滤菌丝后，得孢子悬液。本发明所述混合优选为用无菌生理盐水将所述孢子洗下，放入三角瓶中。本发明所述三角瓶中优选为包括玻璃珠的三角瓶，所述玻璃珠的数量优选为20～30颗，更优选为24～28颗，最优选为25颗。本发明所述玻璃珠的直径优选为4～5mm。本发明所述震荡的时间优选为15～45min，更优选为20～35min，最优选为30min。本发明所述玻璃珠可分散震荡产生孢子，预防孢子成团。本发明所述过滤优选利用漏斗过滤，更优选为带有脱脂棉的漏斗，去除菌丝。本发明去除菌丝后，优选的还包括生理盐水稀释的过程，使所述孢子的浓度为106～107个/mL。
得孢子悬液后，本发明利用紫外诱变所述孢子悬液，得诱变孢子。本发明所述紫外诱变优选采用15W紫外线杀菌灯，所述紫外线杀菌灯的波长为2573A。在紫外照射时，紫外灯与处理物的距离为30cm，取5ml红曲孢子悬液放入已灭菌的具有大头针的直径为9cm培养皿中，置于磁力搅拌器上，使照射均匀，照射时间分别为0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s。
得诱变孢子后，本发明将所述诱变孢子在PDA培养基上暗培养2～5d，得诱变菌。本发明在诱变后稀释至相应级数，涂布于PDA培养皿上。本发明所述暗培养优选的用黑纸包裹所述培养基后培养。本发明所述暗培养的温度优选为25～37℃，更优选为28～35℃，最优选为30℃。本发明所述暗培养的时间优选为2～5d，更优选为2.5～4d，最优选为3d。
得诱变菌后，将所述诱变菌发酵后，检测Monacolin K含量，将MonacolinK含量最高的诱变菌命名为红曲菌HX01。本发明所述检测优选的为高效液相色谱检测，本发明对所述高效液相色谱检测的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。本发明对所述诱变菌发酵的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
得红曲菌种子液后，本发明将得到的所述红曲菌种子液扩大培养，得红曲菌发酵种。本发明所述扩大培养的接种量优选为6～8％，更优选为6.5～7.8％，最优选为7％。本发明所述扩大培养优选为有氧培养，所述有氧培养的通气量优选为为1:0.5(L/L·min)。本发明所述扩大培养的温度优选为27～30℃，更优选为28℃。本发明所述扩大培养时优选进行搅拌，所述搅拌速度优选为200～300r/min，更优选为220～280r/min，最优选为260r/min。本发明所述扩大培养优选为进行两次扩大培养，每次扩大培养的时间优选的独立为48～60h，更优选为50～58h，最优选为55h。
本发明将将四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)进行摇床培养48～60h，得灵芝种子液；所述四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)的保藏编号为CGMCC No.16094，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年08月06日。本发明所述摇床培养的四川灵芝接种量优选为8～12％，更优选为9～11％，最优选为10％。本发明所述摇床培养的培养基优选为PDA液体培养基，所述摇床培养的温度优选为25～26℃，更优选为25.2～25.8℃，最优选为25.5℃。本发明所述摇床培养的搅拌速度优选为250～350r/min，更优选为280～320r/min，最优选为300r/min。本发明所述摇床培养的时间优选为48～60h，更优选为50～58h，最优选为55h。
本发明所述四川灵芝由赤芝GanodermaLucidum Karst诱变获得，所述诱变的步骤包括：a.将赤芝GanodermaLucidum Karst菌种在PDA固体培养基上培养7～8d，得菌丝；b.将所述菌丝在PDA固体培养基上活化培养2～3d，得活化菌；c.将所述活化菌在PCA固体培养基上扩大培养8～9d，得孢子；d.将所述孢子与生理盐水混合后震荡，过滤菌丝后，得孢子悬液；e.紫外诱变所述孢子悬液，得诱变孢子；f.将所述诱变孢子在PDA培养基上暗培养3～4d，得诱变菌；g.将所述诱变菌重悬，紫外灯照射后，在含有LiCl的PDA固体培养基上诱变培养6～7d，得二次诱变菌株；h.将所述二次诱变菌株发酵后，检测灵芝多糖含量，将灵芝多糖含量最高的二次诱变菌株命名为藏灵芝一号。
在本发明中，将赤芝GanodermaLucidum Kars菌种在PDA固体培养基上培养7～8d，得菌丝。本发明所述培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃，最优选为26℃。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面试管培养基，本发明对赤芝GanodermaLucidum Kars菌种与PDA固体培养基的比例关系并没有特殊限定，利用本领域的常规用量即可。本发明在培养7～8d时，菌丝可长满斜面。本发明对所述赤芝GanodermaLucidum Kars菌种的来源没有特殊限定，优选来源于西藏自治区农牧科学院。
得菌丝后，本发明将所述菌丝在PDA固体培养基上活化培养2～3d，得活化菌。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面培养基。本发明所述活化培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃，最优选为26℃。
得活化菌后，本发明将所述活化菌在PDA固体培养基上扩大培养8～9d，得孢子。本发明所述PDA固体培养基优选为PDA斜面培养基。本发明所述扩大培养优选在光照培养箱中进行，所述培养箱的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃，最优选为26℃。
得孢子后，本发明将所述孢子与生理盐水混合后震荡，过滤菌丝后，得孢子悬液。本发明所述混合优选为用无菌生理盐水将所述孢子洗下，放入三角瓶中。本发明所述三角瓶中优选包括玻璃珠，所述玻璃珠的数量优选为20～30颗，更优选为24～28颗，最优选为25颗。本发明所述玻璃珠的直径优选为4～5mm。本发明所述震荡的时间优选为15～45min，更优选为20～35min，最优选为30min。本发明所述震荡可使孢子分散。本发明所述过滤优选利用漏斗过滤，更优选为带有脱脂棉的漏斗，去除菌丝。本发明去除菌丝后，优选的还包括生理盐水稀释的过程，使所述孢子的浓度为106～107个/mL。
得孢子悬液后，本发明利用紫外诱变所述孢子悬液，得诱变孢子。本发明所述紫外诱变优选采用15W紫外线杀菌灯，所述紫外线杀菌灯的波长为2573A。在紫外照射时，紫外灯与处理物的距离为30cm，取5ml孢子悬液放入已灭菌的具有大头针的直径为9cm培养皿中，置于磁力搅拌器上，使照射均匀，照射时间分别为0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s。
得诱变孢子后，本发明将所述诱变孢子在PDA培养基上暗培养3～4d，得诱变菌。本发明在诱变后稀释至相应级数，涂布于PDA培养皿上。本发明所述暗培养优选的用黑纸包裹所述培养基后培养。本发明所述暗培养的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃，最优选为26℃。
得诱变菌后，本发明将所述诱变菌重悬，紫外灯照射后，在含有LiCl的PDA固体培养基上二次诱变培养6～7d，得二次诱变菌株。本发明所述重悬优选利用PDA液体培养基重悬，所述重悬时，PDA液体培养基与诱变菌的体积比为9:1。本发明所述紫外灯照射的时间优选为30～90s，更优选为45～70s，最优选为60s。本发明所述LiCl的含量为300μL，所述LiCl的摩尔浓度优选为1mol/L。本发明所述二次诱变培养的温度优选为20～30℃，更优选为24～28℃，最优选为26℃。
得二次诱变菌株后，本发明将所述二次诱变菌株发酵后，检测灵芝多糖含量，将灵芝多糖含量最高的二次诱变菌株命名为藏灵芝一号。
本发明所述检测优选的为分光光度计法检测，本发明对所述分光光度计法检测的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。本发明对所述诱变菌发酵的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
得到灵芝种子液后，本发明将所述灵芝种子液扩大培养，得灵芝发酵种。本发明所述扩大培养的接种量优选为6～8％，更优选为6.5～7.8％，最优选为7％。本发明所述扩大培养优选为有氧培养，所述有氧培养的通气量优选为为1:0.5(L/L·min)。本发明所述扩大培养的温度优选为25～26℃，更优选为25.2～25.8℃，最优选为25.5℃。本发明所述扩大培养时优选进行搅拌，所述搅拌速度优选为200～350r/min，更优选为250～320r/min，最优选为300r/min。本发明所述扩大培养优选为进行两次扩大培养，每次扩大培养的时间优选的独立为48～60h，更优选为50～58h，最优选为55h。
得到红曲菌发酵种和灵芝发酵种后，本发明将得到的所述红曲菌发酵种接种到乙酸薏米仁粉培养基中进行第一发酵40～55h后，再接种步骤4)得到的所述灵芝发酵种，进行第二发酵40～55h，得复合发酵液；所述乙酸薏米仁粉培养基包括以下重量分数的原料：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、薏米仁粉2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、乙酸0.5％～1％、维生素B150～100PPm，余量为水。本发明所述第一发酵的红曲菌发酵种的接种量优选为4～10％，更优选为5～7％，最优选为6％。本发明所述第一发酵的温度优选为25～26℃。本发明所述第一发酵优选为有氧发酵，所述有氧发酵的通气量优选为1:0.5(L/L·min)，所述有氧发酵的搅拌速度为200～300r/min。本发明所述第一发酵的时间优选为42～52h，更优选为45～50h，最优选为48h。本发明所述第二发酵的灵芝发酵种得接种量优选为3～8％，更优选为4～6％，最优选为5％。本发明所述第二发酵为复合发酵，同时进行红曲菌和灵芝的发酵。本发明所述第二发酵的温度优选为26～27℃。本发明所述第二发酵优选为有氧发酵，所述有氧发酵的通气量优选为1:0.5(L/L·min)，所述有氧发酵的搅拌速度为200～300r/min。本发明所述第二发酵的时间优选为42～52h，更优选为45～50h，最优选为48h。在本发明中，第二发酵时灵芝和红曲菌种复合发酵，两个菌种都形成生长优势，充分利用培养基营养成分，大量生物合成降血脂降血糖功效成份。灵芝菌种发酵条件比较温和，容易形成生长优势，所以发酵阶段让红曲菌种先发酵培养48h，使红曲形成生长优势后再接入灵芝液体种，两者复合发酵培养，这样生产所得的灵芝相对普通灵芝含大量降血脂降血糖功效成份。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有玉米粉，所述玉米粉的重量分数优选为2～5％，更优选为2.5～4.5％，最优选为3.5％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有黄豆粉，所述黄豆粉的重量分数优选为1～2％，更优选为1.2～1.8％，最优选为1.5％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有薏米仁粉，所述薏米仁粉的重量分数优选为1.5～2.5％，更优选为1.8～2.3％，最优选为2％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有葡萄糖，所述葡萄糖的重量分数优选为1～3％，更优选为1.5～2.5％，最优选为2％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有磷酸二氢钾，所述磷酸二氢钾的重量分数优选为0.1～0.5％，更优选为0.2～0.4％，最优选为0.3％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有硫酸镁，所述硫酸镁的重量分数优选为0.05～0.1％，更优选为0.06～0.09％，最优选为0.08％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有乙酸，所述乙酸的重量分数优选为0.5～1％，更优选为0.6～0.9％，最优选为0.8％。本发明所述乙酸薏米仁粉培养基含有维生素B1，所述维生素B1的浓度优选为50～100ppm，更优选为60～90ppm，最优选为80ppm。本发明对所述乙酸薏米仁粉培养基的各原料的来源并没有特殊限定。
得复合发酵液后，本发明将得到的所述复合发酵液经压滤压干后，得固体初产物。本发明所述压滤的压力优选为50～60kg，更优选为53～58kg，最优选为55kg。
得到固体初产物后，本发明将得到的所述固体初产物真空干燥后粉碎，得灵芝。本发明所述真空干燥的真空度优选为0.5～1mp，更优选为0.6～0.9mp，最优选为0.8mp。本发明所述真空干燥的温度优选为60～65℃，更优选为61～64℃，最优选为62℃。本发明所述真空干燥的时间优选为24～28h，更优选为25～27h，最优选为26h。本发明对所述真空干燥的仪器及粉碎的过程并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可，所述粉碎的粒径优选为60～80目，更优选为65～75目，最优选为70目。
下面结合实施例对本发明提供的分段发酵方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)保持温度在28.5±1.5℃，在30L搅拌罐中装入接种有红曲菌HX01的PDA固体培养基，用水稀释成液体培养基，置于振荡器上，并搅拌32±1h，控制搅拌速度为350转/min；
2)保持温度在28.5±1.5℃，将步骤1)搅拌后的液体培养基负压吸入一300L种子罐中，培养52h；
3)保持温度在28.5±1.5℃，将步骤2)搅拌后的液体培养基负压吸入一1.5吨的种子罐中，培养52h；
4)保持温度在25.5±0.5℃，在30L搅拌罐中装入接种有藏灵芝一号的PDA固体培养基，用水稀释成液体培养基，置于振荡器上，并搅拌培养52h，控制搅拌速度为300转/min；
5)保持温度在25.5±0.5℃，将步骤4)搅拌后的液体培养基负压吸入一300L种子罐中，培养48～60h；
6)保持温度在25.5±0.5℃，将步骤5)搅拌后的液体培养基负压吸入一1.5吨的种子罐中，培养48～60h；
7)保持温度在26.5±0.5℃，将所述步骤3)中培养后的培养基负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入含有乙酸薏米仁粉发酵培养基(培养基成分如表1所示)，发酵48h；再将所述步骤6)中培养后的培养基负压吸入该发酵罐中，保持温度在25.5±0.5℃，通气量为1：0.5，搅拌速度为260r/min,复合发酵培养48h。
8)将步骤7)发酵后的液体培养基取出，用55kg的压力压滤，压干，得到固体初产物；
9)将步骤8)得到的固体初产物置于真空中干燥，干燥温度为60±1℃，干燥完成后粉碎，得到粒径为70目的高效降血糖灵芝，含灵芝多糖7.5％，含灵芝三萜类4.5％，含洛伐他汀910mg/1000g。
表1.乙酸薏米仁培养基配方
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 玉米粉 | 3.5％ | 3.5％ | 3.5％ | 3.5％ | 3.5％ | 3.5％ |
| 黄豆粉 | 1.5％ | 1.5％ | 1.5％ | 1.5％ | 1.5％ | 1.5％ |
| 薏米仁粉 | 2％ | 1％ | 3％ | 3％ | 0.5％ | 2％ |
| 葡萄糖 | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| 磷酸二氢钾 | 0.3％ | 0.3％ | 0.3％ | 0.3％ | 0.3％ | 0.3％ |
| 硫酸镁 | 0.08％ | 0.08％ | 0.08％ | 0.08％ | 0.08％ | 0.08％ |
| 乙酸 | 0.15％ | 0.5％ | 1.5％ | 0.5％ | 1.5％ | 0.5％ |
| 维生素B1 | 80ppm | 80ppm | 80ppm | 80ppm | 80ppm | 80ppm |
实施例2
除乙酸薏米仁培养基配方与实施例1不同外，其余操作均相同。
结果显示，得到的降血糖灵芝中含灵芝多糖6.5％，含灵芝三萜类4.7％，含洛伐他汀725mg/1000g。
实施例3
除乙酸薏米仁培养基配方与实施例1不同外，其余操作均相同。
结果显示，得到的降血糖灵芝中含灵芝多糖6.8％，含灵芝三萜类4.5％，含洛伐他汀830mg/1000g。
实施例4
除乙酸薏米仁培养基配方与实施例1不同外，其余操作均相同。
结果显示，得到的降血糖灵芝中含灵芝多糖7.2％，含灵芝三萜类4.4％，含洛伐他汀880mg/1000g。
实施例5
除乙酸薏米仁培养基配方与实施例1不同外，其余操作均相同。
结果显示，得到的降血糖灵芝中含灵芝多糖6.1％，含灵芝三萜类4.6％，含洛伐他汀736mg/1000g。
实施例6
除乙酸薏米仁培养基配方与实施例1不同外，其余操作均相同。
结果显示，得到的降血糖灵芝中含灵芝多糖7.2％，含灵芝三萜类4.6％，含洛伐他汀920mg/1000g。
利用实施例1～6得到的所述降脂降糖灵芝进行降血脂试验：
高血脂病例来自南昌大学第二附属医院，进行流行病学调查及血脂检测，符合中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组《血脂异常防治建议》中诊断标准，且近4周内未服用过血脂调节剂，维持日常饮食，血清TC≥5.7mmol/L或血清TG≥1.7mmol/L。受试者均经体检，排除其他因素导致的高血脂症。符合上述标准的高血脂患者60例，随机分成三组，A组(降脂降糖灵芝组)20例；B组(血脂康胶囊组)20例；C组(安慰剂组)20例。降脂降糖灵芝来自上海禾向生物科技有限公司；血脂康胶囊来自北大维信生物科技有限公司，批准文号：国药准字Z10950029，规格0.3g/粒；安慰剂为食用淀粉。
给药方法：降脂降糖灵芝和食用淀粉分别充填胶囊，规格为0.3g/粒。每日2次，每次2粒，餐后温开水送服，连续服用50天为一个疗程，分别采血检测。
检测结果如表2所示：
表2.治疗前后各组TC、TG、Lp(a)变化检测结果
由上述检测结果可以看出，本发明所述灵芝具有明显的降血脂功效，其降血脂治疗效果与国药血脂康胶囊接近，安慰剂不具有将血脂效果。
利用实施例1～6得到的所述灵芝进行降血脂试验：
高血脂模型通过灌胃高脂肪乳剂致高血脂症小鼠造模。灌胃方法：连续15d灌胃高脂肪乳剂(0.5ml/20g)，最后一天眼眶动脉采血，离心取血清检测TC值。高脂肪乳剂配制：猪油200g/L，胆固醇100g/L，蛋黄粉25g/L，胆酸钠20g/L，丙基硫氧嘧啶10g/L，剩余为蒸馏水。正常对照组和高血脂模型组各20只ICR小鼠，灌喂2周后检测血脂数据。
实验结果如表3所示：
表3.降血脂试验结果
由上述试验可知，本发明得到的所述灵芝，按照1.2mg/Kg的剂量服用，2周后血脂含量下降26％左右，与单独服红曲组结果相似，回复正常水平。
利用实施例1～6得到的所述灵芝进行降血糖试验：
高血糖模型用四氧嘧啶致糖尿病小鼠造模，正常对照组和高血糖模型组各20只ICR小鼠，灌喂2周后检测血糖数据。
实验结果如表4所示：
表4.降血糖试验结果
由上述试验可知，本发明得到的所述灵芝，按照0.85mg/Kg的剂量服用，2周后血糖含量下降53％左右，回复正常水平。
综上可知，本发明的分段发酵方法，通过红曲菌和灵芝的协同作用，使灵芝在降脂降糖方面的药理作用显著增强，显著地增强了降脂降糖功能。且得到的所述灵芝中，含灵芝多糖6％～8％，含灵芝三萜类4％～5％，含洛伐他汀550mg～970mg/1000g，还具有生产过程简单可控，可实现批量生产的优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种生产灵芝的分段发酵方法，包括以下步骤：
1)将红色红曲霉(Monascus ruber)进行摇床培养30～35h，得红曲菌种子液；所述红色红曲霉(Monascus ruber)的保藏编号为CGMCC NO.16261；
2)将步骤1)得到的所述红曲菌种子液扩大培养，得红曲菌发酵种；
3)将四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)进行摇床培养48～60h，得灵芝种子液；所述四川灵芝(Ganoderma.sichuanense)的保藏编号为CGMCC No.16094；
4)将步骤3)得到的所述灵芝种子液扩大培养，得灵芝发酵种；
5)将步骤2)得到的所述红曲菌发酵种接种到乙酸薏米仁粉培养基中进行第一发酵40～55h后，再接种步骤4)得到的所述灵芝发酵种，进行第二发酵40～55h，得复合发酵液；所述乙酸薏米仁粉培养基由以下重量分数的原料组成：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、薏米仁粉2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、乙酸0.5％～1％、维生素B150～100PPm，余量为水；所述第一发酵和第二发酵的温度分别为26～27℃，通气量为1:0.5，搅拌速度为200～300r/min；
6)将步骤5)得到的所述复合发酵液经压滤压干后，得固体初产物；
7)将步骤6)得到的所述固体初产物真空干燥后粉碎，得灵芝。
2.根据权利要求1所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述摇床培养对应的接种量分别为8～12％。
3.根据权利要求1或2所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述摇床培养用培养基分别为PDA液体培养基。
4.根据权利要求1所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤1)所述摇床培养的温度为27～30℃，搅拌速度为300～400r/min。
5.根据权利要求1所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤2)所述扩大培养的接种量为6～8％。
6.根据权利要求1或5所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤2)所述扩大培养为有氧培养，通气量为1:0.5，温度为27～30℃，搅拌速度为200～300r/min。
7.根据权利要求1所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤3)所述摇床培养的温度为25～26℃，搅拌速度为250～350r/min。
8.根据权利要求1所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤4)所述扩大培养的接种量为6～8％。
9.根据权利要求1或8所述的分段发酵方法，其特征在于，步骤4)所述扩大培养为有氧培养，通气量为1:0.5，温度为25～26℃，搅拌速度为200～300r/min。
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