CN108531404A - 一株层出镰孢菌的培养方法及其应用 - Google Patents

一株层出镰孢菌的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株层出镰孢菌的培养方法，该菌株为5号菌株层出镰刀菌，已于2017年11月22日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14798，固体发酵基质为麦麸，培养条件为：N源(NH4)2SO443mg/g、C源玉米粉48.4mg/g、培养基质初始含水量为258mg/g、接种量为0.26mL/g、初始pH值7.6、培养时间120h、培养温度是30.7℃。本发明利用廉价的麦麸作为固体发酵基质,大大降低了成本,为该菌制剂的工业化规模生产提供了技术支撑。

Description

一株层出镰孢菌的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株层出镰孢菌的培养方法及其应用。
背景技术
5号菌株分离自青海贵德患病微孔草植株根际土壤中，由青海大学农科院植保所有害生物综合防治实验室提供保存。通过对该菌株的纯化及鉴定，将该菌株归类为层出镰刀菌Fusarium proliferatum，安全性评价结果显示，该菌株除对春油菜有轻微影响外，对春小麦、蚕豆、豌豆和青稞4种作物相对安全。该菌株具有开发成为春小麦、蚕豆、豌豆和青稞田用于防除农田恶性杂草藜和密花香薷的真菌除草剂的潜力。
菌体生长和产物合成直接受到碳氮源、基质含水量、培养时间、培养温度等因素的影响。对5号菌株的发酵生产工艺来说，明确各因素与菌株发酵生产之间的关系，将为该菌的规模化生产和剂型研究提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一株层出镰孢菌的培养方法及其应用，该方法以5号菌株作为研究对象，运用正交试验开展最佳的菌株培养条件的优化试验，全面考虑层出镰孢5号菌生长所需的各种营养物质,明确固液发酵条件与菌株发酵生产之间的关系，为该菌的大规模生产提供必要的工艺参数，控制并改进发酵工艺条件，使其大量繁殖，为实现生物菌剂的产业化生产及进一步的推广应用提供理论依据。
其具体技术方案为：
一株层出镰孢菌的培养方法，该菌株为5号菌株层出镰刀菌，已于2017年11月22日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14798，固体发酵基质为麦麸，培养条件为：N源(NH4)2SO443mg/g、C源玉米粉48.4mg/g、培养基质初始含水量为258mg/g、接种量为0.26mL/g、初始pH值7.6、培养时间120h、培养温度是30.7℃。
本发明所述方法培养出的层出镰孢菌的发酵液在除草剂制备过程中的应用。
具体应用，包括以下步骤：将层出镰孢菌在PDB培养液中扩大培养120h后，稀释成孢子量为108个·mL-1的发酵液后喷雾接种到移栽的健康杂草植株上，接种量为30mL/盆，花盆的规格为Φ＝15cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明选取了多种能用于生防菌一发酵培养基的碳源、氮源生长因子,在同一培养条件下进行生防菌一发酵培养比较,综合考虑菌落直径和菌悬液OD值2个指标,筛选出其中最适合生防菌一发酵的培养基。结合培养基原料来源丰富、价格低廉、取材方便等因素,利用廉价的麦麸作为固体发酵基质,大大降低了成本,为该菌制剂的工业化规模生产提供了技术支撑。
附图说明
图1是5号菌株菌落形态。
图2是5号菌株对薄蒴草、藜、密花香薷的盆栽防效，其中，图2A、图2B、图2C分别是薄蒴草、藜、密花香薷；
图3是5号菌株对密花香薷和藜的田间防效，其中，图3A、图3B分别是密花香薷和藜。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.材料与方法
1.1供试菌株
5号菌株层出镰刀菌Fusariumproliferatum由青海省农科院植保所有害生物防治综合实验室提供保存；已于2017年11月22日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14798。5号菌株菌落形态如图1所示。
1.2试验设计
1.2.1固体发酵基质单因素筛选
选用菜籽饼、玉米粉、羊粪、麦麸、珍珠岩和小麦秸秆作为基质。不同基质加入2％玉米粉、2％(NH4)2SO4，经121℃、30min高温灭菌后，按每瓶25g放入150ml三角瓶中，接种5ml菌液后25℃室内培养，观察记录菌落生长状况。10d后称取固体发酵物20g装入三角瓶中，加入无菌水充分振荡，获得孢子悬浮液，使用分光光度计法测定过滤的孢子悬浮液的OD值，同时测定不同基质的产孢量，确定产孢量高的底物基质。每处理设3个重复。
1.2.2碳、氮源单因素的确定
以PDA培养基作为基础培养基进行碳氮源单因素试验，用等质量的玉米粉(C1)、小麦粉(C2)、蔗糖(C3)、葡萄糖(C4)、麦麸(C5)、可溶性淀粉(C6)作为碳源。氮源NaNO3(N1)、大豆粉(N2)、酵母浸粉(N3)、(NH4)2SO4(N4)、蛋白胨(N5)、酒糟(N6)为氮源，按照质量浓度2％的添加量，将各碳氮源添加到基础培养基中，配制成不同的碳氮源培养基，取经活化直径8mm的菌饼作为接种体接入皿中。以不添加碳氮源的基质作为对照，每处理2个重复。测量菌落直径，加入无菌水充分振荡，获得孢子悬浮液，使用分光光度计法测定过滤的孢子悬浮液的OD值。
1.2.3固-液发酵条件的优化
采用L25(57)正交表，测定碳源、氮源、初始含水量、接种量、初始pH值、培养时间、培养温度7种因素对菌株5号活菌数的影响，每种因素各取5个水平。根据配方配制不同处理的固态发酵培养基，经121℃灭菌30min，降温后依次接入5号发酵液，搅拌均匀，置于生化培养箱中静置培养。不同处理自然风干、粉碎，平板菌落计数法测定不同处理的活菌数。每个处理设3次重复。
表1菌株5号工艺优化的正交设计方案
表2正交试验的不同处理水平
1.2.4采用本发明制备得到的菌株5号的发酵液在除草方面的应用
将田间生长6～10叶期，叶色正常的藜、薄蒴草、密花香薷移栽于花盆(Φ＝15cm)中，于实验室内培养；将5号真菌按以上方法培养后，稀释成孢子量为108个·mL-1的发酵液后喷雾接种到移栽的健康杂草植株上，接种量为30mL/盆。以接种PDB培养液的植株作为空白对照；接种后的杂草植株置于室温，12h光暗交替培养。7d后调查杂草发病程度，称鲜重，计算发病率、鲜重效、病情指数，所有数据采用DPS统计软件进行差异显著性分析。同时将该菌株喷雾接种到非耕地4-6叶期藜、密花香薷杂草植株上，观察其控制效果。
2.试验结果
2.1固态发酵基质筛选
表3菌株在不同固态基质的产孢量及孢子液吸光值差异显著性分析
结合孢子悬浮液孢子浓度和分光光度值存在正比关系关系，由表1可以看出：5号生长较好的固态基质为麦麸>玉米粉>小麦秸秆>羊粪>珍珠岩>菜籽饼；在产孢量方面，麦麸和其它基质之间存在极显著性差异，肉眼观察5号在麦麸等上菌丝生长旺盛。羊粪、珍珠岩和菜籽饼之间不存在显著性差异。
2.2碳、氮源单因素的确定
用血球计数法和分光光度计法测定5号在不同碳氮源培养基的产孢量和菌悬液OD值，试验结果记录如下：
表4 5号在不同碳源培养基的菌落直径及菌悬液OD值比较
注：同列数据后标不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下表同。
由上表可以看出，5号在C1玉米粉作为碳源的培养基上生长状态最好，其次是小麦粉、麦麸、蔗糖，但菌落生长5d直径与菌悬液OD值均与C1玉米粉的生长状况相比存在显著差异，故以玉米粉作为5号的最适碳源。
表5 5号在不同氮源培养基的菌落直径及菌悬液OD值比较
N源方面，5号在N4(NH4)2SO4上生长最好，菌悬液OD值为0.7641，菌落生长5d后菌落直径为72.83mm，其次为N3酵母浸粉、N2大豆粉、N7酒糟，各处理与C1玉米粉的生长状况相比存在显著差异，故选择(NH4)2SO4为5号的最适氮源。
2.3生防菌株5号固-液发酵条件的优化
对5号菌株固态发酵进行正交设计得到49个处理(表3)，5号菌株固态发酵的正交统计分析结果(表4)表明：试验的7种因素中极差R值从大到小依次为：培养时间(2.16)、接种量(1.10)、培养温度(0.9)、碳源(0.83)、初始含水量(0.74)、初始PH(0.65)、氮源(0.53)。因此，影响5号菌株固态发酵条件的因素作用由大到小依次为：培养时间>接种量>培养温度>碳源>初始含水量>初始PH>氮源。
表6 5号菌株固态发酵菌粉含孢量的正交试验直观分析表
表7 5号菌株固态发酵菌粉含孢量的正交试验结果
注：Ai表示同一列中编号为i的指标的试验结果之和。
2.4采用本发明制备得到的菌株5号的发酵液在除草方面的应用
5号菌株的最佳固态发酵条件，N源(NH4)2SO443mg/g、C源玉米粉48.4mg/g、最适培养基质初始含水量为258mg/g、最适接种量为0.26mL/g、初始批pH值7.6、最佳培养时间培养时间和培养温度是120h、30.7℃。
喷施菌株5号发酵液后，3种杂草表现出不同程度的受害症状，藜叶片出现萎蔫，茎叶发黄，密花香薷表现为叶片卷曲发黑，出现大面积病斑。薄蒴草叶片出现黄化、干枯。结合发病率、鲜重效综合分析(见表8)，该菌株发酵液对藜致病效果突出，与其它阔叶杂草相比差异显著。同时将该菌株喷雾接种到非耕地4-6叶期藜和密花香薷杂草植株上，发现该菌株对这2种杂草具有显著的除草活性，目测防效达95％以上(图3)。因此，5号菌株可作为防除藜和密花香薷的候选菌株，进行开发应用。
表8 5号菌株发酵液对3种杂草致病力
注:同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
生防菌的固态发酵基质的选取一般都是价格低廉、容易获得的农副产品下脚料，既节约了生产的成本，又符合现代可持续发展战略。本发明中筛选出的生防菌株5号最适产孢固态基质麦麸，更适用于大批量生产，方便菌剂储存和运输。除了以上生防菌剂固态发酵的影响因素之外，适宜的助剂在很大程度上也影响制剂的生物活性和稳定性，因此，下一步有必要对该菌的载体助剂进行筛选，为该菌株剂型的制备提供基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一株层出镰孢菌的培养方法，其特征在于，该菌株为5号菌株层出镰刀菌，已于2017年11月22日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14798，固体发酵基质为麦麸，培养条件为：N源(NH4)2SO443mg/g、C源玉米粉48.4mg/g、培养基质初始含水量为258mg/g、接种量为0.26mL/g、初始pH值7.6、培养时间120h、培养温度是30.7℃。
2.权利要求1所述方法培养出的层出镰孢菌的发酵液在除草剂制备过程中的应用。
3.根据权利要求2所述的层出镰孢菌的发酵液在除草剂制备过程中的应用具体应用，其特征在于，包括以下步骤：将层出镰孢菌按以上培养方法培养，稀释成孢子量为108个·mL-1的发酵液后喷雾接种到移栽的健康杂草植株上，接种量为30mL/盆，花盆的规格为Φ＝15cm。
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