CN113583879A - 一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用。所述秸秆酶解组合物包括层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶，利用所述秸秆酶解组合物处理秸秆的方法包括：使用芬顿试剂对秸秆进行预处理，再使用所述秸秆酶解组合物对所述秸秆进行酶解。本发明中，将层生镰刀菌的分泌蛋白作为纤维素酶的补充添加剂或其辅助酶使用，能够提高纤维素酶的酶解效果，提高玉米秸秆的转化率以及还原糖的得率，实现农业废弃物资源的高效利用，同时也为层生镰刀菌的资源化利用提供了一条新途径。

Description

一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业生物质资源利用技术领域，尤其涉及一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用。
背景技术
秸秆是我国最主要的农业废弃物，其主要成分为木质纤维素，占总干质量的90％以上，经酶水解后可以产生低聚糖、戊糖和己糖等，进一步经微生物转化可产生多种生物质能源以及重要化学品，是一种具有很大潜力的可再生资源。
然而，天然的木质纤维素材料具有十分精细严整的生物结构与化学结构，对于生物和机械降解具有高度的顽抗性，严重阻碍了木质纤维素的利用效率。为了克服木质纤维素的顽固结构并尽可能释放被锁定的多糖，通常首先利用预处理手段改变木质素、半纤维素和纤维素之间的相互作用，进一步利用木质纤维素降解酶使纤维素和半纤维素降解为低聚糖。
CN106480128A公开了一种利用乳酸/盐酸胍提取半纤维素以提高水稻秸秆中纤维素酶解效率的绿色方法。此发明首先以乳酸/盐酸胍为溶剂，对水稻秸秆进行预处理，经过滤分离得到残渣，干燥后即得预处理后的水稻秸秆；以水稻秸秆残渣为底物，利用纤维素酶对其进行酶解，最后得到以葡萄糖为主的糖液。然而，此发明中以深度共熔物乳酸/盐酸胍作为溶剂预处理水稻秸秆，采用的预处理试剂成本较高，且纤维素酶的酶解效率仍然较低。
降解复杂的天然木质纤维素材料通常需要纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、木质素酶等诸多酶系的协同作用。目前商业化的木质纤维素降解酶大多来源于木霉属和曲霉属，这类真菌分泌降解木质纤维素的胞外酶主要是一类降解多聚糖的胞外水解酶，也包含部分独特降解木质素及酚环类化合物的氧化酶。
CN102605019A公开了一种多酶协同提高玉米秸秆酶解产糖量的方法，具体为以高温热水预处理后玉米秸秆的不溶性固体为底物，加入一定量纤维素酶和从大麦种子发芽中提取的麦芽酶，置于一定温度下进行酶解。此发明在产糖量相同的情况下，大大减少了纤维素酶的用量，降低酶解成本。解决了玉米秸秆类生物质酶解时纤维素酶用量大，酶解效率低的问题。然而，此发明中所述麦芽酶来源于大麦种子，且其酶活力受提取方法限制，提取成本较高，因此，不适用于大规模处理农业废气物时使用。
因此，提供一种合适的纤维素辅助酶，是提高商业化纤维素酶酶解效率的有效手段。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种秸秆酶解组合物及其制备方法和应用。所述秸秆酶解组合物以层生镰刀菌分泌蛋白作为辅助酶，促进纤维素酶分解秸秆中的木质纤维素降解，从而提高秸秆等农业废弃物的处理效率，提高木质纤维素的利用度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于秸秆酶解的层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，所述层生镰刀菌为YNF15-10，其保藏编号为CGMCC No.22476，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2021年6月17日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
本发明中，所述层生镰刀菌菌株通过本领域常规技术手段分离得到，并经过鉴定。所述层生镰刀菌菌株分泌的蛋白能够用于分解秸秆，且所述蛋白与纤维素酶联用，能够达到较高的分解效率。
第二方面，本发明提供一种秸秆酶解组合物，包括层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶。
层生镰刀菌中具有与木霉真菌完全不同的木质纤维素酶系，将其分泌蛋白作为以木霉菌来源的纤维素酶的补充添加剂或其辅助酶使用，能够帮助纤维素酶提高其木质素降解酶和果胶降解酶活性，进而提高纤维素酶对木质纤维素材料的酶解效果。
作为本发明优选的技术方案，所述层生镰刀菌分泌蛋白包括第一方面所述的层生镰刀菌分泌的蛋白。
本发明中，所述纤维素酶为从市场购得的商业化纤维素酶，包括但不限于Novozymes CellicCTec2和GC220等。
优选地，所述层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶的使用量比值为1g:(25～50)FPU，例如可以是1g:25FPU、1g:30FPU、1g:35FPU、1g:40FPU、1g:45FPU或1g:50FPU等，优选为1g:50FPU。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的秸秆酶解组合物的制备方法，所述制备方法包括：
将层生镰刀菌菌种活化后，接种至诱导培养基中培养，过滤得到层生镰刀菌分泌蛋白，再与纤维素酶混合后得到所述秸秆酶解组合物。
本发明提供的制备方法主要包括层生镰刀菌分泌蛋白的制备方法，即在培养基中培养层生镰刀菌后对其发酵液进行提取即可得到。
但是，所述层生镰刀菌分泌蛋白的制备方法并不局限于此，也可以先对所述分泌蛋白的氨基酸序列进行分析，得到氨基酸序列之后直接进行体外合成或者构建外源表达体系进行表达，均可得到本发明中所述的层生镰刀菌分泌蛋白。
作为本发明优选的技术方案，所述诱导培养基包括：玉米麸皮、葡萄糖、酵母粉、酒石酸铵、微量元素或维生素中的任意一种或至少两种的组合。
将活化后的层生镰刀菌转接至诱导培养基时，以2～3个菌饼/100mL培养液的接种量进行接种，所述菌饼的直径约为0.6cm。
优选地，所述诱导培养基中玉米麸皮的质量百分含量为0.5％～1％，例如可以是0.6％、0.7％、0.8％或0.9％等。
优选地，所述诱导培养基中葡萄糖的质量百分含量为0.5％～1％，例如可以是0.6％、0.7％、0.8％或0.9％等。
优选地，所述诱导培养基中酵母粉的质量百分含量为0.1％～0.2％，例如可以是0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％或0.19％等。
优选地，所述诱导培养基中酒石酸铵的质量百分含量为0.1％～0.2％，例如可以是0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％或0.19％等。
优选地，所述微量元素包括K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+或Cu2+中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述维生素包括维生素B1(VB1)、维生素B2(VB2)、维生素B3(VB3)、维生素B6(VB6)、维生素B9(VB9)、泛酸钙、氯化胆碱、对氨基苯甲酸或肌糖中的任意一种或至少两种的组合。
示例性地，所述诱导培养基，以1L容量为例，配方如下：
玉米麸皮5～10g，葡萄糖5～10g，酵母粉1～2g，酒石酸铵1.84g，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.3g，二水氯化钙(CaCl2·2H2O)0.1～0.2g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5～1g，七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.07～0.14g，水合硫酸锰(MnSO4·H2O)0.035～0.07g，七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.046～0.092g，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.007～0.014g，维生素溶液1mL。
示例性地，所述维生素溶液，以100mL容量为例，配方如下：
VB1 10mg，泛酸钙50mg，氯化胆碱100mg，VB2 5mg，对氨基苯甲酸5mg，VB9 5mg，VB65mg，VB3 50mg和肌糖100mg。
作为本发明优选的技术方案，所述活化使用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
所述PDA培养基以1L容量为例，配方如下：新鲜去皮土豆200g，加入1000mL蒸馏水煮沸20～30min，多层纱布过滤除去残渣，加入葡萄糖20g、琼脂粉15～20g，加热溶解并用蒸馏水定容至1000mL。
优选地，所述培养的时间为7天～10天，例如可以是8天、8.5天或9天等。
优选地，所述培养的温度为23℃～27℃，例如可以是24℃、25℃或26℃等。
优选地，所述培养时的摇床转速为100rpm～120rpm，例如可以是102rpm、105rpm、110rpm、112rpm、115rpm或118rpm等。
优选地，所述过滤为采用0.45μm的滤膜进行过滤。
第四方面，本发明还提供一种秸秆的酶解方法，所述酶解方法使用如第一方面所述的层生镰刀菌或如第二方面所述的秸秆酶解组合物进行酶解。
作为本发明优选的技术方案，所述酶解方法包括：使用芬顿试剂对秸秆进行预处理，再使用所述层生镰刀菌的发酵液或所述秸秆酶解组合物对所述秸秆进行酶解。
优选地，所述秸秆包括玉米秸秆。
优选地，所述秸秆与芬顿试剂的用量比为1g:(15～20)mL，例如可以是1g:16mL、1g:17mL、1g:18mL或1g:19mL等。
所述芬顿试剂的配方为：
100mL 1.5M～2M的H2O2溶液，100mL 10mM～15mM Fe2+溶液(含有Fe2+的溶液可以是FeSO4·7H2O或FeCl2·4H2O等)，混匀。
优选地，所述预处理的时间为60h～84h，例如可以是62h、64h、65h、68h、70h、72h、75h、78h、80h或82h等。
优选地，所述预处理中还包括搅拌的操作。
优选地，所述预处理结束后，还包括将所述秸秆烘干的操作。
优选地，所述烘干的温度为75℃～105℃，例如可以是78℃、80℃、85℃、90℃、95℃、98℃或100℃等，时间为8h～12h，例如可以是8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h或11.5h等。
使用含有H2O2和Fe2+的芬顿试剂对秸秆进行预处理，降低木质纤维素对于生物和机械降解的顽抗性，改变木质素、半纤维素和纤维素之间的相互作用，进而提高纤维素酶在降解时的效率。
优选地，所述酶解方法中，所述秸秆酶解组合物中的层生镰刀菌分泌蛋白以溶液剂形式存在，所述层生镰刀菌分泌蛋白在溶液剂中的浓度为11～15mg/mL，例如可以是11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL或15mg/mL等。
优选地，所述秸秆与层生镰刀菌分泌蛋白溶液的质量比为1:(0.44～0.6)，例如可以是1:0.44、1:0.46、1:0.48、1:0.5、1:0.52、1:0.54、1:0.56、1:0.58或1:0.6等。
优选地，所述秸秆与纤维素酶的用量比为1g:(15～30)FPU，例如可以是1g:15FPU、1g:16FPU、1g:18FPU、1g:20FPU、1g:22FPU、1g:24FPU、1g:26FPU、1g:28FPU或1g:30FPU等。
优选地，所述酶解的pH为4.5～5，例如可以是4.6、4.7、4.8或4.9等，优选为4.8。
优选地，所述酶解的温度为45～55℃，例如可以是46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃或54℃等，优选为48～50℃。
优选地，所述酶解的时间为60～84h，例如可以是62h、64h、65h、68h、70h、72h、75h、78h、80h或82h等。
优选地，所述酶解的振荡速度为120～150rpm，例如可以是125rpm、130rpm、135rpm、140rpm或145rpm等。
作为本发明优选的技术方案，所述酶解方法包括如下步骤：
(1)将玉米秸秆与芬顿试剂以1g:(15～20)mL的比例混合，18～28℃下静置处理60h～84h，所述处理过程中每隔8h～12h搅拌1min～5min，结束后使用蒸馏水清洗所述玉米秸秆，烘干；
(2)将步骤(1)所得玉米秸秆与所述秸秆酶解组合物混合，所述玉米秸秆与秸秆酶解组合物中的层生镰刀菌分泌蛋白溶液的用量比为1:(0.44～0.6)，所述玉米秸秆与秸秆酶解组合物中的纤维素酶的用量比为1g:(15～30)FPU；
其中，所述层生镰刀菌分泌蛋白的制备方法包括：
将层生镰刀菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行活化，再接种至诱导培养基中培养，培养时间为7天～10天，培养温度为23℃～27℃，采用0.45μm的滤膜进行过滤，得到所述层生镰刀菌分泌蛋白；
使用氢氧化钠将混合后溶液的pH调节至4.5～5，于45℃～55℃、120rpm～150rpm的条件下酶解60h～84h。
示例性地，本发明提供一种玉米秸秆的酶解方法，具体包括如下步骤：
(1)玉米秸秆预处理：1L锥形瓶中加入10g干秸秆，200mL芬顿试剂，混匀，每12h搅拌混匀一次，室温下静置处理84h，处理后用蒸馏水清洗干净，100℃烘干12h；
(2)层生镰刀菌分泌蛋白的制备：将层生镰刀菌在PDA平板上活化3天；以2个菌饼(直径约0.6cm)/100mL培养液的接种量接种至诱导培养基中，25℃，120rpm培养7天，采用0.45μm PVDF膜过滤，收集滤液即得到层生镰刀菌分泌蛋白，所得滤液中层生镰刀菌分泌蛋白的浓度为11～15mg/mL；
(3)玉米秸秆酶解：100mL锥形瓶中加入层生镰刀菌分泌蛋白40mL和步骤(1)预处理后的玉米秸秆1g，添加15FPU纤维素酶，采用5M NaOH溶液调节pH值为4.8，于48℃、120rpm的条件下酶解84h。
第四方面，本发明还提供一种如第一方面所述的秸秆酶解组合物在处理农业废弃物中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种秸秆酶解组合物，以常见作物的致病菌即层生镰刀菌的分泌蛋白作为辅酶，来改善商业化纤维素酶的酶解效果，显著地提高了玉米秸秆的转化率以及还原糖的得率，不仅实现了资源的高效利用，也为层生镰刀菌及其他镰刀菌的资源化利用提供了一条新途径；
(2)本发明中提供的秸秆酶解方法，先采用芬顿试剂进行预处理，再结合层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶进行酶解，其中，预处理步骤能够降低木质纤维素对于生物和机械降解的顽抗性，改变木质素、半纤维素和纤维素之间的相互作用，酶解步骤中纤维素酶在层生镰刀菌分泌蛋白的帮助下，能够帮助纤维素酶提高其木质素降解酶和果胶降解酶活性；
因此本发明提供的秸秆酶解方法具有较高的木质素降解效率，其酶解液中总还原糖的含量可达168.94～196.11mg/g秸秆，相比于未添加层生镰刀菌分泌蛋白时，其含量提高了65.82～109.02％，效果十分显著。
附图说明
图1为实施例1～3与对比例1～3中在使用不同酶解试剂后产物中的还原糖产量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，所述室温均为25℃。
以下实施例中，所用玉米秸秆取自河南省巩义市，粉碎后过10目(2mm)筛，105℃烘干至恒重；所述纤维素酶为Novozymes CellicCTec2。
以下实施例中，所述芬顿试剂的配方以200mL为例，包括：20mL 30％H2O2溶液，250mg FeCl2·4H2O，蒸馏水补足体积至200mL；
所述PDA培养基，以1L容量为例，配方如下：新鲜去皮土豆200g，加入1000mL蒸馏水煮沸20min，多层纱布过滤除去残渣，加入葡萄糖20g、琼脂粉20g，加热溶解并用蒸馏水定容至1000mL；
所述诱导培养基，以1L容量为例，配方如下：玉米麸皮5g，葡萄糖5g，酵母粉1g，酒石酸铵1.84g，KH2PO4 1.3g，CaCl2·2H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.07g，MnSO4·H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O 0.046g，CuSO4·5H2O 0.007g，维生素溶液1mL；
所述维生素溶液，以100mL容量为例，配方如下：VB1 10mg，泛酸钙50mg，氯化胆碱100mg，VB2 5mg，对氨基苯甲酸5mg，VB9 5mg，VB6 5mg，VB3 50mg，肌糖100mg。
实施例1
本实施例提供一种玉米秸秆的酶解方法，具体包括如下步骤：
(1)玉米秸秆预处理：
1L锥形瓶中加入10g干秸秆，200mL芬顿试剂，搅拌均匀，室温下静置72h，每12h搅拌5min，而后过滤收集残渣，105℃烘干16h；
(2)分泌蛋白制备：
将保藏编号为CGMCC No.22476的层生镰刀菌菌株(F.proliferatum)YNF15-10在PDA平板上25℃培养3天，获得活化菌株，活化好的层生镰刀菌接种至诱导培养基中，接种量按照2个菌饼/100mL培养液进行，而后在25℃、120rpm条件下培养7天；
培养结束后，使用0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜过滤后收集滤液，即为层生镰刀菌分泌蛋白；
所得层生镰刀菌分泌蛋白的浓度为11mg/mL；
(3)玉米秸秆的酶解：
将步骤(2)中获得的层生镰刀菌分泌蛋白40mL加入1g步骤(1)预处理后的玉米秸秆，再添加15FPU Novozymes CellicCTec2纤维素酶；
采用5M NaOH溶液调节pH值为4.8，于48℃，120rpm振荡酶解72h；
酶解结束后，采用DNS法测定酶解液中总还原糖产量作为酶解效果的评价指标。
实施例2
本实施例提供一种玉米秸秆的酶解方法，具体包括如下步骤：
(1)玉米秸秆预处理：
1L锥形瓶中加入10g干秸秆，150mL芬顿试剂，搅拌均匀，室温下静置60h，期间每12h搅拌5min，而后过滤收集残渣，90℃烘干15h；
(2)分泌蛋白制备：
将保藏编号为CGMCC No.22476的层生镰刀菌菌株(F.proliferatum)YNF15-10在PDA平板上25℃培养3天，获得活化菌株，活化好的镰刀菌接种至诱导培养基中，接种量按照3个菌饼/100mL培养液进行，而后在25℃、120rpm条件下培养9天；
培养结束后，使用0.45μm PVDF膜过滤后收集滤液，即为层生镰刀菌分泌蛋白；
所得层生镰刀菌分泌蛋白的浓度为13mg/mL；
(3)玉米秸秆的酶解：
将步骤(2)中获得的层生镰刀菌(F.proliferatum)分泌蛋白40mL加入1g步骤(1)预处理后的玉米秸秆，添加30FPU Novozymes CellicCTec2纤维素酶，采用5M NaOH溶液调节pH值为4.8，于55℃，120rpm振荡酶解60h；
酶解结束后，采用DNS法测定酶解液中总还原糖产量作为酶解效果的评价指标。
实施例3
本实施例提供一种玉米秸秆的酶解方法，具体包括如下步骤：
(1)玉米秸秆预处理：
1L锥形瓶中加入10g干秸秆，180mL芬顿试剂，搅拌均匀，室温下静置84h，期间每10h搅拌3min，而后过滤收集残渣，105℃烘干12h；
(2)分泌蛋白制备：
将保藏编号为CGMCC No.22476的层生镰刀菌菌株(F.proliferatum)YNF15-10在PDA平板上25℃培养3天，获得活化菌株，活化好的层生镰刀菌接种至诱导培养基中，接种量按照3个菌饼/100mL培养液进行，而后在27℃、100rpm条件下培养10天；
培养结束后，使用0.45μm PVDF膜过滤后收集滤液，即为层生镰刀菌分泌蛋白；
所得层生镰刀菌分泌蛋白的浓度为15mg/mL；
(3)玉米秸秆的酶解：
将步骤(2)中获得的层生镰刀菌分泌蛋白40mL加入1g步骤(1)预处理后的玉米秸秆，添加30FPU Novozymes CellicCTec2纤维素酶，采用5M NaOH溶液调节pH值为5.0，于45℃，150rpm振荡酶解84h；
酶解结束后，采用DNS法测定酶解液中总还原糖产量作为酶解效果的评价指标。
对比例1
与实施例1的区别在于，本对比例中，仅使用15FPU Novozymes CellicCTec2纤维素酶对玉米秸秆进行酶解，不添加层生镰刀菌分泌蛋白，其余步骤及反应条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的区别在于，本对比例中，仅使用30FPU Novozymes CellicCTec2纤维素酶对玉米秸秆进行酶解，不添加层生镰刀菌分泌蛋白，其余步骤及反应条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1的区别在于，本对比例中，将芬顿试剂替换为质量浓度为1％的稀硫酸，其余步骤及反应条件与实施例1相同。
各实验例的总还原糖浓度的测试结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003192084180000131
同时，实施例1～3与对比例1～2的还原糖产量对比如图1所示，图中，“*”表示实施例1～3和对比例2的差异极显著(p＜0.01)，“N.S.”表示对比例1和对比例2无显著差异。
结合表1与图1可知，对比例1中，采用15FPU/g秸秆的Novozymes CellicCTec2的秸秆经72h酶解后，总还原糖产量为93.82mg/g秸秆，进一步增加纤维素酶的使用量，如对比例2中，增加至30FPU/g秸秆时还原糖总产量为101.88mg/g秸秆，并无显著的提升效果；
使用本发明提供的层生镰刀菌的分泌蛋白作为辅助酶，协同15FPU或30FPUNovozymes CellicCTec2后，其效果比对比例1和对比例2提高了65.82％～109.02％，效果十分显著，表明本发明中，利用层生镰刀菌分泌蛋白作为一种辅酶以提高商业化纤维酶对秸秆的酶解效果是一种高效可行的方法。
同时，由实施例1与对比例3比较可知，本发明中，采用芬顿试剂进行预处理，结合层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶进行酶解，能够明显提高酶解效果；
若是不采取预处理步骤或采用其他试剂进行预处理，如对比例3中，使用1％的稀硫酸进行预处理秸秆后的还原糖含量为122.73mg/g秸秆，比实施例1降低了27.35％，但高于对比例1和2的还原糖含量，说明经芬顿试剂处理后的秸秆经层生镰刀菌分泌蛋白和商业化纤维素酶处理能显著提高酶解效果。
此外，本发明中同时测试了包括Fusarium meridionale(南方镰刀菌)、Fusariumtemperatum(温和镰刀菌)等在内的多种菌株分泌蛋白的酶解效果；所得结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003192084180000141
在参照实施例1的条件下，F.meridionale(某市售的南方镰刀菌)分泌蛋白与纤维素酶联用，其总还原糖产量为132.74mg/g秸秆；F.temperatum(某市售的温和镰刀菌)分泌蛋白为124.65mg/g秸秆，酶解效率均远远小于本发明中提供的层生镰刀菌；
同时，本发明中还选用其他层生镰刀菌(某市售的层生镰刀菌)的分泌蛋白，但酶解效果也劣于本发明中保藏编号为CGMCC No.22476的层生镰刀菌。
综上所述，本发明提供的玉米秸秆的酶解方法，先采用芬顿试剂进行预处理，再结合层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶进行酶解，预处理步骤提前改变了木质纤维素酶的结构，酶解步骤中纤维素酶在层生镰刀菌分泌蛋白的帮助下，能够帮助纤维素酶提高其木质素降解酶和果胶降解酶活性，进而提高纤维素酶对木质纤维素材料的酶解效果。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于秸秆酶解的层生镰刀菌，其特征在于，所述层生镰刀菌为层生镰刀菌YNF15-10，保藏编号为CGMCC No.22476，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2021年6月17日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种秸秆酶解组合物，其特征在于，包括层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶；
优选地，所述层生镰刀菌分泌蛋白包括权利要求1所述的层生镰刀菌分泌的蛋白；
优选地，所述层生镰刀菌分泌蛋白和纤维素酶的使用量比值为1g:(25～50)FPU，优选为1g:50FPU。
3.一种如权利要求2所述的秸秆酶解组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将层生镰刀菌菌种活化后，接种至诱导培养基中培养，过滤得到层生镰刀菌分泌蛋白，再与纤维素酶混合后得到所述秸秆酶解组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导培养基包括：玉米麸皮、葡萄糖、酵母粉、酒石酸铵、微量元素或维生素中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述诱导培养基中玉米麸皮的质量百分含量为0.5％～1％；
优选地，所述诱导培养基中葡萄糖的质量百分含量为0.5％～1％；
优选地，所述诱导培养基中酵母粉的质量百分含量为0.1％～0.2％；
优选地，所述诱导培养基中酒石酸铵的质量百分含量为0.1％～0.2％；
优选地，所述微量元素包括K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+或Cu2+中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、泛酸钙、氯化胆碱、对氨基苯甲酸或肌糖中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述活化使用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
优选地，所述培养的时间为7天～10天；
优选地，所述培养的温度为23℃～27℃；
优选地，所述培养时的摇床转速为100rpm～120rpm；
优选地，所述过滤为采用0.22μm或0.45μm的滤膜进行过滤。
6.一种秸秆的酶解方法，其特征在于，所述酶解方法中使用如权利要求1所述的层生镰刀菌或如权利要求2所述的秸秆酶解组合物进行酶解。
7.根据权利要求6所述的酶解方法，其特征在于，所述酶解方法包括：
使用芬顿试剂对秸秆进行预处理，再使用所述层生镰刀菌的发酵液或所述秸秆酶解组合物对所述预处理后的秸秆进行酶解。
8.根据权利要求7所述的酶解方法，其特征在于，所述秸秆包括玉米秸秆；
优选地，所述秸秆与芬顿试剂的用量比为1g:(15～20)mL；
优选地，所述预处理的时间为60h～84h；
优选地，所述预处理中还包括搅拌的操作；
优选地，所述预处理结束后，还包括将所述秸秆烘干的操作；
优选地，所述酶解方法中，所述秸秆酶解组合物中的层生镰刀菌分泌蛋白以溶液剂形式存在，所述层生镰刀菌分泌蛋白在溶液剂中的浓度为11～15mg/mL；
优选地，所述秸秆与所述溶液剂的质量比为1:(0.44～0.6)；
优选地，所述秸秆与纤维素酶的用量比为1g:(15～30)FPU；
优选地，所述酶解的pH为4.5～5，优选为4.8；
优选地，所述酶解的温度为45℃～55℃，优选为48℃～50℃；
优选地，所述酶解的时间为60h～84h；
优选地，所述酶解的振荡速度为120rpm～150rpm。
9.根据权利要求6～8任一项所述的酶解方法，其特征在于，所述酶解方法包括如下步骤：
(1)将玉米秸秆与芬顿试剂以1g:(15～20)mL的比例混合，18～28℃下静置处理60h～84h，所述处理过程中每隔8h～12h搅拌1min～5min，结束后使用蒸馏水清洗所述玉米秸秆，烘干；
(2)将步骤(1)所得玉米秸秆与所述秸秆酶解组合物混合，所述玉米秸秆与秸秆酶解组合物中的层生镰刀菌分泌蛋白溶液的用量比为1:(0.44～0.6)，所述玉米秸秆与秸秆酶解组合物中的纤维素酶的用量比为1g:(15～30)FPU；
其中，所述层生镰刀菌分泌蛋白的制备方法包括：
将层生镰刀菌菌种接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行活化，再接种至诱导培养基中培养，培养时间为7天～10天，培养温度为23℃～27℃，采用0.45μm的滤膜进行过滤，得到所述镰刀菌分泌蛋白；
使用氢氧化钠将混合后溶液的pH调节至4.5～5，于45℃～55℃、120rpm～150rpm的条件下酶解60h～84h。
10.如权利要求1所述的层生镰刀菌或如权利要求2所述的秸秆酶解组合物在处理农业废弃物中的应用。
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