CN105695356A - 利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法 - Google Patents

利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法，包括：1)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束后，得到第一轮菌藻共培养液；2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；3)对第二轮菌藻共培养液进行细胞分离，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。本发明中，蛋白核小球藻活细胞沉淀经洗涤重悬后可作为水中偶氮染料降解等污水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得小球藻细胞干品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、色素和生长因子等相关生物产品的原料。

Description

利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法
技术领域
本发明涉及微生物和生物技术领域，具体涉及一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法。
背景技术
小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养，细胞中含有丰富的营养物质，广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精细化加工品和作为医药制剂原料，其开发利用已经引起国内外广泛的重视。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等，其中蛋白核小球藻藻粉粗蛋白核必需氨基酸含量高，是一种优良的饲料蛋白源(李国平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和饲用价值分析.中国野生植物资源.2003，22(2):23-25)。蛋白核小球藻还可以清除废水中不同形态的氮和磷，可用于工厂化水产养殖废水的净化处理(陈海敏等，工厂化水产养殖废水菌藻联合处理模式研究.浙江树人大学学报，2002，2(4)：64-67)，还能利用偶氮染料为唯一氮源和碳源生长，对印染废水中的偶氮染料具有较强的脱色能力(郑金来等，生物降解常见染料的研究进展.环境污染治理技术与设备，2000，1(3):39-43)。因此，如何在提高细胞生长速率，短时间内获得大量的藻细胞是开发应用蛋白核小球藻的关键技术环节。
已有研究表明微藻和微生物之间存在从寄生到共生等广泛的互作现象，某些微生物对藻细胞的生长代谢影响显著某些微生物对藻细胞的生长代谢影响显著，能促进藻细胞生长和生化组分的积累[UedaH,etal.BacterialcommunitiesconstructedinartificialconsortiaofbacteriaandChlorellavulgaris.MicrobesEnvironment,2010,25(1):36-40.]。植物内生菌是能够定殖在健康植物内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物。水稻植株含有许多内生微生物，是重要的内生细菌资源，来源于水稻植株的内生泛菌可以显著促进宿主水稻的生长，提高其生物量、叶绿素及磷含量的生物学作用(FengY,etal.RiceendophytePantoeaagglomeransYS19promoteshostplantgrowthandaffectsallocationsofhostphotosynthates.JournalofAppliedMicrobiology,2006,100(5):938-945.刘佳,等.内生成团泛菌HAUM1对宿主水稻的定殖及促生作用.湖北农业科学,2011,50(23):4820-4824.)。由于小球藻与植物细胞一样具有叶绿体，能够进行光合作用，其生化代谢特征与植物具有相似性，理论上，对植物具有代谢调节作用的植物内生菌也能影响小球藻的生长和代谢活动，但迄今国内外未见采用包括水稻内生菌在内的植物内生菌促进小球藻生长及生化组分合成积累的技术研究和应用。
发明内容
本发明提供了一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法，应用水稻内生泛菌进行两轮菌藻共培养，达到快速增加小球藻生长速率的目的效果。
一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，包括：
1)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束后，得到第一轮菌藻共培养液；
2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；
3)对第二轮菌藻共培养液进行细胞分离，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤1)中，所述的第一轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为6～12天。进一步优选，所述的第一轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为8天。
所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为1～10000：1，在一定范围内，水稻内生泛菌的比例越高，越能够促进小球藻的生长，越能够提高小球藻产量。进一步优选，所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为10～1000：1。
所述的水稻内生泛菌可采用市售产品，可采用中国农业微生物保藏中心(ACCC)出售的编码为10454的水稻内生泛菌菌种。
所述的小球藻可以为蛋白核小球藻，也可采用市售产品，可采用中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)市售的编号为FACHB-1222的蛋白核小球藻。
步骤2)中，所述的第二轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为2～12天。进一步优选，所述的第二轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为4～8天。
所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为0.25～4：1。进一步优选，所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为1：1，能够更好地促进小球藻的生长，越能够提高小球藻产量。
步骤3)中，所述的细胞分离包括：第二轮菌藻共培养液先在超声波条件下处理，之后离心，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
进一步优选，所述的超声波条件为：在140W～180W、30kHz～50kHz超声波条件下处理15s～45s。所述的离心为在1000～1400r/min低速离心3～10min。更进一步优选，所述的超声波条件为：在160W、40kHz超声波条件下处理30s。所述的离心为在1200r/min低速离心5min。在160W、40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
本发明中，小球藻细胞沉淀经洗涤重悬后可作为水中偶氮染料降解等污水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、色素和生长因子等相关生物产品的原料。
小球藻细胞沉淀经处理后得到小球藻细胞干品，所述的处理包括：洗涤、离心和干燥，将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经6000～10000r/min离心5～20min后收集，之后在30℃～50℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min后收集，之后在40℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。
一种制备生物饲料的方法，包括：
1)根据所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法制备得到小球藻细胞沉淀；
2)将小球藻细胞沉淀经洗涤、离心和干燥后得到小球藻细胞干品，将小球藻细胞干品制成生物饲料。
所述的洗涤、离心和干燥具体为：将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经6000～10000r/min离心5～20min后收集，之后在30℃～50℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min后收集，之后在40℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。
小球藻细胞干品可直接制作为藻生物饲料，也可以将小球藻细胞干品添加到饲料配方中，得到复合生物饲料。
本发明补菌增藻技术的机理在于：在菌藻互作的共培养过程中，由于采用的是小球藻适合的培养基和培养条件，共生细菌能够促进微藻的生长，相反，微藻可能产生细菌生长抑制物质，如绿藻素等抑制菌细胞的增殖，如此随着培养周期的延长，菌藻培养液中藻细胞呈逐渐增长趋势，而菌细胞数量则逐渐衰减，会越来越少，最后菌藻培养体系中只有极少量的菌细胞存活。因此，菌对藻的增殖促进作用在一定范围内随接种菌藻比的增大而增大，而且在补菌初期的增藻效果比后期更为明显，这也是决定本发明所设定的接种菌藻比、共培养周期时段长短和补菌接种时间的技术基础。作为优选，本发明以接种菌藻比10-1000:1，首轮培养8天，第二轮及此后补菌共培养时间以4-8天为主，以达到理想的技术效果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，蛋白核小球藻活细胞沉淀经洗涤重悬后可作为水中偶氮染料降解等污水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、色素和生长因子等相关生物产品的原料。本发明技术操作简单，成本低廉，具有快速增加蛋白核小球藻细胞生长量的显著效果，采用本发明的两轮菌藻共培养技术可使蛋白核小球藻的活细胞获得量比对照提高23.68～93.97倍，在菌藻接种比为1000:1时，可使蛋白核藻细胞干重得率(mg/L)比对照提高60.10倍，蛋白核小球藻蛋白产率(mg/L)比对照提高54.08倍，在蛋白核小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。
本发明将水稻内生泛菌应用于小球藻的培养生产，创建了一种应用水稻内生泛菌增加蛋白核小球藻生长速率的两轮菌藻共培养技术，为小球藻的工业化生产提供了新途径。应用本发明的两轮菌藻共培养技术能快速增加蛋白核小球藻的生长速率，在短时间内获得大量蛋白核小球藻细胞，同时实现菌细胞的重复循环利用，操作简单，成本低，收益高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。给出的实施例仅为了阐释本发明，而不是为了限制本发明的应用范围。以下出现的百分数，如没有特别说明，均为质量百分数。
实施例一：
1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mLLB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养,将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第二次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-FormingUnits)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温25℃8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为，编号为FACHB-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mLBG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×106个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×105CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为10:1，混匀后进行首轮菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种蛋白核小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×105个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
4)共培养第9天，按菌藻共培养初始接种的水稻内生泛菌细胞浓度2×106CFU/mL补接种入水稻内生泛菌种子细胞，进行第二轮菌藻共培养，培养周期为4天。
5)两轮菌藻共培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液1ml采用血球计数板法测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果：纯藻培养对照组培养液中藻细胞浓度平均值为3.58×107个cell/mL，菌藻共培养组藻细胞浓度为9.50×108个cell/mL，同比是对照的23.68倍。
实施例二：
1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mLLB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养,将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第二次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-FormingUnits)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温25℃8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为，编号为FACHB-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mLBG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×107CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为100:1，混匀后进行首轮菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种蛋白核小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×105个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
4)共培养第9天，按菌藻共培养初始接种的水稻内生泛菌细胞浓度2×107CFU/mL补接种入水稻内生泛菌种子细胞，进行第二轮菌藻共培养，培养周期为4天。
5)两轮菌藻共培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液1ml采用血球计数板法测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果：纯藻培养对照组培养液中藻细胞浓度平均值为3.58×107个cell/mL，菌藻共培养组培养液中藻细胞浓度平均值为1.72×109个cell/mL，比对照增加47.05倍。。
实施例三：
1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mLLB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养,将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。连续扩培三次，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第三次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-FormingUnits)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温25℃8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为，编号为FACHB-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mLBG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×108CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为1000:1，混匀后进行首轮菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种蛋白核小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×105个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
4)共培养第9天，按菌藻共培养初始接种的水稻内生泛菌细胞浓度2×108CFU/mL补接种入水稻内生泛菌种子细胞，进行第二轮菌藻共培养，培养周期为4天。
5)两轮菌藻共培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液1ml采用血球计数板法测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果：纯藻培养对照组培养液中藻细胞浓度平均值为3.58×107个cell/mL，菌藻共培养组培养液中藻细胞浓度平均值为3.40×109个cell/mL，比对照增加93.97倍。
实施例四：
菌藻共培养组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×108CFU/mL，如此按菌藻细胞接种比为1000:1，进行两轮菌藻共培养，培养周期结束后，考察了菌藻分离技术效果。
1)培养周期结束后，菌藻共培养组取菌藻共培养液充分震荡混匀后，取1ml按10-2，10-4，10-6，10-8进行梯度稀释后，取稀释菌藻液100μL涂布于LB固体培养基进行倒置静置培养，培养条件为黑暗37℃，共设定三次重复实验，培养24小时后观察记录平板菌落个数，经计算测定出的菌藻共培养液中水稻内生泛菌有效活菌数浓度为1.8×107CFU/mL。
2)培养周期结束后，菌藻共培养组取菌藻共培养液在160W,40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞,如此重复超声波处理和离心分离2次,共3次,合并上清菌液。
3)菌藻共培养组将步骤2)离心获得的上清菌液收集并充分混匀后，取1ml按10-2，10-4，10-6，10-8进行梯度稀释后，取稀释藻液100μL涂布于LB固体培养基进行倒置静置培养，培养条件为黑暗37℃，共设定三次重复实验，培养24小时后观察记录平板菌落个数，经计算测定出的菌藻分离上清菌液中水稻内生泛菌有效活菌数浓度为1.74×107CFU/mL。对比步骤1)菌藻共培养液中水稻内生泛菌浓度，可知经步骤2)的菌藻分离处理，菌藻共培养液中水稻内生菌细胞的去除率达到96.67％(菌去除效率＝[1.74×107CFU/mL]/[1.8×107CFU/mL]＝96.67)，效果比较理想。
将此上清菌液8000r/min离心10min获得水稻内生泛菌菌体细胞沉淀，并接种至新鲜LB培养基培养至对数生长期作为再次菌藻共培养的菌体种子细胞，以实现菌细胞的重复循环利用。
实施例五：
菌藻共培养组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×108CFU/mL，如此按菌藻细胞接种比分别为1000:1，进行两轮菌藻共培养，第一轮8天，第二轮4天，同时设定纯藻培养对照组。培养周期结束后，考察了两轮菌藻共培养技术对蛋白核小球藻细胞干重、蛋白含量的影响效果，并考察以此藻细胞产品制备生物饲料的品质。
1)纯藻培养对照组获得小球藻细胞培养液直接经8000r/min离心10min收集藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表1；
2)菌藻共培养组获得的菌藻共培养液经超声波震荡和温和离心分离后获得的蛋白核小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min收集小球藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表1；
3)采半微量凯氏定氮法测定培养获得的蛋白核小球藻细胞的蛋白含量，以百分含量表示，结果见表1；
表1菌藻共培养对蛋白核小球藻细胞干重得率和蛋白含量的影响效果
注：表中数据为三组数据平均值。
菌藻共培养提高效率＝[(菌藻共培养组-纯藻培养对照组)/纯藻培养对照组]×100％
本实施例结果表明，采用本发明的两轮菌藻共培养技术可使蛋白核小球藻细胞干重得率提高60.10倍，虽然藻细胞蛋白含量比对照降低了9.85％，但由于藻细胞干重增加幅度大，此菌藻共培养技术使藻细胞蛋白产率比对照提高了54.08倍，促进效果十分显著。
将上述藻细胞干品直接作为生物饲料使用，该生物饲料性状为绿色粉状，质地叫膨松，有温和的藻香味，蛋白质含量为52.64％，可用于家畜、家禽以及水产动物的养殖。该产品也可按一定比例20％～80％的质量比与其他饲料组合配制成复合饲料，增加饲料的蛋白含量、色泽及口感。

Claims (10)

1.一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，包括：
1)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束后，得到第一轮菌藻共培养液；
2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；
3)对第二轮菌藻共培养液进行细胞分离，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
2.根据权利要求1所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的第一轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为6～12天。
3.根据权利要求1所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为1～10000：1。
4.根据权利要求1所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的第二轮菌藻共培养的条件为：培养条件均为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为2～12天。
5.根据权利要求1所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为0.25～4：1。
6.根据权利要求1所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的细胞分离包括：第二轮菌藻共培养液先在超声波条件下处理，之后离心，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
7.根据权利要求6所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，所述的超声波条件为：在140W～180W、30kHz～50kHz超声波条件下处理15s～45s。
8.根据权利要求6所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，其特征在于，所述的离心为在1000～1400r/min低速离心3～10min。
9.一种制备生物饲料的方法，其特征在于，包括：
1)根据权利要求1～8任一项所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法制备得到小球藻细胞沉淀；
2)将小球藻细胞沉淀经洗涤、离心和干燥后得到小球藻细胞干品，将小球藻细胞干品制成生物饲料。
10.根据权利要求9所述的制备生物饲料的方法，其特征在于，所述的洗涤、离心和干燥具体为：将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经6000～10000r/min离心5～20min后收集，之后在30℃～50℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。
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