CN114807047B - 一种高表达病毒的人胚胎肾细胞293及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高表达病毒的人胚胎肾细胞293及其用途。人胚胎肾细胞293(Wayne293cell line)，保藏编号为：CGMCC No.45137。本发明的Wayne 293cell line细胞具有密度高、瞬转效率高、病毒包装滴度高，能够高表达病毒的Wayne 293cell line细胞，最高密度方面可以达到6.7×106Cell/mL,比传统细胞高3×106CELL/mL；瞬转效率达到73％，比传统细胞高21％；病毒包装滴度达到5×1014vg/L,比传统细胞高4×1014vg/L，市场前景广阔。

Description

一种高表达病毒的人胚胎肾细胞293及其用途
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高表达病毒的人胚胎肾细胞293及其用途。
背景技术：
动物细胞表达的腺病毒药物销售额迅速增长，作为商业化生产腺病毒的核心技术之一的大规模动物细胞悬浮培养成为腺病毒药物发展的新瓶颈。其中之一主要技术限制就是国内没有自己的高效能商业化动物悬浮培养基，而SIGMA、Invitrogen、Hyclone和Lonza等国际知名培养基，每升高达上千元，且配方保密，不利于后续的培养工艺优化。故研制出自主品牌且低成本的无血清无动物来源培养基，对工艺优化与反应器放大，以满足大量表达基因治疗性病毒的需求，对于病毒药物的产业化的意义是非常重大的。
市场病毒药物70％以上都是由HEK203细胞宿主细胞表达。目前WAYNE293 LVPRO无法高表达病毒，本领域技术人员希望能够获得高表达病毒的WAYNE293 LVPRO细胞。
发明内容：
本发明提供一种Wayne 293cell line细胞，其具有密度高、瞬转效率高、病毒包装滴度高，能够高表达病毒的优点。
本发明的人胚胎肾细胞293(Wayne 293cell line)，其于2022年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.45137。
本发明的第二个目的是提供上述Wayne 293cell line细胞在表达病毒中的应用。
优选，所述的病毒是腺病毒。
本发明的第三个目的是提供一种利用Wayne 293cell line细胞表达病毒的方法，其是将病毒转染进入Wayne 293cell line细胞中，使Wayne 293cell line细胞表达病毒。
优选，所述的病毒是腺病毒。
本发明的Wayne 293cell line细胞具有密度高、瞬转效率高、病毒包装滴度高，能够高表达病毒的Wayne 293cell line细胞，最高密度方面可以达到6.7×106Cell/mL,比传统细胞高3×106CELL/mL；瞬转效率达到73％，比传统细胞高21％；病毒包装滴度达到5×1014vg/L,比传统细胞高4×1014vg/L，市场前景广阔。
人胚胎肾细胞293(Wayne 293cell line)，其于2022年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.45137
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、筛选方法：
a提前24小时在96孔板或24孔板中接种WAYNE293 LVPRO细胞(其公开于申请号CN202110688920.7，发明名称：一种适应无血清培养基环境的WAYNE293 LVPRO细胞及其应用的申请中，其保藏信息是：人胚胎肾细胞WAYNE 293于2021年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为：CGMCC No.22348)8孔，接种量以第二天长成25％单层为宜，置CO2孵箱中37℃培养过夜。
b将培养液换成含聚乙烯亚胺(PEI)的WAYNE293培养基(购自中山康天晟合生物技术有限公司，其产品名称是A21501)，聚乙烯亚胺(PEI)浓度按梯度递增(0,50,100,200,400,600,800和1000μg/ml)。
c培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准，一般为400-800μg/ml，筛选克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半。
2.转染
b.以5×105个/ml的细胞浓度接种筛选后的WAYNE293 LVPRO细胞，37℃，120rpm摇床培养4天后，WAYNE293 LVPRO细胞浓度达到5-10×106个/ml。
c.做脂转complex，按照以下比例混合
试剂名称 试剂数量
AAV病毒载体质粒(合肥赛海生物病毒包装质粒) 5ul(1.0ug/ul)
包装质粒(合肥赛海生物病毒包装质粒) 5ul(1.0ug/ul)
辅助质粒(合肥赛海生物病毒辅助质粒) 5ul(1.0ug/ul)
d.取3μl脂转complex，加入步骤2的3ml含WAYNE293 LVPRO的培养基中，混匀。
e.小心加入脂转complex混合液，十字形慢慢晃动3次，在37℃5％CO2条件下，孵箱中培养90分钟，完成预培养。
f.预培养完成后，加入27ml的WAYNE293培养液(购自中山康天晟合生物技术有限公司，其产品名称是A21501)，在37℃，120rpm摇床继续培养72小时，然后检测病毒颗粒的数量，进行估计病毒滴度。
检测病毒颗粒的数量：由于病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中，可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37℃水浴。将产毒的细胞连同培养基一同收集到三个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中，1000rp m/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬。将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。然后检测病毒颗粒的数量。(快速病毒鉴定和定量检测方法综述，Kumar Pankaj，University of Saskatchewan,Saskatoon,Canada，美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司(Synatom Research)DOI http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.207)。
病毒滴度方法：
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1X10^5/ml,加入96孔板。放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。在每个孔中再加入50uL的带有病毒的培养上清过夜。在显微镜观察荧光GFP阳性细胞在总细胞数量的比例。并计算病毒滴度。其计算公式如下:病毒滴度(TU/ml)＝细胞数′荧光百分比X10^3/病毒原液体积(50uL)。
3.转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含预试验中确定的聚乙烯亚胺(PEI)浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可将细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10-2-10-10)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
4.用ELISA检测单克隆细胞中腺病毒的表达情况，由于不同克隆的表达水平存在差异，因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
5.转染效率检测，利用荧光显微镜测量GFP阳性细胞的频率。计算总细胞数量和GFP阳性荧光细胞数量。这个相对效率由GFP阳性细胞在总细胞数量的频率为转染效率。
如此不断的进行循环驯化，筛选获得一株WAYNE293 LVPRO细胞，命名为：人胚胎肾细胞293(Wayne 293cell line)，其于2022年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.45137
二、Wayne 293cell line细胞的功能测试
1、最高密度测试
将Wayne 293cell line细胞(以初始WAYNE293 LVPRO细胞作为对照)以5×105个/ml的细胞浓度接种WAYNE293培养基(购自中山康天晟合生物技术有限公司，其产品名称是A21501)中，37℃，120rpm摇床培养，每个小时取样统计细胞密度，Wayne 293cell line细胞浓度在第三天最高可达到6.7×106Cell/mL，比初始WAYNE293 LVPRO细胞高3×106Cell/mL。
2、做脂转complex，按照以下比例混合
试剂名称 试剂数量
AAV病毒载体质粒(合肥赛海生物病毒包装质粒) 5ul(1.0ug/ul)
包装质粒(合肥赛海生物病毒包装质粒) 5ul(1.0ug/ul)
辅助质粒(合肥赛海生物病毒辅助质粒) 5ul(1.0ug/ul)
取3μl脂转complex，加入3ml含8×106个/ml的Wayne 293cell line细胞的培养基中，混匀。十字形慢慢晃动3次，在37℃5％CO2条件下，孵箱中培养90分钟，完成预培养。预培养完成后，加入27ml的WAYNE293培养液(购自中山康天晟合生物技术有限公司，其产品名称是A21501)，在37℃，120rpm摇床继续培养72小时，然后检测病毒颗粒的数量和病毒滴度，以及检测转染效率。以WAYNE293 LVPRO作为对照。
A、转染效率检测：瞬转效率达到73％，比初始的WAYNE293 LVPRO高21％；
B、病毒包装滴度达到5×1014vg/L，比初始的WAYNE293 LVPRO高4×1014vg/L。
由此可见，本发明获得的Wayne 293cell line具有密度高、瞬转效率高、病毒包装滴度高的优点。

Claims (3)

1.人胚胎肾细胞293，命名为：Wayne 293cell line，保藏编号为：CGMCC No.45137。
2.权利要求1中 所述的Wayne 293cell line细胞在表达病毒中的应用，所述的病毒是腺病毒。
3.一种利用Wayne 293cell line细胞表达病毒的方法，其特征在于，是将病毒转染进入权利要求1中 所述的Wayne 293cell line细胞中，使Wayne 293cell line细胞表达病毒；所述的病毒是腺病毒。
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Improvement in the suspension-culture production of recombinant adeno-associated virus–LacZ in HEK-293 cells using polyethyleneimine–DNA complexes in combination with hypothermic treatment;Lei Feng等;《Biotechnol. Appl. Biochem》;20080601;第50卷;第121-132页 *
Selection and optimization of transfection enhancer additives for increased virus-like particle production in HEK293 suspension cell cultures;Laura Cervera等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20151201;第99卷(第23期);第9935-9949页 *
慢病毒介导的人前脑啡肽原基因在HEK293细胞中的表达;白凤;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑（电子期刊）》;20141215(第12期);E066-9 *

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