CN107574128A - 一种体外快速优化菌株代谢通路的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。本发明利用Cre‑loxP位点特异性重组的特性，通过在功能基因片段和接收载体引入改进的loxPsym序列实现基因的随机插入，从而获得随机插入的DNA，形成多样性的重排质粒文库，能够实现多个代谢通路功能基因的随机组合，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速的实现多个功能基因的联合分析，快速优化代谢通路，寻找关键基因并且不受宿主限制，应用领域广。

Description

一种体外快速优化菌株代谢通路的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。

背景技术

DNA测序技术的普及，揭示了越来越多物种的全基因组信息，此外，转录组、蛋白质组、代谢组等相关组学技术的发展使得科学家们对生物细胞内各种复杂的代谢通路以及精细的调控机制有了更深刻的认知。例如酿酒酵母生产β-胡萝卜素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB、八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及番茄红素环化酶基因crtY；酿酒酵母生产番茄红素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；酿酒酵母生产紫色杆菌素的必须基因元件为vioA、vioB、vioC、vioD和vioE。

合成生物学的深入研究加速了绿色无污染有机化学品细胞工厂的开发。在工业菌株的改良上，已经可以通过摸索发酵条件、优化细胞代谢通路等措施来降低成本、提高产量。

在微生物工业中，虽然生产的化学品性质各异，对工业菌株的要求也各不相同，但商业目的都是在同等生产条件下获得相对高产的菌株。在长期生产实践中，对工业菌株已经摸索到最佳的发酵条件，单纯通过改变外界环境提高产量上升空间不大，必须对菌株自身进行根本性改良，即改造菌株的基因。传统基因工程，往往通过改变代谢通路中的某个基因的表达水平，或通过调控机制的优化来提高产量，但存在成本高和研发周期久、资源消耗大的缺点。

在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。

由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点,在基因工程领域得到了广泛的应用。位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体，并发生DNA链的切割与交换，实现靶位点之间的整合、切离或倒位。这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击，形成共价中间体，不需要高能量辅助因子的参与。

目前，位点特异性重组酶做为工具酶的体外应用主要有Creator系统和基于λ整合的Gateway系统。Gateway系统在Int和IHF的作用下attB和attP发生重组，再加入Xis即发生attL和attR之间的逆向重组。利用这一原理和一对突变的位点，Hartley等人设计了通过两步克隆高效快速构建表达载体的Gateway系统。同时其载体上均带有自杀基因ccdB，宿主只有正确重组克隆转入后才能生长,方便筛选。Creator系统设计类似Gateway系统，二者均应用于基因克隆和表达，但仅能针对单个基因进行功能性研究，同时基因重排的多样性也不够丰富。因此，亟待开发一种可以针对多个基因功能联合研究的体外随机重组方法，增加基因重排的多样性，以此可以快速优化菌株的代谢通路，高效快速实现多个功能基因的联合分析，指导以后的菌株构建工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，能够针对多个菌株代谢通路功能基因进行体外重排，丰富基因重排的多样性，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速实现多个功能基因的联合分析。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，包括：

步骤1、利用Golden Gate组装方法将菌株代谢通路的各功能基因分别引入到包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的供体质粒上，通过酶切形成各功能基因片段，所述功能基因片段两端为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，中间为功能基因和筛选标签1；

步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；

步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；

步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息。

Cre/loxP重组酶系统常用于基因打靶，其中的LoxP位点来源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列确定了LoxP的方向，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，当两个loxP方向一致时，位于两个loxP中间的序列只能发生删除；当两个loxP方向相反时，位于两个loxP中间的序列只能发生反转，当两条DNA间的loxP发生重排时会导致两条DNA发生移位。本发明调整LoxP位点8bp的间隔序列ATGTATGC为ATGTACAT，使间隔序列消除了方向性，没有方向的loxP位点(SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的loxPsym)，删除、翻转、移位、复制等情形不必局限于之前的限制，均有几率发生，可大大增加重排组合的多样性。

借助上述没有方向的loxP位点特性，本发明在代谢通路的各功能基因片段和接收载体上各自引入改进的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，不仅各功能基因片段和接收载体本身可以发生DNA重排，并且各功能基因片段本和接收载体之间也有可能发生不确定的DNA重排，将功能基因的插入更加随机化和多样化，从而获得多样性的重排质粒文库，相比需要将代谢通路各功能基因合成为长片段DNA再进行重排，本发明这种方法更加简便、省时，并且丰富多样化。

在本发明中，所述步骤1具体为：

由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、URA基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒，该供体质粒可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而快速添加筛选标签1和功能基因片段，在构建的供体质粒基础上，利用Golden Gate组装方法，将功能基因片段与筛选标签1两端快速添加SEQ ID NO:1所示核苷酸序列之间。

功能基因片段的完整转录单元使用PCR方法或者化学合成的方法获得，使其两侧末端携带与供体质粒匹配的BsaI酶切位点，通过Golden Gate组装的方法将目的功能基因片段的转录单元连接到供体质粒上，然后通过限制性内切酶，如NotI酶切获得包含SEQ IDNO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的功能基因片段。

本发明所述代谢通路可指代生成任何化学品的代谢通路，生产β-胡萝卜素的代谢通路、生产番茄红素的代谢通路和生产紫色杆菌素的代谢通路等，通常这些代谢通路是由一些功能基因的表达来实现各自对应化学品的生成，这些功能基因的重排正是优化代谢通路的方式。其中，不同代谢通路的功能基因在本领域已有报道，如生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因为tHMG1、crtI、crtYB、crtE、ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13。

本发明中所提及的筛选标签1和2可选自微生物领域中经常用于筛选目标微生物所采用的筛选标签，如营养缺陷标签因和抗性标签，筛选标签1和2需互不相同，保证整个优化过程可高效正确完成。所述营养缺陷标签一般为氨基酸缺陷标签例如URA、LEU和HIS；所述抗性标签一般选自KanMX、NAT和Hyg。

根据筛选标签可设置对应的筛选标签培养基，如采用URA筛选标签，则对应的筛选标签培养基为缺URA培养基(SC-URA)，采用KanMX筛选标签则对应的筛选标签培养基为含有G418的培养基。

本发明体外重排体系中的Cre酶负责开启体外重排，将重排体系置于Cre酶适合的环境中，如37℃下反应60min，即可开启重排，完成重排后可使Cre酶在高温下失活来关闭，如在70℃下失活10min。因此，步骤2可以具体为：

将各功能基因片段与含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，于37℃反应60min开启重排，然后70℃使Cre酶失活10min关闭重排，获得重排的质粒文库。

其中，所述反应体系中功能基因片段、含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O的用量分别为200ng/功能基因片段、400ng接收载体、1uL Cre酶、5uLCre酶缓冲液，补足ddH₂O至50uL。

在本发明具体实施方式中，所述供体质粒为可采用pYW0120质粒，所述pYW0120质粒由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、作为筛选标签1的URA基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列通过酶切连接的方法插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒。用于各功能基因片段的快速添加，改造后的质粒图谱见图1。

在本发明具体实施方式中，所述接收载体为pYW0113质粒，所述pYW0113质粒是在商品质粒pRS413基础上，通过在多克隆位点用酶切连接的方法，引入overlap PCR扩增的由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、RFP基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接成的DNA序列获得。用于和各功能基因片段的重排，改造后的质粒图谱见图2，其上有筛选标签2-HIS筛选标签。

本发明将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株，由于这些存在明显外观上的改变预示着代谢通路的各功能基因可能得到优化并具备高产潜质，但是不排除丧失或降低生产该代谢通路对应化学品的能力，因此，需要对这些潜在高产菌株进行代谢通路对应的化学品产量的测定，例如进行摇瓶发酵后利用HPLC检测，然后确定真正高产的菌株，从而对其优化后的代谢通路进行分析。

在本发明对代谢通路分析过程中，首先提取正确高产菌株的重排质粒反转大肠杆菌，然后从大肠杆菌中提取重排质粒，利用测序技术对重排质粒结构进行分析，获得各功能基因重排后的序列信息，进而获得优化后代谢通路的信息。

鉴于酵母是微生物领域中的模式生物，方便各项研究的进行，故在本举例阐述发明技术方案时，所述菌株选择酵母，更优选为酿酒酵母，步骤3中所提及的出发菌株也相应采用酵母，如酿酒酵母yYW0301，yYW0301是在原始酿酒酵母菌BY4741(可商业化购买获取)基础上，将三个异源的β-胡萝卜素基因crtI、crtYB和crtE整合在五号染色体CAN基因内，作为待优化的出发菌株。

在本发明具体实施过程中，以优化酵母菌株生产β-胡萝卜素的代谢通路为例，选择产β-胡萝卜素相关外源基因tHMG1、crtI、crtYB和crtE，内源基因ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13，组成代谢通路的各功能基因，按照本发明方法的步骤1-2，以引入loxPsym序列和筛选标签URA的pYW0120质粒为供体质粒，以引入loxPsym序列和筛选标签HIS的pYW0113质粒为接收载体，获得重排的质粒文库，然后醋酸锂电转化至酿酒酵母yYW0301中，在SC-His-Ura筛选培养基上培养，选择菌落颜色为黄色或红色(相对于酿酒酵母yYW0301橙色而言差异显著)以及菌落较大的菌株作为潜在高产菌株，通过β-胡萝卜素摇瓶发酵检测各潜在高产菌株的实际产量(见图3)，然后对各个菌株重排质粒分析，获得重排后功能基因的信息，选择最佳的优化结果(见图4)，作为对后续构建产β-胡萝卜素酿酒酵母的指导方案。

由以上技术方案可知，本发明利用Cre-loxP位点特异性重组的特性，通过在功能基因片段和接收载体引入改进的loxPsym序列实现基因的随机插入，从而获得随机插入的DNA，形成多样性的重排质粒文库，能够实现多个代谢通路功能基因的随机组合，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速的实现多个功能基因的联合分析，快速优化代谢通路，寻找关键基因并且不受宿主限制，应用领域广。

附图说明

图1所示为引入loxPsym序列(SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)和筛选标签URA的供体质粒pYW0120质粒图谱；

图2所示为引入loxPsym序列(SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)和筛选标签HIS的供体质粒pYW0113质粒图谱；

图3所示为体外重排后的质粒文库导入出发菌株yYW0301后转化效果图；

图4所示为利用HPLC检测重排后不同酵母菌β-胡萝卜素和番茄红素的产量；其中，A表示β-胡萝卜素产量位于柱形的下方，B表示番茄红素的产量位于柱形的上方，yYW0339是yYW0301加入不含功能基因片段的空白质粒的对照菌株；

图5所示为重排后酵母菌落颜色对比以及测序结果分析重排结构；其中，yYW0339是yYW0301加入不含功能基因片段的空白质粒的对照菌株。

具体实施方式

本发明公开了一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述启动子和菌株进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：β-胡萝卜素各功能基因片段的合成

由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出DNA结构“loxPsym位点-BsaI酶切位点-RFP(红色荧光蛋白基因)-BsaI酶切位点-URA基因-loxPsym位点”，然后通过酶切连接的方法将该序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为通用载体pYW0120，该通用载体是可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而使外源功能基因片段快速添加到筛选标签1和两端的loxPsym序列。

功能基因片段指目的基因的完整转录单元，使用PCR扩增基因组模版上的功能基因或者采用化学方法从头合成，使功能基因片段的末端携带与通用载体pYW0120匹配的BsaI酶切位点，通用载体pYW0120含有“NotI-loxPsym-BsaI-RFP-BsaI-URA3-loxPsym-NotI”结构，可以通过Golden Gate组装的方法将目的基因的转录单元连接到通用载体pYW0120上，然后通过限制性内切酶NotI酶切获得包含loxPsym序列和筛选标签URA的功能基因片段。

β-胡萝卜素相关外源基因为tHMG1、crtI、crtYB和crtE，内源基因为ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13，组成代谢通路的各功能基因。

实施例2：重排的质粒文库的获得

按照表1的反应体系(50μL)将实施例1中β-胡萝卜素各功能基因片段与引入loxPsym序列和筛选标签HIS的供体质粒pYW0113、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O进行体外重排。

表1重排反应体系

成分	体积(μL)
		tHMG1片段	1.5
crtI片段	1.5
		crtYB片段	1.9
crtE片段	3.8
		ERG10片段	5.1
ERG12片段	2.2
		ERG8片段	2.4
ERG19片段	6.1
		ERG20片段	7.8
BTS1片段	4.1
		ERG13片段	1.7
接收载体pYW113	1.2
		Cre Recombinase(NEB)	1
Cre Recombinase Buffer	5
		ddH2O	4.7

按照表格内各物质的量(以上11个片段质量均为200ng，接收载体pYW0113为400ng)分别加入PCR管中，混合均匀。于37℃反应60min，70℃失活10min，则该重排体系反应完成，获得重排的质粒文库。

实施例3：高产菌株的获得

1、重排的质粒文库转化酿酒酵母

挑取yYW0301酿酒酵母单菌落于5mLYPD液体培养基中，30℃过夜培养；测量过夜培养的酿酒酵母培养液OD₆₀₀，接种过夜培养液到5mL YPD中(0.125OD₆₀₀/ml)，30℃、220rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.5(约需要3.5-4.5h)；

吸取1mL酿酒酵母培养液至1.5mL EP管内，4000rpm离心2min，收集细胞；用1mL无菌水重悬细胞，同上离心，收集细胞；用1mL 0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μL上清，剩余的100μL LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。

准备转化体系：

将该体系充分混合均匀，待用。

向100μL酵母感受态细胞中加入重排后的质粒吹吸均匀后加入转化体系中，上下翻转混合均匀；30℃培养箱中孵育30min；加入90μL DMSO，上下翻转混合均匀；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上清，加入400μL 5mM CaCl₂，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上清，在无菌水中重悬，完成酿酒酵母转化。

2、筛选标签对应的培养基筛选

将上述无菌水重悬后的酿酒酵母涂SC-His-Ura筛选培养板筛选。待酵母在筛选培养板上生长2天，挑取黄色或橙色以及菌落较大的单菌落于SC-His-Ura平板上划线分纯，获得潜在高产菌株yYW0320、yYW0303、yYW0304、yYW0319、yYW0305、yYW0311、yYW0312、yYW0313、yYW0308、yYW0309、yYW0310、yYW0306、yYW0321、yYW0317、yYW0316、yYW0338和yYW0322，见图3。

3、高产菌株的确定

摇瓶发酵测定上述潜在高产菌株的β-胡萝卜素的产量

种子培养基：SC-His-Ura液体培养基

摇瓶培养基：SC-His-Ura液体培养基

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养48h。

β-胡萝卜素与番茄红素定量方法：

取4等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，β-胡萝卜素的检测波长为450nm，番茄红素的检测波长为470nm。结果见图4。其中，yYW0339是yYW0301加入不含功能基因片段的空白质粒的对照菌株。

实施例4：对潜在高产菌株中重排后质粒的分析

1、提取酵母菌株yYW0320、yYW0303、yYW0304、yYW0319、yYW0305、yYW0311、yYW0312、yYW0313、yYW0308、yYW0309、yYW0310、yYW0306、yYW0321、yYW0317、yYW0316、yYW0338和yYW0322的质粒(天根酵母质粒小提试剂盒)

2、大肠转化

制作E.coli电转感受态。从近期划线的WM1788菌株(推荐)无抗LB平板上挑取一个菌落，接在试管中，于220rpm，18-20摄氏度摇床过夜培养，在至少24h之后、36h之前，E.coli才会缓慢生长至OD饱和。之后遵循如下电转化流程即可：

a)将细胞以1:100接到新的100ml无抗LB摇瓶中，继续在低温下培养，在约6h后，OD₆₀₀正当0.4-0.7之间，这是最合适的细胞浓度；

b)将摇瓶放于冰水混合物中冰浴10-20min，令其冷却下来，之后装入预冷的50ml离心管，以4600g(或Sigma标准离心机7000rpm)离心7min，倒出上清，留下细胞沉淀；

c)以预冷ddH₂O洗两遍，分别离心倒上清；

d)以预冷10％甘油洗一遍后，对每100ml菌液离心产物加入1-2ml的10％甘油进行温柔吹吸溶解，并以100ul为单位，分装入10-20个EP管中；

e)制备好的细胞可以冻存与-80℃，或直接用。电转电压与电转杯尺寸配套，依常用设置好即可，电转后在30度培养2h左右，涂到LB+Amp平板上，30度培养箱培养；

f)12-16h之后挑E.coli菌落验证。

3、大肠杆菌质粒提取(天根质粒小提试剂盒)

对应于酵母菌株名：yYW0320、yYW0303、yYW0304、yYW0319、yYW0305、yYW0311、yYW0312、yYW0313、yYW0308、yYW0309、yYW0310、yYW0306、yYW0321、yYW0317、yYW0316、yYW0338和yYW0322，验证后大肠杆菌菌株名对应为bYW0216、bYW0199、bYW0200、bYW0215、bYW0201、bYW0207、bYW0208、bYW0209、bYW0204、bYW0205、bYW206、bYW0202、bYW0217、bYW0213、bYW0212、bYW0230和bYW0215。

4、采用测序技术分析重排后质粒结构。

为检测重排后酵母菌落颜色是否稳定，将重排后的酵母质粒回转大肠杆菌并且重新转化到原始出发菌株yYW0301。图5实验结果显示重新回转后的酵母菌株与重排后菌株菌落颜色一致，表明酵母菌落颜色差异表型是由重排后质粒结构决定的。通过测序技术分析重排后质粒结构，从图5测序结果可以得出以下结论：1.tHMG1基因的插入可以使出发菌株菌落颜色变为黄色，对照图4可以看到β-胡萝卜素的纯度明显提升；2.crtI基因的插入可以使出发菌株菌落颜色变为红色，对照图4可以看出β-胡萝卜素的浓度明显提升。3.菌株yYW0322含有基因组合crtI、tHMG1和crtE可以生产纯度和浓度都提升的β-胡萝卜素，产量为0.76μg/mg(干重)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种体外快速优化菌株代谢通路的方法

<130> MP1711762

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataacttcgt ataatgtaca ttatacgaag ttat 34

Claims (15)

1.一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，其特征在于，包括：

步骤1、利用Golden Gate组装方法将菌株代谢通路的各功能基因分别引入到包含SEQID NO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的供体质粒上，通过酶切形成各功能基因片段，所述功能基因片段两端为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，中间为功能基因和筛选标签1；

步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；

步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；

步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒，该供体质粒可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而快速添加筛选标签1和功能基因片段，在构建的供体质粒基础上，利用Golden Gate组装方法，将功能基因片段与筛选标签1两端快速添加SEQ ID NO:1所示核苷酸序列之间。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述代谢通路的各功能基因为生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因、生产番茄红素的代谢通路的各功能基因或生产紫色杆菌素的代谢通路的各功能基因。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因为tHMG1、crtI、crtYB、crtE、ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：将各功能基因片段与含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，于37℃反应60min开启重排，然后70℃使Cre酶失活10min关闭重排，获得重排的质粒文库。

6.根据权利要求1或5所述方法，其特征在于，所述反应体系中功能基因片段、含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O的用量分别为200ng/功能基因片段、400ng接收载体、1uL Cre酶、5uLCre酶缓冲液，补足ddH₂O至50uL。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供体质粒为pYW0120质粒，所述pYW0120质粒由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、筛选标签URA基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列通过酶切连接的方法插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述接收载体为pYW0113质粒，所述pYW0113质粒是在商品质粒pRS413基础上，通过在多克隆位点用酶切连接的方法，引入overlap PCR扩增的由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、RFP基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接成的DNA序列获得。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述loxPsym序列如SEQ ID NO:1所示。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述筛选标签1和2均为营养缺陷标签或抗性标签。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述营养缺陷标签为氨基酸缺陷标签。

12.根据权利要求11所述方法，其特征在于，所述氨基酸缺陷标签选自URA、LEU和HIS。

13.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述抗性标签选自KanMX、NAT和Hyg。

14.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4为：

提取正确高产菌株的重排质粒反转大肠杆菌，然后从大肠杆菌中提取重排质粒，利用测序技术对重排质粒结构进行分析，获得各功能基因重排后的序列信息，进而获得优化后代谢通路的信息。

15.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌株为酵母。