CN104419718A - 一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法 - Google Patents

一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，步骤为：（1）每次从待筛选的启动子元件库、基因元件库和终止子元件库中各选一个元件组装到带有不同筛选标记的质粒上得到模块，不同的模块中，相同基因元件所选筛选标记相同，由模块组成模块库；（2）对模块库中的模块进行排列组合设计；（3）利用酿酒酵母质粒共转化技术，将与设计对应的模块转入酿酒酵母底盘菌中；（4）将转化后的菌在选择缺陷型培养基上培养，得到排列组合的正确酿酒酵母转化子；（5）结合目标性状的具体特征筛选得到高效模块组合的酿酒酵母转化子。本发明的方法极大的降低了工作量、提高了所构建系统的灵活性。得到的组合不用测序，降低了成本。

Description

一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域，具体涉及的是一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法。 
背景技术
合成生物学是一门新型的交叉学科，是指通过重头设计并构建新的遗传组件、设备和系统，或对现有的、天然的生物系统进行重新设计和改造，以达到利用工程化的遗传系统或生物模型来处理信息、合成化合物、生产能源、提供食物以及改善环境等目的。合成生物学的工程技术本质是按照设计好的蓝图重新组装分子元件，并转入细胞，使这些工程化的细胞执行新的功能。将基因元件（启动子、开放阅读框、终止子、核糖体结合位点等）依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。DNA组装的诞生加速了合成生物学功能元件库（如启动子库）以及生物合成途径的人工构建。随着合成生物学的快速发展，对异源模块在底盘细胞中表达的优化和适配的需求不断增加。 
由于合成生物学的研究模式是“转移一组基因，表达一种蛋白”，因而需要在更大规模更多层次上涉及到细胞网络，如代谢网络等。传统的通过代谢工程网络分析设计相关模块已经无法满足合成生物的需要，不同来源模块之间的组合适配成为重要的应用方法之一。在此过程中,底盘生物本身代谢网络与新生物功能途径相互协调,相互适配，最终得到服务于特定生产和生活需要的“细胞工厂”提供了重要基础。2010年Gregory组发表在Science上的研究利用组合适配的方法将紫衫二烯在大肠杆菌中的表达量提高了15000倍，达到1克/升。其方法为优化大肠杆菌内源MEP途径中关键酶和外源GGPP合成酶、紫衫烯合成酶的启动子组合、质粒拷贝数组合，共产生组合数为32个。2012年，Huimin Zhao组通过启动子突变产生不同强度的启动子库，利用酵母内源同源重组得到带有突变启动子的不同组合，利用一次酵母转化得到含有不同组合的混菌库。在混菌中对表型进行筛选得到一株在木糖培养基上高产乙醇的工业菌株。通过对得到的优势菌株提取酵母质粒进行测序得到最优的启动子组合方式。 
合成生物学现有的对模块的组合研究方式多采用将所有模块组装到同一质粒上，并转入底盘菌株中进行筛选。这种构建模式的优势之处在于所构建途径比较稳定、各模块表达量比较平衡。适用于已对所构建途径已有一定了解、能通过特定组合设计完成构建的途径。但是同时也存在诸多缺点：组合后的质粒很难对中间某一模块进行替换或改造，所涉及的研究范围相对比较片面；在所涉及模块数量较多或模块组合数较多的情况下，对所有模块及组合进行组装工作量巨大；大部分组装方法均需对所有组装模块进行测序，价格昂贵；受组合类型和数目的限制，难以对某一途径的所有步骤及步骤之间的相互联系进行系统的研究。 
基于以上原因，目前需要一种可以将模块进行系统的排列组合并快速筛选的新方法。 
发明内容
本发明的目的是克服现有不足，提供一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法。 
本发明的技术方案概述如下： 
一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，包括以下步骤： 
（1）每次从待筛选的启动子元件库、基因元件库和终止子元件库中各选一个元件组装到带有不同筛选标记的质粒上得到模块，不同的模块中，相同基因元件所选筛选标记相同，由模块组成模块库，进行测序确保模块库中的各模块序列正确； 
（2）对所述模块库中的模块进行排列组合设计； 
（3）利用酿酒酵母质粒共转化技术，按照步骤（2）的设计，将与所述设计对应的模块转入酿酒酵母底盘菌中； 
（4）将步骤（3）转化后的菌在选择缺陷型培养基上培养，得到步骤（2）所有排列组合的正确酿酒酵母转化子； 
（5）结合目标性状的具体特征筛选得到高效模块组合的酿酒酵母转化子。 
待筛选的基因元件库中的基因元件优选为对酿酒酵母目标途径产生影响的酿酒酵母内源基因或外源基因。 
内源基因元件优选木酮糖激酶基因。 
外源基因优选为毕赤酵母木糖还原酶基因、毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因、紫色杆菌素VioA基因或紫色杆菌素VioB基因。 
筛选标记优选为Ura3、His3和Leu2或选任意2个。 
质粒是在酿酒酵母中可自主复制的着丝粒型质粒或在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒。 
可自主复制的着丝粒型质粒优选为pRS416Y载体、PRS413Y载体或PRS415Y载体。 
在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒优选为PRS425载体或PRS426载体。 
步骤（2）排列组合的方式为将步骤（1）模块库中的模块按照筛选标记分为2或3组，从每组中选取一个模块组成一个组合。 
酿酒酵母质粒共转化技术优选96孔板醋酸锂转化法。 
本发明可以实现在酿酒酵母中多个模块组合的快速筛选，通过排列组合考察不同模块以及多个模块之间的相互作用对目标代谢途经的影响，极大的降低了工作量、提高了所构建系统的灵活性。对筛选结果的分析可以快速修改原有组合设计。除此之外，所有通过共转化所得到的组合不用测序，相比以往的方式极大地降低了成本。96孔板酵母质粒共转化技术保障了大量的模块组合筛选，从而实现了组合模块在酿酒酵母底盘细胞中的快速筛选。 
附图说明
图1本发明的过程流程示意图。 
图2为酿酒酵母木糖代谢途径示意图。 
图3为XR,XDH,XKS模块构建方法示意图。 
图4为载体PRS413Y图谱。 
图5为载体PRS415Y图谱。 
图6为载体PRS416Y图谱。 
图7为64种排列组合的转化子在木糖培养基培养7天后平板结果。 
图8为紫色杆菌素代谢途径示意图。 
图9为9种排列组合的转化子在SC-Ura-Leu-His培养基划线48小时后平板结果。 
图10为酵母三质粒共转化64个模块在96孔板上分布图。 
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。 
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。 
如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。 
图1为本发明的过程流程示意图。 
实施例1 
一种高效利用木糖的酿酒酵母模块组合筛选方法 
酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，具备良好的工业生产性状。但是，酿酒酵母由于缺乏木糖代谢途径中将木糖转化为木酮糖的酶而不能利用木糖，需要导入外源毕赤酵母木糖还原酶基因（XR）、毕赤酵母木酮糖脱氢酶基因（XDH）以及过表达内源木糖醇激酶基因(XKS)，见图2。以带有不同启动子的木糖还原酶（XR）、带有不同启动子的木糖醇脱氢酶（XDH）和带有不同启动子的木酮糖激酶（XKS）模块组合筛选为案例，筛选优化启动子组合，得到在木糖培养基中具有更高木糖利用能力的优势菌株，可用于乙醇生产。 
（1）每次从待筛选的启动子元件库、包含有XR,XDH,XKS基因的基因元件库和终止子元件库中选择一个启动子元件、一个基因元件和一个终止子元件通过Yeast Golden Gate法分别组装到带有Ura3、His3、Leu2筛选标记的在酿酒酵母中可以独立复制的着丝粒载体上，得到模块，所有模块构成模块库。其中XR基因选用筛选标记为Ura3的PRS416Y载体、XDH基因选用筛选标记为His3的PRS413Y载体、XKS选用筛选标记为Leu2的PRS415Y载体。 
具体步骤： 
①获得待筛选的启动子元件库和终止子元件库： 
在Yeast Golden Gate标准接口的启动子库(5’端接口序列为GGTCTCACAGT、3’端接口序列为AATGAGAGACC)中选取表达强度为强、中强、中、弱四种不同强度的启动子元件组成启动子元件库1，如表1所示。 
表1启动子强度及编号 
强度 启动子编号
强 P1,P5,P9
中强 P2,P6,P10
中 P3,P7,P11
弱 P4,P8,P12
其中：P1用SEQ ID NO.1所示；P2用SEQ ID NO.2所示；P3用SEQ ID NO.3所示；P4用SEQ ID NO.4所示；P5用SEQ ID NO.5所示；P6用SEQ ID NO.6所示；P7用SEQ ID NO.7 所示；P8用SEQ ID NO.8所示；P9用SEQ ID NO.9所示；P10用SEQ ID NO.10所示；P11用SEQ ID NO.11所示；P12用SEQ ID NO.12所示。 
从Yeast Golden Gate标准接口的终止子库（5’端接口序列为GGTCTCATGAC、3’端接口序列为TTTTAGAGACC）中选取终止子元件T1,T2,T3，构成终止子元件库1。其中T1用SEQ ID NO.13所示；T2用SEQ ID NO.14所示；T3用SEQ ID NO.15所示。 
②获得基因元件库1 
与酿酒酵母木糖途径相关的用SEQ ID NO.16所示的毕赤酵母木糖还原酶基因（XR）和用SEQ ID NO.17所示的毕赤酵母木酮糖脱氢酶基因（XDH）为金唯智公司合成；与酿酒酵母木糖途径相关的SEQ ID NO.18所示的木糖激酶基因（XKS）用SEQ ID NO.19所示的正向引物Primer5和用SEQ ID NO.20所示的反向引物Primer6，以酿酒酵母BY4741基因组为模版获得；上述基因称为基因元件，由所有的基因元件构成基因元件库1。 
PCR反应体系：5×PCR缓冲液5μl，2.5mM dNTPs5μl，正向引物（10μM）1μl，反向引物（10μM）1μl，模板质粒（100～200ng）0.25μl，TransStart FastPfu DNA聚合酶（全式金）0.25μl，加水补足至25μl。 
③利用yeast golden gate恒温一步连接法（见图3）将从启动子元件库1中选取的不同强度的启动子元件P1、P2、P3、P4，从基因元件库1中选取的XR基因元件和从终止子元件库1中选取的T1终止子元件组装到着丝粒型筛选标记为Ura3的pRS416Y载体（见图6）上，得到启动子元件不同，而基因元件和终止子元件相同的模块：PRS416Y-P1-XR-T1、RS416Y-P2-XR-T1、PRS416Y-P3-XR-T1和PRS416Y-P4-XR-T1；将从启动子元件库1中选取的启动子元件P5、P6、P7、P8，从基因元件库1中选取的XDH基因元件和从终止子元件库1中选取的T2终止子元件组装到着丝粒型筛选标记为His3的PRS413Y载体（见图4）上，得到启动子元件不同，而基因元件和终止子元件相同的模块：PRS413Y-P5-XDH-T2、PRS413Y-P6-XDH-T2、PRS413Y-P7-XDH-T2和PRS413-P8-XDH-T2；将从启动子元件库1中选取的启动子元件P9、P10、P11、P12，从基因元件库1中选取的XKS基因元件和从终止子元件库1中选取的T3终止子元件组装到着丝粒型筛选标记为Leu2的PRS415Y载体（见图5）上，得到启动子元件不同，而基因元件和终止子元件相同的模块：PRS415Y-P9-XKS-T3、PRS415Y-P10-XKS-T3、PRS415Y-P11-XKS-T3和PRS415Y-P12-XKS-T3。所得上述12个模块构成模块库1。 
PRS416Y-P1-XR-T1用SEQ ID NO.44所示；PRS416Y-P2-XR-T1用SEQ ID NO.45所示；PRS416Y-P3-XR-T1用SEQ ID NO.46所示；PRS416Y-P4-XR-T1用SEQ ID NO.47所示；PRS413Y-P5-XDH-T2用SEQ ID NO.48所示；PRS413Y-P6-XDH-T2用SEQ ID NO.49所示；PRS413Y-P7-XDH-T2用SEQ ID NO.50所示；PRS413Y-P8-XDH-T2用SEQ ID NO.51所示；PRS415Y-P9-XKS-T3用SEQ ID NO.52所示；PRS415Y-P10-XKS-T3用SEQ ID NO.53所示；PRS415Y-P11-XKS-T3用SEQ ID NO.54所示；PRS415Y-P12-XKS-T3用SEQ ID NO.55所示。 
Yeast Golden Gate恒温一步连接法体系为：10×NEB T4ligase buffer1.5μl（NEB），100×BSA0.15μl(NEB),BsaI酶1μl（NEB），T4Ligase1μl(NEB),按等摩尔混合的载 体、启动子、基因、终止子混合物2μl，加水补足25μl。 
Yeast Golden Gate反应条件为：在PCR仪中设定程序为：37℃1小时，50℃5分钟，80℃5分钟，4℃恒温。将所得连接产物转化到大肠杆菌transT1(全式金)感受态中，在LB+氨苄培养基上过夜培养后挑选白色菌落进行菌落PCR验证后测序，正确。 
（2）对模块库1的模块进行排列组合设计： 
将步骤（1）模块库1中的模块按照筛选标记类型分为3组，从每组中选择一个模块组成一个组合。12种模块采用简写方式如下，模块PRS416Y-P1-XR-T1简写为M1，模块PRS416Y-P2-XR-T1简写为M2，以此类推至PRS415Y-P12-XKS-T3简写为M12。设计的总组合数为4*4*4=64种。对组合进行编号如表2所示。 
表2   64种组合编号表 
编号 组合 编号 组合 编号 组合 编号 组合
1 M1M5M9 5 M2M5M9 9 M3M5M9 13 M4M5M9
2 M1M6M9 6 M2M6M9 10 M3M6M9 14 M4M6M9
3 M1M7M9 7 M2M7M9 11 M3M7M9 15 M4M7M9
4 M1M8M9 8 M2M8M9 12 M3M8M9 16 M4M8M9
编号 组合 编号 组合 编号 组合 编号 组合
17 M1M5M10 21 M2M5M10 25 M3M5M10 29 M4M5M10
18 M1M6M10 22 M2M6M10 26 M3M6M10 30 M4M6M10
19 M1M7M10 23 M2M7M10 27 M3M7M10 31 M4M7M10
20 M1M8M10 24 M2M8M10 28 M3M8M10 32 M4M8M10
编号 组合 编号 组合 编号 组合 编号 组合
33 M1M5M11 37 M2M5M11 41 M3M5M11 45 M4M5M11
34 M1M6M11 38 M2M6M11 42 M3M6M11 46 M4M6M11
35 M1M7M11 39 M2M7M11 43 M3M7M11 47 M4M7M11
36 M1M8M11 40 M2M8M11 44 M3M8M11 48 M4M8M11
编号 组合 编号 组合 编号 组合 编号 组合
49 M1M5M12 53 M2M5M12 57 M3M5M12 61 M4M5M12
50 M1M6M12 54 M2M6M12 58 M3M6M12 62 M4M6M12
51 M1M7M12 55 M2M7M12 59 M3M7M12 63 M4M7M12
52 M1M8M12 56 M2M8M12 60 M3M8M12 64 M4M8M12
（3）利用酿酒酵母质粒共转化技术，在96孔板上将表2所示64种设计相对应的模块转入酿酒酵母底盘菌BY4741(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)中。为了操作方便，在96孔板上模块的分布如图10所示。转化时，用多道移液器向每一孔中加入相应的三个共转化质粒，图10中的对照指共转化PRS413Y、PRS415Y、PRS416Y三个质粒，空白指不加任何质粒。 
酿酒酵母96孔板醋酸锂转化法的具体步骤为： 
①从平板上挑取底盘菌BY4741的单菌落接入5ml YPD液体培养基，30℃过夜培养。 
②将培养好的菌液转接至新鲜培养基，每一个96孔板转化需要转接至100ml新鲜YPD培养基。起始OD600=0.125/ml（YPD背景值约为OD600=0.1/ml，故接菌后最终OD600为0.2/ml）。30℃培养至OD600约为0.5/ml。 
③3000rpm室温下离心5分钟收集细胞，弃掉培养基。 
④用20ml无菌水重悬细胞，洗细胞。5000rpm室温下离心2分钟收集细胞，弃上清。 
⑤用20ml无菌0.1M LiOAC重悬细胞，5000rpm室温下离心2分钟收集细胞，弃上清。 
⑥用3ml无菌0.1M LiOAC重悬细胞，最终制成终体积约为4ml的酵母感受态细胞。 
⑦配置转化体系见表3，并充分混匀。 
表3 
注：单链DNA在使用之前需做变性处理，100℃煮5min（可用PCR仪或水浴、金属浴），然后迅速制于冰上冷却防止其复性。 
⑧用多道移液器将150ul混合转化体系加入96孔板每一孔中，每一孔中加入3种共转化质粒，每种质粒加入100ng。 
⑨每个孔中加入25ul步骤⑥所得感受态细胞，用锡纸贴膜密封，充分震荡混匀后置于30℃培养箱孵育20分钟。 
⑩42℃水浴或金属浴中热激20分钟。 
3000rpm室温下离心5分钟，用多道移液器弃上清。 
用100ul无菌5mM氯化钙溶液重悬细胞，室温静止10分钟。 
（4）将步骤（3）转化后的菌在选择缺陷型培养基（SC-Ura-Leu-His三缺固体培养基）上利用“滴落”方式涂板，在平板上得到64种排列组合的正确酿酒酵母转化子。其中，“滴落”涂板的方式为：取5ul上述100ul细胞重悬液点到SC-Ura-Leu-His三缺固体培养基上，将平板倾斜45度，利用重力作用使菌液滴落到平板另一侧，30℃培养48小时后得到单菌落。（5）结合目标性状的具体特征（木糖为唯一碳源时细胞生长速度较快）筛选高效模块组合的酿酒酵母转化子。具体操作如下： 
①将64种组合的转化子各挑取一个单菌落在深孔96板上1ml SC-Ura-Leu-His三缺液体培养基中进行培养过夜24小时。 
②将50μl上述培养液转移到无菌细胞培养板中，3000rpm离心5分钟，用多道移液器弃上清。 
③加入50μl无菌水重悬细胞，进行梯度10倍稀释，直到稀释至10-5浓度。 
④取5μl的原始菌液、10-1、10-3、10-5稀释菌液点到固体2%合成型木糖培养基（SX培养基）中，30℃培养箱培养7天，结果见图7。 
（6）对图7结果进行分析，筛选在木糖培养基中生长具有优势的菌株组合。其中C为共转三个空载体的对照菌株。在本例所展示64个组合的菌株结果中，对比对照菌株，明显可见菌苔密度存在差异。其中1号、5号、9号、13号、17号、21号、25号、29号、菌株长势最好。分析其对应模块的共同特点可以发现，上述组合XDH基因表达强度一直为最强、XKS基因表达强度可以为强或中，而XR基因的表达强度从弱到强均可得到在木糖培养基中具有生长优势的菌株。 
通过采用本发明的酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，在构建了12个模块的基础上迅速得到64个不同组合的菌株，经过筛选在木糖培养基得到了8个具有优势表型的组合，并且在其中总结了三个基因表达强度对整个途径的影响，对木糖途径的代谢有指导意义。 
实施例2 
一种生产紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans的酿酒酵母模块组合筛选方法 
紫色杆菌素是以L-色氨酸为前体物合成的一种次级代谢产物，可以作为潜在的抗肿瘤、抗病毒药物及生物染料，有广阔的应用前景。酿酒酵母本身不能生产紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans以及紫色杆菌素，本实施例目标产物为绿色的紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans，需要引入的外源基因为vioA、vioB、vioE（见图8）。 
计划在酿酒酵母菌中引入三个外源基因为vioA、vioB、vioE，将其中的vioE固定，通过优化vioA、vioB两个基因启动子组合预期得到优势组合的紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans的酿酒酵母菌株。 
（1）每次从待筛选的启动子元件库、包含有VioA，VioB基因的基因元件库和终止子元件库中选择一个启动子元件、一个基因元件和一个终止子元件通过Gibson连接法分别组装到带有Ura3和Leu2筛选标记的在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒得到模块，所有模块构成模块库。其中VioA基因选用筛选标记为Leu2的PRS425载体，VioB选用筛选标记为Ura3的PRS426载体。具体步骤为： 
①获得待筛选的启动子元件库和终止子元件库： 
所选启动子元件为酿酒酵母内源的表达强度为强、中、弱的组成型启动子构成启动子元件库2，如表4所示。 
表4 启动子强度及编号 
强度 启动子编号
强 P13
中 P14
弱 P15
其中：P13用SEQ ID NO.21所示；P14用SEQ ID NO.22所示；P15用SEQ ID NO.23所示；所选终止子为酿酒酵母内源终止子元件T4、T5，构成终止子元件库2。上述启动子及终止子均从酿酒酵母基因组中扩增获得。T4用SEQ ID NO.42所示；T5用SEQ ID NO.43所示。 
②获得基因元件库2 
与紫色杆菌素代谢相关途径的用SEQ ID NO.24所示的vioA基因和用SEQ ID NO.25的vioB基因均购买自美国BioBrick，上述基因称为基因元件，由所有的基因元件构成基因元件库2。 
③利用Gibson连接法将从启动子元件库2中选取的不同强度的启动子元件P13、P14、P15，从基因元件库2中选取的VioA基因元件和从终止子元件库2中选取的T4终止子元件组装到在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒型筛选标记为Leu2的PRS425载体上，得到启动子元件不同，而基因元件和终止子元件相同的模块：PRS425-P13-vioA-T4、PRS425-P14-vioA-T4和PRS425-P15-vioA-T4；将从启动子元件库2中选取的启动子元件P13、P14、P15，从基因元件库2中选取的vioB基因元件和从终止子元件库2中选取的T5终止子元件组装到可自主复制的游离型质粒型筛选标记为Ura3的PRS426载体上，得到启动子元件不同，而基因元件和终止子元件相同的模块：PRS426-P13-vioB-T5、PRS426-P14-vioB-T5和PRS426-P15-vioB-T5。所得上述6个模块构成模块库2。 
其中，PRS425-P13-vioA-T4用SEQ ID NO.56所示；PRS425-P14-vioA-T4用SEQ ID NO.57所示；PRS425-P15-vioA-T4用SEQ ID NO.58所示；PRS426-P13-vioB-T5用SEQ ID NO.59所示；PRS426-P14-vioB-T5用SEQ ID NO.60所示；PRS426-P15-vioB-T5用SEQ ID NO.61所示。 
用于构建vioA模块的启动子元件P13，采用以SEQ ID NO.26所示的正向引物Primer7分别和用SEQ ID NO.27所示的反向引物Primer8；用于构建vioA模块的启动子元件P14，采用以SEQ ID NO.26所示的正向引物Primer7和用SEQ ID NO.28所示的反向引物Primer9；用于构建vioA模块的启动子元件P15，采用以SEQ ID NO.26所示的正向引物Primer7和用SEQ ID NO.29所示的反向引物Primer10，分别和酿酒酵母BY4741基因组模版进行PCR扩增。用于构建vioA模块的基因片段用SEQ ID NO.34所示的正向引物Primer15、用SEQ ID NO.35所示的反向引物Primer16和用SEQ ID NO.24所示的模版vioA扩增。用于构建vioA模块的终止子T4片段，采用以SEQ ID NO.38所示的正向引物Primer19和用SEQ ID NO.39所示的反向引物Primer20扩增，以酿酒酵母BY4741基因组为模版进行扩增。 
将上述3种启动子元件PCR产物、vioA基因元件PCR产物和T4终止子元件PCR产物以相同摩尔混合，通过gibson法组装到游离型筛选标记为Leu2的PRS425载体上，得到模块PRS425-P13-vioA-T4、PRS425-P14-vioA-T4和PRS425-P15-vioA-T4。 
用于构建vioB模块的启动子片段，采用以SEQ ID NO.30所示的正向引物Primer11和用SEQ ID NO.31所示的反向引物Primer12；采用以SEQ ID NO.30所示的正向引物Primer11和用SEQ ID NO.32所示的反向引物Primer13；采用以SEQ ID NO.30所示的正向引物Primer11和用SEQ ID NO.33所示的反向引物Primer14分别和酿酒酵母BY4741基因组作为模版进行PCR扩增.此步骤所得的三个PCR产物分别用于和vioB进行Gibson组装模块PRS426-P13-vioB-T5、PRS426-P14-vioB-T5和PRS426-P15-vioB-T5。用于构建的vioB模块的基因片段用SEQ ID NO.36所示的正向引物Primer17、用SEQ ID NO.37所示的反向引物Primer18和用SEQ ID NO.25所示的模版vioB扩增。用于构建vioB模块的终止子T5片段， 采用以SEQ ID NO.40所示的正向引物Primer21和用SEQ ID NO.41所示的反向引物Primer22以酿酒酵母BY4741基因组为模版进行扩增。 
将上述3种启动子片段、vioB基因片段和T5终止子片段以相同摩尔比混合，通过gibson法组装到游离型筛选标记为Ura3的PRS426载体上，得到模块PRS426-P13-vioB-T5、PRS426-P14-vioB-T5和PRS426-P15-vioB-T5。 
将所得Gibson连接产物转化到大肠杆菌transT1(全式金)感受态中，在LB+氨苄培养基上过夜培养后挑选菌落进行菌落PCR验证后测序，正确。 
（2）对模块库2中的模块进行排列组合设计； 
将步骤（1）模块库2中的模块按照筛选标记类型分为2组，从每组中选择一个模块组成一个组合。模块PRS425-P13-vioA-T4简写为P13A；模块PRS425-P14-vioA-T4简写为P14A；模块PRS425-P15-vioA-T4简写为P15A；模块PRS426-P13-vioB-T5简写为P13B；模块PRS426-P14-vioB-T5简写为P14B；模块PRS426-P15-vioB-T5简写为P15B。 
设计的总组合数为3*3=9种。对组合进行编号如表5所示。 
表5   9种组合编号表 
编号 组合 编号 组合 编号 组合
1 P13AP13B 4 P14AP13B 7 P15AP13B
2 P13AP14B 5 P14AP14B 8 P15AP14B
3 P13AP15B 5 P14AP15B 9 P15AP15B
（3）.利用酿酒酵母质粒共转化技术，将表5所示9种设计相对应的模块和带有vioE模块的筛选标记为His的质粒共转入酿酒酵母底盘菌BY4741(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)中。对照组为：带有vioE模块的筛选标记His的PRS425和PRS426质粒。 
酿酒酵母醋酸锂法三质粒共转化技术的具体步骤为： 
①从平板上挑取底盘菌BY4741的单菌落接入5ml YPD液体培养基，30℃过夜培养。 
②将培养好的菌液转接至50ml新鲜YPD培养基。起始OD600=0.125/ml（YPD背景值约为OD600=0.1/ml，故接菌后最终OD600为0.2/ml）。30℃培养至OD600约为0.5/ml。 
③3000rpm室温下离心5分钟收集细胞，弃掉培养基。 
④用25ml无菌水重悬细胞，洗细胞。5000rpm室温下离心2分钟收集细胞，弃上清。 
⑤用10ml无菌0.1M LiOAC重悬细胞，5000rpm室温下离心2分钟收集细胞，弃上清。 
⑥用1ml无菌0.1M LiOAC重悬细胞，最终制成酵母感受态细胞。 
⑦配置转化体系见表6，并充分混匀。 
表6 
注：单链DNA在使用之前需做变性处理，100℃煮5min（可用PCR仪或水浴、金属浴），然后迅速制于冰上冷却防止其复性。 
⑧将592μl混合转化体系加入无菌EP管中，每一转化加入与上述组合对应的3种转化质粒，每种质粒加入100ng。 
⑨每个EP管中加入100μl步骤⑥所得感受态细胞，用旋涡振荡仪最高转速震荡10秒充分混匀后置于30℃培养箱孵育30分钟。 
⑩向每个EP管中加入72μl DMSO，用旋涡振荡仪最高转速震荡10秒充分混匀后42℃水浴或金属浴中热激15分钟。 
3000rpm室温下离心2分钟，弃上清。 
用400μl无菌5mM氯化钙溶液重悬细胞，室温静止10分钟。 
（4）将步骤（3）转化后的菌在选择缺陷型培养基（SC-Ura-Leu-His三缺固体培养基）上涂板，30℃培养48小时，在平板上得到9种排列组合的正确转化子单菌落。 
（5）结合目标性状的具体特征（菌落呈现绿色较深紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans积累较多）筛选高效模块组合的酿酒酵母转化子。将步骤（4）所得单菌落划线到在选择缺陷型培养基（SC-Ura-Leu-His三缺固体培养基）上，30℃培养48小时后比较划线绿色深浅，结果见图9。 
（6）对图9结果进行分析，筛选绿色较深的菌株为生产紫色杆菌素代谢前体物deoxychromoviridans优势的菌株，其中C为共转空载体的对照菌株。在本例所展示9个组合的菌株结果中，发现对比对照菌株，明显可见菌落颜色存在差异，其中1号、4号、7号颜色较深,对应的组合分别为P13AP13B、P14AP13B、P15AP13B。分析其共同特点可以发现，在vioE基因表达强度不变时，上述组合中vioB基因的启动子均为强启动子，而vioA基因表达强度强或弱时均产生较深颜色的菌落。 
通过采用本发明的酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，在构建了6个模块的基础上迅速地到9种不同组合的菌株，经过筛选颜色较深的菌落得到3个具有优势表型的组合，为紫色杆菌素在酿酒酵母中的代谢研究提供了参考。 

Claims (10)

1.一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）每次从待筛选的启动子元件库、基因元件库和终止子元件库中各选一个元件组装到带有不同筛选标记的质粒上得到模块，不同的模块中，相同基因元件所选筛选标记相同，由模块组成模块库，进行测序确保模块库中的各模块序列正确；
（2）对所述模块库中的模块进行排列组合设计；
（3）利用酿酒酵母质粒共转化技术，按照步骤（2）的设计，将与所述设计对应的模块转入酿酒酵母底盘菌中；
（4）将步骤（3）转化后的菌在选择缺陷型培养基上培养，得到步骤（2）所有排列组合的正确酿酒酵母转化子；
（5）结合目标性状的具体特征筛选得到高效模块组合的酿酒酵母转化子。
2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述待筛选的基因元件库中的基因元件为对酿酒酵母目标途径产生影响的酿酒酵母内源基因或外源基因。
3.根据权利要求2所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述内源基因元件为木酮糖激酶基因。
4.根据权利要求2所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述外源基因为毕赤酵母木糖还原酶基因、毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因、紫色杆菌素VioA基因或紫色杆菌素VioB基因。
5.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述筛选标记为Ura3、His3和Leu2或选任意2个。
6.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述质粒是在酿酒酵母中可自主复制的着丝粒型质粒或在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒。
7.根据权利要求6所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述可自主复制的着丝粒型质粒为pRS416Y载体、PRS413Y载体或PRS415Y载体。
8.根据权利要求6所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒为PRS425载体或PRS426载体。
9.根据权利要求1或5所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于步骤（2）所述排列组合的方式为将步骤（1）模块库中的模块按照筛选标记分为2或3组，从每组中选取一个模块组成一个组合。
10.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，其特征在于所述酿酒酵母质粒共转化技术是96孔板醋酸锂转化法。
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