CN105624143A - 小片段dna共转化替换大片段dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成生物学染色体合成领域，特别涉及小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。本发明将多个长约3kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身高效的同源重组特性，实现对不大于30kb酿酒酵母V号染色体的替换工作，替换的正确性通过PCR的方法进行验证。能够快速替换大片段真核生物染色体、并使之能够发挥正常功能的大片段DNA。

Description

小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法
技术领域
本发明涉及合成生物学染色体合成领域，特别涉及小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。
背景技术
生物基因组携带了决定生物基本性状的遗传信息，人工DNA合成技术和DNA大片段操作技术推动了基因组人工合成研究的进步。合成生物学的发展推动了通过人工设计合成来“写”基因组信息标志着“人造生命”的开始。
近年来，丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、X174噬菌体、T7噬菌体、水稻(Oryzasativa)叶绿体和小鼠(Musmusculus)线粒体等基因组序列先后实现了人工改造与合成,尤其是活性人工基因组设计与合成的成功使人工基因组合成工作受到了世界的极大关注,即支原体基因组和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)染色体的合成。Venter研究组开发了体外组装和酵母体内组装相结合的方式进行基因组合成，于2008年实现了生殖支原体(Mycoplamagenitalium)基因组的全化学人工合成,然后利用基因组转移的技术于2010年将人工合成的蕈状支原体(Mycoplasmamycoides)基因组转入移除自身染色体的山羊(Capraaegagrushircus)支原体(Mycoplasmacapriolum)细胞中,得到了能够发挥正常功能的全新的支原体细胞。2011年,Boeke研究组分别对酿酒酵母Ⅵ号染色体左臂和Ⅸ号染色体右臂进行了人工设计,并于2014年成功合成了具有生物学活性的完整Ⅲ号人工染色体,标志着基因组人工合成工作进入真核生物领域。
生物染色体的长度较长，尤其是真核生物。通过体外或体外组装和染色体转移的技术来合成全新的、能够发挥正常功能的真核生物染色体困难极大，操作可行性较小。因此，一种能够快速替换大片段真核生物染色体、并使之能够发挥正常功能的大片段DNA替换技术显得极具开发价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。本发明的目的是为了解决不大于30kb大片段酿酒酵母V号染色体的替换问题，提出利用多个小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；所述大片段DNA为不大于30kb的DNA。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中采用两个筛选标记尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合物或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合对所述大片段DNA的替换进行表型表征。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述大片段DNA为酵母染色体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述大片段DNA为酵母V号染色体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示的的核苷酸序列。
本发明提供了所述方法制得酿酒酵母菌株。
本发明还提供了一种组合物，包括小片段DNA；所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域；
多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示或如SEQIDNo.86～SEQIDNo.103所示的的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中还包括酿酒酵母细胞和/或筛选标记；所述筛选标记为尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的组合物。
本发明还提供了所述的组合物或所述的试剂盒在制备合成型染色体中的应用。
本发明的基本思想是利用酿酒酵母同源重组的特性，通过共转化多个小片段DNA实现对大片段酿酒酵母V号染色体的替换。
本发明对比已有成果具有以下有益效果：
利用小片段DNA对大片段酿酒酵母V号染色体进行替换；
利用PCR方法对替换结果进行快速验证。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明得利用小片段DNA共转化替换不大于30kb大片段酵母V号染色体策略示意图；利用酿酒酵母自身的高效同源重组特性，多个不大于4kb小片段DNA被共转化至酿酒酵母细胞中将不大于30kb大片段酵母V号染色体进行替换；
图2示本发明实施例1中PCR验证不大于30kb大片段酵母V号染色体替换正确的电泳图；替换正确后，SYN-PCR出现条带，WT-PCR不出现条带；
图3示本发明实施例2中PCR验证不大于30kb大片段酵母V号染色体替换正确的电泳图；替换正确后，SYN-PCR出现条带，WT-PCR不出现条带；
图4为实施例2中V号酿酒酵母菌株与野生型酿酒酵母菌株BY4741生长曲线比较图；其中，线1示空白对照，线2示BY4741，线3示替换后菌株。
具体实施方式
本发明公开了小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的核心发明点是将多个不大于4kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身高效的同源重组特性，实现对不大于30kb酿酒酵母V号染色体的替换工作，替换的正确性通过PCR的方法进行验证。
关键步骤：将～15个长约3kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中对V号染色体进行替换，每两个相邻小片段DNA之间存在一个不大于750bp的重叠区域，然后利用抗性标记或营养标记筛选和PCR验证确保对不大于30kb酿酒酵母V号染色体替换的正确性。构建策略图见图3。
本发明的目的是通过下属技术方案实现的：
1.多个不大于4kb小片段DNA被共转化至酿酒酵母细胞中，每两个相邻小片段DNA之间存在一个不大于750bp的重叠区域，最后一个小片段DNA上携带URA3或者LUE2营养标记基因。
2.根据所转化小片段DNA所携带的营养标记基因，将转化后的菌株涂布于相应固体培养基上，然后利用PCR对所获得的单菌落进行验证。
3.挑选存在全部PCR条带的菌株，该菌株中上的不大于30kb酿酒酵母V号染色体被替换。
本发明对比已有成果具有以下有益效果：
利用小片段DNA对大片段酿酒酵母V号染色体进行替换；
利用PCR方法对替换结果进行快速验证。
本发明提供的小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法中所用质粒、菌株、原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
DNA共转化替换大片段酿酒酵母V号染色体的方法，包括以下步骤：
1、准备下述小片段DNA各200ng：A1.01，A1.02，A1.03，A2.01，A2.02，A2.03，A2.04，A3.01，A3.02，A3.03，A4.01，A4.02，A4.03，A5.01，A5.02，A5.03和A5.04(核苷酸序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示)。制备方法如下：
1)准备质粒pA1.01，pA1.02，pA1.03，pA2.01，pA2.02，pA2.03，pA2.04，pA3.01，pA3.02，pA3.03，pA4.01，pA4.02，pA4.03，pA5.01，pA5.02，pA5.03和pA5.04。上述质粒均为连接有步骤1中所述片段的pEASY-Blunt载体。
2)利用限制性内切酶PstI对质粒pA1.01，pA1.02，pA1.03，pA3.01，pA3.02，pA3.03进行消化，利用限制性内切酶XhoI对质粒pA2.01，pA2.02，pA2.03，pA2.04进行消化，利用限制性内切酶KpnI对质粒pA4.01，pA4.02，pA4.03进行消化，利用限制性内切酶BamHI对pA5.01，pA5.02，pA5.03，pA5.04进行消化。
3)将步骤2)中酶切消化的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，对目标长度的条带进行DNA胶回收，条带长度分别见表1：
表1小片段DNA
2、将上述DNA片段进行混合，进行酿酒酵母转化。转化菌株为单敲库菌株BY4741ΔYEL067C::KanMX，转化方法如下所示：
a)挑取酿酒酵母单菌落于YPD液体培养基中，30℃过夜培养；
b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液OD600，接种过夜培养液到5mLYPD中(0.125OD600/ml)，30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5(约需要3.5–4.5hrs)；
c)吸取1.5mL酿酒酵母培养液至1.5mLEP管内，5000rpm离心1min，收集细胞；用1mL无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞；用1mL0.1MLiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μL上清，剩余的100μLLiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
d)准备转化体系：
e)将100μL感受态细胞加入至转化体系中，吹吸均匀，最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；加入90μLDMSO，涡旋震荡10s；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上请，加入400μL5mMCaCl2，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上请，在无菌水中重悬后涂SC-Ura筛选培养板筛选。
3、待酵母在筛选培养板上生长2天后，将SC-Ura平板影印于YPD+G418平板上，30℃培养12h。
4、对比SC-Ura平板和YPD+G418平板，挑取在SC-Ura平板上生长而在YPD+G418平板上未生长的转化子同时在SC-Ura平板和YPD+G418平板上进行划线验证。确认在SC-Ura培养基上生长，而在YPD+G418培养基上不能生长的菌株，证明URA3筛选标记整合到了V号染色体上，同时KanMX筛选标记被敲除。
5、挑取表型生长正确的菌株，提取基因组，进行PCR验证确认了酿酒酵母V号上～30kb染色体被小片段DNA所替换。使用15μL的PCR反应体系：ddH2O7.8μL,5xPCR缓冲液3μL,2.5mMdNTPs1.5μL,上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，fastpfuDNA聚合酶0.2μL，模板DNA0.5μL。PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸10min,4℃保存。所使用引物见表2、表3：
表2引物
上游引物 下游引物
SYN-YEL067C1-F SYN-YEL067C1-R
SYN-YEL066W1-F SYN-YEL066W1-R
SYN-YEL065W2-F SYN-YEL065W2-R
SYN-YEL065W1-F SYN-YEL065W1-R
SYN-YEL064C1-F SYN-YEL064C1-R
SYN-YEL063C2-F SYN-YEL063C2-R
SYN-YEL063C1-F SYN-YEL063C1-R
SYN-YEL062W1-F SYN-YEL062W1-R
SYN-YEL062W2-F SYN-YEL062W2-R
SYN-YEL061C3-F SYN-YEL061C3-R
SYN-YEL061C1-F SYN-YEL061C1-R
SYN-YEL061C2-F SYN-YEL061C2-R
SYN-YEL060C2-F SYN-YEL060C2-R
SYN-YEL060C1-F SYN-YEL060C1-R
SYN-YEL058W2-F SYN-YEL058W2-R
SYN-YEL058W1-F SYN-YEL058W1-R
SYN-YEL057C1-F SYN-YEL057C1-R
WT-YEL067C1-F WT-YEL067C1-R
WT-YEL066W1-F WT-YEL066W1-R
WT-YEL065W2-F WT-YEL065W2-R
WT-YEL065W1-F WT-YEL065W1-R
WT-YEL064C1-F WT-YEL064C1-R
WT-YEL063C2-F WT-YEL063C2-R
WT-YEL063C1-F WT-YEL063C1-R
WT-YEL062W1-F WT-YEL062W1-R
WT-YEL062W2-F WT-YEL062W2-R5 -->
WT-YEL061C3-F WT-YEL061C3-R
WT-YEL061C1-F WT-YEL061C1-R
WT-YEL061C2-F WT-YEL061C2-R
WT-YEL060C2-F WT-YEL060C2-R
WT-YEL060C1-F WT-YEL060C1-R
WT-YEL058W2-F WT-YEL058W2-R
WT-YEL058W1-F WT-YEL058W1-R
WT-YEL057C1-F WT-YEL057C1-R
表3引物对应的编号
4.电泳检验PCR结果，如图2所示。SYN-PCR引物特异性扩增替换后的基因组模板，WT-PCR引物特异性扩增替换前的基因组模板。图2电泳结果显示只存在SYN-PCR条带，不存在WT-PCR条带，说明多个小片段DNA成功替换掉了酿酒酵母V号染色体上的～30kb序列。
实施例2
DNA共转化替换大片段酿酒酵母V号染色体的方法，包括以下步骤：
1、准备下述小片段DNA各200ng：B1.01，B1.02，B1.03，B1.04，B2.01，B2.02，B2.03，B2.04，B2.05，B3.01，B3.02，B3.03，B3.04，B4.01，B4.02，B4.03，B4.04，B4.05(核苷酸序列分别如SEQIDNo.86～SEQIDNo.103所示)。制备方法如下：
4)准备质粒pB1.01，pB1.02，pB1.03，pB1.04，pB2.01，pB2.02，pB2.03，pB2.04，pB2.05，pB3.01，pB3.02，pB3.03，pB3.04，pB4.01，pB4.02，pB4.03，pB4.04和pB4.05。上述质粒均为连接有步骤1中所述片段的pEASY-Blunt载体。
5)利用限制性内切酶NotI对质粒pB1.01，pB1.02，pB1.03，pB1.04，pB2.01，pB2.02，pB2.03，pB2.04，pB2.05，pB4.02，pB4.03，pB4.04，pB4.05进行消化，利用限制性内切酶KpnI对质粒pB3.01，pB3.02，pB3.03，pB3.04进行消化，利用限制性内切酶SalI对质粒pB4.01进行消化。
6)将步骤2)中酶切消化的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，对目标长度的条带进行DNA胶回收，条带长度分别见表4：
表4小片段DNA
DNA片段 Length(bp)
B1.01 3139
B1.02 2466
B1.03 3031
B1.04 2981
B2.01 2942
B2.02 2230
B2.03 2129
B2.04 2055
B2.05 2702
B3.01 2917
B3.02 2655
B3.03 3049
B3.04 2059
B4.01 2147
B4.02 2346
B4.03 2581
B4.04 2935
B4.05 2948
2、将上述DNA片段进行混合，进行酿酒酵母转化。转化菌株为实施例1所的酿酒酵母菌株，转化方法如下所示：
a)挑取酿酒酵母单菌落于YPD液体培养基中，30℃过夜培养；
b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液OD600，接种过夜培养液到5mLYPD中(0.125OD600/ml)，30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5(约需要3.5–4.5hrs)；
c)吸取1.5mL酿酒酵母培养液至1.5mLEP管内，5000rpm离心1min，收集细胞；用1mL无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞；用1mL0.1MLiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μL上清，剩余的100μLLiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
d)准备转化体系：
e)将100μL感受态细胞加入至转化体系中，吹吸均匀，最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；加入90μLDMSO，涡旋震荡10s；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上请，加入400μL5mMCaCl2，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上请，在无菌水中重悬后涂SC-Leu筛选培养板筛选。
3、待酵母在筛选培养板上生长2天后，将SC-Leu平板影印于SC-Ura平板上，30℃培养12h。
5.对比SC-Leu平板和SC-Ura平板，挑取在SC-Leu平板上生长而在SC-Ura平板上未生长的转化子同时在SC-Leu平板和SC-Ura平板上进行划线验证。确认在SC-Leu培养基上生长，而在SC-Ura培养基上不能生长的菌株，证明LEU2筛选标记整合到了V号染色体上，同时URA3筛选标记被敲除。
6.挑取表型生长正确的菌株，提取基因组，进行PCR验证确认了酿酒酵母V号上～30kb染色体被小片段DNA所替换。使用15μL的PCR反应体系：ddH2O7.8μL,5xPCR缓冲液3μL,2.5mMdNTPs1.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，fastpfuDNA聚合酶0.2μL，模板DNA0.5μL。PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸10min,4℃保存。所使用引物见表5、表6：
表5引物
表6引物对应的编号
7.电泳检验PCR结果，如图3所示。SYN-PCR引物特异性扩增替换后的基因组模板，WT-PCR引物特异性扩增替换前的基因组模板。图3电泳结果显示只存在SYN-PCR条带，不存在WT-PCR条带，说明多个小片段DNA成功替换掉了酿酒酵母V号染色体上的～30kb序列。
实施例3
比较实施例2替换后的菌株——酿酒酵母V号染色体被替换后所得菌株和BY4741的生长曲线。
试验材料：酿酒酵母V号染色体被替换后所得菌株和BY4741。
试验方法：
培养基：YPD(40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物)；
将上述菌株接种于5mLYPD培养基中，在30℃、220rpm过夜培养，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于200μL新鲜的YPD培养基中，于30℃条件下利用microplate-reader，监测生长过程中的菌体密度(OD600)，检测时长为24h。
试验结果见图4：培养条件下酿酒酵母V号染色体被替换后所得菌株与野生型菌株具有类似的生长状况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，其特征在于，多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；所述大片段DNA为不大于30kb的DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，采用两个筛选标记尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合对所述大片段DNA的替换进行表型表征。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述大片段DNA为酵母染色体。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述大片段DNA为酵母V号染色体。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示或如SEQIDNo.86～SEQIDNo.103所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求1至8任一项所述的制备方法制得酿酒酵母菌株。
9.一种组合物，其特征在于，包括小片段DNA；所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域；
多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段-DNA的替换。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物中所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示的的核苷酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其特征在于，还包括酿酒酵母细胞和/或筛选标记；所述筛选标记为尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合。
12.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求9至11任一项所述的组合物。
13.根据权利要求9至11任一项所述的组合物或如权利要求12所述的试剂盒在大片段DNA的替换中的应用。
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