CN109266566A

CN109266566A - 一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法

Info

Publication number: CN109266566A
Application number: CN201811188465.9A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 吴承晋
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109266566B

Abstract

本发明公开了一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，属于生物工程领域。本发明通过过量表达或缺失本源转录因子的编码基因CgRDS2来调节光滑球拟酵母的抗渗透压胁迫能力。结果表明，光滑球拟酵母缺失CgRDS2基因后，与野生型菌株相比，在渗透压胁迫条件下生物量可降低23％，细胞活性下降46％，细胞膜完整性降低47.6％；过表达CgRDS2基因后，菌株在1.5M NaCl胁迫条件下，生物量增加10％，细胞活性增加39％，细胞膜完整性增加12.1％。

Description

一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法

技术领域

本发明涉及一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母作为生产丙酮酸的唯一工业微生物，也用于生产其他有机酸，苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸等。在发酵生产有机酸的过程中，胞外有机酸的积累会造成培养基pH的下降，为了维持发酵体系的pH始终处于最适范围，需要流加NaOH、CaCO₃等碱性物质，然而，这类物质的添加会使发酵体系渗透压不断升高，导致细胞活力和生产能力下降。因此，渗透压胁迫是光滑球拟酵母发酵生产有机酸过程中一个亟待解决的问题。目前解决高渗胁迫的方法有：在线分离耦合技术、胞外添加或者基因工程手段强化相容性物质的供给、代谢工程手段改造菌种等。以上方法均提高了高渗条件下有机酸的产量。

目前有研究表明可以通过调节转录因子来抵御外界胁迫环境。转录因子CgAsg1和CgHal9通过调节细胞膜质子泵H⁺ATPase的活性来转运酸胁迫条件下胞内多余的H⁺，以维持胞内正常的pH；转录因子Msn2/4通过上调脂肪酸氧化基因加快胞内三酰甘油代谢以抵御饥饿环境；转录因子Mga2通过调节脂质代谢基因使得脂质组分发生变化以抵御氧胁迫环境；转录因子Cip1通过下调细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk1使得细胞周期停滞来应对高渗胁迫；转录因子Gcn4通过下调核糖体蛋白合成基因，使得蛋白质合成能力受损，进而抑制翻译来延长酵母寿命。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种调控光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，通过缺失或过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2。

在本发明的一种实施方式中，所述方法通过过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2增强光滑球拟酵母抵抗渗透压胁迫的能力。

在本发明的一种实施方式中，本发明通过缺失光滑球拟酵母CgRDS2基因，使菌株在渗透压胁迫条件下的生物量和细胞活性下降，从而降低菌株的生长能力。

在本发明的一种实施方式中，所述CgRDS2基因的核苷酸序列是NCBI上gene ID:2891470的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母菌株是Candida glabrata HTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ，已于Yan DN,Lin XB,Qi YL,Liu H,Chen XL,Liu LM,Chen J.2016.Crz1p regulates pH homeostasis in Candida glabrata by alteringmembrane lipid composition.Appl Environ Microb 82:6920-6929.论文中公开。

在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因CgHIS3同基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成CgHIS3，利用重组后的菌株含有CgHIS3基因而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgRDS2基因的的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为缺失CgRDS2基因的菌株Cgrds2Δ。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是将CgRDS2基因连接到质粒pY26上，由强启动子启动转录，得到重组质粒pY26-CgRDS2，然后将重组质粒转化到酵母中，利用重组质粒上的URA3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Cgrds2Δ/CgRDS2。

在本发明的一种实施方式中，所述强启动子为P_TEF。

本发明的第二个目的是提供一种抵抗渗透压胁迫的能力增强的光滑球拟酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述抵抗渗透压胁迫的能力增强的光滑球拟酵母是以基因型为his3Δtrp1Δura3Δ的Candida glabrata HTUΔ为出发菌株，过量表达CgRDS2基因。

本发明的第三个目的是提供一种抵抗渗透压胁迫的能力降低的光滑球拟酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述抵抗渗透压胁迫的能力增强的光滑球拟酵母是以基因型为his3Δtrp1Δura3Δ的Candida glabrata HTUΔ为出发菌株，缺失CgRDS2基因。

本发明还提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜完整性的方法，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2，敲除CgRDS2能够降低光滑球拟酵母细胞膜完整性，过表达CgRDS2能增加光滑球拟酵母细胞膜完整性。

本发明还要求保护所述光滑球拟酵母在工业生产有机酸方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述有机酸包括但不限于丙酮酸、苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸。

有益效果：本发明通过过量表达或缺失本源转录因子的编码基因CgRDS2来调节光滑球拟酵母的抗渗透压胁迫能力。结果表明，光滑球拟酵母缺失CgRDS2基因后，与野生型菌株相比，在渗透压胁迫条件下生物量可降低23％，细胞活性下降46％，细胞膜完整性降低47.6％；过表达CgRDS2基因后，菌株在1.5M NaCl胁迫条件下，生物量增加10％，细胞活性增加39％，细胞膜完整性增加12.1％

附图说明

图1为基因缺失菌株的构建凝胶电泳图：A是构建融合框的基因片段电泳图，其中，M为2000bp marker，LM为基因CgRDS2左臂与组氨酸基因，LMR为基因CgRDS2左臂、组氨酸基因与基因CgRDS2右臂；B是菌落PCR验证，其中，M为5000bp marker，+为阳性对照；-为阴性对照，泳道1表示阳性转化子的菌落PCR片段。

图2为基因过表达菌株的构建凝胶电泳图：A是质粒pY26-CgRds2双酶切验证，其中，M为5000bp marker，泳道1-4为从不同阳性转化子中质粒pY26-CgRds2的双酶切验证条带，上方是pY26片段，大小为7430bp，下方是CgRds2，大小为1389bp；B是含有质粒pY26-CgRds2的菌落PCR验证，其中，M为2000bp marker，泳道1-5为阳性转化子的菌落PCR片段，+为阳性对照。

图3为各菌株在正常条件和不同浓度NaCl条件下的平板生长实验图。

图4为各菌株在正常条件和1.5M NaCl条件下的的生长曲线：A是正常条件下各菌株的生长曲线；B是1.5M NaCl条件下各菌株的生长曲线。

图5为各菌株在正常条件和1.5M NaCl条件下细胞活性的测定结果。

图6为各菌株在正常条件和1.5M NaCl条件下的细胞膜完整性的测定结果。

具体实施方式

实施例1：缺失菌株的构建

以野生型光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 2001基因组为模板，分别以P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物，扩增出待敲除基因的左臂(L)、组氨酸基因(M)和右臂(R)，经融合PCR构建敲除框CgRDS2-LMR(图1)。将测序正确的敲除框用电击转化法导入出发菌株Candida glabrata HTUΔ，利用组氨酸标记基因来筛选阳性转化子，并提取基因组PCR测序验证。验证结果正确的菌株为缺失菌株Cgrds2Δ。

P1：ATTCGAAGGCCCACTGTA

P2：ACCCTCTTAACAAACGCCATGTCAAAAATATGATGCTGTGCTTAG

P3：CACAGCATCATATTTTTGACATGGCGTTTGTTAAGAGGGT

P4：ACTTGTCTATGCATATGTGTCTATGCTAGGACACCCTTAGT

P5：CTAAGGGTGTCCTAGCATAGACACATATGCATAGACAAGTTATATACA

P6：CCACTATTAGTGGCCCTAAATAAGT

实施例2：过表达菌株的构建

以野生型光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 2001基因组为模板，以P7/P8为引物扩增目的基因CgRDS2，将扩增产物与质粒pY26用相同的限制性内切酶NotI和BglII消化，通过T4连接酶将基因CgRDS2连接到pY26，由强启动子P_TEF启动转录，利用重组质粒上的URA3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Cgrds2Δ/CgRDS2(图2)。

P7：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGAAGAACCAGCAGC

P8：GGAAGATCTTTAGTTGGAATGATCTCTTGTAGGA

实施例3：各菌株生长性能的测定

(1)平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基中培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₆₀＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图3)。

(2)生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到100mL的YNB或者含有1.5M NaCl的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₆₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图4)。

平板生长实验和生长曲线分析1.5M NaCl对菌株wt(出发菌株Candida glabrataHTUΔ)、Cgrds2Δ、Cgrds2Δ/CgRDS2生长的影响。正常条件下，敲除或过表达CgRDS2并不影响菌株的生长；在1.5M NaCl条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ的生物量降低了23％，而过表达菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的生物量提高了10％。以上结果表明，基因CgRDS2能够调节细胞对渗透压胁迫的耐受能力。

实施例4：各菌株细胞活性的测定

将菌株wt、Cgrds2Δ、Cgrds2Δ/CgRDS2单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL含有1.5M NaCl的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₆₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养，每隔2小时取200μL涂布于相应的营养缺陷平板上，每个平板上的菌落数控制在30-300个，30℃培养2-3天，对形成的菌落计数并计算细胞活性。如图5所示，培养24h时，Cgrds2Δ菌株细胞活性较野生型菌株wt降低了46％，而Cgrds2Δ/CgRDS2菌株细胞活性较野生型菌株wt提高了39％，表明基因CgRDS2有利于光滑球拟酵母在1.5M NaCl条件下生长。

实施例5：各菌株细胞膜完整性的测定

将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB液体培养基中过夜活化，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₆₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至OD₆₆₀＝1.5，3000rpm离心10min收集菌体，用PBS(NaCl 8.0g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，Na₂HPO₄·H₂O 2.9g/L，KCl0.2g/L)清洗2次，释放到含有1.5M NaCl的YNB液体培养基中处理4h。将待测菌液的OD₆₆₀调节到1.0，吸取500μL，用PBS缓冲液洗涤2次收集菌体后再用500μLPBS缓冲液重悬，向菌体重悬液中加入5μLPI染液立即避光反应5min，3000rpm离心5min收集菌体，用PBS清洗2次，再用500μLPBS重悬，重悬液用于流式细胞仪检测。在低流速下分析样品中的20000个细胞，用FlowJo软件进行数据分析。如图6所示，(1)在正常条件下，wt、Cgrds2Δ、Cgrds2Δ/CgRDS2菌株的完整细胞分别为87.8％，81.4％，94.2％，说明在正常条件下三株菌的细胞完整性没有受到破坏；(2)在1.5M NaCl胁迫条件下，wt、Cgrds2Δ、Cgrds2Δ/CgRDS2菌株的完整细胞分别为73.8％，38.7％，82.7％，说明1.5M NaCl导致了光滑球拟酵母细胞膜完整性的降低；其中，与野生型细胞相比，菌株Cgrds2Δ细胞膜完整性降低了47.6％，而菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞膜完整性提高了12.1％，说明转录因子CgRds2能够提高渗透压胁迫下细胞膜的完整性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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attcgaaggc ccactgta 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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accctcttaa caaacgccat gtcaaaaata tgatgctgtg cttag 45

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<212> DNA

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<400> 3

cacagcatca tatttttgac atggcgtttg ttaagagggt 40

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<212> DNA

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<212> DNA

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ctaagggtgt cctagcatag acacatatgc atagacaagt tatataca 48

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<212> DNA

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ccactattag tggccctaaa taagt 25

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aaggaaaaaa gcggccgcat ggaagaacca gcagc 35

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggaagatctt tagttggaat gatctcttgt agga 34

Claims

1.一种调控光滑球拟酵母渗透压胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是缺失CgRDS2基因以降低菌株渗透压胁迫抗性，或者过表达CgRDS2基因以增强菌株的渗透压胁迫抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CgRDS2基因含有gene ID:2891470的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌株是Candida glabrata HTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缺失突变具体是：(1)将标记基因与基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框；(2)将步骤(1)的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成标记基因，(3)筛选获得缺失CgRDS2基因的菌株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达具体是：以强启动子启动转录CgRDS2基因。

6.一种渗透压胁迫抗性降低的光滑球拟酵母，其特征在于，所述光滑球拟酵母缺失了CgRDS2基因。

7.一种渗透压胁迫抗性提高的光滑球拟酵母，其特征在于，所述光滑球拟酵母过表达了CgRDS2基因。

8.根据权利要求6或7所述的光滑球拟酵母，其特征在于，以基因型为his3Δtrp1Δura3Δ的Candida glabrata HTUΔ为出发菌株。

9.一种改变光滑球拟酵母细胞膜完整性的方法，其特征在于，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2。

10.权利要求6-8任一所述的光滑球拟酵母在工业生产有机酸方面的应用。