CN103517916A

CN103517916A - 具有粘度改变表型的丝状真菌

Info

Publication number: CN103517916A
Application number: CN201280019757.4A
Authority: CN
Inventors: E·A·博迪; R·J·普莱特二世
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: CA2833541C; AR086200A1; BR112013025203A2; CA2833541A1; JP2014513531A; US20140094587A1; EP3000870B1; US9725726B2; EP3000870A1; EP2663633B1; KR20140033053A; AU2017202753A1; DK3000870T3; CA2833660A1; KR101993939B1; KR101952470B1; US9725727B2; AU2012245402B2; AR086201A1; DK2663633T3

Abstract

本发明描述与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。这种变异株非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质。

Description

具有粘度改变表型的丝状真菌

优先权

本专利申请要求均于2011年4月22日提交的系列号为61/478,162和61/478,160的美国临时申请的优先权，特此这些申请案以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，该基因突变产生具有改变的生长特性的变异株。这种变异株非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。

背景技术

丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，从而使得它们非常适于大规模生产用于工业应用、医药应用、动物健康应用以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白质。通常在生物反应器中在菌丝体深层培养中培养丝状真菌，该生物反应器适于将氧气和营养物质引入和分布进培养基(即发酵液)中。菌丝体的形态特征可影响发酵液的流变特性，从而影响生物反应器性能。

一般来讲，发酵液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量越高。在一些情况下，发酵液的粘度变得足够高而明显妨碍氧气和营养物质的溶解，从而不利地影响真菌的生长。另外，混合粘稠发酵液以及对粘稠发酵液进行充气所需的能量可大大增加生产成本，以及招致在马达和电源供应方面的资本支出较高。

发明内容

本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有可产生粘度改变表型的遗传变更。

在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含能使变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Mpg1蛋白的遗传变更，其中变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，功能性Mpg1蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养有氧发酵过程中(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更包含亲本株中所存在的mpg1基因的破坏。在一些实施例中，破坏mpg1基因是缺失mpg1基因的全部或部分所致。在一些实施例中，破坏mpg1基因是缺失包含mpg1基因的基因组DNA的一部分所致。在一些实施例中，破坏mpg1基因是诱变mpg1基因所致。

在一些实施例中，破坏mpg1基因是用位点特异性重组进行。在一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

在一些实施例中，变异株不产生功能性Mpg1蛋白。在一些实施例中，变异株不产生Mpg1蛋白。

在一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含seb1基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因和seb1基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含至少一个选自如下的基因的破坏：sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因。在一些实施例中，变异株每单位量生物质可产生与亲本株实质上相同量或更多的蛋白质。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分类为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(Talaromyces(Geosmithia)emersonii)、Fusarium venenatum和勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在另一方面，提供制备丝状真菌细胞的变异株的方法，该方法包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与亲本株的细胞相比该遗传变更可改变功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更可减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞可在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的mpgI基因。在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的mpg1基因。在一些实施例中，遗传变更利用位点特异性遗传重组进行。

在一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合来进行。在一些实施例中，破坏npg1基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

在一些实施例中，变异株每单位量生物质可产生与亲本株实质上相同量或更多的蛋白质。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种和链孢霉属物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌)、黑曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、Fusarium venenatum和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium lucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，在引入可减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生的遗传变更之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。在一些实施例中，亲本株内的所关注的蛋白质由内源基因或异源基因编码。

在另一方面，提供由上述变异株中任一者产生的所关注的蛋白质。

在又一方面，提供由上述方法中任一者产生的且具有上述特性中任一者的丝状真菌。

在另一方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与亲本株的细胞相比，深层培养物中需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码所关注的蛋白质的基因，其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)的遗传变更之前存在于变异株中。

在一些实施例中，所得的变异株的遗传变更包含亲本株中所存在的mpg1基因的破坏。在一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。在一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏Mpg1基因是与破坏seb1基因相结合进行。在一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

根据本说明书(包括附图)，本发明的变异株和方法的这些及其他的方面和实施例将显而易见。

附图说明

图1为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)pRATT236载体的图谱。

图2为mpg1破坏载体的图谱。

图3为seb1破坏载体的图谱。

具体实施方式

1.既述

本发明的菌株和方法涉及具有可影响其形态和生长特性的遗传修饰的丝状真菌细胞变异株。当在深层培养中培养该变异细胞时，其产生与包含亲本株细胞的细胞发酵液相比具有不同流变特性的细胞发酵液。这些变异株中的一些非常适于大规模生产酶及其他在商业上重要的蛋白质。

II.定义

在详细描述本发明菌株和方法之前，为了清楚起见对如下术语进行定义。未定义的术语应该与它们在相关领域中所用的普通含义一致。

如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。该生物体此前被分类为长梗木霉，并且也被分类为红褐肉座菌。

如本文所用，短语“丝状真菌细胞的变异株”或类似短语是指例如通过遗传操作，从属于盘菌亚门的亲本(或参照)株衍生(即从其获得或可从其获得)的丝状真菌细胞的株系。在本说明书中，亲本株和变异株可描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达表型、形态等等；然而，本领域技术人员将理解，在技术上来说是亲本株或变异株的细胞具有这些特性，称呼“菌株”是为了方便起见。

如本文所用，术语“所关注的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽。这种蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等等，并且可以高水平表达，且可用于商业化目的。所关注的蛋白质可由相对于变异株和/或亲本株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可在细胞内表达或作为分泌性蛋白表达。

如本文所用，短语“实质上无活性”或类似短语，意指特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰该混合物的预期目的。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换使用来指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母编码。该聚合物可以是直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还包含已经以天然方式或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，在功能上和/或在结构上类似的蛋白质视为“相关蛋白”。这类蛋白质可衍生自不同属和/或种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定、通过二级或三级结构分析确定或通过免疫交叉反应确定的同源物。

如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指通过在N末端或C末端任一端或这两个末端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在蛋白质的任一端或两个末端或在氨基酸序列中的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白质的蛋白质。可通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化进合适的宿主中并使该经修饰的DNA序列表达而形成衍生的蛋白质，来实现蛋白质衍生物的制备。

相关的(和衍生的)蛋白质包括“变体蛋白”。变体蛋白与参照/亲本蛋白(例如野生型蛋白)的差别在于少数氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。变体蛋白与亲本蛋白质间的差异氨基酸残基的数目可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白可与参照蛋白具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99或更多的氨基酸序列同一性。变体蛋白与参照蛋白的差别还可在于所选的基序、结构域、表位、保守区等等。

如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内提供与所关注的蛋白质(即通常是原始所关注的蛋白质质)类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在含有α-螺旋或β-片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选维持相同的特异性结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致显示类似或改善功能的变体酶。在一些实施例中，所关注的蛋白质中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于或接近所关注的区段或片段。因而，若所关注的区段或片段含有例如α-螺旋或β-片层结构，则置换氨基酸优选维持该特异性结构。

如本文所用，术语“同源蛋白”是指具有与参照蛋白类似的活性和/或结构的蛋白质。意图的是同源物不必是进化相关的。因而，意图的是该术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或对应的酶(即，就结构和功能而言)。在一些实施例中，希望鉴别具有与参照蛋白类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白可诱导与参照蛋白类似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经工程改造而产生具有所需活性的酶。

序列之间的同源程度可用本领域已知的任何合适方法测定(参见例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math(《应用数学进展》)2：482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48：443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：2444；诸如威斯康星遗传软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)(威斯康星州麦迪逊的GCG公司(Genetics ComputerGroup，Madison，WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA之类的程序；和Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)12：387-95)。

例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的关系。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.(《分子进化杂志》)35：351-60)的渐进比对方法的简化形式。该方法类似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS5：151-53)所描述的方法。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重=3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子为BLAST算法，该算法由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90：5873-87)描述。一种特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol(《酶学方法》)266：460-80)。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值：字长(W)＝11、BLOSUM62打分矩阵(参见例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：10915)、比对(B)＝50，期望值(E)＝10、M'5、N'-4以及对两条链均进行比较。

如本文所用，在至少两个核酸或多肽的情况下，短语“实质上相似”和“实质上相同”通常意指与参照(即野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或甚至至少约99％同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定。(参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-410；Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：10915；Karin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美国科学院院刊》)90：5873；和Higgins等人(1988)Gene(《基因》)73：237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。另外，可用FASTA(Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国科学院院刊》)85：2444-48)搜索数据库。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽实质上与第二多肽相同。两条核酸序列实质上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件(例如在中到高的一系列严格性内)彼此杂交。

如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在指编码和引导蛋白质或RNA的表达的核酸时是同义的。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因而单拷贝的指定基因(即单个等位基因)足以赋予指定表型。

如本文所用，术语“野生型的”和“天然的”可互换使用并且是指自然中存在的基因、蛋白质或株系。

如本文所用，“缺失基因”是指从宿主细胞的基因组移除基因。若基因包括未紧邻基因的编码序列的控制元件(例如，增强子元件)，则缺失基因是指缺失该编码序列，以及任选缺失相邻的增强子元件，包括但不限于例如启动子和/或终止子序列。

如本文所用，“破坏基因”广义地指实质上在宿主细胞中防止细胞产生功能基因产物(例如蛋白质)的任何遗传或化学操作，即突变。示例性的破坏方法包括完全或部分缺失或者诱变基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调控元件，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变型形式，上述突变中的任一者实质上防止功能基因产物的产生。基因还可以利用RNAi方法、反义方法或任何其他废止基因表达的方法来破坏。

如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传变更”可交换使用并且是指核酸序列的变更/改变。该变更可包括但不限于核酸序列中的至少一个核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。

如本文所用，“有氧发酵”是指在存在氧气的情况下的生长。

如本文所用，术语“细胞发酵液”统指液体/深层培养物中的培养基和细胞。

如本文所用，术语“细胞群”(cell mass)是指液体/深层培养物中存在的细胞组分(包括完整的和溶解的细胞)。细胞群可以干重或湿重表示。

如本文所用，术语“流变学”是指研究物质形变和流动的物理学分支。

如本文所用，“粘度”是流体对机械应力(如剪切应力或拉伸应力)引起的形变的抗性的量度。在本发明语境中，粘度还可以指包含丝状真菌细胞的细胞发酵液对机械应力(例如由转子/叶轮所提供的机械应力)的抗性。由于细胞发酵液的粘度可能难以直接测量，可使用粘度的间接测量，如在预选搅拌量下培养物发酵液的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、搅拌细胞发酵液以维持所选溶氧量所需的能量量或甚至是固体培养基上的集落形态。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度改变”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的或增加的粘度(即，减少的或增加的对剪切或拉伸应力的抗性)。一般来讲，等价细胞发酵液具有相当的细胞群。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。本文描述了用于比较丝状真菌细胞发酵液的粘度的方法。一般来讲，相当的(或等价的)细胞发酵液具有相当的细胞群。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度降低”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的粘度(即减少的对剪切或拉伸应力的抗性)。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。

如本文所用，“溶氧”(DO)是指以体积/体积单位测量的液体培养基中存在的氧(O₂)量。在整个发酵过程中，溶氧水平可维持在高的水平，例如170-100％至20％之间、100-80％至20％之间、70％至20％之间、65％至20％之间、60％至20％之间、55％至20％之间、50％至20％之间、45％至20％之间、44％至20％之间、43％至20％之间、42％至20％之间、41％至20％之间、40％至20％之间、35％至20％之间、30％至20％之间以及25％至20％之间。具体地讲，溶氧可在发酵开始时高并且允许随着发酵进行而下降。溶氧水平可通过搅拌(例如搅动)发酵物的速率和/或通过添加空气或氧气的速率来控制。可以400-700rpm搅拌(如搅动)培养物并且通过改变空气或氧气流量和叶轮速度将溶氧水平维持在高于20％、高于25％、高于30％、高于35％、高于40％、高于45％、高于50％和高于55％或更高。

如本文所用，“主要遗传定子”是指这样的基因或其遗传操作，该基因或其遗传操作是在缺少其他基因或其他基因的遗传操作的情况下赋予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是赋予指定表型所必要且充分的并不排除可通过进一步的遗传操作实现对表型的附加影响的可能性。

如本文所用，“功能性多肽/蛋白质”为具有活性，例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，并且尚未被诱变、截短或以其他方式修饰来废止或降低该活性的蛋白质。如所指定的，功能性多肽可以是热稳定性的或不耐热的。

如本文所用，“功能性基因”为能够被细胞组分用于产生活性基因产物(通常是蛋白质)的基因。功能性基因是被破坏的基因的对立物，被破坏的基因被修饰而使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。

如本文所用，如果变异株与亲本株之间蛋白质的表达差异小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约7％、小于约5％、或甚至小于约3％，则相比于亲本株，变异细胞“维持或保持高的蛋白质表达和/或分泌水平”。

如本文所用，如果宿主细胞已通过遗传方式或化学方式改变而防止产生表现出野生型蛋白质的特征性活性，尤其是促进菌丝伸长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌的粘度的活性的功能性蛋白质/多肽，则宿主细胞已经“经过修饰而防止产生指定的蛋白质”。这类修饰包括但不限于缺失或破坏编码该蛋白质的基因(如本文所述的)、修饰该基因而使得所编码的多肽缺少上述活性、修饰该基因以影响翻译后加工或稳定性、以及它们的组合。

如本文所用，“所关注的蛋白质”为期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白质。一般来讲，所关注的蛋白质在商业上对于工业用途、医药用途、动物健康用途以及食品和饮料用途而言是重要的，从而使得期望大量产生它们。所关注的蛋白质应区别于丝状真菌细胞所表达的无数其他蛋白质，这些其他蛋白质通常不是所关注的产品并且主要视为本底蛋白质污染物。

如本文所用，如果相比于亲本株产生的蛋白质的量，变异株产生的蛋白质的量减少不超过20％、不超过15％、不超过10％、甚至不超过5％，则变异株每单位量生物质产生与亲本株“实质上相同的量”的蛋白质，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。

如本文所用，如果相比于亲本株，变异株产生的蛋白质的量增加至少5％、至少10％、至少15％或更多，则变异株每单位量生物质产生比亲本株“实质上更多的蛋白质”，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。

如本文所用，“荧光染料”为发荧光的染料。优选的荧光染料可与真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质结合。

如本文所用，单数词语“一个”、“一种”和“所述”涵盖多个指代物，除非上下文明确指明不是这样。特此以引用的方式将本文所引用的所有参考文献全文并入本文。如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：

III.Mpg1蛋白产量改变的丝状真菌菌株

在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含遗传变更，该遗传变更引起变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Mpg1蛋白。变异株的细胞随后在深层培养有氧发酵期间产生这样的细胞发酵液，与亲本株的细胞相比该细胞发酵液需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量或在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量。

在一些情形下，该遗传变更引起变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生降低量的功能性Mpg1蛋白，并且与亲本株的细胞相比所得的细胞发酵液需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量或在预选的搅拌量下维持更高的溶氧量。在这些情形中，据信与亲本株的细胞群相比，变异株的细胞群表现具有降低的粘度，这是造成与溶氧量和搅拌相关的观察结果的原因，如实例中所述。

功能性Mpg1蛋白的量的降低可由破坏亲本株中存在的mpg1基因引起。因为破坏mpg1基因是将粘度降低表型赋予变异株的主要遗传定子，所以这类变异株仅需要包含破坏的mpg1基因，而所有其他基因可保持完整。在一些情形中，与衍生变异株的亲本株相比，变异株可任选包括另外的遗传变更。这种另外的遗传变更不必赋予粘度降低，但可进一步降低粘度或为变异株赋予其他优点。

破坏mpg1基因可用实质上防止功能性mpg1基因产物即Mpg1蛋白的表达的任何合适方法进行。本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失mpg1基因，包括完全或部分缺失例如Mpg1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件；和完全或部分缺失包括mpg1基因的任何部分的染色体的一部分。破坏mpg1基因的具体方法包括在mpg1基因的任何部分(例如，Mpg1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件)中产生核苷酸置换或插入。优选地，利用序列特异性分子生物学技术通过遗传操作(与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定的核酸序列)进行缺失、插入和/或置换(统称突变)。然而，可将化学诱变用于破坏mpg1基因。

seb1基因中的突变可降低mpg1启动子的效率、降低mpg1增强子的效率、干扰mpg1mRNA的剪接或编辑、干扰mpg1mRNA的翻译、将终止密码子引入Mpg1编码序列中以防止全长Mpg1蛋白的翻译、改变Mpg1蛋白的编码序列以产生活性较低或失活的蛋白质或降低Mpg1与其他细胞壁组分的相互作用、改变Mpg1蛋白的编码序列以产生较不稳定的蛋白质或靶向该蛋白质进行破坏、引起Mpg1蛋白错误折叠或不正确修饰(例如，通过糖基化进行的修饰)或干扰Mpg1蛋白的细胞运输。

在一个实施例中，这些及其他遗传操作起到如下作用：降低或防止功能性Mpg1蛋白的表达，或者降低或防止Mpg1蛋白的正常生物活性，从而在细胞中产生会导致粘度降低表型的形态改变。

在其它情形中，遗传变更可增加或恢复功能性Mpg1蛋白的表达，或者增加Mpg1蛋白的正常生物活性，从而在细胞中产生会导致粘度增加或恢复的表型的形态改变。可增加或恢复Mpg1功能的示例性遗传变更，是将mpg1基因的额外拷贝引入细胞中、增加mpg1启动子、增强子或其他控制元件的效率、增加编码Mpg1蛋白的mRNA的翻译、增加编码Mpg1蛋白的mRNA的稳定性、在mpg1基因中引入可增加Mpg1蛋白的活性或稳定性的改变、在mpg1基因中引入可调节与其他蛋白质或细胞壁组分等的相互作用的改变的那些遗传变更。其他可增加或恢复Mpg1功能的遗传变更，是能使会降低或防止功能性Mpg1蛋白表达的遗传变更的效果发生逆转的那些遗传变更。

用于所述的操作和用途的丝状真菌细胞通常来自子囊菌门盘菌亚门，尤其是具有营养菌丝状态且包含mpg1基因的同源物的真菌。这种生物体包括用于生产商业上重要的工业用和医药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)属物种和链孢霉属物种。具体的生物体包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌)、曲霉菌曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、Fusariumvenenatum和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium lucknowense)。

如Kruszewska等人(1998)Cur.Genet.(《当代遗传学》)33：445-50和Zakrzewska等人(2003)Applied and Environmental Microbiology(《应用微生物学和环境微生物学》)69：4383-89所述，来自里氏木霉的Mpg1(PID122551)编码GTP：α-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶。mpg1基因的过表达可增加GDP-甘露糖水平，这可在蛋白质糖基化的早期阶段起主要调节作用。然而，迄今先前尚未将Mpg1描述为与改变的形态相关，尤其尚未将其描述为与产生低粘度表型的改变的形态相关。本公开提供了Mpg1与改变的形态相关的实验证据。

里氏木霉Mpg1((jgi|Trire2|122551)蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQID NO：1示出：

MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLAERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIIM

粗糙脉孢霉Mpg1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：2示出：

MKALILVGGFGTRLRPLTLTMPKPLVEFGNKRMILHQIEALAAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKYLAEYEKQFGINITISIESEPLGTAGPLKLAEDVLRKDDTPFFVLNSDVTCEYPFKELAAFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVQFVGNRINAGLYIFNPSVIDRVELRPTSIEQETFPAMVRDGQLHSFDLEGFWMDIGQPKDFLTGTCLYLSSLTKKGSKELAPTTLPYIHGGNVLIDPSAKIGKNCRIGPNVTIGPNVVVGDGVRLQRCVLLEGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGKWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSILPHKTIKANVDVPAIIM

米曲霉甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQID NO：3示出：

MKGVGGGTRRTTKVCNKMVHAVAAGVTDVAVNYRMKAYKMKAVGGGTRRTTKVGNRMHVSAAAGVTDVAVNYRDVMVSAKKYYNNSVSDTAGKARGKDDSVNSDVCDYKHKAHGDGTVVTKVYNVKSVSGTAGKAKGKDDSVNSDVCDYKAHKKHGDGTVVTKVDSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGMYNSVKRRTSKIAMVADNHSSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGYMNSVNRRTSTACKDGHSDGWMDVGKDSGTCYSSTKKGSKTTYVHGGNVMHSAKGKNCRGNVTGDGWMDVGKDSGTCYTSAKRNSKANSYVYGGNVMVDSAKGKNCRGNVVGDVVVGDGVRRCVKGSKVKDHAWVKSTVGWNSTVGRWARNVTVGDDVTGDYVNGGSVHNVVVGDGVRRCVNSKVKDHAWVKSTVGWNSSVGRWARNVTVGDDVTADVYVNGGSHKSKANVDVAMKSKNVDVAM

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量水平被改变的Mpg1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性，例如，与SEQ ID NO：1、2或3具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。编码每条氨基酸序列的核苷酸序列可从BLAST搜索每一相应的蛋白质来鉴别，如本领域技术人员已知的。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，被破坏的mpg1基因编码与SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性的Mpg1蛋白，例如，与SEQ ID NO：1、2或3具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。

本文提供的氨基酸序列信息容易使得技术人员能鉴别任何丝状真菌中的Mpg1蛋白和编码Mpg1蛋白的核酸序列，以及能在mpg1基因中做任何适当的破坏以影响Mpg1蛋白的产生。编码SEQ ID NO：1、2和3的多核苷酸序列可在GenBank或JGI数据库中找到，如本领域技术人员已知的。

在另一方面，提供了改变丝状真菌细胞的形态的方法。与亲本细胞生长和细胞发酵液粘度相比，变异丝状真菌细胞在固体培养基上表现出改变的生长形态并且在深层培养中培养时产生具有不同粘度的细胞群。

在一些情形中，该方法包括利用合适的遗传方法破坏亲本株中的mpg1基因，其中在有氧发酵过程中与亲本株的细胞相比，mpg1破坏的变异株在深层培养有氧发酵过程中产生的细胞发酵液需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量。这类方法可用于以上文及别的地方所述的任何方式破坏mpg1基因，如本领域技术人员已知的。优选地，利用序列特异性的分子生物学技术(与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定的核酸序列)通过遗传操作进行mpg1基因的破坏。然而，可使用化学诱变，且结果令人满意。

在一些实施例中，粘度降低表型被引入其中从而产生粘度降低菌株的亲本株已包含旨在以高水平表达的所关注的基因。这样，本发明方法避免需要将所关注的基因引入预先存在的粘度降低菌株来进行生产。因而，本发明方法可用于从已包含所关注的基因的亲本株产生丝状真菌细胞的粘度降低变异株。

IV.通过改变Seb1产量而产生的累加效果

在本发明组合物和方法的一些实施例中，将可影响Mpg1产量的遗传变更与可影响Seb1产量的遗传变更相组合。来自深绿木霉(Trichodermaatroviride)的seb1基因为STRE元件结合蛋白，并且据信seb1基因为酵母msn2/4基因和构巢曲霉msnA基因的直系同源物。要注意的是，seb1基因不能补足酵母中的msn2/4基因，所以其可能不是功能性同源物。Seb1涉及渗透胁迫应答但非该应答所必需的，但尚未描述其与改变的形态(尤其是导致低粘度表型的那些形态)相关。

使用深绿木霉Seb1氨基酸序列(SEQID NO：4)作为查询序列对可公开获得的里氏木霉基因组DNA序列进行BLAST搜索显示，里氏木霉基因组包括与seb1密切同源的单个基因。未鉴别出另外的同源物或相似序列，从而表明seb1为独特的单拷贝基因。Seb1蛋白的同源物存在于例如里氏木霉(SEQ ID NO：5)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)(SEQ ID NO：6)、烟曲霉Af93(SEQ ID NO：7)和费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)NRRL181(SEQID NO：8)中：

深绿木霉Seb1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：4示出：

MDGMMSQAMGQQAFYFYNHNHDHKMARQAIFAQQMAAYQMVPTLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSRKHMMLDAEFGDNPYFPSTPPLSTSGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAMKEAVDTTESLVVDWASIVSPPLSPVYFQSQVSRVPSPTSSPSDILSTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLTGLAEDLKGEQLSTAQHTFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSNLVNLGEVNPIDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEELSFEDNDAFGFNSLPSPTSSIDFSDVHQDKRRKKEKKDIKPIMNTAASGSPSGNEQIGATPAASAASDSNASSASEDPSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHAGGAIVMNLIEDGSEVPAFDGSMMTGPVGDDYNTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGDQSKKKRKRSD

里氏木霉Seb1蛋白的预测氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：5示出：

MDGMMSQPMGQQAFYFYNHEHKMSPRQVIFAQQMAAYQMMPSLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSSRKPMLVDTEFGDNPYFPSTPPLSASGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAIKDSIDATESLVLDWASIASPPLSPVYLQSQTSSGKVPSLTSSPSDMLSTTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLLADDIKGEPLPTAAQPSFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSSLVNLGEINPVDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEDLSFDDEAFHFPSLPSPTSSVDFCDVHQDKRQKKDRKEAKPVMNSAAGGSQSGNEQAGATEAASAASDSNASSASDEPSSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHSGGAIVMNLIEESSEVPAYDGSMMAGPVGDDYSTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGEQGKKKRKRSD

棒曲霉Seb1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：6示出：

MDTTYTMVGTPVQGQPSFAYYTTNDSQSRQQHFTSHPSEMQAFYGQMQPYPQQQQQTCMPDQQSIYAAQPMLNMHQMATANAFRGALSMTPIVSPQPTHLKPTIIVQQDSPMLMPLDTRFVSSDYYAFPSTPPLSTSGSTISSPPSSGRSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHSELLANADWSRSDSPPLTPVFIHPPSLTASQSSDLLSAHSSCPSLSPSPSPVSSTFIAPPHSGLSVEPSGTDFCDPRQLTVESSVDSSTELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHESLSPAYTSSTEDPLGSLPTFDSFTDLDSEDEFVNNLVDFHPGGNPYFLGDKRQRLGSYLLEEDEFLSDRSFDDLDDHEAFAHSGLPSLEPSELISVQGDVAEVSEEMRSKKRTTSRRTLKRTNSSDSSSESLATSGKRTQASANGRSGHSEATSSSAQQSTTPSRQNSTANASSSSEAPSAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCTLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNASLQASYEEREPRLLGAALYEAANAAANKSTTSDSSDGTISDTSSVEGRPIKKRRREDHA

烟曲霉Af93Seb1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：7示出：

MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPFEMQYYGQVSSYPQQQAQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQDSPALMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTDWSRSDSPPLTPVFIQPQSLTASQSSDLLSAQIPCPSLSPSPSPDSATFISHPQSILSALEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFQGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESTDFLAVEGDATQSTEEMSSKKRVTSRRSLKKASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSDTTSTVQQSTASSRQNSTANTSNSESPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNSSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV

费希新萨托菌NRRL181Seb1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ IDNO：8示出：

MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPSEMQYYGQVPPYPQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQQDSPVLMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTGWSRSDSPPLTPVFIQPPSLTASQSSDLLSAHMSCPSLSPSPSPDSTTFISHPQSVLSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFLGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESSDFLAAEGDATQNTEEMSSKKRVTSRRSLKRASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSETTSTVQQSTASSRQNSTANTSSSGSPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNGSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量水平被改变的Seb1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、5、6、7或8的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性，例如，与SEQ ID NO：4、5、6、7或8具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。编码SEQID NO：4、5、6、7和8的多核苷酸序列可在GenBank或JGI数据库中找到，如本领域技术人员已知的。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，seb1基因被破坏，其中seb1基因编码与SEQ ID NO：4、5、6、7或8的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性的Seb1蛋白，例如与SEQ ID NO：4、5、6、7或8具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。

本领域技术人员将理解，可以以与本文详细描述的可影响Mpg1产量的遗传变更相同的方式产生可影响Seb1产量的遗传变更。在2011年4月22日提交的临时专利申请No.61/478,160进一步描述了导致粘度改变的Seb1蛋白变更。

V.通过改变Sfb3产量而产生的累加效果

在本发明组合物和方法的一些实施例中，将可影响Mpg1产量或Mpg1和Seb1产量的遗传变更与可影响Sfb3产量的遗传变更相结合。Sfb3基因(也称为Lst1)之前在出芽酵母(即酿酒酵母(Saccharomvcescerevisiae))中得到表征，在出芽酵母中其编码与围绕运输小泡(运输小泡将蛋白质从内质网转运至高尔基体)的COPII外壳蛋白缔合的蛋白质。Sfb3以及Sfb2是Sec24的同源物，所有所述基因参与将特定货物蛋白质包装进小泡中。

Sec24为酵母中的必需基因，而Sfb3和Sfb2则不是，但缺失酵母中的Sfb3已知可影响质膜转运蛋白(Pmalp)和涉及细胞壁合成的葡聚糖基转移酶(Gaslp)的转运。

使用酿酒酵母Sec24p、Sfb3p或Sfb2p氨基酸序列作为查询序列，用BLAST搜索可公开获得的里氏木霉基因组序列揭示，里氏木霉具有与酵母Sec24最密切同源的单个基因和与酵母Sfb3最密切同源的单个基因。未鉴别出其他同源物，从而表明里氏木霉不具有与Sfb2等价的基因。此外，Sfb3蛋白的同源物存在于例如里氏木霉(SEQ ID NO：9)、米曲霉(SEQ IDNO：10)、黑曲霉(SEQ ID NO：11)、绳状青霉(SEQ ID NO：12)、产黄青霉(SEQ ID NO：13)、粗糙脉孢霉(SEQ ID NO：14)和尖孢镰刀菌(SEQ ID NO：15)中：

里氏木霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：

MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFMRDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKEGDGEATAVMANFAGLRPAYW

米曲霉RIB40Sfb3氨基酸序列(GI：83766074；SEQ ID NO：10)：

MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKLFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRETGYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCVVSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYFSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYW

黑曲霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：11)

MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWLHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMLVEDRNNEAQSSVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYW

绳状青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：12)

MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDVGDLATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKAGDKTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYW

产黄青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：13)

MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQPQQQSQFLNTGLNQHADRPVSPAVGLVSGQSVAAIPGIQSGAGSVPTSGRIDPEHIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMDQHLPPPAAIPFVAQDQGNSSPKYARLTLNNIPSASDFLTSTGLPLGMILQPLAPLDPGEQPIPVLDFGDVGPPRCRRCRTYINPFMSFRSGGSKFVCNMCTFPNDTPPEYFAPLDPSGARVDRMQRPELLMGTVEFTVPKEYWNKEPVGLQTLFLIDVSRESVHRGFLKGVCAGIKDALYGDDDKASEGTEGDGSSRKLPVGAKVGIVTYDKEVHFYNLAAALDQAQMMVMTDLDEPFVPLSEGLFVDPYESKSVITSLLSRIPKIFSSIKNPESALLPTLNSALSALQATGGKIVCAVASLPTCGPGHLAIREDPKVHGTDAERKLFTTENPAWKKTASKLAEAGVGLDLFMAAPGGTYLDVATIGHVSSLTGGETFFYPNFHAPRDLLKLRKEIAHAVTRETGYQTLMKVRCSNGLQVSAYHGNFVQHTLGADLEIAGVDADKAVGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSADGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFVDQDAVVSVIAKEAASKTLDKNLKDIRASISEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLVKSRAFKAGPESSDRRIHDMRLIRSMGCTEMALYLYPRIIPVHNMQPEDGFANEHGQLQIPPTMRASYSRIEDGGVYIVDNGQAILLWIHAQVSPNLLEDLFGPGHNSLQGLNPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKSVTIQLARQGLDGAEYEFARLLLEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEEGGEGAIASLSAMRTPYW

粗糙脉孢霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：14)

MADYTMYHALGQGETLDPNDPNRTTQPAPPQFQPPVAPNPYHPGAEYNAPGQQQQQQQQYGQQYGQQYGQQYGQQQYGQEYGHQQQQQQQQQYGAPSPYGAPPAHSPVSPMDDVGLAAQMGGMSLGAGAGAADHHGRKKKKDRHAFHTVEAPAGSSQPFNGMPPAGIPATQFLNADPSLAGRIPGPGHGQFPMPASPAFGPVPTSAADFAARDATQGVGSGVFAAGGPQGGKPSPDDTPSVPLSRDAVQPYFHTNVYPTFERLVPPPAVTSFVALDQGNSSPKFARLTMTNLPASAEGLKSTGLPLGLLLQPLAETQPGELPIPVLDFGEQGPPRCHRCRAYMNPFMMFKAGGNKFVCNLCTYANDTPPEYFCALSPQGVRVDRDQRPELTRGTVEFVVPKEYWTKEPVGMRYLFVIDVTQESYNKGFLESFCEGILSALYGGSEEGEDQDETGEPKRKIPAGAKVGFVTFDQEIHFYNVSPALEQAQMIVMPDIEDPFLPLSDGLFVDPYESKAVISSLLTRLPQMFSNIKNPEPALLSALNSAVAALEKTGGKVFCSLAALPTWGPGRLFMRDDGKHPGGEPDKKLFTTEHPGWRKLAEKMVSLGVGADFFMASPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFFYPNFVVQRDSTKLSLEIHHAVRRETGYAALMKVRCSNGLQVNAYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKALAVTFGYDGKLDSKLDAHFQAALLYTTASGQRRVRCINVIAGVSDLARDCMKYIDQDAIVSILAKEASTKLSTTSANLKEVRSSLTEKTIDILALYRKNHLAVPHPPQQLVMPERLKEFTMYVLGMLKCRAFKGGNETTDRRVHDMRLIRSMGARELSLYLYPRIIPLHSLQPEDGYPDATTGHLRMPSTMRASFARVEPGGVYLVDNGQVCLLWMHAQTAPALIQDLFGEDKTTLQSLDPYTSTIPVLETHLNAQTRNIIEYMRTVRGSKGLTIQLARQGIDGAEFEFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHVHKGVQLELAGQRKREDGESHSALGSFTGLRPAYW

尖孢镰刀菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：15)

MADYAQYHALGQGEVIDPNDPNRTSQPSAQQFQPPIAPSPYQQQASPYGAPQYLGGQQAPPPMTGSPAPAPGYGYAPPQAQAPPGQAPPSQDATLAAQLGGMNLGDGHGTARRKKKDRHAYHTVEPTGSSQAFNGMPPQGTSATQFLDSVPGGPGFGGQFGSPQGTPQMQSQSQFSAPVNPAFGPGPVAGTPGVGEGLGTASVSTSGPKGVSPDDMPSVPASRDAIQQYYLKNVYPTFERHVPPPSTVSFVAYDQGNSSPKYTRLTLNNIPTTQDALQATGLSLGLLLQPLAPLQAGEAEIPVLDFGEAGPPRCRRCRAYMNPFMMFRSGGNKFVCNLCAYPNDTPPEYFSATNPQGVRVDRDTRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFLIDVTQESYNKGYVEAFCEGIRVALYGGEDQELDENGEPKRRIPEGAKVGFVTYDKDIHFYNVNPALDQAQMMIMPDLEDPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLTRLPDMFSTIKNPEPALLAALNSALAALEATGGKVVASCSALPTWGPGRLFMRDNGNHPGGEIDKKLYTTEHPAWKKVAEKMAASGVGADFFLAAPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFYYPNFIAARDSRKLSLEISHAVTRETGFQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKAMGVSFSYDGKLDPKLDAHFQSALLYTTASGERRVRCSNVIASVTETSKESGAREQGIRECLKFVDQDAVIGMLAKEASTKLATTSSNLKDIRHWLSEKAIDVLACYRKHAAQQHPPGQLVMPERLKEYCMYLLGLLKCRALKGGVENSDRRVHEMRMLRSMGALELSLYLYPRMIPIHNLAPEEGFADPETGHLKMPPAIRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHSQTSPNLISDLFGEDKDSLKSLDPYTSALPLLETHLNAQVRNIIEFLRTMRGSKGLTIQLARQGIDGAEFDFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHKGVQLELSGQRKKEGEEHTAASLSNFAGLRPAYW

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量水平被改变的Sfb3蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性，例如，与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14或15具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。编码每条氨基酸序列的核苷酸序列可从BLAST搜索每一相应的蛋白质来鉴别，如本领域技术人员已知的。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，sfb3基因被破坏，其中sfb3基因编码与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性的Sfb3蛋白，例如与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14或15具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。

来自大约40个盘菌亚门物种的Sfb3蛋白氨基酸序列的比对揭示了一特异性的氨基酸序列，即IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：16，其中X为任何氨基酸残基)，其接近Sfb3蛋白的C端，并且不存在于Sec24蛋白中。该共有序列可用于鉴别盘菌亚门的其他成员中的Sfb3蛋白及其变体。

本领域技术人员将理解，可以以与本文详细描述的可影响Mpg1和/或Seb1产量的遗传变更相同的方式产生可影响Sfb3产量的遗传变更。Sfb3蛋白的改变导致粘度改变还在于2011年8月25日提交的作为国际专利申请No.PCT/US201I/049164提交的、于2012年3月1日公布的PCT专利公开No.WO2012/027580A1中描述，将其以引用方式并入本文。

VI.实用性

已知丝状真菌的粘度降低菌株可用于改善深层培养物中的氧气和营养物质的分布、降低搅拌深层培养物所需的能量量以及增加培养物中存在的，从而导致蛋白质产量增加。此外，本发明的丝状真菌变异株提供优于以前描述的粘度降低菌株的明显优势。

第一，本发明的变异株可具有完全确定的基因组，从而使得它们十分适于后续的遗传操作、互补、杂交等。第二，本发明菌株的蛋白质产量不受不利影响，例如不受导致伴随的粘度改变的操作的影响。第三，粘度降低的菌株可基本上从任何亲本株产生，包括已产生期望高水平表达的蛋白质(即所关注的蛋白质)、已编码选择性标记或已包含在生产宿主中理想的其他特征的亲本株在内。因而，本发明菌株和方法消除了需要将编码所关注的蛋白质的基因转移进预先存在的粘度降低的生产菌株中。

本发明的菌株和方法可用于在丝状真菌的深层培养物中生产商业上重要的蛋白质。商业上重要的蛋白质包括例如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、蛋白酶、激酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、酯酶、过水解酶、转移酶、漆酶、过氧化氢酶、氧化酶、还原酶、叶绿素酶、疏水蛋白、凝乳酶、碳酸酐酶、胸苷酸合酶(hymidylate synthase)、二氢叶酸还原酶、酪氨酸激酶、多药耐药蛋白(如ABC P-gp蛋白)、CAD(氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸酶)、拓扑异构酶、核糖核苷酸还原酶和抗体以及能够在丝状真菌中表达的其他酶和非酶蛋白质。这类蛋白质可适合于工业、医药、动物健康以及食品和饮料用途。

下列带编号的段落进一步描述了本发明组合物和方法的多个方面和实施例：这些带编码的段落每一者的主题可单独使用或与任何其他带编号的段落的主题结合使用，如所指出的那样。

1.在一个方面，提供了衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含能使变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Mpg1蛋白的遗传变更，其中变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

2.在段落1的变异株的一些实施例中，功能性Mpg1蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

3.在段落1或2的变异株的一些实施例中，所述遗传变更包含亲本株中存在的mpg1基因的破坏。

4.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是缺失mpg1基因的全部或部分所致。

5.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是缺失包含mpg1基因的基因组DNA的一部分所致。

6.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是诱变mpg1基因所致。

7.在段落3-6中任一者的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是用位点特异性重组进行。

8.在段落3-7中任一者的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

9.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株不产生功能性Mpg1蛋白。

10.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株不产生Mpg1蛋白。

11.在段落1-10中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

12.在段落1-11中任一者的变异株的一些实施例中，还包含sfb3基因的破坏。

13.在段落1-12中任一者的变异株的一些实施例中，还包含至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2的基因的破坏。

14.在段落1-13中任一者的变异株的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株实质上相同量或更多的蛋白质。

15.在段落1-14中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

16.在段落1-15中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

17.在段落1-16中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

18.在另一方面，提供了制备丝状真菌细胞的变异株的方法，该方法包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与亲本株的细胞相比较该遗传变更可改变功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

19.在段落18的方法的一些实施例中，遗传变更可减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞可在深层培养有氧发酵过程中(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

20.在段落18或19的方法的一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的mpg1基因。

21.在段落18-20中任一者的方法的一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的mpg1基因。

22.在段落18-21中任一者的方法的一些实施例中，遗传变更利用位点特异性遗传重组来进行。

23.在段落18-22中任一者的方法的一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

24.在段落18-23中任一者的方法的一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏sfb3基因相结合进行。

25.在段落18-24中任一者的方法的一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

26.在段落18-25中任一者的方法的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株实质上相同量或更多的蛋白质。

27.在段落18-26中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

28.在段落18-27中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

29.在段落18-28中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

30.在段落18-29中任一者的变异株的一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

31.在段落30的方法的一些实施例中，在引入会减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生的遗传变更之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。

32.在另一方面，提供了由段落11的变异株产生的所关注的蛋白质。

33.在另一方面，提供了通过段落18-31中任一者的方法产生的丝状真菌的变异株。

34.在另一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：

(a)遗传变更，所述遗传变更导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码所关注的蛋白质的基因，

其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)的遗传变更之前存在于变异株中。

35.在段落34的变异株的一些实施例中，遗传变更包含亲本株中存在的mpg1基因的破坏。

36.在段落35的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是与在mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

37.在段落35或36的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

38.在段落35-37中任一者的变异株的一些实施例中，破坏mpg1基因是与破坏seb1基因相结合进行。

根据本说明，本发明菌株和方法的这些及其他方面和实施例对技术人员将是显而易见的。如下实例旨在进一步举例说明(但不限制)所述菌株和方法。

实例

实例1.鉴定出mpg1基因是造成丝状真菌形态改变的原因

A.概述

利用根癌农杆菌介导的转化，用含有pyr2基因和里氏木霉组蛋白H1启动子的核酸转化示例性的丝状真菌即里氏木霉，来制备丝状真菌破坏文库。这样，pyr2基因既充当选择性标记又充当基因标签。该组氨酸H1启动子也充当基因标签以及如果在基因的起始密码子之前插入的话充当启动子以上调基因。所用的特定根癌农杆菌菌株为EHA105，其被认为是超高毒力的(Hood等人，1993)。然而，其他根癌农杆菌菌株例如A136和EHA101可在里氏木酶中产生类似的转化频率。还可以使用毛根农杆菌(A.rhizogenes)菌株，例如ATCC43057。该特定破坏文库含有约50,000个转化株。

B.里氏木霉MAGI菌株

里氏木霉Morph1.1(即“Morph”)突变株缺失四个主要的纤维素酶基因(即cbhI、cbhII、eglI和eglII)，这使得其可用于在缺少纤维素酶本底活性的情况下表达其他蛋白质。通过将报告盒(reporter cassette)的插入靶向至里氏木霉Morph1.1的乳清酸核苷5′-一磷酸焦磷酸化酶(pyr2)基因座来产生MAGI菌株。该报告盒含有处于里氏木霉纤维二糖水解酶I(cbhI)启动子序列和转录终止子序列的控制下的经密码子优化的Ptilosarcus属物种绿色荧光蛋白(GFP)及α-淀粉酶。还将潮霉素B磷酸转移酶基因与该报告盒在pyr2基因座处整合。与整合该报告盒的同时，将pyr2基因的3′部分缺失，从而使得该菌株为尿苷营养缺陷型。

C.DNA的制备

用于破坏的载体为基于PZP100载体的pRATT236，PZP100载体包括T-DNA左边界区和T-DNA右边界区、用于从大肠杆菌转移至农杆菌(Agrobacterium)的pBR322bom位点、分别用于在大肠杆菌和农杆菌中复制的ColE1和pVS1质粒起始区以及用于赋予氯霉素抗性的细菌标记(Hajdukiewiez，O.等人，1994)。该质粒的示图在图1中示出。

通过标准的分子生物学技术制备含有深绿木霉pyr2基因和随后的his1启动子(这个启动子被取向为向外转录到插入位点中)的破坏盒，并将其连接而产生pRATT236载体。将所得的载体在大肠杆菌TOP10细胞(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))中增殖。将含有25ppm氯霉素的LA琼脂板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、10g/L琼脂)用于选择大肠杆菌转化株。将含有该载体的大肠杆菌在加有25ppm氯霉素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl)中培养。用标准方法分离载体DNA。

D.农杆菌细胞的转化

如下制备感受态农杆菌细胞。简而言之，通过在28℃下于LA培养基上培养约三天，将农杆菌细胞从冷冻保存复苏。然后选择菌落并在250ml凹底烧瓶中的体积为50ml的含0.1％葡萄糖的LB培养基中于28℃下培养直至生长明显。作为另一种选择，将菌落在5ml培养管中开始培养并在生长明显后转移至250ml烧瓶。然后将该250ml烧瓶的约10％体积转移进装有相同培养基的新鲜烧瓶中，将其培养至OD(600nm；OD₆₀₀)为约0.4-0.8(培养约5-6小时)。通过在冷冻离心机中以10,000rpm离心10分钟回收细胞，然后在冷的1M HEPES，pH7.0中洗涤三次。接着，将细胞在含有10％甘油的冷1mM HEPES中洗涤一次，将等分试样在-70℃下冷冻。对细胞活力进行测定(冷冻后通常为约1×10⁹CFU/ml)。

将该载体DNA用于通过电穿孔转化农杆菌细胞。将感受态农杆菌细胞在冰上解冻并将约40μl该细胞与约1μg DNA在0.2cm电穿孔池(冰上)中混合。将细胞用Buchler3-150电穿孔仪以2.5伏(200欧姆，25μF)进行电穿孔。在电穿孔后立即将SOC培养基(英杰公司)加至电穿孔池。作为另一种选择，可使用连接混合物通过电穿孔转化农杆菌细胞，从而消除了需要在大肠杆菌中增殖载体DNA。在一个备选的方法中，将约1μl连接混合物用于转化。在添加SOC至电穿孔混合物后，将该混合物的稀释液涂布接种于LA培养基+250ppm氯霉素培养板上并在28℃下温育四天。获得1×10⁷CFU/ml农杆菌转化株，通过PCR分析测得约90-100％含有该载体DNA。可将少至25ppm的氯霉素用于在较短的时间范围内获得菌落，但必须对较大数目的菌落进行筛选以鉴别真正的转化株。

E.农杆菌介导的对里氏木霉的转化

将250ml烧瓶中的25ml基本培养基(2.05g/L K₂HPO₄、1.45g/LKH₂PO₄、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO₄·7·H₂O、0.1g/L CaCl₂·6·H₂O、0.0025g/L、FeSO₄·7·H₂O、0.5g/L(NH₄)₂SO₄和2g/L葡萄糖，在灭菌后添加25ppm氯霉素)用载体转化的农杆菌的冷冻原种或直接来自新鲜LA板的载体转化的农杆菌接种。然后将该基本培养基培养物在28℃下振动温育直至浑浊(过夜至数天)。将10ml该培养物转移至250ml烧瓶中的50ml诱导培养基(2.05g/L K₂HPO₄、1.45g/L KH₂PO₄、0.15g/L NaCl、0.5g/LMgSO₄·7·H₂O、0.1g/L CaCl₂·6·H₂O、0.0025g/L、FeSO₄·7·H₂O、0.5g/L(NH₄)₂SO₄、1.8g/L葡萄糖、5g/L甘油，在40mM MES，pH5.3中制备，灭菌后添加200μL1M乙酰丁香酮)。初始的OD₆₀₀为约0.1，将载体转化的农杆菌细胞培养至OD₆₀₀为约0.4-0.8。

通过将孢子重新悬浮于10ml无菌水中来制备里氏木霉MAGI细胞的新鲜培养物。如下进行对里氏木霉MAGI细胞的转化：将约100μl的农杆菌全发酵液(OD₆₀₀=0.4-0.8)与100μl真菌孢子(10⁷sfu/ml)在管中混合(农杆菌细胞与真菌孢子的其他比例也将产生令人满意的结果)。将约0.1-1.0ml该混合物涂布接种于具有埋入的硝酸纤维素滤膜的诱导琼脂板上(诱导培养基具有15g/L琼脂和0.25mg/mL尿苷)。将板在约18-28℃下温育约24-48小时以让里氏木霉细胞生长。接着，将硝酸纤维素滤膜转移至Vogel氏培养基(Vogel，Microbiol.Genet.Bull.(《微生物遗传学通报》)13：42-43，1956)，该培养基补充有250ppm羧苄青霉素以杀死/抑制农杆菌生长。然后将培养物在28℃下温育直至滤膜上丝状真菌(代表破坏文库的转化株)的生长明显。

F.筛选形态突变株

使用光学显微镜术，在固体和液体培养中针对形态改变对破坏文库中的转化株进行筛选。转化后，使用菌落采集器从硝酸纤维素滤膜挑选单独的转化株并转移至装有马玲薯右旋糖琼脂(CP-700，美国西弗吉尼亚州费尔里的诺冠系统公司(Norgren Systems LLC，Fairlea，WV，USA))的96孔微量滴定板。作为另一种选择，将来自转化株的孢子合并、使之萌发，并使用细胞分选仪将单个孢子添加至微量滴定板孔。通过使用细胞推刮器(spreader)将来自马铃薯右旋糖转化板的孢子悬浮于20ml无菌蒸馏水中来收集孢子。将孢子接种进装有50ml基本培养基的250mL烧瓶中并在28℃下搅拌温育24小时直至获得萌发幼体。利用高速分选(MoFlo分选仪，美国科罗拉多州科林斯堡(Fort Collins，CO，USA)的Cytomation公司)，以15,000个事件/秒的事件速率，60psi，70μm喷嘴)，将单独的萌发幼体分离进装有马玲薯右旋糖琼脂(美国密歇根州底特律(Detroit，MI，USA)的Difco公司)的微量滴定板中。将装有通过任一上述方法获得的转化株的微量滴定板在28℃下温育7天。将单独的萌发孢子影印接种进带有玻璃底的384孔黑色sensoplate板(德国葛莱娜第一生化公司(Greiner Bio-one，Germany))中并于20℃温育24小时，该板装有YEG(每1L水5g酵母膏、20g葡萄糖)。通过显微镜检查各单独转化株的形态。

作为另一种选择，直接从转化板分离缓慢生长的转化株并重新接种于马玲薯右旋糖琼脂(Difco公司)上。将在马铃薯右旋糖板上显示菌落生长的转化株在摇瓶中的YEG培养基中于28℃、150rpm培养24小时，通过显微镜检查转化株的形态。

G.里氏木霉MAGI10-8g的分离和表征

观察到由上述程序获得的突变株MAGI10-8g在液体培养中具有改变的形态，具有比MAGI亲本短的菌丝。在液体培养基中，与含有MAGI亲本的培养物相比，含有MAGI10-8g突变株的培养物在培养过程中也显示出较高的溶氧水平(表1)。

将菌株MAGI和MAGI10-8g在深层(液体)培养中于相似条件下培养，并比较它们的生长表型。简而言之，将每种菌株的孢子独立地添加至同时具有侧挡板和底挡板的3L烧瓶中的500mL基础培养基。在高压灭菌30分钟后，添加无菌60％葡萄糖至27.5g/L的终浓度。由于MAGI菌株为Δpyr2，给其补充2mg/mL尿苷。将培养物在振荡培养箱中于34℃培养48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物独立地添加至装有9.5L培养基的14L发酵罐中，该培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L相同痕量元素溶液。将这些组分在121℃下一起加热灭菌30分钟。将60％葡萄糖和0.48％CaCl₂·2·H₂O的溶液单独高压灭菌、冷却并添加至发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/LCaCl₂·2·H₂O。用28％NH₃将该培养基调节至pH3.5并在整个培养阶段将温度维持在34℃。

当在顶部空间没有增加的压力时将溶氧(DO)探针校准至100％(即0巴表压，1巴绝对压力)。然后将顶部空间中的压力设定为0.7巴(表压)，之后在添加种子培养物之前该氧探针读数为170％。该发酵罐装有两个四叶涡轮，其通过最初设定为500rpm的变速马达提供混合。

随着培养物生长，DO含量水平下降，这至少部分是由于丝状真菌菌丝增殖而引起的发酵液粘度增加的结果。当DO含量水平下降至低于40％时，增加搅拌速率以将溶氧维持在40％。达到750rpm搅拌时，将允许DO含量水平下降至低于40％。如果DO含量不下降至低于40％，则在发酵运行期间不必增加搅拌速率，并且初始搅拌速率高于必要速率。当葡萄糖完全消耗时，测量每个发酵罐中产生的生物质的量，发现对于全部两种菌株而言是实质上相同的。

在给定的搅拌水平下每个发酵罐中的DO含量水平以及维持给定DO含量水平所需的搅拌量，是由于不同的菌株生长表型引起的不同发酵液的粘度的间接量度。尽管仅变动一个变量(即DO或搅拌)并测量另一个变量将是理想的，但希望防止DO下降至低于40％以确保在每个发酵罐中产生足够的生物质，从而使得能在不同菌株的生长之间进行更有意义的比较。

一般来讲，若有必要增加搅拌速率来维持目标DO水平，则可通过供应给驱动发酵罐涡轮的马达的功率量来估计搅拌量，这提供了与发酵液粘度相关的尺度。具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次方成比例。

mpg1基因的核酸序列获自JGI数据库：蛋白质ID：122551，名称：estExt_fgenesh5_pg.C_130115，可得自http：//genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id=122551，(The Genome Portal of theDepartment of Energy Joint Genome Institute(美国能源部联合基因组研究所基因组门户)I.V.Grigoriev，H.Nordberg，I.Shabalov，A.Aerts，M.Cantor，D.Goodstein，A.Kuo，S.Minovitsky，R.Nikitin，R.A.Ohm，R.Otillar，A.Poliakov，I.Ratnere，R.Riley，T.Smimova，D.Rokhsar和I.Dubchak.Nucleic Acids Res(《核酸研究》)20110：gkr947v1-gkr947)，如下所公开的。非翻译区用斜体表示，并且5’和3’旁侧为上游或下游序列，编码序列为粗体，内含子为小写字母(SEQ ID NO：38)：

GGCAAGGCGTACGCATGAGCGGAGCGGCAGTAGGTACTTGCGCCTCCGTGCTCATCTGCTGCCCGCAGCGCGTACCGGCGTCGTGACATCTGGACACCTCGTTCGTCCCTACTTTAGATCCATCCAGCCCGAACCTCATTTTCCTCTCTCCTTTTCCCTTCCATCCTCCCGCAACCACCGCGTCTTTTCTTCCCTCCCGAGCCGACACTCGAGTCTCTGCCCTGCGAGCATTGCACCGTCGCTCGTTCTTCTCTACGCTCACTATCCAACATACTAGTTTAITCTTTTTCCCTTCTTCTACCATCTTCTGCCTCTTTACTTACGAAATCAAACCCCCCCCTTTAAAACATCCACGAATCTCCTTTGCACTTCAGCTTCGTCGCATACATTCACCATGAAGGgtaggtgacgcgccggttccccaatctgcccatcattggcttcactccagctccaatggcaagatctcgctgacaatctctctcccctgcgcagGACTTATTCTTGTCGGCGGCTTTGGCACTCGCCTTCGCCCTCTCgtacgtccacgccagcaccaccagcagcgatccgacctgcatcccactaccgcattgacgcggatggggtggcatggagggggaaaaccaccataagcgcagcctctcacacccgcgaacctccactgaccattgtgcgacgccaatctagACCCTGACGCTCCCCAAGCCTCTGGTTGAGTTCTGCAACAAGCCCATGATTGTGCACCAGATCGAGGCTCTCGTCGCCGCTGGCGTGACCGACATTGTCCTCGCCGTCAACTACCGCCCAGAAATCATGGAAAAGTTCCTGGCCGAGgtgagtcgtgcacatcacaccctatgacccctcactacaaacccttgcctattcgcctgcccattcgctgtaccaagcttttcgcccccccccccccccccctcccctcccctcctactcagcatatctcccccccaccaatgacaatggacgcaaaggctgattgcgtacgctcgaccgtttagTACGAGGAGAAATACAACATCAACATTGAGTTCTCCGTCGAGTCGGAGCCCCTCGACACCGCCGGCCCCCTCAAGCTTGCTGAGCGCATCCTCGGCAAGGATGACTCGCCCTTCTTCGTCCTCAACTCCGACGTCATCTGCGACTATCCCTTCAAGGAGCTCCTCGAGTTCCACAAGGCCCACGGCGATGAGGGCACCATTGTCGTCACCAAGGTCGAGGAGCCGTCCAAGTACGGTGTCGTCGTCCACAAGCCCAACCACCCCTCGCGCATCGACCGCTTCGTCGAGAAGCCCGTCGAGTTCGTCGGCAACCGCATCAACGCCGGCATGTACATCTTCAACCCCTCCGTCCTGAAGCGCATCGAGCTTCGCCCCACGTCGATCGAGAAGGAGACGTTCCCCGCCATGGTTGCCGACAACCAGCTGCACTCGTTCGATCTCGAGGGCTTCTGGATGGACGTTGGCCAGCCCAAGGACTTCCTCAGCGGCACCTGCCTGTACCTGTCCTCCCTCACCAAGAAGGGCAGCAAGGAGCTGACCCCTCCCACCGAGCCCTACGTTCACGGCGGCAACGTCATGATTCACCCTTCGGCCAAGATTGGAAAGAACTGCAGAATAGGCCCCAATGTCACCATTGGCCCGGATGTTGTCGTCGGTGACGGCGTCCGCCTGCAGCGATGCGTCCTCCTCAAGGGCTCCAAGGTCAAGGACCACGCCTGGGTCAAGTCGACGATTGTTGGCTGGAACAGCACCGTCGGTCGCTGGGCCCGTCTCGAGAATGTGACTGTTCTCGGTGACGACGTGACCATTGGCGACGAGATTTACGTCAACGGCGGCAGCGTCCTGCCTCACAAGTCCATCAAGGCCAACGTTGACGTTCCCGCCATCATTATGTGATTTATCTCATGTTGTCACGCATCCTTGGCTCGCATGGGCGTTTTTGTTCCCCATGCGCTGCTTTCCGAGATGATCTTTGTTTCTTCTTCAAACCCCATCTTTTCTTCTTTTAACTTGACATTTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTACAGAACCCCATTTACGCCTTACCGCAAACTCACCACTCCTCCGCTATTCTCAAGAGATACCCTATATTGGTGGGGGAAACAGTCTTTGAGAGAAAAGAAAACCAAGCCACATTTATATAATTACTACTAGTCTCGACATCTTTTTTCCCTTTCTTCTTCTTCCTCAAGAAAAAAGATGTCGTGTACACTTATGTTGAGCCCCAAGTAAATCGTTTGGCGTCTCGGGGAACCGGTTGGCAAAGCATTCTTGGAGGGACAGGGACGAGGGCTGAGGGTTGAGAAGAGCAATGACGGACGAGGCACTCAAGATTTCCATGTATGAAAAGATGATAGCGTAGCGAATGAAGTGTATTTACGCTTGCGCCGACTGTGTTGTCTGGTGACGCGATTGCTGAGGTCGAGCTTGTCCAGTACGAGCACTGCTTGAAGATGAACAAATCGAGGTGGTTCCCCCATAGGCTGACCTTATACAGAATTTCGCTATGCATCAGAAGTAAGTCGTTATCACATTTGATGAGATAGCATCTCCGCTCACTTGTCATTTCAGTTAGAATATTCATT

如表1中所示，与亲本MAGI相比，MAGI10-8g的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，MAGI对照菌株经历搅拌增加至最大750rpm，然后经历DO下降低至35％。菌株MAGI10-8g不要求这么多的能量来实现相同的生物质浓度。当％DO降低至40时搅拌速率稍微增加至513rpm。与MAGI相比，MAGI10-8g中蛋白质产量未受不利地影响(未示出)。

表1.MAGI与MAGI10-8g的发酵液粘度比较

将反相PCR用于鉴别含有pyr2his1基因的T-DNA在里氏木霉基因组中的插入位点。简而言之，用限制性内切酶SpeI将来自菌株MAGI10-8g的高分子量基因组DNA消化至完全。在使该酶热失活后，将该反应物在连接缓冲液中五倍稀释并添加T4DNA连接酶。在过夜连接反应之后，将连接酶热失活并用乙酸铵和乙醇沉淀该反应物。将洗涤过的DNA沉淀溶解于TE中并用作使用引物RPG253和RPG255的PCR的模板(参见表2)。纯化所得的PCR产物，然后用巢式引物RPG239和RPG207测序以确定T-DNA插入的位点旁侧的核苷酸序列。将该序列相对于JGI里氏木霉v2.0基因组序列进行BLASTn分析揭示，该T-DNA已缺失Scaffold13的区域369089至370324。

使用与该插入位点旁侧的基因组DNA同源的引物和与该T-DNA同源的引物，通过PCR确认插入位点。具体地讲，将引物RPG256和RPG268用于确认T-DNA的3′端的序列，并且引物RPG268和RPG269扩增了该被鉴别的位点处的全T-DNA插入物。

突变株MAGI10-8g中的T-DNA插入位点在里氏木霉JGI基因组数据库v2中处于Scaffold13的369089至370324。在该位点处存在的基因为mpg1基因(PDI122551)，其存在于包括棒曲霉、烟曲霉和费希新萨托菌在内的其他真菌中。如Kruszewska等人(1998)Cur.Genet.(《当代遗传学》)33：445-50和Zakrzewska等人(2003)Applied and EnvironmentalMicrobiology(《应用微生物学和环境微生物学》)69：4383-4389所述，来自里氏木霉的mpg1编码GTP：α-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶，该酶可在蛋白质糖基化的早期阶段起主要调节作用。DNA印记分析显示，除了天然拷贝外，该菌株仅还含有一个拷贝的pyr2基因，从而指示已发生了一个破坏事件(未示出)。

由于该位点处的插入被证实是MAGI10-8g菌株中产生的唯一遗传改变，由此得出结论mpg1基因的破坏是造成所观察到的形态改变的原因。

表2.实例1中使用的引物

实例2.从里氏木霉突变株77B7缺失mpg1基因

A.Morph菌株TrGA77B7

此前将上述Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离了含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变来产生突变株(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择分离自发的pyr2突变衍生物。

B.mpg1破坏盒的产生

将里氏木霉mpg1((jgi|Trire2|122551)从突变株Morph77B7缺失。

使用标准的分子生物学程序制备mpg1破坏盒质粒pRATT249(图2)。该质粒包括具有一2.5Kb区的DNA序列(左旁侧序列)，该区与跨越5′非翻译区的一部分的DNA序列及邻接的上游序列同源。该质粒中还包括具有一3.3Kb区的DNA序列(右旁侧序列)，该区域与跨越mpg1基因的第四个外显子的一部分的DNA序列及邻接的下游序列同源。这些序列被设计用于靶向mpg1并用间插盒序列置换基因组的在所述左旁侧序列和右旁侧序列之间的区域。这些间插序列包括来自深绿木霉的pyr2选择标记，旨在使与待转化菌株的基因组中的内源性里氏木霉pyr2的同源性最小。紧邻该pyr2选择标记上游的是该标记3′端的同向重复副本，其有利于后续失去该标记以及分离转化株/破坏株(disruptant)的有用pyr2突变衍生物。使用引物RPG388和RPG391通过PCR扩增了该完全mpg1破坏盒。汇集了多份PCR反应物并用标准的分子生物学程序纯化以用于后续步骤。

C.菌株Morph77B7Δmpg1的产生

利用PEG介导的转化用mpg1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。分离单独的转化株并通过转移至Vogel氏基本培养基进行繁殖。将PCR分析用于鉴别其中mpg1破坏盒通过同源重组在mpg1基因座处整合的转化株。通过用两个引物对扩增具有预期大小的DNA片段来验证Δmpg1破坏盒在mpg1基因座处的同源整合。引物对RPG394和RPG253扩增了从该破坏盒区的5′端外侧开始并在3′区内结束的DNA片段。引物对RPG395和RPG273扩增了在该破坏盒的5′区内开始并在该破坏盒的3′端外侧结束的DNA片段。将所产生的确认有mpg1破坏盒的同源整合的菌株命名为Morph77B7Δmpg1。表4列出了引物序列。

将菌株Morph77B7和Morph77B7Δmpg1在深层(液体)培养中于相同条件下培养，并比较它们的生长表型。简而言之，将每种菌株的孢子独立地添加至同时具有侧挡板和底挡板的3L烧瓶中的500mL培养基。该培养基含有5g/L(NH₄)₂SO₄、4.5g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7·H₂O和14.4g/L柠檬酸，用5％NaOH调节至pH5.5。在高压灭菌30分钟后，添加无菌的60％葡萄糖至终浓度27.5g/L，连同一起添加2.5mL/L痕量元素溶液，该溶液含有175g/L柠檬酸、200g/L FeSO₄.7.H2O、16g/L ZnSO₄·7·H₂O、3.2g/LCuSO₄·5·H₂O、1.4g/L MnSO₄·H₂O和0.8g/L H₃BO₃。将培养物在振荡培养箱中于34℃培养48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物独立地添加至装有9.5L培养基的14L发酵罐中，该培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L相同痕量元素溶液。将这些组分在121℃下一起加热灭菌30分钟。将60％葡萄糖和0.48％CaCl₂·2·H₂O的溶液单独高压灭菌、冷却并添加至发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/LCaCl₂·2·H₂O。用28％NH3将该培养基调节至pH3.5并在整个培养阶段将温度维持在34℃。

随着培养物生长，DO水平水平下降，这至少部分是由于丝状真菌菌丝增殖而引起的发酵液粘度增加的结果。当DO下降至低于40％时，增加搅拌速率以将溶氧维持在40％。达到750rpm搅拌时，将允许DO下降至低于40％。如果DO不下降至低于40％，则在发酵运行期间不必增加搅拌速率，并且初始搅拌速率高于必要速率。当葡萄糖完全消耗时，测量每个发酵罐中产生的生物质的量，发现对于全部两种菌株而言是实质上相同的。

在给定的搅拌水平下每个发酵罐中的DO水平以及维持给定DO水平所需的搅拌量，是由于不同的菌株生长表型引起的不同发酵液的粘度的间接量度。尽管仅变动一个变量(即DO或搅拌)并测量另一个变量将是理想的，但希望防止DO下降至低于40％以确保在每个发酵罐中产生足够的生物质，从而使得能在不同菌株的生长之间进行更有意义的比较。

一般来讲，若有必要增加搅拌速率来维持目标DO水平，则可通过供应给驱动发酵罐涡轮的马达的功率量来估计搅拌量，其提供了与发酵液粘度相关的尺度。具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次方成比例。

对于其中％DO不降低至低于40％的菌株，该尺度是基于在预选搅拌速率下维持的最低溶氧水平。

如表3中所示，从Morph77B7缺失mpg1基因导致产生了发酵液粘度降低的菌株(Morph77B7Δmpg1)。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，对照菌株经历了搅拌增加至616rpm，此时DO下降低至40％时。mpg1缺失型菌株不要这么多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm且DO仅下降低至102％。

表3.具有和不具有mpg1基因的Morph77B7的发酵液粘度

表4.实例2中使用的引物

实例3.具有被破坏的mpg1基因和seb1基因的突变株的累加粘度降低

A.此前将上述Morph77B7Δmpg1用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离了含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变来产生具有与低粘度表型相关的改变形态的突变株(77B7)。如上所述缺失mpg1基因。随后通过针对对5-氟乳清酸的抗性进行选择来自发缺失pyr2基因，从而产生菌株Morph77B7Δmpg1，Δpyr2。

B.seb1破坏盒的产生

使用标准的分子生物学程序制备seb1破坏盒质粒pRATT240(图3)。这些间插序列包括来自深绿木霉的pyr2选择标记，旨在使与待转化菌株的基因组中的内源性里氏木霉pyr2的同源性最小。紧邻该pyr2选择标记上游的是该标记3′端的副本，该同向重复区有利于后续失去该标记以及分离转化株/破坏株(disruptant)的有用pyr2突变衍生物。使用引物RPG257和RPG264(参见表6)通过PCR扩增了该全seb1破坏盒。汇集了多份PCR反应物并用标准的分子生物学程序纯化以用于后续步骤。

C.菌株Morph77B7Δmpg1Δseb1和Morph77B7Δseb1

的产生利用PEG介导的转化用seb1破坏盒转化Morph77B7Δpyr2和Morph77B7Δmpg1Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel式基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。分离单独的转化株并通过转移至Vogel氏基本培养基进行繁殖。将PCR分析用于鉴别其中seb1破坏盒通过同源重组在seb1基因座处整合的转化株。通过用两个引物对扩增具有预期大小的DNA片段来确认Δseb1破坏盒在seb1基因座处的同源整合。引物对RPG297和RPG253扩增了从该破坏盒区的5′端外侧开始并在3′区内结束的DNA片段。引物对RPG296和RPG273扩增了在该破坏盒的5′区内开始并在该破坏盒区的3′端外侧结束的DNA片段。与破坏同时，使用来自未转化的亲本株的模板DNA，第三引物对RPG133和RPG220扩增了跨越插入位点的1.6kb DNA片段，但使用来自seb1破坏菌株的模板DNA，不能扩增该片段。将所产生的确认有seb1破坏盒的同源整合的菌株命名为Morph77B7Δseb1和Morph77B7Δmpg1Δseb1。

D.在深层培养中培养Morph77B7Δmpg1Δseb1

如实例2中所述将菌株Morph77B7Δmpg1和Morph77B7Δmpg1Δseb1在深层(液体)培养中于相同条件进行培养，并比较它们的生长表型。如表5中所示，破坏Morph77B7Δmpg1菌株中的seb1基因导致产生了粘度进一步降低的菌株(根据在预选搅拌速率下最小的维持溶氧水平)，从而表明破坏seb1基因和破坏mpg1基因对于形态和粘度降低具有累加效果。Morph77B7Δmpg1Δseb1的蛋白质产量为Morph TrGA77B7和Morph TrGA77B7Δseb1的蛋白质产量的至少85％或更高。

表5.Morph77B7Δseb1、Morph77B7Δmpg1和MorphΔmpg1Δseb1 的发酵液粘度

表6.实例3中使用的引物

实例4.具有被破坏的mpg1基因和sfb3基因的突变株中的累加粘度降低

A.Morph菌株TrGA#32

此前将上述Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离了含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变来产生具有与低粘度表型相关的改变形态的细胞壁突变株(70H2)。该粘度降低表型之后被确定为是截短的sfb3基因的结果(数据未示出)。用额外拷贝的TrGA转化的70H2菌株(即TrGA#32)还可用于过表达TrGA。

B.mpg1破坏盒的产生

如实例2中所述破坏了mpg1基因以制备菌株TrGA#32Ampg1。

C.在深层培养中培养TrGA#32Δmpg1

如实例2中所述将菌株TrGA#32和TrGA#32Δmpg1在深层(液体)培养中于相同条件下进行培养，并比较它们的生长表型。如表7中所示，从TrGA#32菌株缺失mpg1基因导致产生粘度进一步降低的菌株(根据维持预选溶氧水平所需的rpm)，从而表明破坏mpg1基因及破坏sfb3基因对于形态和粘度降低具有累加效果。蛋白质产量不受mpg1缺失影响(未示出)。

表7.TrGA#32和TrGA#32Δmpg1在液体培养基中的生长特性

实例5.破坏gas1、crz1和tps2基因中的至少一者联合破坏mpg1、 seb1知/或sbf3的突变株中的累加粘度降低

A.破坏gas1时的粘度降低

Gel/Gas/Phr家族的真菌p(1，3)-葡聚糖基转移酶通过加工主要组分β(1，3)-葡聚糖在细胞壁生物合成中起重要作用(Popolo等人，2008)。gas1(PID22914)编码β-1，3-葡聚糖基转移酶，该酶为能够分解和连接p-1，3-葡聚糖的GPI(和/或葡聚糖)-锚定蛋白。在许多真菌基因组中存在多种旁系同源物，包括里氏木霉，其具有五种旁系同源物。单独的研究已经显示，gas1基因(或如烟曲霉中已知的gel1基因)的突变可影响真菌细胞壁结构，并且可导致形态改变以及对荧光增白剂(Calcofiuor White)、刚果红和十二烷基硫酸钠的超敏性(Schirawski，J.等人，2005；Mouyna，I.等人，2005)。

里氏木霉Morph菌株缺失四个主要的纤维素酶基因，包括cbhI、cbhII、egII和egIV，这使得其特别适于在缺少纤维素酶本底或在减少的纤维素酶本底的情况下表达其他蛋白质。参见WO05/001036。此前已将Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离了含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变来产生突变株(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择来分离自发的pyr2突变衍生物。从变体Morph77B7缺失了里氏木霉gas1(PID22914)。

利用PEG介导的转化用gas1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Voge1氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表8中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δgas1的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。为达到该间歇式培养阶段结束，Morph77B7对照菌株经历搅拌增加至616rpm，然后经历DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δgas1不要求这么多的能量(即搅拌的rpm增加量)来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于115。与Morph77B7相比，在Morph77B7Δgas1中的蛋白质产量未受不利地影响(数据未示出)。关于gas1破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61,480,602，将其以引用的方式全文并入本文。

表8.Morph77B7与Morph77b7Δgas1相比的发酵液粘度

B.破坏crz1时的粘度降低

在真菌中，已显示钙调磷酸酶介导的Ca²⁺信号传导为许多生物体中的生长、发育以及毒力所需。其对于适应多样的环境条件(包括高的阳离子水平和碱性pH)而言是必要的。基因crz1编码钙调磷酸酶调节的转录因子。当磷酸酶钙调磷酸酶被Ca²⁺/钙调蛋白激活时，Crz1p转录因子去磷酸化。其然后进入细胞核并诱导许多基因表达，这些基因中的许多编码具有细胞壁相关功能的蛋白质(Yoshimoto等人，2002；Lagorce等人，2003；Garcia等人，2004；Karababa等人，2006；Pardini等人，2006；Munro，C.等人，2009)。缺失crz1或同源物可导致菌丝形态改变(Kothe，G.和Free，S.1998，Prokisch，H.等人，1997)。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变株Morph77B7缺失里氏木霉crz1(PID36391)。利用PEG介导的转化用crz1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Voge1氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表9中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δcrz1的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。为达到该间歇式培养阶段结束，Morph77B7对照菌株经历搅拌增加至616rpm，然后经历DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δcrz1不要求这么多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于100。关于crz1破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61,480,610，将其以引用的方式全文并入本文。

表9.Morph77B7与Morph77b7Δcrz1相比的发酵液粘度

C.破坏tps1时的粘度降低

基因tps2编码涉及二糖海藻糖的合成的海藻糖-磷酸磷酸酶。海藻糖为胁迫诱导的糖，该糖可缓冲变性蛋白质在细胞质和ER中的重新折叠(Singer，M等人，1998；Simola，M等人，2000)。各种各样的生物体在响应多种胁迫时会大量产生该二糖。在酵母中，海藻糖使高温下的蛋白质稳定并且帮助热损害的蛋白质重新折叠(Simola，M等人，2000)。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变株Morph77B7缺失了里氏木霉tps2(PID48707)。利用PEG介导的转化用tps2破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Voge1氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表10中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δtps2的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。为达到该间歇式培养阶段结束，Morph77B7对照菌株经历搅拌增加至616rpm，然后经历DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δtps2不要求这么多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于110。关于tps1破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61,480,629，将其以引用的方式全文并入本文。

表10.Morph77B7与Morph77b7Δtps2相比的发酵液粘度

尽管为了清楚的理解已通过示例和实例详细地描述了上述组合物和方法，但本领域技术人员将显而易见的是可作出某些改变和修饰。因而，所述描述不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书限定。

本文引用的全部出版物、专利以及专利申请特此全文以引用方式并入以用于所有目的、且达到与犹如每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以便如此以引用方式并入相同的程度。

参考文献

以下参考文献和本文引用的另外的参考文献特此以引用方式并入：

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Claims

1.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含能使所述变异株的细胞与所述亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Mpg1蛋白的遗传变更，其中所述变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

2.根据权利要求1所述的变异株，其中功能性Mpg1蛋白的所述改变量为减少量，并且所述变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

3.根据权利要求1或2所述的变异株，其中所述遗传变更包括破坏所述亲本菌株中存在的mpg1基因。

4.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是缺失所述mpg1基因的全部或部分所致。

5.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是缺失包含所述mpg1基因的基因组DNA的一部分所致。

6.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是诱变所述mpg1基因所致。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是使用位点特异性重组进行。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是与在所述mpg1基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生功能性Mpg1蛋白。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生Mpg1蛋白。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的变异株，其中所述变异株还包含编码目的蛋白质的基因。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的变异株，还包含sfb3基因的破坏。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的变异株，还包含至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的变异株，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质的量与所述亲本株实质上相同或者更多。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是木霉属(Trichoderma)物种。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。

18.一种制备丝状真菌细胞的变异株的方法，包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传变更改变了功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述遗传变更减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的mpg1基因。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的mpg1基因。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述遗传变更是使用位点特异性遗传重组进行。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中破坏所述mpg1基因是与在所述mpg1基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中破坏mpg1基因是与破坏sfb3基因相结合进行。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中破坏mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质的量与所述亲本株实质上相同或者更高。

27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是盘菌亚门物种。

28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是木霉属物种。

29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是里氏木霉。

30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述亲本株还包含编码目的蛋白质的基因。

31.根据权利要求30所述的方法，其中在引入所述减少或防止功能性Mpg1蛋白的产生的遗传变更之前，所述编码目的蛋白质的基因存在于所述亲本株中。

32.一种目的蛋白质，所述蛋白质由根据权利要求11所述的变异株产生。

33.一种丝状真菌变异株，所述丝状真菌变异株通过根据权利要求18-31中任一项所述的方法产生。

34.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含：

(b)编码目的蛋白质的基因，

其中所述编码目的蛋白质的基因在(a)的所述遗传变更之前存在于所述变异株中。

35.根据权利要求34所述的变异株，其中所述遗传变更包含所述亲本菌株中存在的mpg1基因的破坏。

36.根据权利要求35所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是与在所述mpg1基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。

37.根据权利要求35或36所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、seb1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因相结合进行。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的变异株，其中破坏所述mpg1基因是与破坏所述seb1基因相结合进行。