KR101993939B1 - 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균 - Google Patents

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Abstract

성장 특징이 변경된 변이형 사상균에 관련된 조성물 및 방법이 개시된다. 이러한 변이체는 침지 배양에서의 성장에, 예를 들어 상업적 응용을 위한 효소 및 다른 단백질의 대규모 생성에 적절하다.

Description

변경된 점성 표현형을 갖는 사상균{FILAMENTOUS FUNGI HAVING AN ALTERED VISCOSITY PHENOTYPE}
우선권
본 출원은 미국 가출원 제61/478,162호 및 미국 가출원 제61/478,160호의 우선권을 주장하는데, 상기 미국 가출원 둘 모두는 2011년 4월 22일자로 출원되고, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 주(strain) 및 방법은 성장 특징이 변경된 주 변이체를 야기하는 사상균(filamentous fungi)의 유전자 돌연변이에 관한 것이다. 이러한 변이체는 침지 배양에서의 성장에, 예를 들어 상업적 응용을 위한 효소 및 다른 단백질 또는 대사산물의 대규모 생성에 적절하다.
사상균은 천연 및 이종 단백질을 고수준으로 발현하여 이것이 산업적 응용, 의약품 응용, 동물 건강 응용 및 식음료 응용을 위한 효소 및 다른 단백질의 대규모 생성에 적절해지게 할 수 있다. 전형적으로 사상균을 생물반응기에서 균사체 침지 배양에서 성장시키는데, 상기 생물반응기는 산소 및 영양소를 배양 배지(즉, 브로쓰(broth)) 내로 도입하고 분배하도록 된다. 균사체의 형태학적 특징들은 브로쓰의 유동학적 특성에 영향을 주고 이럼으로써 생물반응기 성능에 영향을 준다.
일반적으로, 브로쓰의 점성이 더 높을수록 산소 및 영양소의 분포가 덜 균일해지며, 배양물의 교반에 더 많은 에너지가 요구된다. 일부의 경우, 브로쓰의 점성은 산소 및 영양소의 용해를 유의하게 간섭하기에 충분히 높아지게 되고, 이럼으로써 진균류의 성장에 악영향을 주게 된다. 부가적으로, 점성 브로쓰의 혼합 및 통기에 요구되는 전력은 생산 원가를 유의하게 증가시키고, 모터 및 전력 공급 면에서 더 높은 자본 지출을 초래할 수 있다.
변경된 점성 표현형을 야기하는 유전자 변경을 갖는 사상균에 관련된 주 및 방법이 개시된다.
일 태양에서, 모 주(parental strain)로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 변경된 양의 기능성 Mpg1 단백질을 생성하게 하는 유전자 변화를 포함하며, 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.
일부 실시 형태에서, 기능성 Mpg1 단백질의 변경된 양은 감소된 양이며, 변이주는 침지 배양에서 호기성 배양 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 모 주에 존재하는 mpg1 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 전부의 또는 일부의 mpg1 유전자의 결실의 결과이다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자를 포함하는 게놈 DNA의 일부분의 결실의 결과이다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 돌연변이 유발의 결과이다.
일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 부위 특이적 재조합을 이용하여 수행된다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다.
일부 실시 형태에서, 변이주는 기능성 Mpg1 단백질을 생성하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 Mpg1 단백질을 생성하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 변이주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 sfb3 유전자의 파괴를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 seb1 유전자의 파괴를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 sfb3 및 seb1 유전자의 파괴를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 단위량의 바이오매스당 모 주와 사실상 동일한 양의 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성한다.
일부 실시 형태에서, 사상균은 주발버섯아문(Pezizomycotina) 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마(Trichoderma) 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 푸사륨(Fusarium) 종, 스케도스포륨(Scedosporium) 종, 페니실륨(Penicillium) 종, 크리소스포륨(Chrysosporium) 종, 세팔로스포륨(Cephalosporium) 종, 탈라로마이세스(Talaromyces) 종, 게오스미티아(Geosmithia) 종 및 뉴로스포라(Neurospora) 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) (이전에는 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 및 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)로 분류됨), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 이타코니쿠스(Aspergillus itaconicus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 소에(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 스케도스포륨 프롤리피칸스(Scedosporium prolificans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실륨 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 탈라로마이세스 (게오스미티아) 에메르소니이(Talaromyces ( Geosmithia ) emersonii), 푸사륨 베네나툼(Fusarium venenatum) 및 크리소스포륨 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이이다.
다른 태양에서, 사상균 세포의 변이주를 생성하는 방법이 제공되며, 이는 모 주의 세포와 비교하여 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 변경시키는 유전자 변화를 사상균 세포의 모 주 내에 도입하고, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하며, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 mpg1 유전자를 파괴하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 mpg1 유전자를 결실시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 부위 특이적 유전자 재조합을 이용하여 수행된다.
일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서,mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1b1 유전자 및 tps2s2유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다.
일부 실시 형태에서, 변이주는 단위량의 바이오매스당 모 주와 사실상 동일한 양의 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성한다.
일부 실시 형태에서, 사상균은 주발버섯아문 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 종, 아스페르길루스 종, 푸사륨 종, 스케도스포륨 종, 페니실륨 종, 크리소스포륨 종, 세팔로스포륨 종, 탈라로마이세스 종, 게오스미티아 종 및 뉴로스포라 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이 (이전에는 트리코데르마 롱기브라키아툼 및 하이포크레아 제코리나로 분류됨), 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 이타코니쿠스, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 테레우스, 아스페르길루스 소에, 아스페르길루스 자포니쿠스, 스케도스포륨 프롤리피칸스, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 크리소게눔, 탈라로마이세스 (게오스미티아) 에메르소니이, 푸사륨 베네나툼 및 크리소스포륨 루크노웬세를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이이다.
일부 실시 형태에서, 모 주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변화의 도입 이전에 모 주에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 모 주 내의 관심대상의 단백질은 내인성 유전자 또는 이종성 유전자에 의해 코딩된다.
다른 태양에서, 전술한 변이주들 중 임의의 것에 의해 생성된 관심대상의 단백질이 제공된다.
또 다른 태양에서, 전술한 방법들 중 임의의 것에 의해 생성된 그리고 전술한 특성들 중 임의의 것을 갖는 사상균이 제공된다.
다른 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 이 변이주는 (a) (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 침지 배양에서 감소된 교반을 요구하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 침지 배양에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 유전자 변경, 및 (b) (a)에서의 유전자 변경 전에 변이주에 존재하는, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 생성된 변이주의 유전자 변화는 모 주에 존재하는 mpg1 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 seb1 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서,mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다.
본 발명의 변이주 및 방법의 이들 및 다른 태양과 실시 형태는 첨부된 도면을 비롯하여 설명으로부터 명백해질 것이다.
<도 1>
도 1은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) pRATT 236 벡터의 지도이다.
<도 2>
도 2는 mpg1 파괴 벡터의 지도이다.
<도 3>
도 3은 seb1 파괴 벡터의 지도이다.
I. 개관
본 발명의 주 및 방법은 형태 및 성장 특징에 영향을 주는 유전자 변형을 갖는 사상균 세포의 변이주에 관련된다. 변이 세포를 침지 배양에서 성장시킬 때, 상기 세포는 모 주의 세포를 포함하는 세포 브로쓰와 비교하여 상이한 유동학적 특성을 갖는 세포 브로쓰를 생성한다. 이들 변이주들 중 일부는 효소 및 다른 상업적으로 중요한 단백질의 대규모 생성에 적절하다.
II. 정의
본 발명의 주 및 방법을 상세히 설명하기 전에, 하기 용어들이 명확함을 위하여 정의된다. 정의되지 않은 용어들은 관련 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미에 부합되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "트리코데르마 레에세이"는 자낭균류(Ascomycota) 문, 주발버섯아문의 아문(subylum)의 사상균을 말한다. 이 유기체는 이전에 트리코데르마 롱기브라키아툼으로, 그리고 또한 하이포크레아 제코리나로 분류되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "사상균 세포의 변이주" 또는 유사 어구는 예를 들어 유전자 조작에 의해 주발버섯아문에 속하는 모 (또는 기준) 주로부터 유래된 (즉, 그로부터 얻어지거나 또는 그로부터 얻어질 수 있는) 사상균 세포의 주를 말한다. 본 설명에서, 모 주 및 변이주는 소정의 특징, 예를 들어 유전자 변형, 발현 표현형, 형태 등을 갖는 것으로 설명될 수 있지만, 당업자라면 이것은 기술적으로 이러한 특징들을 갖는 모 주 또는 변이주의 세포이며 "상기 주들"이 편의상 언급됨을 인식할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "관심대상의 단백질"은 사상균에서 발현시키기를 원하는 폴리펩티드를 말한다. 이러한 단백질은 효소, 기질 결합 단백질, 표면 활성 단백질, 구조 단백질 등일 수 있으며, 고수준으로 발현될 수 있으며, 상업화 목적을 위한 것일 수 있다. 관심대상의 단백질은 변이주 및/또는 모 주와 관련하여 내인성 유전자 또는 이종성 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 관심대상의 단백질은 세포내에서 발현될 수 있거나 또는 분비형 단백질로 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "사실상 활성이 없는", 또는 유사 어구는 특정 활성이 혼합물에서 검출가능하지 않거나, 또는 혼합물의 의도된 목적을 간섭하지 않을 양으로 존재함을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" (및/또는 그의 각각의 복수형)은 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기들을 위한 통상적인 1문자 또는 3문자 암호가 본 명세서에서 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비아미노산(non-amino acid)이 개재될 수 있다. 상기 용어들은 자연적으로 또는 개재에 의해; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)와, 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 상기 정의 내에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질은 "관련 단백질"인 것으로 간주된다. 그러한 단백질들은 상이한 속 및/또는 종의 유기체로부터 또는 심지어 상이한 강의 유기체 (예를 들어, 박테리아 및 진균류)로부터 유래될 수 있다. 관련 단백질들은 일차 서열 분석에 의해 결정되거나, 이차 또는 삼차 구조 분석에 의해 결정되거나, 또는 면역학적 교차 반응성에 의해 결정된 상동체를 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체형 폴리펩티드/단백질"은 N- 및 C-말단(들) 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열 내의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 단백질의 어느 하나의 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 단백질로부터 유도되거나 또는 유도가능한 단백질을 말한다. 단백질 유도체의 제조는 천연 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체형 단백질을 형성하는 것에 의해 성취될 수 있다.
관련 단백질 (및 유도체형 단백질)은 "변이 단백질"을 포함한다. 변이 단백질은 소수의 아미노산 잔기에서의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 기준/모 단백질 (예를 들어, 야생형 단백질)과 상이하다. 변이 단백질과 모 단백질 사이에서 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50개 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 변이 단백질은 기준 단백질과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상, 또는 그보다 큰 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 또한 변이 단백질은 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 기준 단백질과 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유사 서열"은 관심대상의 단백질(즉, 전형적으로 관심대상의 원래 단백질)과 유사한 기능, 삼차 구조 및/또는 보존된 잔기를 제공하는 단백질 내의 서열을 말한다. 예를 들어, α-나선 또는 β-시트 구조를 함유하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내의 대체 아미노산들은 바람직하게는 동일한 특정 구조를 유지한다. 이 용어는 또한 아미노산 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열도 말한다. 일부 실시 형태에서, 유사 서열은 대체 아미노산이 유사한 또는 개선된 기능을 나타내는 변이 효소를 생성하도록 개발된다. 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질에서의 아미노산의 삼차 구조 및/또는 보존된 잔기는 관심대상의 절편 또는 단편에 또는 그 근처에 위치한다. 따라서, 관심대상의 절편 또는 단편이 예를 들어 α-나선 또는 β-시트 구조를 함유할 경우, 대체 아미노산은 바람직하게는 그 특정 구조를 유지한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동 단백질"은 기준 단백질과 유사한 활성 및/또는 구조를 갖는 단백질을 말한다. 상동체는 반드시 진화론적으로 관련될 필요가 있는 것으로 의도되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 상이한 유기체들로부터 얻어진 동일하거나, 유사하거나 또는 상응하는 효소(들)(즉, 구조 및 기능 면에서)를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 기준 단백질과 유사한 사차, 삼차 및/또는 일차 구조를 갖는 상동체를 확인하는 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질은 기준 단백질과 유사한 면역 반응(들)을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질은 원하는 활성(들)을 갖는 효소를 생성하도록 엔지니어링된다.
서열들 사이의 상동성 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443]; 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-95] 참조).
예를 들어, PILEUP는 서열 상동성 수준의 결정에 유용한 프로그램이다. PILEUP는 진행형, 쌍 정렬을 이용하여 관련 서열들 군으로부터 다수의 서열 정렬을 생성한다. 또한 이것은 정렬 생성에 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 보여주는 트리(tree)를 도시할 수 있다. PILEUP는 펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행형 정렬법을 간소화한 것을 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-60]). 상기 방법은 문헌[Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53]에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치(default gap weight), 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 말단 갭 가중치를 포함한다. 유용한 알고리즘의 다른 예로는 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10] 및 문헌[Karlin et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87]에 기재되어 있는 BLAST 알고리즘이 있다. 하나의 특히 유용한 BLAST 프로그램으로는 WU-BLAST-2 프로그램이 있다 (예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-80] 참조). 파라미터 "W", "T", 및 "X"는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램에서는 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (예를 들어, 문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬값(B), 10의 기대치(E), M'5, N'-4, 및 양 가닥의 비교가 이용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적어도 2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 어구 "사실상 유사한" 및 "사실상 동일한"은 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기준(즉, 야생형) 서열과 비교하여 약 70% 이상의 동일성, 약 75% 이상의 동일성, 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상의 동일성, 약 91% 이상의 동일성, 약 92% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 94% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 96% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 98% 이상의 동일성, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성, 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 사용하여 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL과 같은 공지된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]; 문헌[Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873]; 및 문헌[Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244] 참조). BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공개적으로 입수가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA를 이용하여 검색될 수 있다 (문헌Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48]). 두 폴리펩티드가 사실상 동일하다는 하나의 표시는 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 면역적 교차 반응성을 갖는다는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 상이해진 폴리펩티드들은 면역적 교차 반응성을 갖는다. 따라서, 소정 폴리펩티드는, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이해질 경우, 제2 폴리펩티드와 사실상 동일하다. 두 핵산 서열이 사실상 동일하다는 다른 표시는, 상기 두 분자가 엄격한 조건 하에서 (예를 들어, 중간 엄격도 내지 높은 엄격도의 범위 내에서) 서로와 혼성화된다는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 단백질 또는 RNA를 코딩하여 단백질 또는 RNA의 발현을 유도하는 핵산을 말함에 있어서 용어 "대립유전자"와 동의어이다. 사상균의 영양형은 일반적으로 반수체이며, 따라서 특정 유전자의 단일 카피(즉, 단일 대립유전자)가 특정 표현형의 부여에 충분하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형" 및 "천연"은 상호교환가능하게 사용되며, 자연에서 발견되는 유전자, 단백질, 또는 주를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 결실"은 숙주 세포의 게놈으로부터의 그의 제거를 말한다. 유전자가 유전자의 코딩 서열에 바로 인접하여 위치하는 것이 아닌 조절 요소 (예를 들어, 인핸서 요소)를 포함할 경우, 유전자의 결실은 코딩 서열과, 선택적으로 인접 인핸서 요소들의 결실을 말하는데, 상기 인핸서 요소들은 예를 들어 프로모터 및/또는 전사 종결 서열(terminator sequence)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴"는 대체적으로 숙주 세포에서 세포가 기능성 유전자 생성물, 예를 들어 단백질을 생성하는 것을 사실상 방지하는 임의의 유전자 조작 또는 화학적 조작, 즉 돌연변이를 말한다. 예시적인 파괴 방법에는 폴리펩티드 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 또는 다른 조절 요소를 포함하는 유전자의 임의의 일부의 전 결실 또는 부분 결실 또는 이의 돌연변이 유발이 포함되며, 여기서, 돌연변이 유발은 치환, 삽입, 결실, 역위, 및 이의 조합 및 변동을 포함하는데, 상기 돌연변이들 중 임의의 것은 기능성 유전자 생성물의 생성을 사실상 방지한다. 유전자는 또한 RNAi, 안티센스, 또는 유전자 발현을 무효화하는 임의의 다른 방법을 이용하여 파괴될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 조작" 및 "유전자 변화"는 상호교환가능하게 사용되며, 핵산 서열의 변화/체인지를 말한다. 상기 변화는 핵선 서열 내의 적어도 하나의 핵산의 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "호기성 발효"는 산소의 존재 하에서의 성장을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 브로쓰"는 액체/침지 배양에서 배지 및 세포를 총괄적으로 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 매스(cell mass)"는 액체/침지 배양물에 존재하는 세포 성분 (온전한 세포 및 용해된 세포를 포함함)을 말한다. 세포 매스는 건조 또는 습윤 중량으로 표현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "리올로지(rheology)"는 물질의 변형(deformation) 및 유동을 다루는 물리학의 분야를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "점도"는 기계적 응력, 예를 들어 전단 응력 또는 인장 응력에 의한 변형에 대한 유체의 내성의 척도이다. 본 발명의 맥락에서, 점도는 또한 예를 들어 로터/임펠러에 의해 제공되는 기계적 응력에 대한, 사상균 세포를 포함하는 세포 브로쓰의 내성을 말할 수 있다. 세포 브로쓰의 점도는 직접적으로 측정하는 것이 어려울 수 있기 때문에, 간접적 점도 측정, 예를 들어 소정량의 교반에서의 배양 브로쓰의 용존 산소 함량, 소정의 용존 산소 함량을 유지하는 데 필요한 교반의 양, 소정의 용존 산소 함량이 유지되도록 세포 브로쓰를 교반하는 데 필요한 전력의 양, 또는 심지어 고체 배지 상에서의 콜로니 형태가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사상균 세포의 "점도 변경" 변이주는 모 주에 의해 생성되는 등가의 세포 브로쓰와 비교하여 점도가 감소되거나 또는 증가된(즉, 전단 응력 또는 인장 응력에 대한 내성이 감소되거나 또는 증가된) 세포 브로쓰를 생성하는 변이주를 말한다. 일반적으로, 등가의 세포 브로쓰는 비견되는 세포 매스를 갖는다. 바람직하게는, 임의의 직접적 또는 간접적 점도 측정과 관련하여, 변이체, 점도 변경 주 및 모 주 사이의 차이는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 심지어 적어도 50%이거나 또는 그보다 더 크다. 사상균 세포 브로쓰의 점도를 비교하는 방법은 본 명세서에 기재되어 있다. 일반적으로, 비견되는 (또는 등가의) 세포 브로쓰는 비견되는 세포 매스를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사상균 세포의 "점도 감소" 변이주는 모 주에 의해 생성되는 등가의 세포 브로쓰와 비교하여 점도가 감소된(즉, 전단 응력 또는 인장 응력에 대한 내성이 감소된) 세포 브로쓰를 생성하는 변이주를 말한다. 바람직하게는, 임의의 직접적 또는 간접적 점도 측정과 관련하여, 변이체, 점도 변경 주 및 모 주 사이의 차이는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 심지어 적어도 50%이거나 또는 그보다 더 크다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "용존 산소"(DO)는 vol/vol 단위로 측정될 때 액체 배지에 존재하는 산소(O2)의 양을 말한다. 용존 산소 수준은 발효 전체에 걸쳐 높은 수준으로, 예를 들어 170-100% 내지 20%, 100-80% 내지 20%, 70% 내지 20%, 65% 내지 20%, 60% 내지 20%, 55% 내지 20%, 50% 내지 20%, 45% 내지 20%, 44% 내지 20%, 43% 내지 20%, 42% 내지 20%, 41% 내지 20%, 40% 내지 20%, 35% 내지 20%, 30% 내지 20%, 및 25% 내지 20%로 유지될 수 있다. 특히, 용존 산소는 발효 시작시에 높을 수 있으며, 발효가 진행됨에 따라 감소되는 것이 허용될 수 있다. 용존 산소 수준은 발효물을 교반하는 속도, 예를 들어 휘젓는 속도에 의해 및/또는 공기 또는 산소의 첨가 속도에 의해 제어될 수 있다. 배양물은 400-700 rpm으로 교반될 수 있으며, 예를 들어 휘저어질 수 있으며, 용존 산소 수준은 공기 또는 산소 유량 및 임펠러 속도의 변경에 의해 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과 및 55% 초과로 또는 그보다 높게 유지된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "주요 유전적 결정 인자(primarily genetic determinant)"는 다른 유전자 또는 이의 유전자 조작물의 부재 하에 특정 표현형의 부여에 필요하고 상기 부여에 충분한 유전자 또는 이의 유전자 조작물을 말한다. 그러나, 특정 유전자가 특정 표현형의 부여에 필요하고 상기 부여에 충분하다는 것은 표현형에 대한 추가의 효과가 추가의 유전자 조작에 의해 성취될 수 있다는 가능성을 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 폴리펩티드/단백질"은 활성, 예를 들어 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성 등을 보유하는, 그리고 돌연변이되거나 절단되거나 또는 달리 변형되어 그 활성이 무효화되거나 또는 감소된 것이 아닌 단백질이다. 기능성 폴리펩티드는 특정된 바와 같이 열안정성 또는 열불안정성일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 유전자"는 활성 유전자 생성물, 전형적으로 단백질의 생성을 위하여 세포 성분에 의해 사용될 수 있는 유전자이다. 기능성 유전자는 파괴된 유전자의 반대인데, 상기 파괴된 유전자는 이것이 활성 유전자 생성물의 생성을 위하여 세포 성분에 의해 사용될 수 없도록, 또는 활성 유전자 생성물의 생성을 위하여 세포 성분에 의해 사용되는 능력이 감소되도록 변형된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이 세포는, 변이주와 모 주 사이의 단백질 발현의 차이가 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 7% 미만, 약 5% 미만, 또는 심지어 약 3% 미만일 경우 모 주와 비교하여 "높은 수준의 단백질 발현 및/또는 분비를 유지하거나 또는 보유한다".
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 숙주 세포는, 야생형 단백질의 활성 특성, 특히 액체 배양에서 사상균의 균사의 신장을 촉진하거나 또는 달리 상기 사상균의 점도를 증가시키는 활성을 나타내는 기능성 단백질/폴리펩티드의 생성이 방지되도록 숙주 세포가 유전자 변경되거나 또는 화학적으로 변경되었을 경우 "특정 단백질의 생성이 방지되도록 변형"되었다. 이러한 변형은 당해 단백질 (본 명세서에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴, 코딩된 폴리펩티드에 전술한 활성이 결여되도록 하는 유전자의 변형, 번역 후 프로세싱 또는 안정성에 영향을 주는 유전자의 변형 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "관심대상의 단백질"은 사상균 세포의 침지 배양에서 생성하기를 원하는 단백질이다. 일반적으로, 관심대상의 단백질은 공업적 용도, 의약품 용도, 동물 건강상의 용도, 및 식품 및 음료 용도에 상업적으로 중요하며, 이는 관심대상의 단백질을 대량으로 생성하는 것이 바람직해지도록 한다. 관심대상의 단백질은, 일반적으로 생성물로서 관심이 없으며 주로 배경 단백질 오염물질로 간주되는, 사상균 세포에 의해 발현되는 무수한 다른 단백질과 구별되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이주는 모 주에 의해 생성되는 단백질과 비교하여 변이주에 의해 생성되는 단백질의 양이 20% 이하로 감소될 경우, 15% 이하로 감소될 경우, 10% 이하로 감소될 경우, 심지어 5% 이하로 감소될 경우, 단위량의 바이오매스당 모 주와 "사실상 동일한 양"의 단백질을 생성하며, 여기서, 단백질의 양은 단백질 생성이 측정되는 세포의 바이오매스의 총량에 대하여 정규화되고, 바이오매스는 (예를 들어 세포 펠렛의) 습윤 또는 건조 중량에 관하여 표현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이주는 변이주에 의해 생성되는 단백질의 양이 모 주와 비교하여 5% 이상 증가될 경우, 10% 이상 증가될 경우, 15% 이상 증가될 경우 또는 그보다 많이 증가될 경우, 모 주보다 "단위량의 바이오매스당 사실상 더 많은 단백질"을 생성하며, 여기서, 단백질의 양은 단백질 생성이 측정되는 세포의 바이오매스의 총량에 대하여 정규화되고, 바이오매스는 (예를 들어 세포 펠렛의) 습윤 또는 건조 중량에 관하여 표현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "플루오로크롬"은 형광 염료이다. 바람직한 플루오로크롬은 진균류의 세포벽 중의 셀룰로오스 및/또는 키틴에 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 하기 약어/두문자어는 달리 특정되지 않으면 하기 의미를 갖는다:
CFU 콜로니 형성 단위(colony forming unit)
EC 효소 위원회(enzyme commission)
kDa 킬로달톤
kb 킬로베이스
MW 분자량
w/v 중량/부피
w/w 중량/중량
v/v 부피/부피
wt% 중량%
℃ 섭씨 온도
H2O 물
H2O2 과산화수소
dH2O 또는 DI 탈이온수
dIH2O 탈이온수, 밀리-큐(Milli-Q) 여과
DO 용존 산소
g 또는 gm 그램
㎍ 마이크로그램
mg 밀리그램
kg 킬로그램
lb 파운드
μL 및 μl 마이크로리터
mL 및 ml 밀리리터
mm 밀리미터
㎛ 마이크로미터
mol 몰
mmol 밀리몰
M 몰랄
mM 밀리몰랄
μM 마이크로몰랄
nm 나노미터
U 단위
ppm 백만분율
sec 및 " 초
min 및 ' 분
hr 및 h 시간
EtOH 에탄올
eq. 당량
N 노르말
PCR 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)
DNA 데옥시리보핵산
FOA 플루오로오로트산
UV 자외광
A540 540 nm의 파장에서 측정된 흡광도
CMC 카르복시메틸 셀룰로오스
rpm 분당 회전수
Δ 결실에 관련됨
CER CO2 발생률
bp 염기쌍
III. Mpg1 단백질 생성이 변경된 사상균주
일 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 변경된 양의 기능성 Mpg1 단백질을 생성하게 하는 유전자 변경을 포함한다. 후속적으로 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하는 세포 브로쓰, 또는 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 매스를 생성한다.
일부의 경우에, 유전자 변화는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 감소된 양의 기능성 Mpg1 단백질을 생성하게 하며, 생성된 세포 브로쓰는 모 주의 세포와 비교하여, 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하거나 또는 소정량의 교반에서 더 높은 용존 산소 함량을 유지한다. 이러한 경우에, 변이주의 세포 매스는 모 주의 세포 매스와 비교하여 감소된 점도를 나타내며, 이는 실시예에 기재된 바와 같이 용존 산소 함량 및 교반에 관련된 관찰 사항을 설명하는 것으로 믿어진다.
기능성 Mpg1 단백질의 양의 감소는 모 주에 존재하는 mpg1 유전자의 파괴에서 생길 수 있다. mpg1 유전자의 파괴는 점도 감소 표현형을 변이주에 부여함에 있어서 주요한 유전적 결정 인자이기 때문에, 이러한 변이주는 단지 파괴된 mpg1 유전자를 포함할 필요가 있는 반면, 모든 다른 유전자는 온전하게 남아 있을 수 있다. 일부의 경우에, 변이주는 그가 유래되는 모 주와 비교하여 추가의 유전자 변화를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 유전자 변화는 점도 감소를 부여하는 데 필요하지 않지만, 변이주에 있어서 추가로 점도를 감소시키거나 또는 다른 이점을 부여할 수 있다.
mpg1 유전자의 파괴는 기능성 mpg1 유전자 생성물, 즉 Mpg1 단백질의 발현을 사실상 방지하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같은 예시적인 파괴 방법은 예를 들어 Mpg1 코딩 서열, 프로모터, 전사 종결 서열, 인핸서, 또는 다른 조절 요소의 전 결실 또는 부분 결실을 포함하는 mpg1 유전자의 전 결실 또는 부분 결실; 및 mpg1 유전자의 임의의 부분을 포함하는 염색체의 일부분의 전 결실 또는 부분 결실을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. mpg1 유전자를 파괴하는 특별한 방법은 mpg1 유전자의 임의의 부분, 예를 들어 Mpg1 코딩 서열, 프로모터, 전사 종결 서열, 인핸서, 또는 다른 조절 요소에서 뉴클레오티드 치환 또는 삽입을 만드는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결실, 삽입 및/또는 치환 (돌연변이로 총칭됨)은, 일반적으로 특정 핵산 서열을 표적화하지 않는 화학적 돌연변이 유발에 의한 것과는 대조적으로, 서열 특이적 분자 생물학 기술을 이용한 유전자 조작에 의해 만들어진다. 그럼에도 불구하고, 화학적 돌연변이 유발을 이용하여 mpg1 유전자를 파괴할 수 있다.
seb1 유전자에서의 돌연변이는 mpg1 프로모터의 효율을 감소시키거나, mpg1 인핸서의 효율을 감소시키거나, mpg1 mRNA의 스플라이싱 또는 에디팅(editing)을 간섭하거나, mpg1 mRNA의 번역을 간섭하거나, 종결 코돈을 Mpg1 코딩 서열 내로 도입하여 전장 Mpg1 단백질의 번역을 방지하거나, Mpg1 단백질의 코딩 서열을 변화시켜 덜 활성인 또는 불활성인 단백질을 생성하거나 또는 Mpg1과 다른 세포벽 성분들의 상호작용을 감소시키거나, Mpg1 단백질의 코딩 서열을 변화시켜 덜 안정성인 단백질을 생성하거나 또는 파괴를 위하여 당해 단백질을 표적화하거나, Mpg1 단백질이 잘못 폴딩되게(misfold) 하거나 또는 부정확하게 변형되게 하거나(예를 들어, 글리코실화에 의해), 또는 Mpg1 단백질의 세포 궤적의 추적을 간섭할 수 있다.
일 실시 형태에서, 이들 및 다른 유전자 조작은 기능성 Mpg1 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 방지하는 작용을 하거나, 또는 Mpg1 단백질의 정상적인 생물학적 활성을 감소시키거나 또는 방지하는 작용을 하고, 이럼으로써 점도 감소 표현형으로 이어지는 세포에서의 형태 변화를 생성한다.
다른 경우에, 유전자 변화는 기능성 Mpg1 단백질의 발현을 증가 또는 복구시키거나, 또는 Mpg1 단백질의 정상적인 생물학적 활성을 증가시키고, 이럼으로써 점도 증가 또는 복구 표현형으로 이어지는 세포에서의 형태 변화를 생성한다. Mpg1 기능을 증가시키거나 또는 복구시키는 예시적인 유전자 변화로는 추가 카피의 mpg1 유전자를 세포 내로 도입하는 것, mpg1 프로모터, 인핸서, 또는 다른 제어 요소의 효율을 증가시키는 것, Mpg1 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역을 증가시키는 것, Mpg1 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성을 증가시키는 것, Mpg1 단백질의 활성 또는 안정성을 증가시키는 mpg1 유전자 내의 변화를 도입하는 것, 다른 단백질 또는 세포벽 성분과의 상호작용을 조정하는 mpg1 유전자 내의 변화를 도입하는 것 등이 있다. Mpg1 기능을 증가시키거나 또는 복구시키는 다른 유전자 변화로는 기능성 Mpg1 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변화의 효과를 역전시키는 것이 있다.
기재된 바와 같이 조작 및 사용을 위한 사상균 세포는 일반적으로 자낭균류 문, 주발버섯아문의 아문, 특히 영양 균사 상태를 갖는 진균류 유래의 것이며, mpg1 유전자의 상동체를 포함한다. 이러한 유기체는 상업적으로 중요한 산업 단백질 및 의약품용 단백질의 생성에 사용되는 사상균 세포를 포함하며, 이는 트리코데르마 종, 아스페르길루스 종, 푸사륨 종, 스케도스포륨 종, 페니실륨 종, 크리소스포륨 종, 세팔로스포륨 종, 탈라로마이세스 종, 게오스미티아 종, 및 뉴로스포라 종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 유기체는 트리코데르마 레에세이 (이전에는 트리코데르마 롱기브라키아툼 및 하이포크레아 제코리나로 분류됨), 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 이타코니쿠스, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 테레우스, 아스페르길루스 소에, 아스페르길루스 자포니쿠스, 스케도스포륨 프롤리피칸스, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 크리소게눔, 탈라로마이세스 (게오스미티아) 에메르소니이, 푸사륨 베네나툼 및 크리소스포륨 루크노웬세를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
문헌[Kruszewska et al. (1998) Cur. Genet. 33:445-50] 및 문헌[Zakrzewska et al. (2003) Applied and Environmental Microbiology 69:4383-89)]에 기재된 바와 같이, 트리코데르마 레에세이 유래의 Mpg 1(PID 122551)은 GTP:알파-D-만노스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제를 코딩한다. mpg1 유전자의 과다발현은 GDP-만노스 수준을 증가시키며, 이는 단백질 글리코실화의 초기 단계에서 중요한 조절 역할을 할 수 있다. 그러나, Mpg1은 이전에는 형태 변경, 특히 저점도 표현형이 생기게 하는 형태 변경과 결부된 것으로 기재되지 않았다. 본 발명은 Mpg1이 형태 변경과 결부된다는 실험적 증거를 제공한다.
트리코데르마 레에세이 Mpg 1 ((jgi|Trire2|122551) 단백질의 아미노산 서열이 하기에 서열 번호 1로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00001
뉴로스포라 크라사 Mpg1 단백질의 아미노산 서열이 하기에 서열 번호 2로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00002
아스페르길루스 오리자에 만노스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 단백질의 아미노산 서열이 하기에 서열 번호 3으로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00003
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, 생성 수준이 변경된 Mpg1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 2 또는 3 중 적어도 하나의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 1, 2 또는 3의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는다. 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 공지된 바와 같이 각각의 상응하는 단백질에 대한 BLAST 검색으로부터 확인될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, 파괴된 mpg1 유전자는 서열 번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 1, 2 또는 3의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 Mpg1 단백질을 코딩한다.
본 명세서에 제공된 아미노산 서열 정보는 임의의 사상균에서 당업자가 손쉽게 Mpg1 단백질 및 Mpg1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 확인하게 하며, mpg1 유전자를 적절하게 파괴하여 Mpg1 단백질의 생성에 영향을 주게 한다. 서열 번호 1, 2 및 3의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 젠뱅크(GenBank) 또는 JGI 데이터베이스에서 찾아볼 수 있으며, 이는 당업자에게 공지된 바와 같다.
다른 태양에서, 사상균 세포의 형태를 변경하는 방법이 제공된다. 변이형 사상균 세포는 고체 배지 상에서 변경된 성장 형태를 나타내며, 침지 배양에서 성장시킬 때 모 세포 성장 및 모 세포 브로쓰 점도와 비교하여 상이한 점도를 갖는 세포 매스를 생성한다.
일부의 경우에, 본 방법은 적합한 유전자적 방법을 이용하여 모 주에서 mpg1 유전자를 파괴하는 것을 포함하며, 여기서, 호기성 발효 동안, 상기 파괴된 mpg1 변이주는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하거나 또는 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다. 이러한 방법은 상기에 그리고 다른 곳에 기재된 임의의 방식으로 mpg1 유전자를 파괴하는 데 사용될 수 있으며, 이는 당업자에게 공지된 바와 같다. 바람직하게는, mpg1유전자의 파괴는, 일반적으로 특정 핵산 서열을 표적화하는 것은 아닌 화학적 돌연변이 유발과는 대조적으로, 서열 특이적 분자 생물학 기술을 이용하여 유전자 조작에 의해 수행된다. 그러나, 화학적 돌연변이 유발이 만족스러운 결과로 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 점도 감소 표현형을 도입하여 점도 감소 주를 생성하는 모 주는 높은 수준으로 발현시키고자 하는 관심대상의 유전자를 이미 포함한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 생성을 위하여 기존의 점도 감소 주 내로 관심대상의 유전자를 도입할 필요성을 없앤다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심대상의 유전자를 이미 포함하는 모 주로부터 사상균 세포의 점도 감소 변이주를 생성하는 데 사용될 수 있다.
IV. Seb1 생성의 변경에 의해 생성되는 상가 효과
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, Mpg1 생성에 영향을 주는 유전자 변화는 Seb1 생성에 영향을 주는 유전자 변화와 조합된다. 트리코데르마 아트로비리데 유래의 seb1 유전자는 STRE-요소 결합 단백질이며, seb1 유전자는 효모 msn2/4 유전자 및 아스페르길루스 니둘란스 msnA 유전자의 오르토로그인 것으로 믿어진다. 특히, seb1 유전자는 효모에 있어서 msn2 /4 유전자를 상보할 수 없으며, 따라서 이것은 아마도 기능성 상동체가 아니다. Seb1은 삼투 스트레스 응답에 연루되나 삼투 스트레스 응답에 필수적인 것은 아니지만, 형태 변경, 특히 저점도 표현형이 생기게 하는 것과 결부된 것으로 기재되지 않았다.
쿼리(query)로서 티. 아트로비리데 Seb1 아미노산 서열 (서열 번호 4)을 이용하여 수행된 트리코데르마 레에세이의 공개적으로 입수가능한 게놈 DNA 서열의 BLAST 검색에 의하면, 티. 레에세이 게놈은 seb1에 대하여 밀접하게 상동성인 단일 유전자를 포함한다는 것이 나타났다. 추가의 상동체 또는 유사 서열은 확인되지 않았으며, 이는 seb1이 독특한 단일 카피 유전자임을 시사하는 것이다. Seb1 단백질의 상동체는 예를 들어 아스페르길루스 클라바투스 (서열 번호 6), 아스페르길루스 푸미가투스 Af93 (서열 번호 7), 및 네오사르토리아 피쉐리 NRRL 181 (서열 번호 8)에서 발견되었다:
트리코데르마 아트로비리데 Seb1 단백질의 아미노산 서열은 하기에 서열 번호 4로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00004
트리코데르마 레에세이 Seb1 단백질의 예상 아미노산 서열이 하기에 서열 번호 5로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00005
아스페르길루스 클라바투스 Seb1 단백질의 아미노산 서열은 하기에 서열 번호 6으로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00006
아스페르길루스 푸미가투스 Af93 Seb1 단백질의 아미노산 서열은 하기에 서열 번호 7로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00007
네오사르토리아 피쉐리 NRRL 181 Seb1 단백질의 아미노산 서열은 하기에 서열 번호 8로 예시된다:
Figure 112013104704172-pct00008
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, 생성 수준이 변경된 Seb1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 5, 6, 7 또는 8 중 적어도 하나의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 4, 5, 6, 7 또는 8의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는다. 서열 번호 4, 5, 6, 7 또는 8의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업자에게 공지된 바와 같이 젠뱅크 또는 JGI 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, seb1 유전자가 파괴되며, 여기서, seb1 유전자는 서열 번호 4, 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 4, 5, 6, 7 또는 8의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 Seb1 단백질을 코딩한다.
당업자라면, Seb1 생성에 영향을 주는 유전자 변화가 Mpg1 생성에 영향을 주는 유전자 변화와 동일한 방식으로 이루어질 수 있음을 인식할 것인데, 이는 본 명세서에 상술되어 있다. 점도를 변화시키는 Seb1 단백질의 변화는 본 명세서에 참고로 포함된, 2011년 4월 22일자로 출원된 미국 가출원 제61/478,160호에 추가로 기재되어 있다.
V. Sfb3 생성의 변경에 의해 생성되는 상가 효과
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, Mpg1 생성 또는 Mpg1 및 Seb1 생성에 영향을 주는 유전자 변화는 Sfb3 생성에 영향을 주는 유전자 변화와 조합된다. Sfb3 유전자 (Lst1로도 공지됨)는 출아 효모 (즉, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae))에서 이전에 특성화되었으며, 여기서 이것은 소포체로부터 골지체(Golgi apparatus)로 단백질을 운반하는 수송 소포를 둘러싸고 있는 COPII 단백질 코트와 결부된 단백질을 코딩한다. Sfb3과, Sfb2는 Sec24의 상동체이며, 상기 유전자 전부는 특정 카고(cargo) 단백질을 상기 소포 내에 패키징하는 것과 관계된다.
Sec24는 효모에 있어서 필수 유전자인 반면, Sfb3 및 Sfb2는 그렇지 않지만, 효모에 있어서 Sfb3의 결실은 세포벽 합성에 연루된 글루카노실트랜스퍼라아제(Gas1p) 및 원형질 막 수송 단백질(Pma1p)의 수송에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다.
쿼리 서열로서 에스. 세레비지애의 Sec24p, Sfb3p 또는 Sfb2p 아미노산 서열을 이용하여 트리코데르마 레에세이의 공개적으로 입수가능한 게놈 서열을 검색하기 위하여 BLAST를 이용하면, 티. 레에세이는 효모 Sec24에 대하여 가장 밀접하게 상동성인 단일 유전자 및 효모 Sfb3에 대하여 가장 밀접하게 상동성인 단일 유전자를 가짐이 나타난다. 다른 상동체는 확인되지 않았으며, 이는 티. 레에세이가 Sfb2와 등가인 유전자를 갖지 않음을 시사하는 것이다. 게다가, Sfb3 단백질의 상동체는 예를 들어 티. 레에세이 (서열 번호 9), 에이. 오리자에 (서열 번호 10), 에이. 니게르 (서열 번호 11), 피. 푸니쿨로숨 (서열 번호 12), 피. 크리소게눔 (서열 번호 13), 엔. 크라사 (서열 번호 14), 및 에프. 옥시스포룸 (서열 번호 15)에서 발견되었다:
트리코데르마 레에세이 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 9):
Figure 112013104704172-pct00009
아스페르길루스 오리자에 RIB40 Sfb3 아미노산 서열 (GI: 83766074; 서열 번호 10):
Figure 112013104704172-pct00010
아스페르길루스 니게르 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 11)
Figure 112013104704172-pct00011
페니실륨 푸니쿨로숨 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 12)
Figure 112013104704172-pct00012
페니실륨 크리소게눔 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 13)
Figure 112013104704172-pct00013
뉴로스포라 크라사 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 14)
Figure 112013104704172-pct00014
푸사륨 옥시스포룸 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 15)
Figure 112013104704172-pct00015
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, 생성 수준이 변경된 Sfb3 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각의 상응하는 단백질에 대한 BLAST 검색으로부터 확인될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자가 파괴되며, 여기서, sfb3 유전자는 서열 번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 서열 번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 서열에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 Sfb3 단백질을 코딩한다.
대략 40가지의 주발버섯아문 종 유래의 Sfb3 단백질들의 아미노산 서열의 정렬은 특정 아미노산 서열, 즉IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (서열 번호 16, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기임)을 나타냈으며, 이는 Sfb3 단백질의 C-말단에 가깝고 Sec24 단백질에서는 발견되지 않는다. 이 콘센서스 서열은 주발버섯아문의 다른 구성원에서 Sfb3 단백질 및 이의 변이체를 확인하는 데 사용될 수 있다.
당업자라면, Sfb3 생성에 영향을 주는 유전자 변화가 Mpg1 및/또는 Seb1 생성에 영향을 주는 유전자 변화와 동일한 방식으로 이루어질 수 있음을 인식할 것인데, 이는 본 명세서에 상술되어 있다. 점도를 변화시키는 Sfb3 단백질의 변화는 2012년 3월 1일자로 공개되고, 2011년 8월 25일자로 국제특허 출원 제PCT/US2011/049164호로 출원되고 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2012/027580 A1호에 추가로 기재되어 있다.
VI. 유용성
사상균의 점도 감소 주의 사용은 침지 배양에서 산소 및 영양소의 분포를 개선시키고, 침지 배양물의 교반에 필요한 에너지의 양을 감소시키고, 배양물에 존재하는 세포 매스를 증가시켜 단백질 생성을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 게다가, 본 발명의 사상균 변이주는 이전에 기재된 점도 감소 주에 비하여 상당한 이점을 제공한다.
첫째, 본 발명의 변이주는 완전히 정의된 게놈을 가져서, 변이주가 후속 유전자 조작, 컴플리멘테이션(complementation), 메이팅(mating) 등에 적절해지게 할 수 있다. 둘째, 본 발명의 주는 예를 들어 수반되는 점도 변화로 이어지는 조작(들)에 의해 단백질 생성에 있어서 악영향을 받지 않는다. 셋째, 점도 감소 주는 고수준 발현용으로 의도되는 단백질(즉, 관심대상의 단백질)을 이미 생성하거나, 선발가능 마커를 이미 코딩하거나, 또는 생산 숙주에 있어서 바람직한 다른 특징들을 이미 포함하는 모 주를 비롯하여 본질적으로 임의의 모 주로부터 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 주 및 방법은 기존의 점도 감소 생산주 내로 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 전달할 필요성을 없앤다.
본 발명의 주 및 방법은 사상균의 침지 배양에서의 상업적으로 중요한 단백질의 생성에서 용도가 찾아진다. 상업적으로 중요한 단백질은 예를 들어 셀룰라아제, 자일라나아제, 펙티나아제, 라이아제, 프로테아제, 키나아제, 아밀라아제, 풀룰라나아제, 리파아제, 에스테라아제, 퍼하이드롤라아제, 트랜스퍼라아제, 락카아제, 카탈라아제, 옥시다아제, 리덕타아제, 클로로필라아제, 하이드로포빈, 키모신, 카르보닉 언하이드라아제, 하이미딜레이트 신타아제, 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 타이로신 키나아제, 다중 약물 내성 단백질 (예를 들어, ABC P-gp 단백질), CAD (카르바밀-P 신타아제, 아스파테이트 트랜스카르바밀라아제, 다이하이드로오로타아제), 토포아이소머라아제, 리보뉴클레오티드 리덕타아제 및 항체와, 사상균에서 발현될 수 있는 다른 효소 및 효소외 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 공업적 용도, 의약품 용도, 동물 건강상의 용도, 및 식품 및 음료 용도에 적합할 수 있다.
하기의 넘버링된 파라그래프는 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 태양 및 실시 형태를 추가로 설명한다. 넘버링된 파라그래프들 각각의 요지는 단독으로 이용되거나 또는 임의의 다른 넘버링된 파라그래프의 요지와 조합되어 이용될 수 있으며, 이는 나타낸 바와 같다.
1. 일 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 변경된 양의 기능성 Mpg1 단백질을 생성하게 하는 유전자 변경을 포함하며, 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.
2. 파라그래프 1의 변이주의 일부 실시 형태에서, 기능성 Mpg1 단백질의 변경된 양은 감소된 양이며, 변이주는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.
3. 파라그래프 1 또는 2의 변이주의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 모 주에 존재하는 mpg1 유전자의 파괴를 포함한다.
4. 파라그래프 3의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 전부의 또는 일부의 mpg1 유전자의 결실의 결과이다.
5. 파라그래프 3의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자를 포함하는 게놈 DNA의 일부분의 결실의 결과이다.
6. 파라그래프 3의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 돌연변이의 결과이다.
7. 파라그래프 3 내지 6 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 부위 특이적 재조합을 이용하여 수행된다.
8. 파라그래프 3 내지 7 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다.
9. 파라그래프 1 내지 8 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 변이주는 기능성 Mpg1 단백질을 생성하지 않는다.
10. 파라그래프 1 내지 8 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 변이주는 Mpg1 단백질을 생성하지 않는다.
11. 파라그래프 1 내지 10 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 변이주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
12. 파라그래프 1 내지 11 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 이는 sfb3 유전자의 파괴를 추가로 포함한다.
13. 파라그래프 1 내지 12 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 변이주는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴를 추가로 포함한다.z1
14. 파라그래프 1 내지 13 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 변이주는 단위량의 바이오매스당 모 주와 사실상 동일하거나 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성한다.
15. 파라그래프 1 내지 14 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 사상균은 주발버섯아문 종이다.
16. 파라그래프 1 내지 15 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 종이다.
17. 파라그래프 1 내지 16 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이이다.
18. 다른 태양에서, 사상균 세포의 변이주를 생성하는 방법이 제공되며, 이는 모 주의 세포와 비교하여 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 변경시키는 유전자 변화를 사상균 세포의 모 주 내에 도입하고, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
19. 파라그래프 18의 방법의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하고, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성한다.
20. 파라그래프 18 또는 19의 방법의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 mpg1 유전자를 파괴하는 것을 포함한다.
21. 파라그래프 18 내지 20 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 mpg1 유전자를 파괴하는 것을 포함한다.
22. 파라그래프 18 내지 21 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화를 부위 특이적 유전자 재조합을 이용하여 수행한다.
23. 파라그래프 18 내지 22 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다.
24. 파라그래프 18 내지 23 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다.
25. 파라그래프 18 내지 24 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴와 조합하여 수행된다. s1z1
26. 파라그래프 18 내지 25 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 변이주는 단위량의 바이오매스당 모 주와 사실상 동일하거나 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성한다.
27. 파라그래프 18 내지 26 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 사상균은 주발버섯아문 종이다.
28. 파라그래프 18 내지 27 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 종이다.
29. 파라그래프 18 내지 28 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이이다.
30. 파라그래프 18 내지 29 중 어느 하나의 방법의 일부 실시 형태에서, 모 주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
31. 파라그래프 30의 방법의 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변화의 도입 이전에 모 주에 존재한다.
32. 다른 태양에서, 파라그래프 11의 변이주에 의해 생성된 관심대상의 단백질이 제공된다.
33. 다른 태양에서, 파라그래프 18 내지 31 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 사상균의 변이주가 제공된다.
34. 다른 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 상기 변이주는
(a) (i) 침지 배양에서 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 침지 배양에서 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 유전자 변화, 및
(b) 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며,
관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 (a)에서의 유전자 변화 이전에 변이주에 존재한다.
35. 파라그래프 34의 변이주의 일부 실시 형태에서, 유전자 변화는 모 주에 존재하는 mpg1 유전자의 파괴를 포함한다.
36. 파라그래프 35의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행된다.
37. 파라그래프 35 또는 36의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다.
38. 파라그래프 35 내지 37 중 어느 하나의 변이주의 일부 실시 형태에서, mpg1 유전자의 파괴는 seb1 유전자의 파괴와 조합되어 수행된다.
본 발명의 주 및 방법의 이들 및 다른 태양 및 실시 형태는 본 발명의 설명을 고려하면 당업자에게 명백해질 것이다. 하기 실시예는 본 주 및 방법을 추가로 예시하고자 하는 것이며, 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1. 사상균의 형태적 변화에 책임이 있는 mpg1 유전자의 확인
A. 개관
사상균의 파괴 라이브러리는 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환을 이용하여, 예시적인 사상균, 즉, 트리코데르마 레에세이를 pyr2 유전자를 함유하는 핵산으로 형질전환시킴으로써 제조하였다. 이러한 방식으로, pyr2 유전자는 선발가능 마커 및 유전자 태그 둘 모두로서의 역할을 하였다. 또한 히스톤 H1 프로모터가 유전자의 시작 코돈 앞에 삽입될 경우 유전자를 상향조절하는 프로모터로서 그리고 유전자 태그로서의 역할을 하였다. 사용한 특정 에이. 투메파시엔스 주는 EHA 105였는데, 이는 초전염성(hypervirulent)인 것으로 간주된다 (문헌[Hood et al., 1993]). 그러나, 다른 에이. 투메파시엔스 주, 예를 들어 A136 및 EHA 101은 티. 레에세이에서 유사한 형질전환 빈도를 생성한다. 에이. 리조게네스(A. rhizogenes) 주, 예를 들어 ATCC 43057이 또한 사용될 수 있다. 특정한 파괴 라이브러리는 약 50,000개의 형질전환체를 함유하였다.
B. 트리코데르마 레에세이 MAGI 주
티. 레에세이 Morph 1.1(즉, "Morph") 돌연변이체는 4가지의 주요 셀룰라아제 유전자(즉, cbhI, cbhII, eglI 및 eglII)에 대하여 결실되어 있으며, 이는 상기 돌연변이체가 셀룰라아제 배경 활성의 부재 하에 다른 단백질을 발현시키는 데 유용해지게 한다. MAGI 주는 리포터 카세트의 삽입을 트리코데르마 레에세이 Morph 1.1의 오로티딘 5'-모노포스페이트 파이로포스포릴라아제 ((pyr2) 유전자좌에 표적화함으로써 생성하였다. 이 리포터 카세트는 티. 레에세이의 셀로바이오하이드롤라아제 I (cbhI) 프로모터 및 전사 종결 서열의 제어 하의 알파-아밀라아제 및 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 종 유래의 코돈 최적화된 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 함유한다. 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 또한 pyr2 유전자좌에서 리포터와 통합시킨다. 리포터 카세트의 통합과 일치하여, pyr2 유전자의 3' 부분이 결실되어 이 주는 우리딘 영양요구체가 된다.
C. DNA 의 준비
파괴에 사용한 벡터는 PZP 100 벡터를 기반으로 한 pRATT 236이었으며, 이는 좌측 및 우측 T-DNA 경계 영역, 이. 콜라이로부터 아그로박테륨으로의 이동을 위한 pBR322 bom 부위, 각각 이. 콜라이 및 아그로박테륨에서의 복제를 위한 ColE1 및 pVS1 플라스미드 복제 기점, 및 클로람페니콜 내성을 부여하기 위한 박테리아 마커를 포함한다 (문헌[Hajdukiewiez, O. et al., 1994]). 벡터의 대표도가 도 1에 예시되어 있다.
트리코데르마 아트로비리데의 pyr2 유전자, 이어서 삽입 부위 내로 바깥쪽으로 전사하도록 배향된 his1 프로모터를 함유하는 파괴 카세트를 표준 분자 생물학 기술에 의해 제조하고, 라이게이션시켜 pRATT 236 벡터를 생성하였다. 생성된 벡터를 이. 콜라이 TOP10 세포 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))에서 증식시켰다. 25 ppm의 클로람페니콜을 포함하는 LA 한천 플레이트 (10 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물, 10 g/L의 NaCl, 10 g/L의 한천)를 사용하여 이. 콜라이 형질전환체를 선발하였다. 상기 벡터를 함유하는 이. 콜라이를 LB 배지 (10 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물, 10 g/L의 NaCl) + 25 ppm의 클로람페니콜에서 성장시켰다. 벡터 DNA를 표준 방법을 이용하여 단리하였다.
D. 아그로박테륨 세포의 형질전환
적격 아그로박테륨 세포를 다음과 같이 만들었다. 간략하게는, 아그로박테륨 세포를 LA 배지 상에서 28℃에서 약 3일 동안 성장시킴으로써 냉동보존물로부터 회생시켰다. 그 후, 콜로니를 선발하고, 성장이 명백해질 때까지 28℃에서 250 ml의 경사 바닥 플라스크(dented bottom flask)에서 50 ml의 부피의, 0.1% 글루코스를 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. 대안적으로, 콜로니를 5 ml 배양 튜브에서 시작하고, 성장이 명백해졌을 때 250 ml 플라스크로 옮겼다. 그 후, 250 ml 플라스크의 부피의 약 10%를 동일 배지를 포함하는 신선한 플라스크 내로 옮겼으며, 이를 약 0.4-0.8의 OD (600 nm; OD600)가 되도록 (약 5-6시간의 성장) 성장시켰다. 세포를 10,000 rpm에서 10분 동안 저온 원심분리기에서의 원심분리에 의해 회수하고, 그 후 pH 7.0의 냉 1 M HEPES에서 3회 세척하였다. 다음, 세포를 10% 글리세롤을 포함하는 냉 1 mM HEPES에서 1회 세척하고, 분취물을 -70℃에서 냉동시켰다. 세포 생존성을 결정하였다 (전형적으로, 냉동 후 약 1x109 CFU/ml).
전기 천공에 의해 상기 벡터 DNA를 이용하여 아그로박테륨 세포를 형질전환시켰다. 적격 아그로박테륨 세포를 얼음 상에서 해동시키고, 약 40 ㎕의 상기 세포를 (얼음 상의) 0.2 cm 전기 천공 셀에서 약 1 ㎍의 DNA와 혼합하였다. 부클러(Buchler) 3-150 전기 천공기를 이용하여 2.5 볼트 (200 옴, 25 μF)에서 세포를 전기 천공시켰다. SOC 배지 (인비트로겐)를 전기 천공 직후 전기 천공 셀에 첨가하였다. 대안적으로, 아그로박테륨 세포를 라이게이션 혼합물을 이용하여 전기 천공에 의해 형질전환시키고, 이럼으로써 이. 콜라이에서 상기 벡터 DNA를 증식시킬 필요성을 제거할 수 있다. 대안적인 방법에서, 약 1 μl의 라이게이션 혼합물을 형질전환에 이용한다. 전기 천공 혼합물에 SOC를 첨가한 후, 상기 혼합물의 희석물을 LA 배지 + 250 ppm 클로람페니콜 배양 플레이트 상에 플레이팅하고, 28℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 1 x 107 CFU/ml의 아그로박테륨 형질전환체를 수득하였으며, 약 90-100%는 상기 벡터 DNA를 함유하였고, 이는 PCR 분석법에 의해 결정되는 바와 같았다. 25 ppm의 적은 클로람페니콜을 이용하여 더욱 짧은 시간틀(time frame) 내에서 콜로니를 수득할 수 있지만, 더 많은 수의 콜로니를 스크리닝하여 진정한 형질전환체를 확인하여야 한다.
E. 티. 레에세이의 아그로박테륨 -매개 형질전환
250 ml의 플라스크에서 25 ml의 최소 배지 (2.05 g/L의 K2HPO4, 1.45 g/L의 KH2PO4, 0.15 g/L의 NaCl, 0.5 g/L의 MgSO4·7·H2O, 0.1 g/L의 CaCl2·6·H2O, 0.0025 g/L의 FeSO4·7·H2O, 0.5 g/L의 (NH4)2SO4 및 2 g/L의 글루코스, 살균 후, 25 ppm의 클로람페니콜을 첨가함)에 벡터-형질전환 아그로박테륨의 냉동된 스톡을 접종하거나 또는 직접적으로 신선 LA 플레이트로부터 접종하였다. 그 후, 최소 배지 배양물을 탁해질 때까지 (하룻밤 내지 수일) 진탕하면서 28℃에서 인큐베이션하였다. 250 ml의 플라스크에서 10 ml의 배양물을 50 ml의 유도 배지 (2.05 g/L의 K2HPO4, 1.45 g/L의 KH2PO4, 0.15 g/L의 NaCl, 0.5 g/L의 MgSO4·7·H2O, 0.1 g/L의 CaCl2·6·H2O, 0.0025 g/L의 FeSO4·7·H2O, 0.5 g/L의 (NH4)2SO4, 1.8 g/L의 글루코스, 5 g/L의 글리세롤, pH 5.3의 40 mM MES 중에 제조, 살균 후, 200 μL의 1 M 아세토시링곤을 첨가함)로 옮겼다. 출발 OD600은 약 0.1이었으며, 벡터-형질전환된 아그로박테륨 세포를 약 0.4-0.8의 OD600으로 성장시켰다.
티. 레에세이 MAGI 세포의 신선 배양물을 10 ml의 살균수 중에 포자를 재현탁시킴으로써 제조하였다. 티. 레에세이 MAGI 세포의 형질전환을 다음과 같이 수행하였다: 튜브에서 약 100 ㎕의 아그로박테륨 전 브로쓰 (OD600 = 0.4-0.8)를 100 ㎕의 진균류 포자 (107 sfu/ml)와 혼합하였다 (진균류 포자에 대한 아그로박테륨 세포의 다른 비도 만족스러운 결과를 생성할 것이다). 약 0.1-1.0 ml의 이 믹스를 니트로셀룰로오스 필터가 매립된 유도 한천 플레이트 (15 g/L의 한천 및 0.25 mg/mL의 우리딘을 포함하는 유도 배지) 상에 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 약 18-28℃에서 약 24-48시간 동안 인큐베이션하여 티. 레에세이 세포의 성장을 허용하였다. 다음, 니트로셀룰로오스 필터를 250 ppm의 카르베니실린이 보충된 보겔 배지(Vogel's medium) (문헌[Vogel, Microbiol. Genet. Bull. 13:42-43, 1956])로 옮겨 아그로박테륨을 사멸/아그로박테륨의 성장을 저해하였다. 그 후, 상기 필터 상에서의 사상균 (파괴 라이브러리의 형질전환체를 대표함)의 성장이 명백해질 때까지 상기 배양물을 28℃에서 인큐베이션하였다.
F. 형태 돌연변이체에 대한 스크리닝
파괴 라이브러리에서의 형질전환체를 광학 현미경법을 이용하여 고체 및 액체 배양에서 형태 변화에 대하여 스크리닝하였다. 형질전환 후, 개별 형질전환체를 콜로니 피커(picker)를 이용하여 니트로셀룰로오스 필터로부터 골라내고, 감자 덱스트로스 한천을 함유하는 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 (CP-700, 미국 웨스트버지니아주 페어리 소재의 노르그렌 시스템즈 엘엘씨(Norgren Systems LLC))로 옮겼다. 대안적으로, 형질전환체 유래의 포자들을 조합하고, 발아시키고, 단일 포자를 세포 분류기를 이용하여 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하였다. 포자들은 세포 스프레더(spreader)를 이용하여 20 ml 살균 증류수 중에 감자 덱스트로스 형질전환 플레이트로부터의 포자를 현탁시킴으로써 수집하였다. 포자를 50 ml의 최소 배지를 함유하는 250 mL 플라스크 내에 접종하고, 발아체가 수득될 때까지 28℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 70 ㎛ 노즐을 이용하여, 초당 15,000 이벤트(event)의 이벤트 속도, 414 kPa(60 psi)에서 고속 분류 (모플로(MoFlo) 분류기, 미국 콜로라도주 포트 콜린스 소재의 사이토메이션(Cytomation))를 이용하여, 개별 발아체를 감자 덱스트로스 한천 (미국 미시간주 디트로이트 소재의 디프코(Difco))을 함유하는 마이크로타이터 플레이트 웰 내로 분리하여 넣었다. 상기에 기재된 방법에 의해 수득한 형질전환체를 함유하는 마이크로타이터 플레이트들을 28℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 개별 발아체 포자를 YEG ( 물 1 L당 5 g의 효모 추출물, 20 g의 글루코스)를 함유하는, 유리 바닥을 갖는 384웰 블랙 센소플레이트(black sensoplate) (독일 소재의 그레이네르 바이오-원(Greiner Bio-one)) 내로 이중 플레이팅하고, 20℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 개별 형질전환체의 형태를 현미경으로 조사하였다.
대안적으로, 느리게 성장하는 형질전환체를 형질전환 플레이트로부터 직접적으로 단리하고, 감자 덱스트로스 한천 (디프코) 사에 재플레이팅하였다. 감자 덱스트로스 플레이트 상에서 콜로니 성장을 나타내는 형질전환체를 진탕 플라스크에서 28℃, 150 rpm에서 YEG 배지에서 24시간 동안 성장시키고, 형질전환체의 형태를 현미경으로 조사하였다.
G. 티. 레에세이 MAGI 10-8g의 단리 및 특성화
상기 절차로부터 수득한 돌연변이 MAGI 10-8g는 모 MAGI보다 더 짧은 필라멘트를 갖는, 액체 배양에서의 변경된 형태를 갖는 것으로 관찰되었다. 액체 배지에서, MAGI 10-8g 돌연변이체를 함유하는 배양물은 또한 모 MAGI를 함유하는 배양물과 비교하여 성장 동안 더 높은 수준의 용존 산소를 나타냈다 (표 1).
주 MAGI 및 MAGI 10-8g는 침지 (액체) 배양에서 유사한 조건 하에 성장시켰으며, 이들의 성장 표현형을 비교하였다. 간략하게는, 각각의 주의 포자를 측면 배플(baffle) 및 바닥 배플 둘 모두를 갖는 3 L 플라스크 내의 500 mL의 배지에 별도로 첨가하였다. 30분 동안 오토클레이브한 후, 살균 60% 글루코스를 27.5 g/L의 최종 농도로 첨가하였다. MAGI 주는 Δpyr2이기 때문에, 이것에 2 mg/mL의 우리딘을 보충하였다. 상기 배양물을 진탕 인큐베이터에서 34℃에서 48시간 동안 성장시켰다.
48시간 후, 각각의 플라스크의 내용물을, 4.7 g/L의 KH2PO4, 1.0 g/L의 MgSO4 -7·H2O, 4.3 g/L의 (NH4)2SO4 및 2.5 mL/L의 동일 미량 원소 용액을 함유하는 9.5 L의 배지를 함유하는 14 L 발효기에 별도로 첨가하였다. 이들 성분을 121℃에서 30분 동안 함께 가열 살균하였다. 60%의 글루코스 및 0.48%의 CaCl2 -2·H2O의 용액을 별도로 오토클레이브하고, 냉각시키고, 75 g/L의 글루코스 및 0.6 g/L의 CaCl2 -2·H2O의 최종 농도로 발효기에 첨가하였다. 배지를 28%의 NH3으로 pH 3.5로 조정하고, 전체 성장 기간 동안 온도를 34℃로 유지하였다.
상부 공간에 압력이 부가되지 않을 때(즉, 0 kPa(0바)의 게이지, 100 kPa(1바)의 절대 압력) 100%로 용존 산소(DO) 탐침자를 보정하였다. 그 후, 상부 공간 내의 압력을 70 kPa(0.7바)(게이지)로 설정하였으며, 그 후 상기 산소 탐침자는 시드(seed) 배양물이 첨가되기 전에 170%로 판독되었다. 발효기는 2개 블레이드, 4개 블레이드 터빈을 포함하였으며, 상기 터빈은 처음에 500 rpm으로 설정된 가변 속도 모터를 통한 혼합을 제공하였다.
상기 배양물들이 성장함에 따라, DO 함량 수준은 적어도 부분적으로는 사상균 균사의 증식으로 인한 브로쓰의 점도 증가의 결과로서 강하되었다. DO 함량 수준이 40% 미만으로 저하되었을 때, 교반 속도를 증가시켜 용존 산소를 40%로 유지하였다. 750 rpm의 교반에 도달할 때, DO 함량 수준은 40% 미만으로 강하시킬 것이다. DO 함량이 40% 미만으로 저하되지 않으면, 발효 실행 동안 교반 속도를 증가시킬 필요가 없었으며, 초기 교반 속도가 필요한 것보다 더 높았다. 글루코스가 완전히 소비되었을 때 각각의 발효기에서 생성된 바이오매스의 양을 측정하였더니, 둘 모두의 주에 있어서 사실상 동일한 것으로 밝혀졌다.
주어진 수준의 교반에서의 각각의 발효기에서의 DO 함량 수준, 및 주어진 DO 함량 수준을 유지하는 데 필요한 교반의 양은, 상이한 주 성장 표현형으로 인하여 상이한 브로쓰의 점도의 간접적인 척도가 된다. 단지 하나의 변수(즉, DO 또는 교반)를 변화시키고 다른 하나를 측정하는 것이 이상적일 것이지만, 각각의 발효기에서의 충분한 바이오매스의 생성에 있어서 DO가 40% 미만으로 저하되지 않게 하고 이럼으로써 상이한 주들의 성장 사이의 더욱 유의한 비교를 가능하게 하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 교반 속도를 증가시켜 표적 DO 수준을 유지하는 것이 필요한 경우, 교반의 양은 발효기 터빈을 구동시키는 모터에 공급되는 전력의 양에 의해 개산될 수 있으며, 이는 브로쓰의 점도와 상관되는 계량치(metric)를 제공한다. 특히, 현탁된 배양물을 교반하는 데 필요한 가외의 전력은 교반 속도를 세제곱한 것에 비례한다.
mpg1 유전자의 핵산 서열을 JGI 데이터베이스로부터 획득하였다: 하기에 개시된 바와 같이, 단백질 ID: 122551, 명칭: estExt_fgenesh5_pg.C_130115이고, http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id=122551에서 입수가능하다 (문헌[I. V. Grigoriev, H. Nordberg, I. Shabalov, A. Aerts, M. Cantor, D. Goodstein, A. Kuo, S. Minovitsky, R. Nikitin, R. A. Ohm, R. Otillar, A. Poliakov, I. Ratnere, R. Riley, T. Smirnova, D. Rokhsar, and I. Dubchak. Nucleic Acids Res 2011 0: gkr947v1-gkr947]). 미번역 영역은 이탤릭체로 되어 있고 상류 또는 하류 서열이 5' 및 3' 측면에 위치하며, 코딩 영역은 볼드체로 되어 있고, 인트론은 소문자로 되어 있다 (서열 번호 38):
Figure 112013104704172-pct00016
Figure 112013104704172-pct00017
표 1에 나타낸 바와 같이, MAGI 10-8g는 모 MAGI에 비하여 브로쓰 점도가 감소된다. 배치 성장기(batch growth phase)의 마지막에, 모든 글루코스가 소비되었을 때, 둘 모두의 주는 유사한 바이오매스 농도를 성취하였다. 여기에 도착하기 위하여, MAGI 대조 주는 750 rpm의 최대치로 증가된 교반을 했으며, 그 후 35%만큼 낮게 DO 강하가 있었다. 주 MAGI 10-8g는 동일한 바이오매스 농도를 성취하기 위하여 그만큼 많은 에너지를 필요로 하지 않았다. DO (%)가 40으로 강하되었을 때 교반 속도를 513 rpm으로 약간 증가시켰다. 단백질 생성은 MAGI에 비하여 MAGI 10-8g에서 악영향을 받지 않았다.
Figure 112013104704172-pct00018
역 PCR을 이용하여 티. 레에세이 게놈 내의, pyr2 his1 유전자를 함유하는 T-DNA의 삽입 부위를 확인하였다. 간략하게는, 주 MAGI 10-8g 유래의 고분자량 게놈 DNA를 제한 효소 SpeI로 완전히 절단하였다. 상기 효소의 가열 불활성화 후, 반응물을 라이게이션 완충제에서 5배 희석시키고, T4 DNA 라이가아제를 첨가하였다. 하룻밤의 라이게이션 반응 후, 라이가아제를 가열 불활성화시키고, 반응물을 아세트산암모늄 및 에탄올로 침전시켰다. 세척된 DNA 펠렛을 TE에 용해시키고, 프라이머 RPG253 및 RPG255를 이용한 PCR을 위한 주형으로 이용하였다 (표 2 참조). 그 후, 생성된 PCR 생성물을 세정하고, 네스티드(nested) 프라이머 RPG239 및 RPG207을 이용하여 서열결정하여 T-DNA 삽입 부위의 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. JGI 트리코데르마 레에세이 v 2.0 게놈 서열에 대한 이 서열의 BLASTn 분석에 의하면 T-DNA가 스캐폴드(Scaffold) 13의 영역 369089 내지 370324를 결실시켰음이 나타났다.
삽입 부위는 삽입 부위의 측면에 위치하는 게놈 DNA에 대하여 상동성인 프라이머 및 T-DNA에 대하여 상동성인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다. 특히, 프라이머 RPG256 및 RPG268을 사용하여 T-DNA의 3' 말단의 서열을 확인하고, 프라이머 RPG268 및 RPG269는 확인된 부위에서 전 T-DNA 삽입물을 증폭시켰다.
돌연변이 MAGI 10-8g 내의 T-DNA 삽입 부위는 티. 레에세이 JGI 게놈 데이터베이스 v2에서 스캐폴드 13에서 369089 내지 370324였다. 이 부위에서 발견된 유전자는 mpg1 유전자 (PDI 122551)이며, 이는 아스페르길루스 클라바투스, 아스페르길루스 푸미가투스 및 네오사르토리아 네오사르토리아 피쉐리를 비롯한 다른 진균류에서 발견된다. 문헌[Kruszewska et al. (1998) Cur. Genet. 33:445-50] 및 문헌[Zakrzewska et al. (2003) Applied and Environmental Microbiology 69:4383-4389]에 기재된 바와 같이, 트리코데르마 레에세이 유래의 mpg1은 GTP:알파-D-만노스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제를 코딩하며, 이는 단백질 글리코실화의 초기 단계에서 중요한 조절 역할을 할 수 있다. 서던(Southern) 분석에 의하면, 이 주는 천연 카피 뿐만 아니라 단지 하나의 pyr2 유전자 카피도 함유함이 나타났으며, 이는 하나의 파괴 이벤트가 일어났음을 나타내는 것이었다 (예시하지 않음).
이 부위에서의 삽입은 단지 MAGI 10-8g 주에서 이루어진 유전자 변화인 것으로 밝혀졌기 때문에, mpg1 유전자의 파괴가 관찰된 형태적 변화의 원인이 되었다는 결론이 나온다.
Figure 112013104704172-pct00019
실시예 2. 티. 레에세이 돌연변이체 77B7로부터의 mpg1 유전자의 결실
A. Morph 주 TrGA 77B7
상기에 기재된 Morph 주는 amds를 마커로서 사용하여, CBH1 프로모터의 제어 하에 천연 트리코데르마 글루코아밀라아제 유전자 (TrGA)로 이전에 형질전환되었다. 글루코아밀라아제의 2개의 탠덤 카피를 함유하는 형질전환체 (TrGA 29-9)를 후속적으로 단리하고, 랜덤한 화학적 돌연변이 유발을 이용하여 돌연변이체 (77B7)를 생성하였다. 후속적으로, 자발적 pyr2 돌연변이 유도체를 5-플루오로-오로트산 (FOA) 선발에 의해 단리하였다.
B. mpg1 파괴 카세트의 생성
트리코데르마 레에세이 mpg1 ((jgi|Trire2|122551)을 돌연변이 Morph 77B7로부터 결실시켰다.
mpg1 파괴 카세트 플라스미드 pRATT249 (도 2)를 표준 분자 생물학 절차를 이용하여 제조하였다. 이 플라스미드는 5' 비번역 영역의 일부 및 연접 상류 서열(좌측 측면)을 포괄하는 DNA 서열에 대하여 상동성을 갖는 2.5 Kb 영역을 갖는 DNA 서열을 포함하였다. mpg1유전자의 네 번째 엑손의 일부 및 연접 하류 서열(우측 측면)을 포괄하는 DNA 서열에 대하여 상동성인 3.3 Kb 영역을 갖는 DNA 서열이 상기 플라스미드 내에 또한 포함되었다. 이들 서열은 mpg1 유전자를 표적화하여 상기 좌측 측면과 우측 측면 사이의 게놈의 영역들을 개재 카세트 서열들로 대체하도록 설계하였다. 이들 개재 서열들은 형질전환시킬 주의 게놈 내에 내인성 티. 레에세이 pyr2에 대한 상동성을 최소화하고자 하는 트리코데르마 아트로비리데 유래의 pyr2 선발 마커를 포함하였다. pyr2 선발 마커의 바로 상류에는 상기 마커의 3' 말단의 직접적 반복 중복체가 있었으며, 이는 형질전환체/파괴체의 유용한 pyr2 돌연변이 유도체의 후속적인 상기 마커 상실 및 단리를 용이하게 하였다. 이러한 전 mpg1 파괴 카세트를 프라이머 RPG388 및 RPG391을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 후속 단계에서 사용하기 위하여 표준 분자 생물학 절차를 이용하여 다수의 PCR 반응물을 풀링하여 세정하였다.
C. 주 Morph 77B7Δ mpg1 의 생성
주 Morph TrGA 77B7 Δ pyr2를 PEG-매개 형질전환을 이용하여 mpg1 파괴 카세트로 형질전환시키고, 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 플레이팅하여 pyr2 마커에 의해 획득된 우리딘 원영양성을 기초로 하여 후보들에 대하여 선발하였다. 개별 형질전환체를 보겔 최소 배지로 옮김으로써 단리하고 증식시켰다. 상동 재조합에 의해 mpg1 유전자좌에 mpg1 파괴 카세트가 통합된 형질전환체를 확인하기 위하여 PCR 분석을 이용하였다. mpg1 유전자좌에서의 Δmpg1 파괴 카세트의 상동 통합은 2개의 프라이머 쌍을 이용하여 예상된 크기의 DNA 단편을 증폭시킴으로써 검증하였다. 프라이머 쌍 RPG394 및 RPG253은 상기 파괴 카세트 영역의 5' 말단의 바깥에서 시작하여 3' 영역 내에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. 프라이머 쌍 RPG395 및 RPG273은 상기 파괴 카세트의 5' 영역 내에서 시작하여 상기 파괴 카세트 영역의 3' 말단 바깥에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. mpg 1 파괴 카세트의 상동 통합이 확인된 생성된 주를 Morph 77B7 Δ mpg1로 명명하였다. 프라이머 서열들이 표 4에 열거되어 있다.
주 Morph 77B7 및 Morph 77B7 Δ mpg1은 침지 (액체) 배양에서 동일한 조건 하에 성장시켰으며, 이들의 성장 표현형을 비교하였다. 간략하게는, 각각의 주의 포자를 측면 배플 및 바닥 배플 둘 모두를 갖는 3 L 플라스크 내의 500 mL의 배지에 별도로 첨가하였다. 배지는 5 g/L의 (NH4)2SO4, 4.5 g/L의 KH2PO4, 1 g/L의 MgSO4-7·H2O, 및 14.4 g/L의 시트르산을 함유하였으며, 이는 5% NaOH로 pH 5.5로 조정하였다. 30분 동안 오토클레이빙한 후, 살균 60% 글루코스를, 175 g/L의 시트르산, 200 g/L의 FeSO4 -7·H2O, 16 g/L의 ZnSO4 -7·H2O, 3.2 g/L의 CuSO4 -5·H2O, 1.4 g/L의 MnSO4 -H2O, 및 0.8 g/L의 H3BO3을 함유하는 2.5 mL/L의 미량 원소 용액과 함께, 27.5 g/L의 최종 농도로 첨가하였다. 상기 배양물을 진탕 인큐베이터에서 34℃에서 48시간 동안 성장시켰다.
48시간 후, 각각의 플라스크의 내용물을, 4.7 g/L의 KH2PO4, 1.0 g/L의 MgSO4 -7·H2O, 4.3 g/L의 (NH4)2SO4 및 2.5 mL/L의 동일 미량 원소 용액을 함유하는 9.5 L의 배지를 함유하는 14 L 발효기에 별도로 첨가하였다. 이들 성분을 121℃에서 30분 동안 함께 가열 살균하였다. 60%의 글루코스 및 0.48%의 CaCl2 -2·H2O의 용액을 별도로 오토클레이브하고, 냉각시키고, 75 g/L의 글루코스 및 0.6 g/L의 CaCl2 -2·H2O의 최종 농도로 발효기에 첨가하였다. 배지를 28%의 NH3으로 pH 3.5로 조정하고, 전체 성장 기간 동안 온도를 34℃로 유지하였다.
상부 공간에 압력이 부가되지 않을 때(즉, 0 kPa(0바)의 게이지, 100 kPa(1바)의 절대 압력) 100%로 용존 산소(DO) 탐침자를 보정하였다. 그 후, 상부 공간 내의 압력을 70 kPa(0.7바)(게이지)로 설정하였으며, 그 후 상기 산소 탐침자는 시드(seed) 배양물이 첨가되기 전에 170%로 판독되었다. 발효기는 2개 블레이드, 4개 블레이드 터빈을 포함하였으며, 상기 터빈은 처음에 500 rpm으로 설정된 가변 속도 모터를 통한 혼합을 제공하였다.
상기 배양물들이 성장함에 따라, DO 수준은 적어도 부분적으로는 사상균 균사의 증식으로 인한 브로쓰의 점도 증가의 결과로서 강하되었다. DO가 40% 미만으로 저하되었을 때, 교반 속도를 증가시켜 용존 산소를 40%로 유지하였다. 750 rpm의 교반에 도달할 때, DO는 40% 미만으로 강하시킬 것이다. DO가 40% 미만으로 저하되지 않으면, 발효 실행 동안 교반 속도를 증가시킬 필요가 없었으며, 초기 교반 속도가 필요한 것보다 더 높았다. 글루코스가 완전히 소비되었을 때 각각의 발효기에서 생성된 바이오매스의 양을 측정하였더니, 둘 모두의 주에 있어서 사실상 동일한 것으로 밝혀졌다.
주어진 수준의 교반에서의 각각의 발효기에서의 DO 수준, 및 주어진 DO 수준을 유지하는 데 필요한 교반의 양은, 상이한 주 성장 표현형으로 인하여 상이한 브로쓰의 점도의 간접적인 척도가 된다. 단지 하나의 변수(즉, DO 또는 교반)를 변화시키고 다른 하나를 측정하는 것이 이상적일 것이지만, 각각의 발효기에서 충분한 바이오매스의 생성을 보장하기 위하여 DO가 40% 미만으로 저하되지 않게 하고 이럼으로써 상이한 주들의 성장 사이의 더욱 유의한 비교를 가능하게 하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 교반 속도를 증가시켜 표적 DO 수준을 유지하는 것이 필요한 경우, 교반의 양은 발효기 터빈을 구동시키는 모터에 공급되는 전력의 양에 의해 개산될 수 있으며, 이는 브로쓰의 점도와 상관되는 계량치(metric)를 제공한다. 특히, 현탁된 배양물을 교반하는 데 필요한 가외의 전력은 교반 속도를 세제곱한 것에 비례한다.
DO (%)가 40% 미만으로 강하되지 않는 주에 있어서, 계량은 소정의 교반 속도에서 유지된 최소 용존 산소 수준을 기반으로 한다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 주 Morph 77B7로부터의 mpg1 유전자의 결실은 브로쓰 점도가 감소된 주(Morph 77B7 Δ mpg1)를 생성하였다. 배치 성장기의 마지막에, 모든 글루코스가 소비되었을 때, 둘 모두의 주는 유사한 바이오매스 농도를 성취하였다. 여기에 도착하기 위하여, 대조 주는, DO가 40%만큼 낮게 강하될 때 616 rpm으로 증가된 교반을 했다. mpg1-결실 주는 동일한 바이오매스 농도를 성취하기 위하여 많은 에너지를 필요로 하지 않았다. 교반 속도를 500 rpm 초과로 증가시키지 않았으며, DO는 단지 102%만큼 낮게 강하되었다.
Figure 112013104704172-pct00020
Figure 112013104704172-pct00021
실시예 3. 파괴된 mpg1 및 seb1 유전자를 갖는 돌연변이체에서의 상가적 점도 감소
A. 상기에 기재된 Morph 77B7 Δ mpg1 주는 amdS를 마커로서 사용하여 CBH1 프로모터의 제어 하에 천연 트리코데르마 글루코아밀라아제 유전자(TrGA)로 이전에 형질전환되었다. 글루코아밀라아제의 2개의 탠덤 카피를 함유하는 형질전환체 (TrGA 29-9)를 후속적으로 단리하고, 랜덤한 화학적 돌연변이 유발을 이용하여 저점도 표현형과 결부된 변경된 형태를 갖는 돌연변이체 (77B7)를 생성하였다. mpg1 유전자를 상기에 기재된 바와 같이 결실시켰다. pyr2 유전자는 5-플루오로오로트산에 대한 내성에 대하여 선발함으로써 후속적으로 자발적으로 결실시켜 주 Morph 77B7 Δ mpg1, Δpyr2를 생성하였다.
B. seb1 파괴 카세트의 생성
seb1 파괴 카세트 플라스미드 pRATT240 (도 3)을 표준 분자 생물학 절차를 이용하여 제조하였다. 이들 개재 서열들은 형질전환시킬 주의 게놈 내에 내인성 티. 레에세이 pyr2에 대한 상동성을 최소화하고자 하는 트리코데르마 아트로비리데 유래의 pyr2 선발 마커를 포함하였다. pyr2 선발 마커의 바로 상류에는 상기 마커의 3' 말단의 중복체가 있었으며, 상기 직접적 반복체는 형질전환체/파괴체의 유용한 pyr2 돌연변이 유도체의 후속적인 상기 마커 상실 및 단리를 용이하게 하였다. 이러한 전 seb1 파괴 카세트를 프라이머 RPG257 및 RPG264 (표 6 참조)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 후속 단계에서 사용하기 위하여 표준 분자 생물학 절차를 이용하여 다수의 PCR 반응물을 풀링하여 세정하였다.
C. 주 Morph 77B7 Δ mpg1 Δ seb1 및 Morph 77B7 Δ seb1 의 생성
Morph 77B7 Δpyr2 및 Morph 77B7 Δmpg1 Δpyr2를 PEG-매개 형질전환을 이용하여 seb1 파괴 카세트로 형질전환시키고, 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 플레이팅하여 pyr2 마커에 의해 획득된 우리딘 원영양성을 기초로 하여 후보들에 대하여 선발하였다. 개별 형질전환체를 보겔 최소 배지로 옮김으로써 단리하고 증식시켰다. 상동 재조합에 의해 seb1 유전자좌에 seb1 파괴 카세트가 통합된 형질전환체를 확인하기 위하여 PCR 분석을 이용하였다. seb1 유전자좌에서의 Δseb1 파괴 카세트의 상동 통합은 2개의 프라이머 쌍을 이용하여 예상된 크기의 DNA 단편을 증폭시킴으로써 검증하였다. 프라이머 쌍 RPG297 및 RPG253은 상기 파괴 카세트 영역의 5' 말단의 바깥에서 시작하여 3' 영역 내에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. 프라이머 쌍 RPG296 및 RPG273은 상기 파괴 카세트의 5' 영역 내에서 시작하여 상기 파괴 카세트 영역의 3' 말단의 바깥에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. 파괴와 일관되게, 제3 프라이머 쌍, RPG133 및 RPG220은 형질전환되지 않은 모 주 유래의 주형 DNA를 사용하여 상기 삽입 부위를 포괄하는 1.6 kb DNA를 증폭시켰지만, seb1 파괴 주 유래의 주형 DNA를 사용해서는 이 단편을 증폭시키지 못하였다. seb1 파괴 카세트의 확인된 상동 통합을 갖는 생성된 주를 Morph 77B7 Δseb1 및 Morph 77B7 Δ mpg1 Δ seb1로 명명하였다.
D. 침지 배양에서의 Morph 77B7 Δ mpg1 Δ seb1 의 성장
주 Morph 77B7 Δ mpg1 및 Morph 77B7 Δ mpg1 Δseb1을 실시예 2에 설명한 바와 같이 침지 (액체) 배양에서 동일 조건 하에 성장시키고, 이들의 성장 표현형을 비교하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, Morph 77B7 Δ mpg1 주에서의 seb1 유전자의 파괴에 의해, (소정의 교반 속도에서 최소로 유지된 용존 산소 수준을 기준으로 하여) 점도가 추가로 감소된 주가 생성되었으며, 이는 seb1 유전자의 파괴 및 mpg1 유전자의 파괴가 형태 및 점도 감소와 관련하여 상가 효과를 가짐을 나타내는 것이다. Morph 77B7 Δmpg1 Δseb1의 단백질 생성량은 Morph TrGA 77B7 및 Morph TrGA 77B7Δseb1의 것의 적어도 85% 이상이었다.
Figure 112013104704172-pct00022
Figure 112013104704172-pct00023
실시예 4. 파괴된 mpg1 및 sfb3 유전자를 갖는 돌연변이체에서의 상가적 점도 감소
A. Morph 주 TrGA #32
상기에 기재된 Morph 주는 amds를 마커로서 사용하여, CBH1 프로모터의 제어 하에 천연 트리코데르마 글루코아밀라아제 유전자(TrGA)로 이전에 형질전환되었다. 글루코아밀라아제의 2개의 탠덤 카피를 함유하는 형질전환체 (TrGA 29-9)를 후속적으로 단리하고, 랜덤한 화학적 돌연변이 유발을 이용하여 점도 감소 표현형과 결부된 변경된 형태를 갖는 세포벽 돌연변이체(70H2)를 생성하였다. 이러한 점도 감소 표현형은 절단된 sfb3 유전자의 결과인 것으로 이후에 결정되었다 (데이터는 예시하지 않음). TrGA의 추가의 카피로 형질전환된 70H2 주(즉, TrGA #32)는 추가로 TrGA의 과다발현에 유용하였다.
B. mpg1 파괴 카세트의 생성
mpg1 유전자를 실시예 2에 설명한 바와 같이 파괴하여 주 TrGA #32 Δmpg1을 만들었다.
C. 침지 배양에서의 TrGA#32 Δ mpg1 의 성장
주 TrGA#32 및 TrGA#32 Δmpg1을 실시예 2에 설명한 바와 같이 침지 (액체) 배양에서 동일 조건 하에 성장시키고, 이들의 성장 표현형을 비교하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, TrGA#32 주로부터의 mpg1 유전자의 결실은 (소정 수준의 용존 산소를 유지하는 데 필요한 rpm을 기초로 하여) 점도가 추가로 감소된 주를 생성하였으며, 이는 mpg1 유전자의 파괴 및 sfb3 유전자의 파괴가 형태 및 점도 감소와 관련하여 상가 효과를 가짐을 나타내는 것이었다. 단백질 생성은 mpg1 결실에 의해 영향을 받지 않았다 (예시하지 않음).
Figure 112013104704172-pct00024
실시예 5. 파괴된 mpg1 , seb1 , 및/또는 sbf3 과 함께인, gas1 , crz1 및 tps2 유전자 중 적어도 하나가 파괴된 돌연변이체에서의 상가적 점도 감소
파괴된 gas1 에서의 점도 감소
진균류 β(1,3)-글루카노실트랜스퍼라아제의 Gel/Gas/Phr 패밀리는 주 성분인 β(1,3)-글루칸의 프로세싱에 의한 세포벽 생체내 합성에서 중요한 역할을 한다 (문헌[Popolo et al., 2008]). gas1 (PID 22914)은 베타-1,3-글루칸을 파괴하고 연결할 수 있는 GPI (및/또는 글루칸)-고정된 단백질인 베타-1,3-글루카노실트랜스퍼라아제를 코딩한다. 5개를 갖는 티. 레에세이를 비롯하여 많은 진균류 게놈 내에는 다수의 파라로그(paralog)가 있다. 별도의 연구에 의하면, gas1 유전자 (또는 이것이 아스페르길루스 푸미가투스에서 공지된 바와 같이 gel1 유전자)의 돌연변이는 진균류 세포벽 구조에 영향을 주며, 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White), 콩고 레드(Congo Red) 및 소듐 도데실 설페이트에 대한 과민성 뿐만 아니라 형태적 변화에도 이르게 될 수 있음이 밝혀졌다 (문헌[Schirawski, J. et al. 2005, Mouyna, I. et al. 2005]).
트리코데르마 레에세이 Morph 주는 cbhI, cbhII, egII, 및 egIV를 비롯하여 4개의 주요 셀룰라아제 유전자에 대하여 결실되었으며, 이는 상기 주가 셀룰라아제 배경의 부재 하에 또는 감소된 셀룰라아제 배경에서 다른 단백질을 발현하는 데 특히 적합해지게 한다. 국제특허 공개 05/001036호를 참조하라. Morph 주는 amdS를 마커로서 사용하여, CBH1 프로모터의 제어 하에 천연 트리코데르마 글루코아밀라아제 유전자 (TrGA)로 이전에 형질전환되었다. 글루코아밀라아제의 2개의 탠덤 카피를 함유하는 형질전환체 (TrGA 29-9)를 후속적으로 단리하고, 랜덤한 화학적 돌연변이 유발을 이용하여 돌연변이체 (77B7)를 생성하였다. 후속적으로, 자발적 pyr2 돌연변이 유도체를 5-플루오로-오로트산 (FOA) 선발에 의해 단리하였다. 트리코데르마 레에세이 gas1 (PID 22914)을 돌연변이체 Morph 77B7로부터 결실시켰다.
주 Morph TrGA 77B7 Δpyr2를 PEG-매개 형질전환을 이용하여 gas1 파괴 카세트로 형질전환시키고, 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 플레이팅하여 pyr2 마커에 의해 획득되는 우리딘 원영양성을 기초로 하여 후보에 대하여 선발하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, Morph 77B7 Δgas1은 모 Morph 77B7과 비교하여 브로쓰 점도가 감소된다. 배치 성장기의 마지막에, 모든 글루코스가 소비되었을 때, 상기 둘 모두의 주는 유사한 바이오매스 농도를 성취하였다. 배치 성장기의 마지막에 도달하기 위하여, Morph 77B7 대조 주는 616 rpm으로 증가된 교반을 하였으며, 그 후 DO 함량 수준이 40%만큼 낮게 강하되었다. Morph 77B7 Δgas1은 동일 바이오매스 농도를 성취하기 위하여 많은 에너지(즉, 교반에 있어서의 rpm의 증가)를 필요로 하지 않았다. 교반 속도는 500 rpm 초과로 증가하지 않았으며, DO (%)는 115 미만으로 강하되지 않았다. 단백질 생성은 Morph 77B7 (데이터는 예시되지 않음)과 비교하여 Morph 77B7 Δgas1에서 악영향을 받지 않았다. gas1 파괴에 대한 상세 사항은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2011년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제61,480,602호에서 찾아볼 수 있다.
Figure 112013104704172-pct00025
파괴된 crz1 에서의 점도 감소
진균류에서, 칼시뉴린 매개 Ca2+ 신호전달이 많은 유기체에서 성장, 발달 및 독력(virulence)에 필요한 것으로 밝혀졌다. 이것은 높은 양이온 수준 및 알칼리성 pH를 비롯한 다양한 환경 조건에의 적응에 필요하다. 유전자 crz1은 칼시뉴린-조절 전사 인자를 코딩한다. Crz1p 전사 인자는 포스파타아제 칼시뉴린이 Ca2+/칼모듈린에 의해 활성화될 때 탈포스포릴화된다. 그 후 이것은 핵으로 들어가서 다수의 유전자의 발현을 유도하며, 상기 유전자 중 많은 것은 세포벽 관련 기능을 갖는 단백질을 코딩한다 (문헌[Yoshimoto et al., 2002]; 문헌[Lagorce et al., 2003]; 문헌[Garcia et al., 2004]; 문헌[Karababa et al., 2006]; 문헌[Pardini et al, 2006], 문헌[Munro, C. et al. 2009]). crz1 또는 상동체의 결실은 균사 형태를 변경시킬 수 있다 (문헌[Kothe, G. and Free, S. 1998, Prokisch, H. et al. 1997]).
트리코데르마 레에세이 Morph 주를 상기에 설명한 바와 같이 준비하였다. 트리코데르마 레에세이 crz1 (PID 36391)을 돌연변이 Morph 77B7로부터 결실시켰다. 주 Morph TrGA 77B7 Δpyr2를 PEG-매개 형질전환을 이용하여 crz1 파괴 카세트로 형질전환시키고, 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 플레이팅하여 pyr2 마커에 의해 획득되는 우리딘 원영양성을 기초로 하여 후보에 대하여 선발하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이, Morph 77B7 Δcrz1은 모 Morph 77B7과 비교하여 브로쓰 점도가 감소된다. 배치 성장기의 마지막에, 모든 글루코스가 소비되었을 때 상기 둘 모두의 주는 유사한 바이오매스 농도를 성취하였다. 배치 성장기의 마지막에 도달하기 위하여, Morph 77B7 대조 주는 616 rpm으로 증가된 교반을 하였으며, 그 후 DO 함량 수준이 40%만큼 낮게 강하되었다. 주 Morph 77B7 Δcrz1은 동일 바이오매스 농도를 성취하기 위하여 많은 에너지를 필요로 하지 않았다. 교반 속도는 500 rpm 초과로 증가하지 않았으며, DO (%)는 100 미만으로 강하되지 않았다. crz1 파괴에 대한 상세 사항은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2011년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제61,480,610호에서 찾아볼 수 있다.
Figure 112013104704172-pct00026
파괴된 tps1 에서의 점도 감소
유전자 tps2는 이당인 트레할로스의 합성에 연루된 트레할로스-포스페이트 포스파타아제를 코딩한다. 트레할로스는 세포질 및 ER에서 변성 단백질의 재폴딩(refolding)을 완충시키는, 스트레스 유도되는 당이다 (문헌[Singer, M et al. 1998], 문헌[Simola, M et al. 2000]). 이 이당은 다양한 스트레스에 응답하여 다양한 유기체에 의해 다량으로 생성된다. 효모에 있어서, 트레할로스는 고온에서 단백질을 안정화하며, 열손상된 단백질의 재폴딩을 돕는다 (문헌[Simola, M et al. 2000]).
트리코데르마 레에세이 Morph 주를 상기에 설명한 바와 같이 준비하였다. 트리코데르마 레에세이 tps2 (PID 48707)를 돌연변이 Morph 77B7로부터 결실시켰다. 주 Morph TrGA 77B7 Δpyr2를 PEG-매개 형질전환을 이용하여 tps2 파괴 카세트로 형질전환시키고, 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 플레이팅하여 pyr2 마커에 의해 획득되는 우리딘 원영양성을 기초로 하여 후보에 대하여 선발하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, Morph 77B7 Δtps2는 모 Morph 77B7과 비교하여 브로쓰 점도가 감소된다. 배치 성장기의 마지막에, 모든 글루코스가 소비되었을 때 상기 둘 모두의 주는 유사한 바이오매스 농도를 성취하였다. 배치 성장기의 마지막에 도달하기 위하여, Morph 77B7 대조 주는 616 rpm으로 증가된 교반을 하였으며, 그 후 DO 함량 수준이 40%만큼 낮게 강하되었다. 주 Morph 77B7 Δtps2는 동일 바이오매스 농도를 성취하기 위하여 많은 에너지를 필요로 하지 않았다. 교반 속도는 500 rpm 초과로 증가하지 않았으며, DO (%)는 110 미만으로 강하되지 않았다. tps1 파괴에 대한 상세 사항은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2011년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제61,480,629호에서 찾아볼 수 있다.
Figure 112013104704172-pct00027
전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확성을 위하여 예시 및 예로서 약간 상세하게 설명하였지만, 소정의 변화 및 변경이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 설명은 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안되는데, 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구범위에 의해 기술된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상, 그리고 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 특정적으로 그리고 개별적으로 그렇게 참고로 포함되는 것으로 나타내어진 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
참고 문헌
하기 참고 문헌, 및 여기에 인용된 추가의 참고 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다:
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Val Asp Val Pro Ala Ile Ile Met 355 360 <210> 2 <211> 364 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 2 Met Lys Ala Leu Ile Leu Val Gly Gly Phe Gly Thr Arg Leu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Met Pro Lys Pro Leu Val Glu Phe Gly Asn Lys Arg 20 25 30 Met Ile Leu His Gln Ile Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Thr Asp 35 40 45 Ile Val Leu Ala Val Asn Tyr Arg Pro Glu Ile Met Glu Lys Tyr Leu 50 55 60 Ala Glu Tyr Glu Lys Gln Phe Gly Ile Asn Ile Thr Ile Ser Ile Glu 65 70 75 80 Ser Glu Pro Leu Gly Thr Ala Gly Pro Leu Lys Leu Ala Glu Asp Val 85 90 95 Leu Arg Lys Asp Asp Thr Pro Phe Phe Val Leu Asn Ser Asp Val Thr 100 105 110 Cys Glu Tyr Pro Phe Lys Glu Leu Ala Ala Phe His Lys Ala His Gly 115 120 125 Asp Glu Gly Thr Ile Val Val Thr Lys Val Glu Glu Pro Ser Lys Tyr 130 135 140 Gly Val Val Val His Lys Pro Asn His Pro Ser Arg Ile Asp Arg Phe 145 150 155 160 Val Glu Lys Pro Val Gln Phe Val Gly Asn Arg Ile Asn Ala Gly Leu 165 170 175 Tyr Ile Phe Asn Pro Ser Val Ile Asp Arg Val Glu Leu Arg Pro Thr 180 185 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tgatgagata gcatctccgc tcacttgtca tttcagttag aatattcatt 2630

Claims (38)

  1. 모 주(parental strain)로부터 유래된 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)의 변이주로서, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 감소된 양의 기능성 만노스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (Mpg1) 단백질을 생성하도록 하는 mpg1 유전자의 파괴를 포함하고, sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴를 추가로 포함하며, 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰(broth)를 생성하는 변이주.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) mpg1 유전자의 파괴는 전부의 또는 일부의 mpg1 유전자의 결실의 결과이거나;
    (b) mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자를 포함하는 게놈 DNA의 일부분의 결실의 결과이거나;
    (c) mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 돌연변이 유발의 결과인 변이주.
  3. 제2항에 있어서, mpg1 유전자의 파괴는 부위 특이적 재조합을 이용하여 수행되거나, mpg1 유전자의 파괴는 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합되어 수행되는 변이주.
  4. 제1항에 있어서, 기능성 Mpg1 단백질을 생성하지 않는 변이주.
  5. 제1항에 있어서, Mpg1 단백질을 생성하지 않는 변이주.
  6. 제1항에 있어서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 변이주.
  7. 제1항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴를 추가로 포함하는 변이주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단위량의 바이오매스(biomass)당 모 주와 사실상 동일하거나 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성하는 변이주.
  9. 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 세포의 변이주를 생성하는 방법으로서, 모 주의 세포와 비교하여 기능성 만노스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (Mpg1) 단백질의 생성을 감소시키거나 방지하는 mpg1 유전자의 파괴를 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 세포의 모 주 내에 도입하고, sfb3 유전자, seb1 유전자, gas1 유전자, crz1 유전자 및 tps2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 파괴를 추가로 포함하며, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (a) mpg1 유전자의 파괴는 유전자 조작을 이용하여 수행되거나;
    (b) mpg1 유전자의 파괴는 유전자 조작을 이용하여 모 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 세포에서 mpg1 유전자를 결실시키는 것을 포함하거나;
    (c) mpg1 유전자의 파괴는 부위 특이적 유전자 재조합을 이용하여 수행되는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    (a) mpg1 유전자의 파괴가 mpg1 유전자의 유전자좌에서의 선발가능한 마커의 도입과 조합하여 수행되거나;
    (b) mpg1 유전자의 파괴가 sfb3 유전자의 파괴와 조합하여 수행되는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변이주는 단위량의 바이오매스당 모 주와 사실상 동일하거나 또는 그보다 더 많은 양의 단백질을 생성하는 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모 주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 Mpg1 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변화의 도입 이전에 모 주에 존재하는 방법.
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