CN114667350A - 包含蛋白质生产率提高表型的真菌菌株及其方法 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及包含蛋白质生产率提高表型的经修饰的丝状真菌菌株(细胞),其中此类经修饰的菌株特别适用于在深层培养物中生长(例如,用于工业/商业应用的蛋白质的大规模生产)。因此,本公开的某些实施例涉及从包含编码天然GEF1蛋白的基因的亲代菌株衍生(获得)的丝状真菌的此类变体(经修饰的)菌株,其中该变体菌株包含破坏或缺失编码天然GEF1蛋白的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下生长/培养/发酵时,该变体菌株包含蛋白质生产率增加表型(即,相对于该亲代菌株)。
Description
技术领域
本公开总体上涉及生物学、分子生物学、丝状真菌、酵母、发酵、遗传学、工业蛋白生产等领域。更特别地,本公开的菌株和方法涉及丝状真菌中的遗传修饰,这些遗传修饰产生表型改变的变体(经修饰的)菌株,其中此类经修饰的菌株特别适用于在深层培养物中生长(例如,用于工业/商业应用的蛋白质的大规模生产)。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月08日提交的美国临时专利申请号62/932,525的权益,将该申请通过引用以其全文并入本文。
序列表的引用
命名为“NB41383-WO-PCT_SequenceListing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2020年10月27日,并且大小为55KB,将其通过引用以其全文特此并入。
背景技术
丝状真菌(例如,曲霉属(Aspergillus)物种、青霉属(Penicillium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、毁丝霉属(Myceliophthora)物种、脉孢菌属(Neurospora)物种、念珠菌属(Candida)物种、木霉属(Trichoderma)物种等)能够表达高水平的天然和异源蛋白,从而使其非常适用于大规模生产用于工业和/或商业应用(诸如药物应用、动物健康应用、食品应用、饮料应用、洗衣和纺织品应用等)的蛋白质(例如,酶、抗体、肽等)和/或代谢物。丝状真菌典型地在生物反应器(发酵罐)中的菌丝体深层培养物中生长,这些生物反应器经调节以将氧和营养素引入并分配到培养基(即,培养肉汤)中。例如,已知丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei,真菌红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的一种无性型)是纤维素酶的有效生产者。
因此,丝状真菌由于其生产蛋白质(例如,酶)的能力而被利用,这些蛋白质在生产商品诸如纤维素(衍生的)乙醇、纺织品加工品、谷物加工品、洗涤剂、纤维/纸浆/纸、食品添加剂、饲料添加剂等中是有价值的。例如,在此类真菌宿主菌株中的重组基因表达是生产蛋白质(即,用于工业和商业目的)的常见方法,并且因此,真菌宿主菌株的蛋白质生产率改进是蛋白质生产成本的重要经济因素。因此,如本领域技术人员所理解,用于提高丝状真菌菌株中蛋白质产生的此类新型组合物和方法具有重要的商业意义。
发明内容
本公开总体上涉及包含蛋白质生产率提高表型的经修饰的丝状真菌菌株(细胞),其中此类经修饰的菌株特别适用于在深层培养物中生长(例如,用于工业/商业应用的蛋白质的大规模生产)。因此,本公开的某些实施例涉及从包含编码天然GEF1蛋白的基因的亲代菌株衍生(获得)的丝状真菌的此类变体(经修饰的)菌株,其中该变体菌株包含破坏或缺失编码天然GEF1蛋白的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下生长/培养/发酵时,该变体菌株包含蛋白质生产率增加表型(即,相对于该亲代菌株)。
生物学序列简述
SEQ ID NO:1是里氏木霉多核苷酸序列,其编码包含SEQ ID NO:2的天然GEF1蛋白。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1的多核苷酸编码的天然全长GEF1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码SEQ ID NO:2的天然全长GEF1蛋白的可读框(ORF)。
SEQ ID NO:4是C末端截短的GEF1变体蛋白,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸位置1-1,244。
SEQ ID NO:5是SEQ ID NO:2中存在的GEF1结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:2中存在的BAR结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是SEQ ID NO:2中存在的保守未知结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是里氏木霉GEF1基因内的靶位点3(TS3)RNA序列。
SEQ ID NO:9是引物AL950的核酸序列。
SEQ ID NO:10是引物AL952的核酸序列。
SEQ ID NO:11是引物RhoF1的核酸序列。
SEQ ID NO:12是引物RhoR1的核酸序列。
SEQ ID NO:13是里氏木霉GEF1基因内的靶位点4(TS4)RNA序列。
SEQ ID NO:14是潮霉素磷酸转移酶标记基因的核酸序列。
SEQ ID NO:15是粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)cpc1启动子核酸序列。
SEQ ID NO:16是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)trpC终止子核酸序列。
SEQ ID NO:17是引物HygF1的核酸序列。
SEQ ID NO:18是引物HygR1的核酸序列。
SEQ ID NO:19是pyr2标记基因的核酸序列。
附图说明
图1呈现编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的天然木霉属物种GEF1蛋白同源物的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1;图1A-图1B)。如图1A和图1B所示,编码GEF1蛋白(SEQ IDNO:2)的DNA序列包含两(2)个以小写(核苷酸)字母表示的内含子和三(3)个以大写(核苷酸)字母表示的外显子,其中Cas9靶位点3(TS3)核苷酸以双下划线大写字母表示,Cas9靶位点4(TS4)核苷酸以单下划线大写字母表示,并且野生型序列(SEQ ID NO:1)的密码子GAG以粗体大写字体表示,该密码子在突变体菌株中突变为过早(TAG)终止密码子,从而编码C末端截短的GEF1蛋白(图1B)。
图2显示编码SEQ ID NO:2的天然GEF1蛋白的可读框(ORF)序列(SEQ ID NO:3;图2A-图2B)。
图3显示天然GEF1蛋白(SEQ ID NO:2;图3A)和变体(C末端截短的)GEF1蛋白(SEQID NO:4;图3B)的氨基酸序列。此外,图3所示为SEQ ID NO:2的天然GEF1蛋白的GEF1结构域(图3C;SEQ ID NO:5)、BAR结构域(图3D;SEQ ID NO:6)和未知结构域(图3E;SEQ ID NO:7)。例如,天然GEF1蛋白(SEQ ID NO:2;图3A)的氨基酸序列包含Pfam预测的GEF1结构域(图3A,淡灰色氨基酸阴影;PF00621)和BAR结构域(图3A,粗体氨基酸;PF03114)。如图3B所示,变体GEF1蛋白(SEQ ID NO:4)在C末端截短,其中截短发生在GEF1结构域的N末端附近(例如,残基“VIK”)。
具体实施方式
如本文所阐述和描述,本公开总体上涉及经遗传修饰的丝状真菌菌株(细胞)及其在生产工业蛋白质中的用途。更特别地,本公开的菌株和方法涉及丝状真菌中的遗传修饰,这些遗传修饰产生表型改变的变体菌株,其中此类变体菌株特别适用于在深层培养物中生长(例如,用于工业/商业应用的蛋白质的大规模生产)。因此,如本文所述,本公开的某些实施例涉及经遗传修饰的丝状真菌菌株及其方法,其中此类经修饰的菌株包含蛋白质生产率提高表型,诸如改进的体积效率、较高的比生产率、改进的碳源产量、降低的生物反应器(发酵罐)操作成本等。
I.定义
在详细地描述本发明的菌株和方法之前,为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本说明书中引用的所有公开物以及专利都通过引用并入本文。
在提供了一系列值的情况下,应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示),该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内,并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内,服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下,排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。
本文提供了某些范围,其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时,接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性等值的数字。例如,关于数值,术语“约”是指数值的-10%至+10%的范围,除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中,短语“约6的pH值”是指pH值为从5.4至6.6,除非pH值另有具体定义。
本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制,这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此,把说明书作为一个整体参考时,以下即将定义的术语得以更全面地定义。
根据这一详细说明,以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物,除非上下文中另有清楚地指示。因此,例如,提及“酶”包括多种此类酶,并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一次或多次剂量及其等效物等。
还应注意,权利要求书可以经撰写而排除任何任选的要素。因此,此陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”、“不包括”等或使用“否定型”限定的前提基础。
还应注意,如本文所用,术语“包含”意指“包括但不限于”在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的组分是必需的或强制性的,但是包含一种或多种组分的组合物还可以包括其他非强制性或可选择的一种或多种组分。
还要注意的是,如本文所用,术语“由……组成”意指包括且限于术语“由……组成之后的一种或多种组分”。因此,术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的,且组合物中不存在一种或多种其他组分。
如将对于本领域技术人员显而易见的是,在阅读本公开时,本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征,这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
用于如本文所述操作、构建和使用的丝状真菌细胞通常来自子囊菌门盘菌亚门(Pezizomycotina),特别是具有营养菌丝状态的真菌。此类生物体包括用于生产商业上重要的工业和药物蛋白的丝状真菌细胞,包括但不限于木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、青霉属物种、金孢属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属物种、疣青霉属(Geosmithia)物种、脉孢菌属物种、毁丝霉属物种等。
例如,在某些实施例中,丝状真菌细胞及其菌株包括但不限于里氏木霉(先前分类为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和红褐肉座菌)、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、粗糙脉孢菌、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(埃默森疣青霉)(Talaromyces(Geosmithia)emersonii)、腐皮镰刀菌(Fusarium venenatum)、嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)、勒克诺金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)(C1)等。
如本文所用,为便于描述,术语和短语诸如“一种或多种丝状真菌菌株”、“一种或多种真菌菌株”、“一种或多种丝状真菌细胞”、“一种或多种丝状真菌细胞”,“一种或多种真菌细胞”等可以互换使用,并且不旨在限制本公开的范围。
如本文所用,“酵母”和/或“酵母菌株”包括但不限于酵母属(Saccharomyces)物种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴氏酵母(S.pastorianus)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))、耶氏酵母属(Yarrowia)物种(例如解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))等。
如本文所用,术语“基因”与术语“等位基因”同义,是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸(多核苷酸)。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体,因此指定基因的单拷贝(即,单个等位基因)足以赋予特定表型。
如本文所用,诸如“亲代细胞”、“亲代真菌细胞”、“亲代菌株”、“亲代真菌菌株”、“丝状真菌细胞的亲代菌株”、“参考菌株”等的短语可以互换使用,并且是指“未修饰的”亲代丝状真菌细胞。例如,“丝状真菌细胞的亲代菌株”是指如下丝状真菌的任何细胞或菌株,其中“亲代”细胞的基因组被修饰(例如,通过引入亲代细胞中的遗传修饰)以产生丝状真菌细胞的变体(子代)菌株,使得“亲代”和“子代”细胞不同。
如本文所用,诸如“变体细胞”、“子代细胞”、“变体菌株”、“子代菌株”、“变体或子代真菌菌株”、“丝状真菌细胞的变体或子代菌株”等的短语可以互换使用,并且是指衍生自(即,获自或可获自)丝状真菌细胞的亲代(或参考)菌株的丝状真菌细胞的经修饰的菌株,其中变体菌株包含亲代菌株中不存在的遗传修饰,因此,通过比较,“亲代”与“变体”菌株之间的表型差异可以归因于该遗传修饰。换句话说,除了“引入”变体菌株中的一种或多种遗传修饰之外,亲代与变体菌株在其他方面是同基因的。
因此,亲代和变体“菌株”可以被描述为具有某些特征,诸如遗传修饰、表达表型、形态表型等;然而,熟练的技术人员将理解,从技术上讲,是亲代或变体菌株的“细胞”具有此类特征,且为方便起见提及“菌株”。
如本文所用,术语“野生型”和“天然的”可互换使用,并是指天然发现的基因、蛋白、蛋白混合物或菌株。
如本文所用,编码目的蛋白的“内源丝状真菌基因”包括但不限于如本领域技术人员所已知和理解的编码糖苷水解酶(GH)家族酶(例如像EC No.3.2.1.1-3.2.1.206)的内源基因,编码蛋白酶的内源基因、编码酯酶的内源基因、编码脂肪酶的内源基因等。
如本文所用,短语“木质纤维素降解酶”、“纤维素酶(cellulase enzyme)”和“纤维素酶(cellulase)”可互换使用,并且包括糖苷水解酶(GH)诸如纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶,这些酶水解纤维素(半纤维素)的β-(1,4)-连接的糖苷键以产生葡萄糖。
在某些实施例中,纤维二糖水解酶包括归类于酶委员会编号(EC 3.2.1.91)的酶,内切葡聚糖酶包括归类于EC 3.2.1.4的酶,内切-β-1,4-木聚糖酶包括归类于EC 3.2.1.8的酶、β-木糖苷酶包括归类于EC 3.2.1.37的酶,并且β-葡糖苷酶包括归类于EC 3.2.1.21的酶。
如本文所用,“内切葡聚糖酶”蛋白可以缩写为“EG”,“纤维二糖水解酶”蛋白可以缩写为“CBH”,“β-葡糖苷酶”蛋白可以缩写为“BG”,并且“木聚糖酶”蛋白可以缩写为“XYL”。因此,如本文所用,编码EG蛋白的基因(或ORF)可以缩写为“eg”,编码CBH蛋白的基因(或ORF)可以缩写为“cbh”,编码BG蛋白的基因(或ORF)可以缩写为“bg”,并且编码XYL蛋白的基因(或ORF)可以缩写为“xyl”。
在某些实施例中,用于如本文所述操作、构建和使用的丝状真菌细胞通常来自盘菌亚门,特别是具有营养菌丝状态并且包含GEF1基因或其同源物的真菌。
如本文所用,“编码天然GEF1蛋白的基因或多核苷酸”与SEQ ID NO:1具有序列同源性。在某些实施例中,编码天然GEF1蛋白的基因或多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有约70%至100%序列同一性。在某些其他实施例中,编码天然GEF1蛋白的基因或多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有约70%至100%序列同一性,并编码与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的GEF1结构域。在某些其他实施例中,编码天然GEF1蛋白的基因或多核苷酸在中等至严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列杂交。
在某些实施例中,上游(5′)纤维素酶基因启动子序列包括但不限于纤维二糖水解酶(cbh)基因启动子序列、内切葡聚糖酶(eg)基因启动子序列、β-葡糖苷酶(bg)基因启动子序列、木聚糖酶(xyl)基因启动子序列等。
如本文所用,“编码天然木霉属物种GEF1蛋白的可读框(ORF)核酸序列”与SEQ IDNO:3的ORF核酸序列具有序列同源性。在某些其他实施例中,ORF核酸序列编码与SEQ IDNO:2具有约70%至100%序列同一性的天然木霉属物种GEF1蛋白。在其他实施例中,ORF核酸序列编码与SEQ ID NO:2具有约70%至100%序列同一性的天然木霉属物种GEF1蛋白,并包含与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的GEF1结构域。在某些其他实施例中,编码天然GEF1蛋白的ORF在中等至严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列杂交。
如本文所用,使用SEQ ID NO:2的天然木霉属物种GEF1蛋白的氨基酸残基编号(位置)对“给定氨基酸序列”中氨基酸残基的“位置”进行编号。例如,图3A呈现天然木霉属物种GEF1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。因此,短语诸如“在对应于SEQ ID NO:2的位置1,244的序列位置处包含谷氨酸(E;Glu)残基”或“在对应于SEQ ID NO:2的位置1,242-1,454的序列位置处包含GEF1结构域”,天然(木霉属物种)GEF1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)用作参考(亲代)蛋白序列。例如,如图3A所示,可以使用本文所述的比对算法(和/或本领域技术人员已知的比对算法)将本文所述的给定氨基酸序列与天然木霉属物种GEF1蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)比对,并且给定氨基酸序列中与天然序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可以方便地通过参考GEF1序列中的对应氨基酸残基来编号。
同样,为了与木霉属物种GEF1蛋白(SEQ ID NO:2)的一级(1°)序列建立序列同源性或序列同一性,本领域技术人员可以使用本领域技术人员已知的序列比对算法、软件及其方法容易地将SEQ ID NO:2的一级序列与一种或多种候选GEF1蛋白同源物/直系同源物序列进行比较。因此,在比对保守残基,允许进行必要的插入和缺失以维持比对(即,避免通过任意缺失和插入消除保守残基)后,定义了等效于候选丝状真菌GEF1蛋白一级序列中特定氨基酸的残基。保守残基的比对优选应该保留此类残基的100%。然而,大于98%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、50%或至少45%的保守残基的比对也足以定义等效残基。
如本文所用,使名为“T4”的木霉属菌株在选择性条件下连续繁殖以鉴定和分离其能够进行高温蛋白质产生而不会不利地影响比生产率(Qp)的突变体菌株。
如本文所用,在选择性温度下鉴定并分离到名为“T4-E1”(即,衍生自亲代‘T4’菌株)的突变体木霉属菌株,其中相对于T4菌株在25℃下的比生产率(Qp),T4-E1突变体菌株在28℃下具有类似Qp。
如本文所用,名为“T4-ΔRho#22D”的变体木霉属菌株衍生自T4亲代菌株,其中变体T4-ΔRho#22D菌株包含在Cas9切割位点(TS3)引入的pyr2标记基因,从而破坏GEF1编码序列。
如本文所用,名为“t-ATV84”的木霉属菌株包含编码DXST内切葡聚糖酶的大孢圆孢霉(S.coccosporum)基因的3个拷贝,并包含编码CBHI、CBHII、EGI和EGII蛋白的天然纤维素酶基因的缺失(或破坏)。
如本文所用,名为“t-AWC88”的木霉属菌株衍生自t-ATV84菌株,并且还包含引入的GEF1基因的破坏。
如本文所用,大孢圆孢霉(Staphylotrichum coccosporum)内切葡聚糖酶“STCE1”描述于美国专利号7,595,182(通过引用以其全文并入本文)中。
如本文所用,“大孢圆孢霉STCE1内切葡聚糖酶”也可以称为“大孢圆孢霉DXST内切葡聚糖酶”,因此,术语STCE1和DXST可互换的。在某些实施例中,将编码DXST蛋白的多核苷酸序列置于启动子诸如cbhI的控制下。
如本文所用,短语“升高的发酵(培养)温度”为大于25℃的发酵温度。在某些实施例中,升高的发酵温度为至少约25.5℃至约28℃。在某些实施例中,升高的发酵温度为至少约25.1℃至25.9℃。
如本文所用,术语“多肽”和“蛋白质”(和/或其各自的复数形式)可互换地用来指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。聚合物可以是线性的或支化的,它可以包含经修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物;例如,通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰,诸如与标记组分缀合。该定义中还包括,例如,含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如,非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用,术语“衍生多肽/蛋白”是指通过以下衍生的或可衍生的蛋白:向一个或多个N末端和C末端中的一个或两个添加一个或多个氨基酸,在氨基酸序列中一个或多个不同位点处取代一个或多个氨基酸,在蛋白的一端或两端或者在氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸,和/或在氨基酸序列中一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸。蛋白衍生物的制备可以通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、将该DNA序列转化到合适的宿主中、以及表达修饰的DNA序列以形成衍生蛋白来实现。
相关(和衍生)蛋白包括“变体蛋白”。变体蛋白通过在少量氨基酸残基处的取代、缺失和/或插入而不同于参考/亲代蛋白(例如,野生型蛋白)。变体与亲代蛋白之间的不同氨基酸残基的数量可以是一个或多个,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或更多个氨基酸残基。变体蛋白与参考蛋白可以共有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%、或更多氨基酸序列同一性。变体蛋白也可以与参考蛋白在选择的基序、结构域、表位、保守区域等方面不同。
如本文所用,术语“类似序列”是指蛋白质内提供与目的蛋白(即,典型地目的原始蛋白)类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如,在含有α-螺旋或β-折叠结构的表位区域中,类似序列中的置换氨基酸优选保持相同的特定结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中,开发了类似序列以使得氨基酸的置换产生显示类似或改进功能的变体酶。在一些实施例中,目的蛋白中氨基酸的三级结构和/或保守残基位于目的区段或片段处或附近。因此,当目的区段或片段含有例如α-螺旋或β-折叠结构时,置换氨基酸优选维持所述特定结构。
如本文所用,术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有类似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在表示同源物必定在进化上相关。因此,其旨在表示所述术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或相应(即,在结构和功能方面)的一种或多种蛋白。在一些实施例中,期望鉴别与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何合适的方法确定(参见,例如,Smith和Waterman,1981;Needleman和Wunsch,1970;Pearson和Lipman,1988;威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(威斯康星州麦迪逊市的遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的程序,诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA;和Devereux等人,1984)。
例如,PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)的渐进比对方法的简化。该方法类似于Higgins和Sharp(1989)所述的方法。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重,为0.10的默认空位长度权重,以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是Altschul等人,1990和Karlin等人,1993描述的BLAST算法。一种特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见,例如,Altschul等人,1996)。参数“W”、“T”和“X”决定了该比对的灵敏度和速度。该BLAST程序使用字长(W)11、BLOSUM62得分矩阵(参见,例如,Henikoff和Henikoff,1989)比对(B)50、期望值(E)10、M′5、N′-4以及两条链的比较作为默认值。
如本文所用,在至少两种核酸或多肽的情况下,短语“基本上类似”和“基本上同一”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即,野生型)序列相比具有至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性、或甚至至少约99%同一性、或更高同一性的序列。可以使用已知的程序(诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL)使用标准参数确定序列同一性。(参见,例如,Altschul等人,1990;Henikoff等人,1989;Karlin等人,1993;和Higgins等人,1988)。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开地获得。此外,可以使用FASTA搜索数据库(Pearson等人,1988)。两种多肽基本上同一的一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地,差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此,多肽与第二多肽基本上同一,例如,其中两个肽的区别仅在于保守取代。两个核酸序列基本上同一的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如,在中等至高严格性的范围内)彼此杂交。
如本文所用,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分,以及基因组或合成起点的DNA、cDNA和RNA,其可能是双链或单链,无论代表有义或反义链。
如本文所用,术语“表达”是指衍生自本公开的核酸分子的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此,术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,这些步骤包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。
如本文所用,组合术语“表达/产生”,如诸如“丝状真菌细胞的变体菌株表达/产生‘增加’量的目的蛋白(POI)”(即,相对于亲代细胞)的短语中所用,所述术语“表达/产生”意欲包括参与在本公开的此类变体丝状真菌菌株中表达和产生蛋白质的任何步骤。
在某些实施例中,编码具有“序列同源性”的天然GEF1蛋白的基因、多核苷酸或核酸序列是指如下DNA或RNA(核酸)序列,其与(所比较的)相应核酸序列具有微小序列变化,并保留了与(所比较的)相应核酸序列基本相同的生物学功能。例如,在某些实施例中,与编码天然GEF1蛋白的基因、多核苷酸或核酸具有相当大序列同源性的核酸序列如本文中所述通过鉴别编码的基因产物(天然GEF1蛋白)来评定。
在某些其他实施例中,使用核酸杂交方法确定/鉴别与编码天然GEF1蛋白的基因、多核苷酸或核酸具有序列同源性的基因、多核苷酸或核酸序列。例如,在某些实施例中,与编码天然GEF1蛋白(例如,SEQ ID NO:2)的基因具有相当大序列同源性的DNA/RNA序列通过此种DNA/RNA序列在严格条件下与本公开的指定核酸序列杂交的能力来鉴别。
如本文所用,“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件,在所述条件下彼此显著同一或同源的核苷酸序列保持彼此杂交。此类严格条件是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Ausubel等人,1995;Sambrook等人,1989)。例如,在某些实施例中,严格杂交条件的非限制性实例包括在约65℃-70℃下在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交(或在约42℃-50℃下在4×SSC加50%甲酰胺中杂交),随后在约65℃-70℃下用1×SSC洗涤一次或多次。同样,高度严格杂交条件的非限制性实例包括在约65℃-70℃下在1×SSC中杂交(或在约42℃-50℃下在4×SSC加50%甲酰胺中杂交),随后在约65℃-70℃下用0.3×SSC洗涤一次或多次。因此,高度严格杂交条件包括在约50℃-60℃下在4×SSC中杂交(或可替代地,在约40℃-45℃下在6×SSC加50%甲酰胺中杂交),随后在约50℃-60℃下用2×SSC洗涤一次或多次。本公开还旨在涵盖在上述值中间的范围,例如在65℃-70℃下或在42℃-50℃下。在某些实施例中,在杂交和洗涤缓冲液中可以用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl,10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA,pH 7.4)替代SSC(1×SSPE为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠);杂交完成后,每次进行洗涤15分钟。预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的解链温度(Tm)低5℃-10℃,其中Tm根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体,Tm(℃)=2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度在18个与49个碱基对之间的杂交体,Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N),其中N是杂交体中的碱基数,并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC的[Na+]=0.165M)。本领域技术人员也将认识到,可以将其他试剂添加至杂交和/或洗涤缓冲液中以减少核酸分子与膜例如硝酸纤维素或尼龙膜的非特异性杂交,这些其他试剂包括但不限于阻断剂(例如,BSA或鲑鱼或鲱鱼精子载体DNA)、去污剂(例如,SDS)、螯合剂(例如,EDTA)、Ficoll、PVP等。特别地,当使用尼龙膜时,严格杂交条件的另一个非限制性实例是在约65℃下在0.25-0.5M NaH2PO4、7%SDS中杂交,随后在65℃下在0.02M NaH2PO4、1%SDS中,或可替代地在0.2×SSC、1%SDS中洗涤一次或多次(参见,例如,Church和Gilbert,1984)。
因此,如上文总体上阐述,本公开的某些实施例涉及丝状真菌细胞的变体菌株,所述变体菌株包含编码天然GEF1蛋白的基因的遗传修饰。如本文所用,术语“修饰”和“遗传修饰”可以互换使用,并且包括但不限于:(a)基因中一个或多个核苷酸的引入、取代或去除,或基因转录或翻译所需的调控元件中一个或多个核苷酸的引入、取代或去除,(b)基因破坏,(c)基因转化,(d)基因缺失,(e)基因(例如,反义RNA、siRNA、miRNA等)的下调,(f)本文公开的任何一个或多个基因的特异性诱变(包括但不限于基于CRISPR/Cas9的诱变)和/或(g)随机诱变。
如本文所用,包含遗传修饰的丝状真菌的变体菌株包括但不限于编码本文公开的天然GEF1蛋白的基因的遗传修饰。因此,如下文另外详细描述,各种分子生物学方法是本领域技术人员熟知的并且可用于产生/构建丝状真菌细胞的此类变体菌株。
如本文所用,“编码蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的引入、取代或去除”,此类遗传修饰包括基因编码序列(即,外显子)和非编码间插(内含子)序列。
如本文所用,“基因的破坏”、“基因破坏”、“基因的灭活”和“基因灭活”可互换地使用,并且广泛地指基本上破坏/灭活靶基因的任何遗传修饰。基因破坏的示例性方法包括但不限于基因任何部分(包括多肽编码序列(CDS)、启动子、增强子或另外的调控元件)的完全或部分缺失或其诱变,其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒置及其任何组合和变化,其破坏/灭活一个或多个靶基因并基本上减少或阻止功能基因产物的表达/产生。在本公开的某些实施例中,此类基因破坏阻止宿主细胞表达/产生编码的lov基因产物。
在某些实施例中,使用已建立的基因编辑技术遗传修饰了编码天然GEF1蛋白的基因、多核苷酸或核酸序列,所述技术诸如CRISPR/Cas9基因编辑、锌指核酸酶(ZFN)基因编辑、转录活化因子样效应子核酸酶编辑(TALEN)、归巢(大型)核酸酶编辑等。
在其他实施例中,丝状真菌的变体菌株通过基因转化的方法(例如,参见Iglesias和Trautner,1983)构建(即,遗传修饰)。
在其他实施例中,通过如下方法对由本公开的真菌细胞表达/产生的目的蛋白(例如,内源POI或异源POI)进行检测、鉴别、测量、测定等:蛋白定量方法、基因转录方法、mRNA翻译方法等,包括但不限于蛋白迁移/迁移率(SDS-PAGE)、质谱、HPLC、尺寸排阻、超速离心沉降速度分析、转录组学、蛋白组学、荧光标签、表位标签、荧光蛋白(GFP、RFP等)嵌合体/杂交体等。
如本文所用,功能上和/或结构上类似的蛋白被认为是“相关蛋白”。此类相关的蛋白可以衍生自不同属和/或物种的生物体,或甚至不同纲的生物体(例如,细菌和真菌)。相关的蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物和/或直系同源物。
如本文所用,术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。通常,编码序列位于启动子序列3'(下游)。启动子可以全部衍生自天然基因,或者由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成,或者甚至包含合成的核酸区段。本领域技术人员应该理解,不同启动子可以在不同细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件或生理条件来指导基因表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。还认识到,由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切边界,不同长度的DNA片段可具有同一的启动子活性。
如本文所用,术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合,这样使得一个核酸片段的功能受到另一个影响。例如,当能够实现该编码序列的表达(即,编码序列在启动子的转录控制下)时,启动子与该编码序列(例如ORF)可操作地连接。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接到调控序列上。当核酸置于与另一核酸序列的功能关系时,该核酸与另一核酸序列“可操作地连接”。例如,如果编码分泌性前导子(即,信号肽)的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,那么所述编码分泌性前导子的DNA可操作地连接到所述多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录,那么该启动子或增强子可操作地连接到该序列;或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译,那么该核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。通常,“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的,并且在分泌性前导子的情况下,是连续的并且处于阅读相中。然而,增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在,则按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所定义,“合适的调节序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列),并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
如本文中所定义,如短语诸如“向真菌细胞中引入”至少一种多核苷酸可读框(ORF)或其基因或其载体中所使用的术语“引入”,包括本领域中已知用于将多核苷酸引入细胞中的方法,包括但不限于原生质体融合、自然或人工转化(例如,氯化钙、电穿孔)、转导、转染等。
如本文所用,“转化的”或“转化”指通过使用重组DNA技术转化的细胞。转化典型地通过将一个或多个核苷酸序列(例如,多核苷酸、ORF或基因)插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即,在待转化的细胞中不是天然存在的序列)。
如本文所用,“转化”是指将外源DNA引入宿主细胞中,使得DNA保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。如本文所用,“转化DNA”、“转化序列”和“DNA构建体”是指用于将序列引入宿主细胞中的DNA。可以通过PCR或任何其他合适的技术在体外产生DNA。在一些实施例中,转化DNA包含输入序列,而在其他实施例中,其还包含同源盒侧翼的输入序列。在又另一个实施例中,转化DNA包含其他非同源序列,添加到末端(即,填充序列或侧翼)。末端可以闭合,这样使得转化DNA形成闭环,诸如像,插入载体中。
如本文所用,“输入序列”是指引入真菌细胞染色体中的DNA序列。在一些实施例中,输入序列是DNA构建体的一部分。在其他实施例中,输入序列编码一种或多种目的蛋白。在一些实施例中,输入序列包含可以或可以不存在于待转化的细胞的基因组中的序列(即,它可以是同源或异源序列)。在一些实施例中,输入序列编码一种或多种目的蛋白、基因、和/或突变的或经修饰的基因。在可替代的实施例中,输入序列编码功能性野生型基因或操纵子、功能性突变体基因或操纵子、或非功能性基因或操纵子。在一些实施例中,输入序列是插入基因中以破坏基因功能的非功能序列。在另一实施例中,输入序列包括选择性标记。在另一个实施例中,输入序列包括两个同源盒。
如本文所用,“同源盒”是指与真菌细胞染色体中的序列同源的核酸序列。更具体地,根据本发明,同源盒是上游或下游区,该上游或下游区与被缺失、破坏、灭活的、下调等的基因或基因的一部分的直接侧翼编码区具有约80%与100%之间的序列同一性、约90%与100%之间的序列同一性、或约95%与100%之间的序列同一性。这些序列指导了在真菌细胞染色体中,DNA构建体的整合位置,并且指导了真菌细胞染色体的哪部分被输入序列替代。尽管不欲限制本公开,但同源盒可以包括约1个碱基对(bp)至200千碱基(kb)。优选地,同源盒包括约1bp与10.0kb之间;1bp与5.0kb之间;1bp与2.5kb之间;1bp与1.0kb之间和0.25kb与2.5kb之间。同源盒还可以包括约10.0kb、5.0kb、2.5kb、2.0kb、1.5kb、1.0kb、0.5kb、0.25kb和0.1kb。在一些实施例中,选择性标记的5'和3'端在同源盒侧翼,其中所述同源盒包含紧密位于基因的编码区侧翼的核酸序列。
如本文所用,术语“编码可选择性标记的核苷酸序列”是指核苷酸序列,所述核苷酸序列能够在宿主细胞中表达并且其中可选择性标记的表达赋予含有表达的基因的细胞在不存在对应的选择性试剂或缺乏必需营养素的情况下生长的能力。
如本文所用,术语“可选择性标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如,基因),其允许容易地选择含有载体的那些宿主。此类可选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂。因此,术语“可选择标记”是指提供宿主细胞已经摄取了输入性目的DNA或者已经发生了一些其他反应的指示的基因。典型地,可选择性标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势的基因,以允许在转化期间将包含外源DNA的细胞与未接受任何外源序列的细胞区分开来。
如本文所定义,宿主细胞“基因组”、真菌细胞“基因组”或丝状真菌细胞“基因组”包括染色体基因和染色体外基因。
如本文所用,术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件,其通常携带典型地不是细胞的中心代谢的一部分的基因,并且通常呈环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列,其中许多核苷酸序列已连接或重组到单一结构中,该单一结构能够将针对选定基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当3′未翻译序列引入到细胞中。
如本文所用,术语“载体”是指可以在细胞中复制(传播)并且可以携带新基因或DNA片段(例如,“输入序列”)到细胞中的任何核酸。因此,该术语是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。载体包括病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体诸如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、PLAC(植物人工染色体)等,其为“附加体”(即,自主复制)或可以整合到宿主细胞的染色体中。
如本文所用,“转化盒”是指包含基因(或其ORF),并且具有除促进特定宿主细胞的转化的基因外的元件的特定载体。
如本文所用,“表达载体”是指具有在细胞中并入并表达异源DNA的能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购获得并且是本领域技术人员已知的。适当的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所用,术语“表达盒”和“表达载体”是指重组或合成生成的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件(即,这些是载体或载体元件,如上所述)的核酸构建体。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地,表达载体的重组表达盒部分包括(除了其他序列之外)待转录的核酸序列和启动子。在一些实施例中,DNA构建体还包括一系列允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。在某些实施例中,本公开的DNA构建体包含如本文定义的选择性标记和灭活的染色体或基因或DNA区段。
如本文所用,“靶向载体”是如下载体,该载体包括与该靶向载体转化至其中的宿主细胞的染色体中的区同源的多核苷酸序列,并且该载体可以驱动在该区处的同源重组。例如,靶向载体可用于通过同源重组将遗传修饰引入宿主细胞的染色体中。在一些实施例中,靶向载体包含其他非同源序列,例如添加到末端的其他非同源序列(即,填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合,这样使得靶向载体形成闭环,诸如像,插入载体中。
如本文所用,包含“蛋白质生产率提高表型”的变体细胞(或菌株)包括但不限于包含体积生产率提高/增加的变体细胞(或菌株)、包含碳转化效率提高/增加的变体细胞(或菌株)、蛋白质产率提高/增加的变体细胞(或菌株)、比蛋白质生产率提高/增加的变体细胞(或菌株)等。例如,在某些实施例中,包含蛋白质生产率提高表型的变体细胞或菌株每克供给糖表达/产生至少0.1%或更多的总蛋白(g)(相对于亲代菌株),其中供给糖可以在生产阶段期间(即,供给开始后)添加到发酵罐中的糖的质量表示。
如本文所定义,短语“蛋白质生产率提高表型”和“蛋白质生产率增加表型”可以互换使用。
如本文所用,当描述未修饰的(亲代)细胞相对于经修饰的(变体/子代)细胞的“蛋白质生产率提高/增加表型”时,应理解“亲代”和“变体”细胞在相同条件(例如,相同条件诸如培养基、温度、pH等)下生长/培养/发酵。类似地,当描述在未修饰的(亲代)细胞中“表达/产生”目的蛋白(POI)相对于在经修饰的(变体/子代)细胞中“表达/产生”相同POI时,应理解“亲代”和“变体”细胞在基本上相同条件(例如,相同条件诸如培养基、温度、pH等)下生长/培养/发酵。
如本文所用,“需氧发酵”是指在氧存在下生长。
如本文所用,术语“肉汤”、“细胞肉汤”、“发酵肉汤”和/或“培养肉汤”可以互换使用,并且总体上指液体(深层)培养中的(i)发酵(培养)培养基和(ii)细胞。
如本文所用,术语“细胞团”是指液体(深层)培养中存在的细胞组分(包括完整和裂解的细胞)。细胞团可以干细胞重量(DCW)或湿细胞重量(WCW)表示。
II.在升高的培养温度下包含蛋白质生产率提高表型的真菌菌株
如以下实例部分中总体上描述和阐述,申请人在选择性条件下连续繁殖名为T4的里氏木霉全纤维素酶菌株以鉴定和分离其能够进行高温蛋白质产生(即,不会不利地影响比生产率(Qp);例如,参见实例1)的突变体菌株。更特别地,在此类选择性条件(实例2)下鉴定和分离到名为“T4-E1”的突变体里氏木霉菌株,其中相对于在25℃下的亲代T4菌株,突变体T4-E1菌株在28℃下具有类似比生产率(表1)。申请人鉴定了T4-E1菌株中的突变基因,其中推断的所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2;PID:120482)包括与GEF1蛋白结构域(SEQ ID NO:5)同源的序列区域。如实例2中所详述,T4-E1菌株中的突变用过早终止密码子置换谷氨酸密码子(Glu;氨基酸第1,245位),从而在“GEF1结构域”起点附近截短了(GEF1)蛋白(例如,参见图3A天然序列与图3B C末端截短的序列)。
如本公开的实例3中所述,申请人还构建了衍生自T4亲代菌株的变体(经修饰的)木霉属菌株(名为“T4-ΔRho#22D”),其中变体T4-ΔRho#22D菌株包含在Cas9切割位点(TS3)引入的pyr2标记基因,从而破坏GEF1编码序列。例如,野生型(亲代)T4菌株、突变体T4-E1菌株和构建的变体T4-ΔRho#22D菌株的发酵罐(培养)性能如表1所呈现,其中相对于亲代T4菌株在25℃下的总蛋白生产速率,突变体T4-E1菌株和构建的变体T4-ΔRho#22D菌株在28℃下展现增加的总蛋白生产速率。
如实例4中另外描述,申请人构建了用编码大孢圆孢霉DXST(STCE1)内切葡聚糖酶的基因的拷贝转化的木霉属物种生产菌株。更特别地,名为“t-ATV84”的亲代木霉属DXST生产菌株用编码大孢圆孢霉DXST内切葡聚糖酶的基因的拷贝转化,并且还包含编码CBHI、CBHII、EGI和EGII蛋白的天然纤维素酶基因的缺失。同样,名为“t-AWC88”的变体(经修饰的)木霉属DXST生产菌株衍生自t-ATV84菌株,并且还包含引入的GEF1基因的破坏。例如,如表2所示,相对于包含天然GEF1基因的亲代菌株(t-ATV84)在25℃下产生的DXST内切葡聚糖酶的量,包含破坏的GEF1基因的变体木霉属菌株(t-AWC88)在25℃、26℃和27℃下展现出更高量的DXST内切葡聚糖酶。
III.分子生物学
如上文总体上阐述,本公开的某些实施例涉及包含蛋白质生产率提高表型的经修饰的丝状真菌菌株。在某些优选的实施例中,经修饰的(变体)丝状真菌菌株在升高的发酵(培养)温度下包含蛋白质生产率提高表型。在另一个实施例中,本公开涉及包含乙醇生产率提高表型的经修饰的酵母菌株。在某些优选的实施例中,经修饰的(变体)酵母菌株在升高的发酵(培养)温度下包含乙醇生产率提高表型。
因此,本公开的某些其他实施例涉及分子生物学、遗传修饰、多核苷酸、基因、ORF、载体、表达盒等。在某些实施例中,本公开涉及包含编码目的蛋白(POI)的基因或ORF的重组核酸(多核苷酸)。在某些实施例中,重组核酸(多核苷酸)包含编码POI的多核苷酸表达盒。
在某些实施例中,本公开的多核苷酸包含一种或多种可选择性标记。用于丝状真菌中的可选择性标记包括但不限于alsl、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤路径基因、色氨酸路径基因、胸苷激酶标记等。在一个特别实施例中,可选择性标记是pyr2,其组合物和使用方法通常阐述于PCT公开号WO2011/153449中。
使用转化丝状真菌和培养真菌的标准技术(这些标准技术是本领域技术人员所熟知的)来转化本公开的真菌宿主细胞。因此,将DNA构建体或载体引入真菌宿主细胞中包括如下技术,诸如:转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如,脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染)、用磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微粒高速轰击、基因枪或生物射弹转化、原生质体融合等。一般的转化技术是本领域已知的(参见,例如,Ausubel等人,1987,Sambrook等人,2001和2012,以及Campbell等人,1989)。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725;美国专利号6,268,328;Harkki等人,1991以及Harkki等人,1989中。还参考了Cao等人,(2000)的曲霉属菌株的转化。
通常,使用已经进行了渗透性处理的原生质体或细胞转化木霉属物种,典型地以105至107/mL、特别是2×106/mL的密度进行。将100μL体积的在适当溶液(例如1.2M山梨糖醇和50mM CaCl2)中的这些原生质体或细胞与期望DNA混合。通常,向摄取溶液中添加高浓度的聚乙二醇(PEG)。也可以将添加剂诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中以促进转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞(例如,参见美国专利号6,022,725和美国专利号6,268,328,两者均通过引用并入。
因此,本公开的方法和组合物通常依赖于重组遗传学领域中的常规技术。例如,在某些实施例中,将编码目的蛋白的异源基因或ORF引入丝状真菌(宿主)细胞中。在某些实施例中,典型地将异源基因或ORF克隆到中间载体中,然后转化到丝状真菌(宿主)细胞中用于复制和/或表达。这些中间载体可以是原核载体,诸如像质粒或穿梭载体。在某些实施例中,异源基因或ORF的表达处于其天然启动子的控制下。在其他实施例中,将异源基因或ORF的表达置于异源启动子的控制下,该异源启动子可以是异源组成型启动子或异源诱导型启动子。
本领域技术人员清楚的是可以通过替换、取代、添加或消除一个或多个核苷酸而不改变启动子的功能来修饰天然(自然)的启动子。本发明的实践涵盖但不受对启动子的这些改变的限制。
表达载体典型地含有转录单元或表达盒,该转录单元或表达盒含有表达异源序列所需的所有附加元件。例如,典型的表达盒含有与编码目的蛋白的异源核酸序列可操作地连接的5′启动子,并且还可以包含转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止序列所需的序列信号。该盒的附加元件可以包括增强子,并且如果使用基因组DNA作为结构基因,可以包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列之外,该表达盒还可以含有结构基因的录终止区下游转以提供有效的终止。该终止区可以从与启动子序列相同的基因获得或者可以从不同基因获得。尽管任何真菌终止子均可能在本发明中起作用,但优选的终止子包括:来自木霉属cbhI基因的终止子、来自构巢曲霉trpC基因的终止子(Yelton等人,1984;Mullaney等人,1985)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg等人,1984;Boel等人,1984)。
用于将遗传信息运送到细胞中的特定表达载体并不特别关键。可以使用用于在真核细胞或原核细胞中表达的常规载体中的任一种。标准细菌表达载体包括噬菌体λ和M13,以及质粒诸如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D,和融合表达系统,诸如MBP、GST和LacZ。也可以将表位标签例如c-myc添加到重组蛋白中以提供便利的分离方法。
可以包括在表达载体中的元件还可以是复制子,编码允许选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性的基因,或在质粒的非必需区中的允许插入异源序列的独特限制性位点。所选择的特定抗生素抗性基因也不是决定性的,因为本领域已知的许多抗性基因中的任一种都可以是合适的。优选地选择原核序列,使得它们不干扰DNA在里氏木霉中的复制或整合。
本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或一部分稳定整合到丝状真菌的基因组中。然而,还考虑了导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。可以使用多种标准转染方法来产生表达大量异源蛋白质的里氏木霉细胞系,因此,可以使用将外源核苷酸序列引入真菌宿主细胞中的任何已知程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体,以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他已知方法。还使用农杆菌(Agrobacterium)介导的转染方法,诸如美国专利号6,255,115中所述的转染方法。
将表达载体引入细胞中后,在有利于表达基因的条件下培养转化的细胞。大批转化细胞可以如本文所述进行培养。最后,使用标准技术从培养物回收蛋白产物。因此,本公开提供了期望目的蛋白的表达和提高的生产,特别是在本文所述的升高的发酵(培养)温度下。
在某些其他实施例中,本公开涉及包含蛋白质生产率提高表型的经遗传修饰的丝状真菌菌株(细胞)。在特定实施例中,本公开的经修饰的真菌菌株在升高的发酵温度下包含蛋白质生产率提高表型。例如,在某些实施例中,丝状真菌的变体菌株包含对编码GEF1蛋白的基因的遗传修饰,其中该遗传修饰包括但不限于:(a)引入、取代或去除GEF1基因(或其ORF)中的一个或多个核苷酸,或者引入、取代或去除GEF1基因(或其ORF)的转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个核苷酸,(b)基因破坏,(c)基因转化,(d)基因缺失,(e)基因下调,(f)特异性诱变和/或(g)随机诱变编码与SEQ ID NO:2具有序列同一性的GEF1蛋白的基因。
因此,在某些实施例中,通过基因缺失消除GEF1蛋白的表达/产生来构建包含遗传修饰的丝状真菌的变体菌株。
在其他实施例中,通过部分基因缺失或基因破坏以消除天然GEF1蛋白的表达/产生来构建包含遗传修饰的丝状真菌的变体菌株。例如,如下文在实例3(图3B)中所述,通过引入过早终止密码子(即,该过早终止密码子在C末端截短GEF1蛋白;SEQ ID NO:4)灭活亲代丝状真菌菌株中的天然GEF1基因,得到在25℃下发酵时相对于亲代细胞包含蛋白质生产率提高表型的变体(子代)菌株。更特别地,当亲代(T4)和子代(T4-ΔRho#22D)菌株在升高的发酵温度(28℃)下发酵时,变体(子代)菌株相对于亲代菌株展现出蛋白质生产率增加表型(表1,蛋白质生产速率)。
因此,在某些实施例中,经修饰的丝状真菌菌株包含GEF1基因的部分缺失,其中部分缺失包括GEF1基因编码序列的任何部分的部分缺失,其中此种变体菌株包含蛋白质生产率提高表型。因此,在某些其他实施例中,此类变体菌株不表达/产生GEF1蛋白,或此类变体菌株相对于亲代菌株表达/产生减少量的GEF1蛋白。
因此,如本文总体上阐述和上文总体上描述,本领域技术人员可以通过参考本文公开的一种或多种核酸序列和/或蛋白质序列容易地进行一种或多种遗传修饰并构建其变体丝状真菌菌株。
例如,基因缺失技术能够部分或完全去除基因,从而消除或减少蛋白质的表达/产生,和/或从而消除或减少所编码蛋白质的表达/产生(例如,GEF1)。在此类方法中,基因的缺失可以通过使用整合质粒/载体进行同源重组来完成,所述整合质粒/载体已构建成连续含有基因侧翼的5′和3′区。可以将连续的5′和3′区例如在整合质粒/载体上在与可选择标记结合下引入丝状真菌细胞中以允许质粒整合在细胞中。
在其他实施例中,丝状真菌的变体菌株包含破坏或灭活编码该蛋白质(例如,GEF1)的基因的遗传修饰。基因破坏/灭活的示例性方法包括破坏基因的任何部分(例如,参见,图1-图3),包括多肽编码序列(CDS)、启动子、增强子或另一种调控元件,所述破坏包括取代、插入、缺失、倒置及其组合和其变体。基因破坏技术的非限制性实例包括向本公开的一个或多个基因中插入(整合)含有与所述(例如,GEF1)基因同源的核酸片段的整合质粒,这将产生同源区域的重复,并在重复区域之间掺入(插入)载体DNA。在某些其他非限制性实例中,基因破坏技术包括向基因(例如,编码GEF1蛋白的基因)中插入含有与所述(例如,GEF1)基因同源的核酸片段的整合质粒,这将产生同源区域的重复,并在重复区域之间掺入(插入)载体DNA,其中插入的载体DNA将例如GEF1基因的启动子与GEF1蛋白编码区分开,或中断(破坏)GEF1基因的编码或非编码序列,从而得到蛋白质生产率提高表型。因此,破坏性构建体可以是伴有与GEF1基因同源的5′和3′区的可选择标记基因(例如,pyr2)。可选择标记使得能够鉴别含有破坏的基因的转化体。因此,在某些实施例中,基因破坏包括如下基因控制元件的修饰,诸如启动子、核糖体结合位点(RBS)、非翻译区(UTR)、密码子改变等。
在其他实施例中,通过引入、取代或去除基因或其转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个核苷酸来构建(即,遗传修饰)丝状真菌的变体菌株。例如,可以插入或去除核苷酸,以便引入过早终止密码子,去除起始密码子或使可读框(ORF)移码。此种修饰可以根据本领域中已知的方法,通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成(例如,参见Botstein和Shortle,1985;Lo等人,1985;Higuchi等人,1988;Shimada,1996;Ho等人,1989;Horton等人,1989以及Sarkar和Sommer,1990)。
在另一个实施例中,丝状真菌的变体菌株通过基因转化的方法(例如,参见Iglesias和Trautner,1983)构建。例如,在基因转化方法中,将对应于靶基因的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列,然后将所述核酸序列转化到亲代细胞中以产生包含缺陷基因的变体细胞。通过同源重组,缺陷核酸序列将内源基因替代。可能期望的是,缺陷基因或基因片段也编码可用于选择含有缺陷基因的转化体的标记。例如,可以将缺陷基因与可选择标记缔和引入非复制或温度敏感的质粒上。通过在不允许质粒复制的条件下选择标记来实现质粒整合的选择。通过检查菌落损失可选择性标记和获得突变型基因来实现导致基因替代的第二重组事件的选择(Perego,1993)。
在其他实施例中,丝状真菌的变体菌株通过建立的反义(基因沉默)技术,使用与GEF1基因的核酸序列互补的核苷酸序列来构建(Parish和Stoker,1997)。更具体地,可以通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来减少(下调)或消除丝状真菌菌株的基因的表达,该核苷酸序列在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下,由此降低或消除了所翻译的蛋白的量。此类反义方法包括但不限于RNA干扰(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸等,所有这些都是本领域技术人员熟知的。
在其他实施例中,使用本领域中熟知的方法(包括但不限于化学诱变和转座(参见,例如,Youngman等人,1983)),通过随机或特异性诱变构建丝状真菌的变体菌株。可以通过对亲代细胞进行诱变并筛选其中GEF1基因的表达已经减少或消除的突变体细胞来进行基因的修饰。诱变可以是特异性或随机的,可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行、通过使用合适的寡核苷酸进行或通过将所述DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外,诱变可通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时,典型地通过如下方法来进行诱变:在合适的条件下在选择的诱变剂的存在下孵育待诱变的亲代细胞,并选择表现出基因表达降低或无基因表达的突变体细胞。
在某些其他实施例中,借助于位点特异性基因编辑技术构建丝状真菌的变体菌株。例如,在某些实施例中,通过使用转录活化因子如内切核酸酶(TALEN)、锌指核酸内切酶(ZFN)、归巢(大型)核酸内切酶等来构建(即,遗传修饰)丝状真菌的变体菌株。更特别地,借助于ZFN基因编辑、TALEN基因编辑、归巢(大型)内切核酸酶等对基因中待修饰的部分(例如,编码区、非编码区、前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子、转录活化因子或表达编码区所要的其他调控元件)进行遗传修饰,这些修饰方法是本领域技术人员熟知并且可以使用的。
在某些其他实施例中,借助于CRISPR/Cas9编辑(例如,参见本文的实例)构建丝状真菌的变体菌株。更具体地,本领域中描述了并且熟知用CRISPR/Cas9系统进行真菌基因组修饰的组合物和方法(例如,参见,PCT公开号:WO 2016/100571、WO 2016/100568、WO 2016/100272、WO 2016/100562等)。因此,编码GEF1蛋白的基因可以借助于核酸指导的内切核酸酶破坏、缺失、突变或以其他方式进行遗传修饰,所述核酸指导的内切核酸酶通过结合指导RNA(例如,Cas9)或指导DNA(例如,NgAgo)找到其靶DNA,这将内切核酸酶募集到DNA上的靶序列上,其中该内切核酸酶可以在DNA中产生单链或双链断裂。此靶向DNA断裂成为DNA修复的底物,并且可以与提供的编辑模板重组以破坏或缺失所述基因。例如,编码核酸指导的内切核酸酶的基因(例如,来自化脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9或编码Cas9核酸酶的密码子优化的基因)与丝状真菌细胞中的活性启动子和丝状真菌细胞中的活性终止子可操作地连接,从而产生丝状真菌Cas9表达盒。同样地,本领域技术人员容易鉴定目的基因特有的一个或多个靶位点。
例如,为了构造编码gRNA的针对目的基因内的靶位点的DNA构建体,可变的靶向结构域(VT)将包含为(PAM)前间区序列邻近基序(TGG)5′的靶位点的核苷酸,所述核苷酸与编码化脓链球菌Cas9的Cas9内切核酸酶识别结构域(CER)的DNA融合。将编码VT结构域的DNA和编码CER结构域的DNA组合,从而产生编码gRNA的DNA。因此,通过将编码gRNA的DNA可操作地连接到丝状真菌细胞中的活性启动子和丝状真菌细胞中的活性终止子来产生gRNA的丝状真菌表达盒。
在某些实施例中,由核酸内切酶诱导的DNA断裂用输入序列修复/替代。例如,为了精确修复由上述Cas9表达盒和gRNA表达盒生成的DNA断裂,提供核苷酸编辑模板,使得细胞的DNA修复机制可以利用编辑模板。例如,靶向基因的约500bp 5′可以与靶向基因的约500bp 3′融合以产生编辑模板,所述模板由丝状真菌宿主的机构用于修复由RGEN(RNA指导的内切核酸酶)产生的DNA断裂。
可以使用许多不同的方法(例如,原生质体融合、电穿孔、自然感受态或诱导感受态)将Cas9表达盒、gRNA表达盒和编辑模板共同递送至丝状真菌细胞。通过用正向和反向引物扩增靶基因座,通过PCR来筛选转化的细胞。这些引物可以扩增野生型基因座或已经由RGEN编辑的经修饰的基因座。然后使用测序引物对这些片段进行测序以鉴定编辑的菌落。
可以对本公开的编码GEF1蛋白的基因进行遗传修饰的另一种方式是通过改变目的基因的表达水平。例如,此类核苷酸指导的内切核酸酶的核酸酶缺陷变体(例如,Cas9D10A、N863A或Cas9 D10A、H840A)可以用于通过增强或拮抗靶基因的转录来调节基因表达水平。这些Cas9变体对蛋白序列中存在的所有核酸酶结构域均无活性,但保留了RNA指导的DNA结合活性(即,这些Cas9变体在与同源靶位点结合时不能切割DNA的任一条链)。因此,核酸酶缺陷蛋白(即,Cas9变体)当与丝状真菌gRNA表达盒组合时可以表达为丝状真菌表达盒,使得该Cas9变体蛋白针对细胞内的特定靶序列。Cas9(变体)蛋白与特定基因靶位点的结合可以阻断转录机构在细胞DNA上的结合或移动,从而减少产生的基因产物的量。因此,使用此方法可以使本文公开的任何基因靶向降低的基因表达。通过使用诸如RNAseq的方法,可以在含有核酸酶缺陷型Cas9表达盒和一个或多个gRNA表达盒的细胞中监测基因沉默。
V.目的蛋白
如前述部分中简要陈述,本发明的菌株和方法可用于在丝状真菌的深层培养物中生产商业上重要的蛋白质。本公开的目的蛋白(POI)可以是任何内源或异源蛋白质,并且它可以是此种POI的变体。该蛋白可以含有一个或多个二硫桥,或者是功能形式为单体或多聚体的蛋白,即,该蛋白具有四级结构并且由多个同一(同源的)或不同一的(异源的)亚基构成,其中POI或其变体POI优选是具有目的特性的POI。
在某些实施例中,丝状真菌的变体菌株相对于(未修饰的)亲代菌株表现出增加的蛋白质滴度,其中蛋白质滴度定义为每体积的蛋白质量(g/L)。例如,可以通过本领域已知的方法(例如,ELISA、HPLC、Bradford测定、LC/MS等)来测量滴度。因此,在某些实施例中,相比于未修饰的(亲代)细胞,丝状真菌的变体菌株包含至少约0.1%、至少约1%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多的蛋白质滴度增加。
在某些实施例中,丝状真菌的变体菌株相对于(未修饰的)亲代菌株表现出增加的体积生产率,其中体积生产率定义为发酵期间每公称体积(L)生物反应器每总发酵时间产生的蛋白质的量(g)。例如,可以通过本领域已知的方法(例如,ELISA、HPLC、Bradford测定、LC/MS等)来测定体积生产率。因此,在某些实施例中,与未修饰的(亲代)细胞相比,丝状真菌的变体菌株包含至少约0.1%、至少约1%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多的体积生产率增加。
在某些其他实施例中,丝状真菌的变体菌株表现出增加的总蛋白产率,其中总蛋白产率定义为相对于(未修饰的)亲代菌株每克碳水化合物供给产生的蛋白质的量(g)。因此,如本文所用,可以使用以下等式计算总蛋白产率(g/g):
Yf=Tp/Tc
其中“Yf”是总蛋白产率(g/g),“Tp”是发酵期间产生的总蛋白(g),并且“Tc”是发酵(生物反应器)操作期间供给的总碳水化合物(g)。在某些实施例中,经修饰菌株的总蛋白产率的增加(即,相对于亲代菌株)为与未修饰的(亲代)细胞相比增加至少约0.1%、至少约1%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多。
总蛋白产率也可以描述为碳转换效率/碳产率,例如,以掺入总蛋白的供给的碳的百分比(%)的形式描述。因此,在某些实施例中,丝状真菌的变体菌株包含相对于(未修饰的)亲代菌株增加的碳转化效率(例如,供给的碳中掺入总蛋白中的百分比(%)的增加)。在某些实施例中,经修饰的菌株的碳转化效率的增加(即,相对于亲代菌株)为与未修饰的(亲代)细胞相比增加至少约0.1%、至少约1%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多。
在某些实施例中,丝状真菌的变体菌株相对于(未修饰的)亲代菌株表现出增加的POI的比生产率(Qp)。例如,比生产率(Qp)的检测是用于评价蛋白生产速率的合适方法。比生产率(Qp)可以使用以下等式确定:
“Qp=gP/gDCW·hr”
其中,“gP”是罐中生产的蛋白质的克数;“gDCW”是罐中的干细胞重量(DCW)的克数,并且“hr”是从接种时间开始的以小时表示的发酵时间,包括生产时间以及生长时间。因此,在某些实施例中,与未修饰的(亲代)细胞相比,丝状真菌的变体菌株包含至少约0.1%、至少约1%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更多的比生产率(Qp)增加。
在某些实施例中,POI或其变体POI选自由以下组成的组:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。
在某些实施例中,POI或其变体POI选自如下酶学委员会(EC)编号,该酶学委员会(EC)编号选自由EC 1、EC 2、EC 3、EC 4、EC 5或EC 6组成的组。
例如,在某些实施例中,POI是氧化还原酶,该氧化还原酶包括但不限于选自以下的EC1(氧化还原酶)酶:EC 1.10.3.2(例如,漆酶)、EC 1.10.3.3(例如,L-抗坏血酸氧化酶)、EC 1.1.1.1(例如,醇脱氢酶)、EC 1.11.1.10(例如,氯化物过氧化物酶)、EC1.11.1.17(例如,过氧化物酶)、EC 1.1.1.27(例如,L-乳酸脱氢酶)、EC 1.1.1.47(例如,葡萄糖1-脱氢酶)、EC 1.1.3.X(例如,葡萄糖氧化酶)、EC 1.1.3.10(例如,吡喃糖氧化酶)、EC1.13.11.X(例如,加双氧酶)、EC 1.13.11.12(例如,亚油酸13S-脂氧合酶(lineolate 13S-lipozygenase))、EC 1.1.3.13(例如,醇氧化酶)、EC 1.14.14.1(例如,单加氧酶)、EC1.14.18.1(例如,单酚单加氧酶(monophenol monooxigenase))、EC 1.15.1.1(例如,超氧化物歧化酶)、EC 1.1.5.9(先前,EC 1.1.99.10,例如,葡萄糖脱氢酶)、EC 1.1.99.18(例如,纤维二糖脱氢酶)、EC 1.1.99.29(例如,吡喃糖脱氢酶)、EC 1.2.1.X(例如,脂肪酸还原酶)、EC 1.2.1.10(例如,乙醛脱氢酶)、EC 1.5.3.X(例如,果糖基胺还原酶)、EC 1.8.1.X(例如,二硫键还原酶)和EC 1.8.3.2(例如,硫醇氧化酶)。
在某些实施例中,POI是转移酶,该转移酶包括但不限于选自以下的EC 2(转移酶)酶:EC 2.3.2.13(例如,转谷氨酰胺酶)、EC 2.4.1.X(例如,己糖基转移酶)、EC 2.4.1.40(例如,交替蔗糖酶(alternasucrase))、EC 2.4.1.18(例如,1,4α-葡聚糖分支酶)、EC2.4.1.19(例如,环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶)、EC 2.4.1.2(例如,糊精葡聚糖酶)、EC2.4.1.20(例如,纤维二糖磷酸化酶)、EC 2.4.1.25(例如,4-α-葡聚糖转移酶)、EC2.4.1.333(例如,1,2-β-低聚葡糖磷酸转移酶)、EC 2.4.1.4(例如,淀粉蔗糖酶)、EC2.4.1.5(例如,葡聚糖蔗糖酶)、EC 2.4.1.69(例如,半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶)、EC2.4.1.9(例如,菊粉蔗糖酶(inulosucrase))、EC 2.7.1.17(例如,木酮糖激酶)、EC2.7.7.89(原名EC 3.1.4.15,例如,[谷氨酰氨合成酶]-腺苷-L-酪氨酸磷酸化酶)、EC2.7.9.4(例如,α葡聚糖激酶)和EC 2.7.9.5(例如,磷酸葡聚糖激酶)。
在其他实施例中,POI是水解酶,该水解酶包括但不限于选自以下的EC 3(水解酶)酶:EC 3.1.X.X(例如,酯酶)、EC 3.1.1.1(例如,果胶酶)、EC 3.1.1.14(例如,叶绿素酶)、EC 3.1.1.20(例如,鞣酸酶)、EC 3.1.1.23(例如,甘油酯酰基水解酶)、EC 3.1.1.26(例如,半乳糖脂酶)、EC 3.1.1.32(例如,磷脂酶A1)、EC 3.1.1.4(例如,磷脂酶A2)、EC 3.1.1.6(例如,乙酰酯酶)、EC 3.1.1.72(例如,乙酰木聚糖酯酶)、EC 3.1.1.73(例如,阿魏酸酯酶)、EC 3.1.1.74(例如,角质酶)、EC 3.1.1.86(例如,鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶)、EC3.1.1.87(例如,伏马菌素B1酯酶)、EC 3.1.26.5(例如,核糖核酸酶P)、EC 3.1.3.X(例如,磷酸单酯水解酶)、EC 3.1.30.1(例如,曲霉核酸酶S1)、EC 3.1.30.2(例如,粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶)、EC 3.1.3.1(例如,碱性磷酸酶)、EC 3.1.3.2(例如,酸性磷酸酶)、EC 3.1.3.8(例如,3-植酸酶)、EC 3.1.4.1(例如,磷酸二酯酶I)、EC 3.1.4.11(例如,磷脂酰肌醇磷脂酶C)、EC 3.1.4.3(例如,磷脂酶C)、EC 3.1.4.4(例如,磷脂酶D)、EC3.1.6.1(例如,芳基硫酸酯酶)、EC 3.1.8.2(例如,二异丙基-氟磷酸酶)、EC 3.2.1.10(例如,寡-1,6-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.101(例如,甘露聚糖内切-1,6-α-甘露糖苷酶)、EC3.2.1.11(例如,α-1,6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)、EC 3.2.1.131(例如,木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶(glucuronosidase))、EC 3.2.1.132(例如,壳聚糖N-乙酰葡糖氨基水解酶)、EC3.2.1.139(例如,α-葡糖醛酸酶(glucuronidase))、EC 3.2.1.14(例如,几丁质酶)、EC3.2.1.151(例如,木葡聚糖特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶)、EC 3.2.1.155(例如,木葡聚糖特异性外切-β-1,4-葡聚糖酶)、EC 3.2.1.164(例如,半乳聚糖内切-1,6-β-半乳糖苷酶)、EC 3.2.1.17(例如,溶菌酶)、EC 3.2.1.171(例如,鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶)、EC3.2.1.174(例如,鼠李半乳糖醛酸聚糖鼠李糖水解酶)、EC 3.2.1.2(例如,β-淀粉酶)、EC3.2.1.20(例如,α-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.22(例如,α-半乳糖苷酶)、EC 3.2.1.25(例如,β-甘露糖苷酶)、EC 3.2.1.26(例如,β-果糖呋喃糖苷酶)、EC 3.2.1.37(例如,木聚糖1,4-β-木糖苷酶)、EC 3.2.1.39(例如,葡聚糖内切-1,3-β-D-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.40(例如,α-L-鼠李糖苷酶)、EC 3.2.1.51(例如,α-L-岩藻糖苷酶)、EC 3.2.1.52(例如,β-N-乙酰己糖胺酶)、EC 3.2.1.55(例如,α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶)、EC 3.2.1.58(例如,葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.59(例如,葡聚糖内切-1,3-α-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.67(例如,半乳聚糖1,4-α-半乳糖醛酸酶)、EC 3.2.1.68(例如,异淀粉酶)、EC 3.2.1.7(例如,1-β-D-果聚糖果糖水解酶)、EC 3.2.1.74(例如,葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.75(例如,葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.77(例如,甘露聚糖1,2-(1,3)-α-甘露糖苷酶)、EC 3.2.1.80(例如,果聚糖β-果糖苷酶)、EC 3.2.1.82(例如,外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶)、EC 3.2.1.83(例如,κ-角叉菜胶酶)、EC 3.2.1.89(例如,阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶)、EC3.2.1.91(例如,纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶)、EC 3.2.1.96(例如,甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰葡糖氨糖苷酶)、EC 3.2.1.99(例如,阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶)、EC 3.4.X.X(例如,肽酶)、EC 3.4.11.X(例如,氨肽酶)、EC 3.4.11.1(例如,亮氨酰氨肽酶)、EC 3.4.11.18(例如,甲硫氨酰氨肽酶)、EC 3.4.13.9(例如,Xaa-Pro二肽酶)、EC3.4.14.5(例如,二肽基-肽酶IV)、EC 3.4.16.X(例如,丝氨酸型羧肽酶)、EC 3.4.16.5(例如,羧肽酶C)、EC 3.4.19.3(例如,焦谷氨酰肽酶I)、EC 3.4.21.X(例如,丝氨酸内肽酶)、EC3.4.21.1(例如,胰凝乳蛋白酶)、EC 3.4.21.19(例如,谷氨酰内肽酶)、EC 3.4.21.26(例如,脯氨酰寡肽酶)、EC 3.4.21.4(例如,胰蛋白酶)、EC 3.4.21.5(例如,凝血酶)、EC3.4.21.63(例如,蜂蜜曲霉蛋白酶)、EC 3.4.21.65(例如,热霉菌素)、EC 3.4.21.80(例如,链霉菌素A)、EC 3.4.22.X(例如,半胱氨酸内肽酶)、EC 3.4.22.14(例如,肌动蛋白)、EC3.4.22.2(例如,木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.3(例如,无花果蛋白酶)、EC 3.4.22.32(例如,茎菠萝蛋白酶)、EC 3.4.22.33(例如,水果菠萝蛋白酶)、EC 3.4.22.6(例如,木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.23.1(例如,胃蛋白酶A)、EC 3.4.23.2(例如,胃蛋白酶B)、EC 3.4.23.22(例如,栗疫霉胃蛋白酶)、EC 3.4.23.23(例如,毛霉胃蛋白酶)、EC 3.4.23.3(例如,胃蛋白酶)、EC 3.4.24.X(例如,金属内肽酶)、EC 3.4.24.39(例如,氘代溶素(deuterolysin))、EC3.4.24.40(例如,粘质沙雷氏菌酶)、EC 3.5.1.1(例如,天冬酰胺酶)、EC 3.5.1.11(例如,青霉素酰胺酶)、EC 3.5.1.14(例如,N-酰基-脂族-L-氨基酸酰胺水解酶)、EC 3.5.1.2(例如,L-谷氨酰胺酰胺水解酶)、EC 3.5.1.28(例如,N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)、EC3.5.1.4(例如,酰胺酶)、EC 3.5.1.44(例如,蛋白-L-谷氨酰胺酰胺水解酶)、EC 3.5.1.5(例如,脲酶)、EC 3.5.1.52(例如,肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖氨基)天冬酰胺酰胺酶)、EC3.5.1.81(例如,N-酰基-D-氨基酸脱酰基酶)、EC 3.5.4.6(例如,AMP脱氨酶)和EC 3.5.5.1(例如,腈水解酶)。
在其他实施例中,POI是裂解酶,该裂解酶包括但不限于选自以下的EC 4(裂解酶)酶:EC 4.1.2.10(例如,扁桃腈裂解酶)、EC 4.1.3.3(例如,N-乙酰神经氨酸裂解酶)、EC4.2.1.1(例如,碳酸脱水酶)、EC 4.2.2.-(例如,鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶)、EC4.2.2.10(例如,果胶裂解酶)、EC 4.2.2.22(例如,果胶三糖-裂解酶)、EC 4.2.2.23(例如,鼠李半乳糖醛酸聚糖内切裂解酶)和EC 4.2.2.3(例如,甘露糖醛特异性海藻酸裂解酶)。
在某些其他实施例中,POI是异构酶,该异构酶包括但不限于选自以下的EC 5(异构酶)酶:EC 5.1.3.3(例如,醛糖1-差向异构酶)、EC 5.1.3.30(例如,D-阿洛酮糖3-差向异构酶)、EC 5.4.99.11(例如,异麦芽酮糖合酶)和EC 5.4.99.15(例如,(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡糖基变位酶)。
在又其他实施例中,POI是连接酶,该连接酶包括但不限于选自以下的EC 6(连接酶)酶:EC 6.2.1.12(例如,4-香豆酸:辅酶A连接酶)和EC 6.3.2.28(例如,L-氨基酸α-连接酶)。
鉴于本说明书和以下实例,本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是显而易见的。
VII.发酵
在某些实施例中,本公开提供了用于产生目的蛋白的方法,这些方法包括发酵丝状真菌细胞,其中该真菌细胞分泌目的蛋白。在其他实施例中,本公开提供了用于在酵母菌株中产生增加量的乙醇的方法。通常,使用本领域熟知的发酵方法发酵真菌细胞。在一些实施例中,真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。经典的分批发酵是封闭的系统,其中在发酵开始时设定培养基的组成,并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时,用一种或多种期望生物体接种培养基。在这种方法中,使发酵在不向系统添加任何组分的情况下发生。典型地,分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格,并且经常对控制因素诸如pH和氧浓度进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在分批培养中,细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期,最后进入生长速率减少或停止的稳定期。如果不经处理,处于稳定期的细胞最终死亡。通常,在对数期的细胞负责产物的大量生产。
标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型分批系统的这种变体中,随着发酵的进展,将底物以增量添加。当分解代谢物阻遏可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下,补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的并且因此基于可测量因素(诸如pH、溶解氧和废气(诸如,CO2)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是熟知的。
连续发酵是开放的系统,在该系统中,将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中,同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度,其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对影响细胞生长和/或产物浓度的一种或多种因素进行调节。例如,在一个实施例中,将限制营养素(诸如碳源或氮源)保持在固定的速率,并且允许调控所有其他参数。在其他系统中,影响生长的许多因素可以不断改变,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此,由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
本公开的某些实施例涉及用于培养真菌的发酵程序。用于产生纤维素酶的发酵程序是本领域已知的。例如,纤维素酶可以通过固体培养或浸没培养(包括分批、补料分批和连续流程)来产生。培养通常在生长培养基中完成,该生长培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳源和能源材料、分子氧以及当然还有待使用的丝状真菌宿主的起始接种物。
除了碳源和能源、氧、可同化氮和微生物的接种物外,还有必要以恰当比例供给合适量的矿质营养素来确保适当的微生物生长,使微生物转化过程中细胞对碳源和能源的同化最大化,并且在发酵培养基中获得最大细胞产量和最大细胞密度。
含水矿质培养基的组成可在宽泛的范围内变化,这部分取决于所使用的微生物和底物,正如本领域所已知的。除了氮以外,所述矿质培养基还应该包括处于合适的可溶性可同化离子形式和化合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠,并且还优选应存在也处于适合的可溶性可同化形式的某些痕量元素诸如铜、锰、钼、锌、铁、硼和碘以及其他,这些全部如本领域所已知的。
该发酵反应是一需氧过程,其中所需的分子氧通过含分子氧气体诸如空气、富氧空气或甚至基本上纯的分子氧供给,只要维持发酵容器的内容物具有可有效用于帮助微生物物种以旺盛方式生长的合适的氧分压。
微生物还需要可同化氮源。可同化氮源可以是任何含氮化合物或能够释放适于微生物进行代谢利用的形式的氮。虽然可采用多种有机氮源化合物如蛋白水解产物,但通常可以利用廉价的含氮化合物,诸如氨、氢氧化铵、尿素和多种铵盐(诸如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或多种其他氨化合物)。氨气本身便于大规模操作,并且能以合适的量通过鼓泡穿过含水发酵物(发酵培养基)而使用。同时,还可采用这种氨来帮助进行pH控制。
含水微生物发酵物(发酵混合物)中的pH范围应该是在约2.0至8.0的示例性范围内。在丝状真菌的情况下,pH通常在约2.5至8.0的范围内;在里氏木霉的情况下,pH通常在约3.0至7.0的范围内。微生物pH范围的偏好在一定程度上取决于所采用的培养基以及特定的微生物,并因而随着培养基的变化而稍微改变,如可以通过本领域技术人员容易地确定的。
优选地,发酵以使得含碳底物可被控制为限制性因素的方式进行,从而为细胞提供了含碳底物的良好转化并避免这些细胞被基本量的未转化底物污染。后一种情况对水溶性底物而言不是问题,因为任何剩余的痕量物质均可容易地洗掉。然而,在非水溶性底物的情况下这可能是个问题,并且需要增加的产物处理步骤诸如合适的洗涤步骤。
如上所述,达到该水平的时间不是关键的,并且可随特定的微生物和所进行的发酵过程而变化。然而,本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及期望碳源水平是否已经达到。
发酵可以分批或连续操作进行,为了易于控制、产生均一量的产物以及最经济地使用所有设备,分批补料操作是更为优选的。
如果需要,在将含水矿质培养基进料至发酵罐之前,可以将碳源和能源材料的部分或全部和/或可同化氮源(诸如氨)的部分添加至该含水矿质培养基。
优选以预定的速率,或者响应可通过监测诸如碳和能量底物的浓度、pH、溶解氧、来自发酵罐的废气中的氧或二氧化碳、通过干细胞重量可测量的细胞密度、光透射比等而确定的需求来控制引入反应器的每一种料流。多种材料的进料速度可以变化以便获得与碳源和能源的有效利用相一致的尽可能快的细胞生长速率,以获得相对于底物变化尽可能高的微生物细胞产量。
在分批操作或优选的补料分批操作中,一开始对所有的设备、反应器或发酵装置、器皿或容器、管道、附带的循环或冷却设备等进行灭菌,通常通过采用蒸汽诸如在约121℃持续至少约15分钟。然后在存在所有所需的营养素,包括氧和含碳底物的情况下,用所选微生物的培养物接种灭菌过的反应器。所用发酵罐类型并不重要。
从发酵肉汤收集和纯化蛋白质还可以通过本领域已知的程序进行。发酵肉汤将通常含有细胞碎片,包括细胞、多种悬浮固体和其他生物质污染物(优选将它们通过本领域已知的手段从发酵肉汤去除)以及期望纤维素酶产物。
适用于这种去除的方法包括常规的固体-液体分离技术,诸如像离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或其他已知的方法,以产生无细胞滤液。可以优选地使用技术诸如超滤、蒸发或沉淀在结晶之前进一步浓缩发酵肉汤或无细胞滤液。
沉淀上清液或滤液的蛋白组分可以借助于盐(例如,硫酸铵)来完成,然后通过各种色谱法程序(例如,离子交换色谱法、亲和色谱法或本领域公认的类似程序)进行纯化。
VIII.示例性实施例
本公开的非限制性实施例包括但不限于:
1.一种衍生自包含编码天然GEF1蛋白的基因的亲代丝状真菌菌株的丝状真菌变体(或经修饰的)菌株,其中所述变体菌株包含破坏或缺失所述编码天然GEF1蛋白的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下培养时,所述变体菌株相对于所述亲代菌株包含蛋白质生产率提高表型。
2.如实施例1所述的变体菌株,其中所述蛋白质生产率提高表型选自由以下组成的组:增加的蛋白质生产率、增加的总蛋白质生产率、增加的体积生产率、增加的碳转化效率和增加的比生产率。
3.如实施例1所述的变体菌株,其中所述丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)。
4.如实施例1所述的变体菌株,其中所述丝状真菌选自由以下组成的组:木霉属(Trichoderma)物种菌株、曲霉属(Aspergillus)物种菌株、镰刀菌属(Fusarium)物种菌株、青霉属(Penicillium)物种菌株、念珠菌属(Candida)物种菌株、金孢属(Chrysosporium)物种菌株、头孢霉属(Cephalosporium)物种菌株、篮状菌属(Talaromyces)物种菌株、脉孢菌属(Neurospora)物种菌株和毁丝霉属(Myceliophthora)物种菌株等。
5.如实施例1所述的变体菌株,当将所述变体和亲代菌株在相同条件下于25℃发酵时,所述变体菌株相对于所述亲代菌株包含蛋白质生产率增加表型。
6.如实施例1所述的变体菌株,当将所述变体和亲代菌株在相同条件下于26℃发酵时,所述变体菌株相对于所述亲代菌株包含蛋白质生产率增加表型。
7.如实施例1所述的变体菌株,当将所述变体和亲代菌株在相同条件下于27℃发酵时,所述变体菌株相对于所述亲代菌株包含蛋白质生产率增加表型。
8.如实施例1所述的变体菌株,当将所述变体和亲代菌株在相同条件下于28℃发酵时,所述变体菌株相对于所述亲代菌株包含蛋白质生产率增加表型。
9.如实施例1所述的变体菌株,所述变体菌株包含编码内源目的蛋白(POI)的基因。
10.如实施例9所述的变体菌株,其中所述内源POI是木质纤维素降解酶。
11.如实施例1所述的变体菌株,所述变体菌株包含编码异源目的蛋白(POI)的表达构建体。
12.如实施例11所述的变体菌株,其中所述异源POI选自酶、抗体或其片段、受体蛋白和肽。
13.如实施例12所述的变体菌株,其中所述异源POI是选自由氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶组成的组的酶。
14.如实施例12所述的变体菌株,其中所述异源POI是选自由以下组成的组的酶:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。
15.一种目的蛋白,所述目的蛋白由如实施例1所述的变体菌株产生。
16.如实施例1所述的变体菌株,其中所述所编码的GEF1蛋白与SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性。
17.如实施例1所述的变体菌株,其中所述所编码的GEF1蛋白与SEQ ID NO:5的GEF1结构域具有至少90%序列同一性。
18.如实施例1所述的变体菌株,其中所述编码GEF1蛋白的基因与SEQ ID NO:1的GEF1多核苷酸序列具有至少70%序列同一性。
19.如实施例1所述的变体菌株,其中所述编码GEF1蛋白的基因与SEQ ID NO:3的可读框(ORF)序列具有至少70%序列同一性。
20.如实施例1所述的变体菌株,其中所述编码GEF1蛋白的基因在中等至严格杂交条件下与SEQ ID NO:1的GEF1基因或SEQ ID NO:3的GEF1 ORF杂交。
21.如实施例1所述的变体菌株,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前20个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后20个氨基酸残基。
22.如实施例1所述的变体菌株,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前200个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后200个氨基酸残基。
23.如实施例1所述的变体菌株,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前500个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后500个氨基酸残基。
24.如实施例1所述的变体菌株,其中所述遗传修饰截短了所述GEF1 C末端的至少700至750个氨基酸残基。
25.如实施例1所述的变体菌株,其中所述编码GEF1蛋白的基因缺失。
26.一种用于在经修饰的丝状真菌菌株中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法,所述方法包括(a)通过破坏或缺失天然GEF1基因对丝状真菌菌株进行遗传修饰,以及(b)在适于产生所述POI的条件下发酵所述经修饰的菌株,其中当在相同条件下于25℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
27.如实施例26所述的方法,其中所述丝状真菌是盘菌亚门。
28.如实施例26所述的方法,其中所述丝状真菌选自由以下组成的组:木霉属物种菌株、曲霉属物种菌株、镰刀菌属物种菌株、青霉属物种菌株、念珠菌属物种菌株、金孢属物种菌株、头孢霉属物种菌株、篮状菌属物种菌株、脉孢菌属物种菌株和毁丝霉属物种菌株等。
29.如实施例26所述的方法,其中当在相同条件下于26℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
30.如实施例26所述的方法,其中当在相同条件下于27℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
31.如实施例26所述的方法,其中当在相同条件下于28℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
32.如实施例26所述的方法,其中所述内源POI是木质纤维素降解酶。
33.如实施例26所述的方法,其中所述经修饰的菌株还包含编码异源POI的表达构建体。
34.如实施例26所述的方法,其中所述所编码的GEF1蛋白与SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性。
35.如实施例26所述的方法,其中所述所编码的GEF1蛋白与SEQ ID NO:5的GEF1结构域具有至少90%序列同一性。
36.如实施例26所述的方法,其中所述编码GEF1蛋白的基因与SEQ ID NO:1的GEF1多核苷酸序列具有至少70%序列同一性。
37.如实施例26所述的方法,其中所述编码GEF1蛋白的基因与SEQ ID NO:3的可读框(ORF)序列具有至少70%序列同一性。
38.如实施例26所述的方法,其中所述编码GEF1蛋白的基因在中等至严格杂交条件下与SEQ ID NO:1的GEF1基因或SEQ ID NO:3的GEF1 ORF杂交。
39.如实施例26所述的方法,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前20个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后20个氨基酸残基。
40.如实施例26所述的方法,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前200个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后200个氨基酸残基。
41.如实施例26所述的方法,其中所述遗传修饰截短了GEF1 N末端的至少前500个氨基酸残基,或截短了GEF1 C末端的至少后500个氨基酸残基。
42.如实施例26所述的方法,其中所述遗传修饰截短了所述GEF1 C末端的至少700至750个氨基酸残基。
43.如实施例26所述的方法,其中所述编码GEF1蛋白的基因缺失。
44.一种用于在经修饰的丝状真菌菌株中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法,所述方法包括(a)通过破坏或缺失所述天然GEF1基因并通过引入编码异源POI的表达盒对丝状真菌菌株进行遗传修饰,以及(b)在适于产生所述异源POI的条件下发酵所述经修饰的菌株,其中当在相同条件下于25℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
45.如实施例44所述的方法,其中所述丝状真菌是盘菌亚门。
46.如实施例44所述的方法,其中所述丝状真菌选自由以下组成的组:木霉属物种菌株、曲霉属物种菌株、镰刀菌属物种菌株、青霉属物种菌株、念珠菌属物种菌株、金孢属物种菌株、头孢霉属物种菌株、篮状菌属物种菌株、脉孢菌属物种菌株和毁丝霉属物种菌株等。
47.如实施例44所述的方法,其中当在相同条件下于26℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
48.如实施例44所述的方法,其中当在相同条件下于27℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
49.如实施例44所述的方法,其中当在相同条件下于28℃培养时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的菌株产生增加量的所述POI。
50.如实施例44所述的方法,其中所述异源POI选自酶、抗体或其片段、受体蛋白和肽。
51.如实施例44所述的方法,其中所述异源POI是选自由氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶组成的组的酶。
52.如实施例44所述的方法,其中所述异源POI是选自由以下组成的组的酶:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。
53.一种目的蛋白,所述目的蛋白由如实施例26或实施例44所述的方法产生。
54.一种用于在酵母发酵工艺中产生增加量的乙醇的方法,所述方法包括(a)通过缺失或破坏所述天然GEF1基因对酵母菌株进行遗传修饰,以及(b)在适于产生乙醇的条件下发酵所述经修饰的菌株,其中当在相同条件下培养时,相对于由所述亲代菌株在发酵结束(EOF)时产生的乙醇的量,所述经修饰的菌株在EOF时产生增加量的乙醇。
55.一种衍生自包含编码GEF1蛋白同源物的基因的亲代菌株的变体酵母菌株,其中所述变体菌株包含缺失或破坏所述编码GEF1蛋白同源物的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下培养时,相对于所述亲代菌株,所述变体菌株包含乙醇生产率增加表型
实例
根据以下实例可以进一步理解本公开的某些方面,所述实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
实例1
鉴定在升高的培养温度下包含蛋白质生产率提高表型的突变体木霉属菌株
使里氏木霉全纤维素酶(T4)菌株在选择性条件下连续繁殖以分离能够进行高温蛋白质产生而不会不利地影响比生产率的突变体。鉴定并分离到一种名为“T4-E1”的突变体里氏木霉菌株,相对于25℃下的亲代里氏木霉T4菌株,该突变体里氏木霉菌株在28℃下具有类似比生产率(Qp)。例如,使T4亲代菌株在BIRD琼脂上生成孢子,并从琼脂板收集1×107个孢子/mL,悬浮在水中,并在室温下用0.15mg/mL 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(Sigma112,994-1)处理两(2)小时,直到只有1%的孢子仍然存活。将孢子接种到进化培养基中,所述进化培养基含有0.5%微晶纤维素(EMCOCEL,德国罗森堡的JRS制药公司(JRS Pharma,Rosenburg,Germany))、羧甲基纤维素(CMC;Sigma-Aldrich C5678,密西根州圣路易斯(St.Louis,MO))或酸溶胀纤维素(例如,对于制备,参见Wood,1988)作为唯一碳源。此外,还含有每升硫酸铵(4g)、磷酸二氢钠(4.5g)、七水合硫酸镁(1g)、二水合氯化钙(1g)和2.5ml400X微量元素溶液。
更具体地,在第一方法中,将约一(1)百万个经化学突变的孢子接种到含有上述进化培养基的两百五十(250)ml凹底烧瓶中,该进化培养基具有作为唯一碳源。将烧瓶在180rpm、31℃下孵育五(5)天。此时,将10%体积/体积转移到第二同一烧瓶中,将该第二烧瓶以相同方式孵育。如下连续转移十一(11)继代(P):P1=五(5)天、P2=五(5)天、P3=四(4)天、P4=四(4)天、P5=四(4)天、P6=四(4)天、P7=四(4)天、P8=四(4)天、P9=三(3)天、P10=三(3)天和P11=两(2)天。将来自P11摇瓶的P11肉汤以4,000rpm离心十(10)分钟。丢弃上清液,将细胞悬浮在水中并涂在BIRD培养基上。
在31℃、200rpm和80%湿度下,在缓释乳糖微量滴定板(srMTP;例如,参见PCT公开号WO 2014/047520)中孵育四(4)天后,评价单个菌落形成单位的总蛋白BCA(产品号23228,伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,Rockford,IL))。因此,在发酵罐中进一步评价了相对于在25℃下亲代菌株产生的总蛋白量在31℃下产生等量总蛋白量的突变体菌株的高温蛋白质产生。
在第二方法中,使用Bachmann等人(2013)中所述的方法将里氏木霉T4亲代菌株的突变孢子包封在水和油乳液液滴中。液滴含有进化培养基,该进化培养基具有0.5%微晶纤维素(EMCOCEL,德国罗森堡的JRS制药公司(JRS Pharma,Rosenburg,Germany))、羧甲基纤维素(Sigma-Aldrich C5678,密西根州圣路易斯(St.Louis,MO))或酸溶胀纤维素(Wood,1988)作为唯一碳源。此外,还含有每升硫酸铵(4g)、磷酸二氢钠(4.5g)、七水合硫酸镁(1g)、二水合氯化钙(1g)和2.5ml 400X微量元素溶液。将液滴在31℃在管中孵育三(3)天,此时使用Bachmann等人(2013)中所述的方法破坏乳液。回收细胞,在琼脂平板上生成孢子,再包封并在31℃孵育三(3)天。重复此过程10次。在最终转移之后,将细胞悬浮在水中并涂在BIRD培养基上。在31℃、200rpm和80%湿度下,在srMTP乳糖板(PCT公开号WO 2014/047520)中孵育四(4)天后,评价单个菌落形成单位的总BCA蛋白(产品号23228,伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,Rockford,IL))。在发酵罐中进一步评价了相对于在25℃下亲代菌株产生的总蛋白量在31℃下产生等量总蛋白量的突变体菌株的高温蛋白质产生。因此,如上文总体上阐述和下文总体上呈现,将名为“T4-E1”的突变体里氏木霉(T4)菌株鉴定为与在25℃下亲代T4菌株的最佳蛋白质产生相比(比较),能够在28℃下进行最佳蛋白质产生的高温突变体。
实例2
包含突变的GEF1基因的突变体木霉属菌株的特征
上文在实例1中描述的木霉属变体(突变体)菌株中突变的基因位于野生型里氏木霉QM6a v2.0基因组序列组装中的支架位置3:1532639-1538781,该信息可在联合基因组研究所(JGI)网站(genome.jgi.doe.gov)获得。例如,推导出的氨基酸序列(PID:120482,SEQID NO:2)包括与Rho/Rac/Cdc42样鸟嘌呤核苷酸交换因子结构域(GEF1结构域;PfamPF00621,也称为Dbl同源或DH结构域)同源的序列区域(例如,SEQ ID NO:4)。此同源区域处于推导的氨基酸序列(即PID:120482;SEQ ID NO:2)中的氨基酸残基第1,242-1,454位。Rho家族GTP酶调节许多不同的细胞过程,其中此类GTP酶通过释放结合的GDP和随后结合GTP而被活化,该结合由GEF1家族中的鸟嘌呤交换因子催化。变体T4-E1菌株中的突变用过早终止密码子置换了谷氨酸密码子(Glu(E);氨基酸第1,245位),从而在GEF1结构域起点附近截短蛋白质(例如,参见图3A-图3C)。
同样,推导的氨基酸序列(PID:120482;SEQ ID NO:2)还在SEQ ID NO:2的残基第1,576-1,677位与BAR或AH/BAR结构域(例如,SEQ ID NO:5;Pfam PF03114)具有同源性。AH/BAR结构域存在于一系列蛋白质中。在一些情况下,该结构域已显示与膜相互作用、二聚化或结合Arf和Rho家族GTP酶,包括ARF1,ARF1是一种参与高尔基复合体(Golgi complex)小泡芽生的小GTP酶。在其他四(4)种里氏木霉GEF1结构域蛋白中未观察到AH/BAR结构域(SEQID NO:5)。
与一些其他GEF1结构域蛋白不同,在SEQ ID NO:2(PID:120482)中未发现普列克底物蛋白(Plekstrin)同源结构域(PH结构域,Pfam PF00169)。PH结构域可以结合膜中的磷脂酰肌醇和异源三聚体G蛋白或蛋白激酶C的β/γ亚基,从而与信号转导途径相关。在里氏木霉QM6a基因组中发现了四(4)种含有GEF1结构域的其他推导的蛋白质序列,其中两(2)种还含有PH结构域。
此外,推导的氨基酸序列(PID:120482;SEQ ID NO:2)在SEQ ID NO:2的残基第1,918-1,990位处包括与一些其他丝状真菌的GEF1结构域蛋白高度保守的C末端序列(例如,SEQ ID NO:6),这些其他丝状真菌包括藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、太瑞斯梭孢壳菌(Thielavia terrestris)、鹅柄孢壳菌(Podospora anserina)、产红青霉(Penicillium rubens)和黑曲霉。然而,此C末端序列结构域(SEQ ID NO:6)不在里氏木霉基因组中鉴定的其他四(4)种GEF1结构域蛋白中。
实例3
通过插入pyr2基因灭活木霉属菌株中的GEF1基因
使用基于Cas9的方法在里氏木霉菌株中进行编码SEQ ID NO:2(PID:120482)的GEF1蛋白的GEF1基因(JGI里氏木霉v2.0支架3:1532639-1538781)的灭活。更特别地,从Synthego公司(加利福尼亚州红木城(Redwood City,CA))购买纯化的Cas9蛋白和经修饰EZtracrRNA,并且由Synthego合成经修饰的crRNA,该经修饰的crRNA在5′末端具有以下序列(TS3;SEQ ID NO:7),该序列对里氏木霉GEF1基因内的靶位点(TS3)具有特异性。
TS3:CAUUCAUCCAAGAAUCCGAG(SEQ ID NO:7)
GEF1基因中由上述RNA序列(SEQ ID NO:7)确定的Cas9靶位点(TS)在编码序列中的核苷酸第3,659-3,678位处,该Cas9靶位点与T4-E1突变体菌株(实例2)中观察到的核苷酸第3,733位处的突变接近。根据制造商的说明,将tracrRNA和crRNA退火形成指导RNA(gRNA),然后与Cas9-2NLS组合形成核糖核蛋白复合物(Cas9:RNP)。使用前,将Cas9:RNP与购自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))的Lipofectamine CRISPR-MAX混合。
使用引物AL950(SEQ ID NO:8)和AL952(SEQ ID NO:9)引物通过PCR扩增含有里氏木霉pyr2基因的线性DNA片段,该里氏木霉pyr2基因具有天然启动子和终止子序列,并且侧接492bp的里氏木霉重复序列(SEQ ID NO:18)。使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒纯化得到的PCR产物。
AL950:CCTAACTAACGTCTGACATCG(SEQ ID NO:8)
AL952:CGTACCATTTGACTGATACGATG(SEQ ID NO:9)
用pyr2 PCR产物加上Cas9:RNP转化里氏木霉亲代菌株的原生质体。选择转化体中的尿苷营养缺陷型。使用正向和反向引物对RhoF1(SEQ ID NO:10)和RhoR1(SEQ ID NO:11),通过PCR进行pyr2期望地插入GEF1基因中的转化体的筛选,这些引物在GEF1 Cas9中扩增
RhoF1:GAGCTAGACACGGGCGAAG(SEQ ID NO:10)
RhoR1:AGGAACCCTTCGTGAGCAAG(SEQ ID NO:11)
插入pyr2将PCR产物的大小从755bp增加到约2.8kb。使用RhoF1和RhoR1引物通过桑格测序(Sanger sequencing)确定来自名为“ΔRho#22D”的转化体的2.8kb PCR产物的DNA序列,从而验证了pyr2在Cas9切割位点的插入和GEF1编码序列的破坏。
如表1中所呈现,将ΔRho#22D转化体的发酵罐性能与亲代T4菌株和实例1中所述的名为T4-E1菌株的突变体比较。例如,T4、T4-E1和T4-ΔRho#22D菌株在28℃下的最终比生产率(Qp)速率在表1中以相对于对照菌株T4在25℃下的最终Qp速率的百分比(%)的形式显示。
表1以对照(T4 25℃)的百分比表示的最终Qp速率(g/gDCW/hr)
实例4
包含异源纤维素酶表达构建体的木霉属菌株中GEF1基因通过部分缺失而灭活
如本实例所述,名为“T4-DXST”的木霉属菌株衍生自/构建自亲代里氏木霉T4菌株,其中编码CBHI、CBHII、EGI和EGII蛋白的天然纤维素酶基因通过缺失或破坏而灭活(即,使用本领域技术人员已知的常规分子生物学技术),并用置于高效cbhI启动子控制下的编码大孢圆孢霉内切葡聚糖酶1(STCE1)的基因的拷贝转化。
已经公开了用外源添加的质粒DNA转化里氏木霉的方法(Penttila等人,1986;Gruber等人,1990;Smith等人,1991)。通过将质粒DNA整合到宿主染色体中产生稳定的转化体。可以在基因组中与质粒DNA的区域同源的位点处或可以在非同源位点处整合。
使用基于Cas9的方法进行包含引入的STCE1纤维素酶构建体的亲代里氏木霉菌株(例如,参见美国专利号7,595,182)中编码GEF1的基因的灭活。更特别地,从Synthego公司(加利福尼亚州红木城(Redwood City,CA))购买纯化的Cas9-2NLS蛋白和经修饰的EZtracrRNA。由Synthego合成经修饰的crRNA,所述经修饰的crRNA在5′末端具有以下RNA序列,这些序列对里氏木霉GEF1基因内的靶位点3和4(TS3/TS4)具有特异性。
TS3:CAUUCAUCCAAGAAUCCGAG(SEQ ID NO:7)
TS4:AUUGUGGAGGAAAUCUACAA(SEQ ID NO:12)
GEF1基因中由上述RNA序列确定的Cas9靶位点(TS3/TS4)在编码序列中的核苷酸第3,659-3,678位处和核苷酸第3,775-3794位处,这些Cas9靶位点与T4-E1突变体菌株中观察到的核苷酸第3,733位处的突变接近。根据制造商的说明,将tracrRNA和crRNA退火形成指导RNA(gRNA),然后与Cas9-2NLS组合形成核糖核蛋白复合物(Cas9:RNP)。使用前,将Cas9:RNP与购自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))的Lipofectamine CRISPR-MAX混合。
使用引物HygF1(SEQ ID NO:16)和HygR1(SEQ ID NO:17)通过PCR扩增线性DNA片段,该线性DNA片段含有与粗糙脉孢菌cpc1启动子(SEQ ID NO:14)和构巢曲霉trpC终止子(SEQ ID NO:15)可操作地连接的细菌潮霉素磷酸转移酶基因(SEQ ID NO:13)。
HygF1:TGGCTTTCCGTCTCCATTG(SEQ ID NO:16)
HygR1:AGTGTACCTGTGCATTCTGGG(SEQ ID NO:17)
用线性DNA片段和两种Cas9:RNP(具有两种crRNA)的混合物转化里氏木霉亲代菌株的原生质体。在适当的琼脂培养基上选择具有潮霉素抗性的转化体。然而,仅从选择性琼脂平板中挑取出较小且生长较慢的转化菌落并转移到具有非选择性培养基的琼脂平板中。在非选择性培养基上生长之后,挑取转化体并点样到具有潮霉素的培养基上。选择在潮霉素存在下不生长的转化体进行进一步研究。假设这些转化体短暂展示出潮霉素抗性,随后丧失了未整合到里氏木霉基因组中的潮霉素抗性DNA标记片段。使用RhoF1(SEQ ID NO:10)和RhoR1(SEQ ID NO:11)引物进行PCR用于筛选潮霉素敏感性转化体。
如发生Cas9靶位点TS3和TS4之间的缺失时所预期,鉴定到产生约630bp的PCR产物的转化体。在野生型细胞中此PCR产物的大小为756bp。使用引物RhoF1(SEQ ID NO:10)和RhoR1(SEQ ID NO:11)从每一端对PCR产物进行测序。转化体#89(t-AWC88)在TS3和TS4之间具有125bp缺失(即,编码序列中的核苷酸第3,668-3,791位),没有插入。随后,将木霉属转化体#89(t-AWC88)发酵,并与亲代菌株(t-AVT84)在25℃和28℃下的STCE/DXST蛋白产生相比(比较),如表2所呈现。
表2
以25℃下对照菌株t-AVT84的百分比表示的生产期间的最终蛋白质产率
更特别地,如上表2所示,T4-DXST子代菌株(t-AWC88)具有比亲代菌株(t-AVT84)高至少2℃-3℃的最佳蛋白质生产温度。
参考文献
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Claims (19)
1.一种衍生自包含编码GEF1蛋白的基因的亲代细胞的变体丝状真菌细胞,其中所述变体细胞包含破坏或缺失所述编码GEF1蛋白的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下发酵时,相对于所述亲代细胞,所述变体细胞包含蛋白质生产率提高表型。
2.如权利要求1所述的变体细胞,其中所述蛋白质生产率提高表型选自由以下组成的组:增加的蛋白质生产率、增加的总蛋白质生产率、增加的体积生产率、增加的碳转化效率和增加的比生产率。
3.如权利要求1所述的变体细胞,当将所述变体和亲代细胞在相同条件下于26℃发酵时,所述变体细胞相对于所述亲代细胞包含蛋白质生产率增加表型。
4.如权利要求1所述的变体细胞,所述变体细胞包含编码内源目的蛋白(POI)的基因和/或包含编码异源POI的表达盒。
5.如权利要求4所述的变体细胞,其中所述内源POI是木质纤维素降解酶。
6.如权利要求5所述的变体细胞,其中所述木质纤维素降解酶选自由纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组成的组。
7.如权利要求4所述的变体细胞,其中所述表达盒编码选自酶、抗体、受体和肽的异源POI。
8.如权利要求7所述的变体细胞,其中所述酶选自由氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶组成的组。
9.一种目的蛋白,所述目的蛋白由如权利要求1所述的变体细胞产生。
10.一种用于在经修饰的丝状真菌细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法,所述方法包括:
(a)通过破坏或缺失天然GEF1基因对亲代丝状真菌细胞进行遗传修饰,以及
(b)在适于产生所述POI的条件下发酵所述经修饰的细胞,
其中当在相同条件下于25℃发酵时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述内源POI是木质纤维素降解酶。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述木质纤维素降解酶选自由纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组成的组。
13.如权利要求10所述的方法,其中所述经修饰的菌株进一步包含编码异源POI的表达构建体。
14.一种用于在经修饰的丝状真菌细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法,所述方法包括:
(a)通过破坏或缺失所述天然GEF1基因并通过引入编码异源POI的表达盒对丝状真菌细胞进行遗传修饰,以及
(b)在适于产生所述异源POI的条件下发酵所述经修饰的细胞,其中当在相同条件下于25℃发酵时,相对于所述亲代菌株,所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述异源POI选自酶、抗体或其片段、受体蛋白和肽。
16.如权利要求14所述的方法,其中所述异源POI是选自由氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶组成的组的酶。
17.一种目的蛋白,所述目的蛋白由如权利要求10或权利要求14所述的方法产生。
18.一种用于在酵母发酵工艺中产生增加量的乙醇的方法,所述方法包括:
(a)通过缺失或破坏所述天然GEF1基因对酵母菌株进行遗传修饰,以及
(b)在适于产生乙醇的条件下发酵所述经修饰的菌株,其中当在相同条件下发酵时,相对于由所述亲代菌株在发酵结束(EOF)时产生的乙醇的量,所述经修饰的菌株在EOF时产生增加量的乙醇。
19.一种衍生自包含编码GEF1蛋白同源物的基因的亲代菌株的变体酵母菌株,其中所述变体菌株包含缺失或破坏所述编码GEF1蛋白同源物的基因的遗传修饰,其中当在相同条件下发酵时,相对于所述亲代菌株,所述变体菌株包含乙醇生产率增加表型。
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