CN108064267A - 真菌菌株及使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了改进的真菌菌株及其用途,其中这些真菌菌株能够生产改变水平的目的蛋白、酶、变体和其他物质。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月9日提交的当前未决的美国临时专利申请序列号62/113,905以及于2015年6月10日提交的美国临时专利申请序列号62/173,511的优先权。
发明领域
本披露涉及能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,以及遗传修饰真菌菌株使得其具有生产改变水平的目的蛋白的能力的方法。此外,本披露涉及通过使该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵生产的目的蛋白以及包含该目的蛋白的组合物。此外,本披露涉及使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株生产目的蛋白的方法,以及生产和使用包含这种目的蛋白的组合物的方法。本文中目的蛋白可以是内源蛋白质或异源蛋白质。本披露还涉及用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白。
序列表的引用
名称为“40733-PCT-SEQ_Listing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容是在2015年2月8日创建的,其大小为30KB,将其通过引用以其全文特此结合。
对生物材料保藏的参考
本申请包含对生物材料保藏的参考,该保藏通过引用结合在此。具体地,CBS140022是里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株RLP37 Nik1(M743T),根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)的条款将该CBS140022保藏在位于荷兰乌特勒支市(Uppsalalaan 8,3584 CTUtrecht,the Netherlands)的荷兰皇家艺术与科学学院研究所真菌生物多样性中心真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures,Fungal Biodiversity Centre,Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences(KNAW))。
背景技术
真菌因其商业应用(作为工业产品的内源性蛋白质,以及作为生产工业上有用的蛋白质的表达宿主两者)而众所周知。在真菌的直接工业用途的一个实例中,丝状真菌菌株例如里氏木霉(Trichoderma reesei)、特异腐质霉(Humicola insolens)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等直接应用于纤维素生物质上以帮助将此类材料的纤维素和半纤维素组分分解为可以进一步被加工成工业上有用的物质的小的聚合糖和/或单体糖。然而,这样的直接用途迄今被证明在经济上不可行,主要是因为可以由这些生物体生产的总蛋白质/酶的量的固有限制,特别是当被分解顽固性底物(例如纤维素生物质)所需要的高水平的酶活性抵消时。
在另一方面,使用真菌菌株作为目的蛋白的生产宿主长期以来一直被认为是经济上可行的并且在一段时间被广泛用于商业环境中。丝状真菌将精确折叠成三维结构和二硫键、在翻译后精确地进行蛋白水解剪切、并且相对可预测地用n-连接和o-连接糖基化反应进行糖基化的复杂的蛋白质分泌的能力致使这些生物体成为用于生产分泌型蛋白的高度有吸引力的宿主(MacKenzie,D.A.等人,J Gen Microbiol[普通和应用微生物学杂志](1993)139:2295-2307;Peberdy,J.F.,Trends in BioTechnology[生物技术趋势](1994)12:50-57)。已知真菌是生物质水解、食品和饲料添加剂、纺织应用、谷物加工、清洁和其他工业用途的有效的酶生产者。
使用真菌表达的蛋白质用于工业过程是广泛的且稳定增加的,特别是鉴于目前对使用涉及酶的工业过程从非石油可再生材料或来源生产燃料和化学药品的兴趣。在该领域中已经开发出了改进蛋白质表达的各种技术。这些技术包括例如经典的菌株改良方法,例如对菌株进行多轮诱变并选择高生产者、构建或遗传工程改造具有在基因组中插入的高拷贝数的目的基因的生产菌株。虽然这些方法中的许多方法在提高菌株的生产率方面是有效的,但它们具有局限性,包括例如,制备每个单独产品通常所需的菌株构建操作的劳动强度。因此,仍然需要获得能够增加对单一的目的蛋白、或目的蛋白的多个组、或甚至内源蛋白质的蛋白质生产的改进的真菌菌株。
发明内容
本披露涉及能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,以及遗传修饰真菌菌株使得其具有生产改变水平的目的蛋白的能力的方法。此外,本披露涉及通过使该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵生产的目的蛋白以及包含该目的蛋白的组合物。此外,本披露涉及使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株生产目的蛋白的方法,以及生产和使用包含目的蛋白的组合物的方法。本披露还涉及用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白。
在第一方面,本披露提供工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或表达变体组氨酸激酶。
在一些实施例中,该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在一些实施例中,该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型基因的变体。在某些实施例中,该变体组氨酸激酶基因编码作为响应外部渗透压的信号传导途径的一部分起作用的多肽。在组氨酸激酶中具有突变的菌株可以通过对某些化合物的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的二甲酰亚胺杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈的存在下)进行筛选来鉴定。将预期的是,在这一信号传导途径的其他组分的突变也将是有益的。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。因此,与此相关,本披露还提供鉴定对渗透胁迫具有抗性或敏感性的真菌菌株的方法,该真菌菌株作为可用于生产工业上有用的分子的宿主生物体是有利的。
在某些实施例中,变体组氨酸激酶基因编码如下多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性、但不是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有100%同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:1的位置743处具有突变。在具体实施例中,在SEQ ID NO:1的位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M743T。
在其他实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。在具体实施例中,在SEQ ID NO:1的位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M786T。
在一些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的亲本菌株是子囊菌(Ascomycete)真菌菌株。在具体实施例中,该亲本菌株是丝状真菌菌株。相关地,该工程改造的真菌菌株包含由变体组氨酸激酶基因编码的变体组氨酸激酶,其中该变体组氨酸激酶包含如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的位置743处具有突变以及在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。
在一些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产高得多的量的目的蛋白。例如,该工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、或甚至至少约150%更高的量的目的蛋白。
在第二方面,本披露提供了转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株,这些真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该转化的真菌菌株或该衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因。
在一些实施例中,转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在一些实施例中,转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在某些实施例中,该变体组氨酸激酶基因编码作为响应外部渗透压的信号传导途径的一部分起作用的多肽。在这种组氨酸激酶中具有突变的菌株可以通过对某些化合物的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈的存在下)进行选择或筛选来鉴定。将预期的是,在这一信号传导途径的其他组分的突变也将是有益的。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。
在某些实施例中,这一方面的转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性、但不是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有100%同一性的氨基酸序列。例如,在某些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:1的位置743处具有突变。在具体实施例中,在SEQ ID NO:1的位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M743T。在其他实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。在具体实施例中,在SEQ ID NO:43的位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M786T。
在一些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的亲本菌株是子囊菌真菌菌株。在具体实施例中,该亲本菌株是丝状真菌菌株。相关地,该工程改造的真菌菌株包含由变体组氨酸激酶基因编码的变体组氨酸激酶,其中该变体组氨酸激酶包含如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性并且在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的位置743处具有突变以及在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。
在一些实施例中,这一方面的转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产高得多的量的目的蛋白。例如,这一方面的转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、或甚至至少约150%更高的量的目的蛋白。
在第三方面,本披露提供了与其亲本菌株相比通过工程改造的、转化的、或衍生的真菌菌株改进蛋白质生产的方法,该方法包括使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因。
在一些实施例中,在这一方面的方法中使用的变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在一些实施例中,变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在某些实施例中,该变体组氨酸激酶基因编码作为响应外部渗透压的信号传导途径的一部分起作用的多肽。在这种组氨酸激酶中具有突变的菌株可以通过对某些化合物的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈的存在下)进行选择或筛选来鉴定。将预期的是,在这一信号传导途径的其他组分的突变也将是有益的。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。
在某些实施例中,在这一方面的方法中使用的变体组氨酸激酶基因编码如下多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性、但不是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43具有100%同一性的氨基酸序列。例如,在这一方面的方法中使用的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性,并且在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的位置743处具有突变以及在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。在某些具体实施例中,在SEQ ID NO:1的位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M743T。在其他实施例中,在SEQ ID NO:43的位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即,M786T。
在一些实施例中,如在这一方面的方法中使用的工程改造的真菌菌株的亲本菌株是子囊菌真菌菌株。在具体实施例中,该亲本菌株是丝状真菌菌株。相关地,该工程改造的真菌菌株包含由变体组氨酸激酶基因编码的变体组氨酸激酶,其中该变体组氨酸激酶包含如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性,并且在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的位置743处具有突变以及在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。
在一些实施例中,在这一方面的方法中使用的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产高得多的量的目的蛋白。例如,该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、或甚至至少约150%更高的量的目的蛋白。
在另一个方面,本披露提供生产目的蛋白的方法,该方法包括使如本文中所描述的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或表达由变体组氨酸激酶基因编码的组氨酸激酶,分泌目的蛋白。
在又另一个方面,本披露提供通过使工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株(例如本文中所描述的真菌菌株)发酵生产的目的蛋白,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或表达由变体组氨酸激酶基因编码的组氨酸激酶。
在本文中发明的任何方面的实施例中,目的蛋白可以是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其混合物、其功能片段、或这些酶及其功能片段中的一种或多种的混合物。蛋白质的非限制性实例可以进一步包括淀粉代谢中涉及的蛋白质或酶;糖原代谢中涉及的蛋白质或酶;乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02-氧化还原酶,EC 1.1.3.5)、其变体、其功能片段或其组合。目的蛋白还可以是肽激素、生长因子、凝固因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如,HBV表面抗原、HPV E7等)、或以上物质的变体、功能片段、或两种或更多种的混合物。
在某些相关的方面,本披露提供包含本文所描述的任何方面的目的蛋白的组合物。本披露还提供了在生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理等中使用这样一种组合物的方法。
在进一步的方面,本披露提供了用于鉴定或筛选工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株相比(相对)于亲本菌株能够生产改变水平的目的蛋白,该方法包括以下步骤:
(a)将菌株接种到具有渗透剂和/或二甲酰亚胺杀真菌剂的琼脂板的表面上;并且
(b)筛选或选择比亲本菌株生长更快或更慢的菌株。
例如,在某些实施例中,渗透剂包括但不限于糖、糖醇和盐。在某些实施例中,渗透剂是糖,该糖包括但不限于葡萄糖、蔗糖、果糖、低聚果糖、果糖低聚糖、转化糖等。在某些其他实施例中,渗透剂是糖醇,该糖醇包括但不限于山梨糖醇、木糖醇、半乳糖基山梨糖醇等。在又其他实施例中,渗透剂是盐,该盐包括但不限于氯化钠和氯化钾。在另一个实施例中,杀真菌剂是二甲酰亚胺或苯基吡咯。在具体实施例中,杀真菌剂为异菌脲或咯菌腈。
在这一方面的一些实施例中,与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。不希望被理论所束缚,但是,可以预期,在这一信号传导途径的其他组分中的突变单独地或集体地对此类真菌菌株的生产率也是有益的。这一信号传导途径的合适的其他组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。
在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。
在一些实施例中,这一方面的工程改造的真菌菌株的亲本菌株是子囊菌真菌菌株。在具体实施例中,该亲本菌株是丝状真菌菌株。
合适的渗透剂可以包括糖、糖醇或盐中的一种或组合。例如,渗透剂可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、低聚果糖、果糖低聚糖、转化糖、山梨糖醇、木糖醇、半乳糖基山梨糖醇、氯化钠或氯化钾中的一种或多种。
附图简要说明
图1.描绘了TrNik-1的结构域架构的示意图。
图2.描绘了具有包含nik1M743T等位基因的基因置换盒的pRRAB nik1M743T的图谱。
图3A-3F.比较了RLP37、RLP37 Nik1M743T、和RLP37 ΔNik1在各种培养基上的菌落表型。图3A描绘了RLP37 Nik1M743T在Vogel基本培养基上的菌落表型。图3B描绘了RLP37在Vogel基本培养基上的菌落表型。图3C描绘了RLP37 Nik1M743T在具有山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图3D描绘了RLP37在具有山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图3E描绘了RLP37 ΔNik1在Vogel基本培养基上的菌落表型。图3F描绘了RLP37 ΔNik1在具有山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。
图4A-4B.比较了RLP37和RLP37 Nik1M743T在DASGIP 2L规模发酵中的蛋白质生产。图4A描绘了RLP37和RLP37 Nik1M743T的单位总蛋白质生产速率。图4B描绘了在相同条件下在发酵期间RLP37和RLP37 Nik1M743T基于供给糖的单位产量。
图5A-5B.比较了RLP37和RLP37 Nik1M743T在14L规模标准真菌发酵中的蛋白质生产。图5A描绘了RLP37和RLP37 Nik1M743T的单位总蛋白质生产速率。图5B描绘了在相同条件下在发酵期间RLP37和RLP37 Nik1M743T基于供给糖的单位产量。
图6.描绘了含有Δnik1::hph基因缺失盒的pRRAB Δnik1的质粒图。
图7A-7B.比较了RLP37和RLP37 ΔNik1在DASGIP 2 L规模发酵期间的单位总蛋白质生产速率。图7A描绘了RLP37和RLP37 ΔNik1的单位总蛋白质生产速率。图7B描绘了在相同条件下在发酵期间RLP37和RLP37 ΔNik1基于供给糖的单位产量。
图8A-8L.比较了各种菌株在各种培养基上的菌落表型。图8A描绘了NoCbh1Nik1M743T在具有尿苷的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8B描绘了NoCbh1在具有尿苷的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8C描绘了NoCbh1 Nik1M743T在具有尿苷和山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8D描绘了NoCbh1在具有尿苷和山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8E描绘了Cbh1 Nik1M743T在具有尿苷的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8F描绘了Cbh1在具有尿苷的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8G描绘了Cbh1Nik1M743T在具有尿苷和山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8H描绘了Cbh1在具有尿苷和山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8I描绘了TR Nik1WT在Vogel基本培养基上的菌落表型。图8J描绘了TR Nik1M743T在Vogel基本培养基上的菌落表型。图8K描绘了TRNik1WT在具有山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。图8L描绘了TR Nik1M743T在具有山梨糖醇的Vogel基本培养基上的菌落表型。
图9A-9B.比较了Cbh1和Cbh1 Nik1M743T在DASGIP 2 L规模发酵中的蛋白质生产。图9A描绘了Cbh1和Cbh1 Nik1M743T的单位总蛋白质生产速率。图9B描绘了在相同条件下在发酵期间Cbh1和Cbh1 Nik1M743T基于供给糖的单位产量。
图10A-10B.比较了Cbh1和Cbh1 Nik1M743T在14L规模标准真菌发酵中的蛋白质生产。图10A描绘了Cbh1和Cbh1 Nik1M743T的单位总蛋白质生产速率。图10B描绘了在相同条件下在发酵期间Cbh1和Cbh1 Nik1M743T基于供给糖的单位产量。
图11.描绘了具有包含nik1WT等位基因的基因置换盒的pRRAB nik1WT的图谱。
图12A-12B.比较了RLP37、TR Nik1M743T的亲本菌株、TR Nik1M743T和TR Nik1WT在DASGIP 2 L规模发酵中的蛋白质生产。图12A描绘了RLP37、TR Nik1M743T和TR Nik1WT的单位总蛋白质生产速率。图12B描绘了在相同条件下在发酵期间RLP37、TR Nik1M743T和TR Nik1WT基于供给糖的单位产量。
图13.比较了里氏木霉菌株RLP37和RLP37 Nik1M743T在具有或不具有杀真菌剂的培养基上的表型。图13A在Vogel基本培养基上的RLP37,图13B在Vogel基本培养基上的RLP37Nik1M743T,图13C在具有0.15%DMSO的Vogel基本培养基上的RLP37,图13D在具有0.15%DMSO的Vogel基本培养基上的RLP37 Nik1M743T,图13E在具有45μM异菌脲的Vogel基本培养基上的RLP37,图13F在具有45μM异菌脲的Vogel基本培养基上的RLP37 Nik1M743T。
图14.描绘了具有包含黑曲霉nik1M786T等位基因的基因置换盒的pRNnik1M786T的图谱。
图15.比较了含有野生型nik1等位基因的菌株GICC2071(对照)和含有nik1M786T等位基因的GICC2071 Nik1M786T突变菌株#99、117和121处于摇瓶规模的蛋白质生产。来自摇瓶的上清液在SDS-PAGE上运行。
图16.比较了在含有野生型nik1等位基因的菌株GICC2071和含有nik1M786T等位基因的GICC2071 Nik1M786T突变菌株#99、117和121之间处于摇瓶规模的上清液酶对PNPG的活性。相对吸光度归一化至GICC2071对照。误差条表示标准偏差。
发明内容
I.概述
本发明的菌株和方法涉及变体或突变丝状真菌细胞,该变体或突变丝状真菌细胞已经从其野生型亲本丝状真菌细胞进行遗传修饰以包含变体组氨酸激酶基因和/或表达由变体组氨酸激酶基因编码的变体组氨酸激酶,其中该细胞的组氨酸激酶介导的信号转导机制被实质改变或消除。此类菌株非常适合在改进的生产力水平上大规模生产目的蛋白。
II.定义
在描述本发明的菌株、组合物和方法之前,定义以下术语和短语。未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。
在提供了一系列值的情况下,应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示),该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内,并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内,服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下,排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。
本文提供了某些范围,其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时,接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性等值的数字。例如,关于数值,术语“约”是指数值的-10%至+10%的范围,除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中,短语“约6的pH值”是指pH值为从5.4至6.6,除非pH值另有具体定义。
本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制,这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此,将说明书作为一个整体参考时,下面即将定义的术语被定义得更全面。
将本文件分为若干部分以便于阅读;然而,读者将领会的是,在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式,用于本披露的不同部分的标题不应被解释为限制。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中,但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有公开物和专利都通过引用结合在此,就好像每个单独的公开物或专利被具体地并单独地指示为通过引用结合,并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对其在申请日之前的披露,并且不能理解为承认因为先前发明而本发明组合物和方法不能获得比这些公开物更早的申请日。此外,所提供的公开日期可能与实际公开日期不同,实际公开日期可能需要独立地证实。
根据这一详细说明,以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物,除非上下文中清楚地另外指出。因此,例如提及“酶”包括多个这样的酶,并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等效物,等等。
进一步注意的是,权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此,该陈述意在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语例如“单独”、“仅”等或利用“否定型”限定的前提基础。
进一步注意到,如本文使用的术语“基本上由……组成”是指一种组合物,其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总体组合物的以重量计小于30%的总量,并且不会有助于或干扰一种或多种组分的作用或活性。
进一步注意到,如本文所使用的术语“包含”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的组分是必需的或强制性的,但是包含一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或可选择的一种或多种组分。
还要注意的是,如本文所使用的术语“由……组成”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此,术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的,且组合物中不存在一种或多种其他组分。
如将对于本领域技术人员显而易见的是,在阅读本披露时,本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征,这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
如本文所使用的,术语“目的蛋白”是指期望在丝状真菌中表达的多肽(任选地以高水平和出于商业化的目的)。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等。
如本文所使用的,术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用,是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。聚合物可以是线性的或支化的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经自然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物;这些修饰是例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰,例如与标记组分轭合。定义中还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的,当与多肽结合使用时,“变体”是指通常通过应用重组DNA技术,通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸而衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽可以通过一个或多个、或几个(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸残基与亲本多肽不同。变体多肽可以通过其初级氨基酸序列与亲本多肽的同源性/同一性的水平来定义。优选地,变体多肽与亲本或参考多肽具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的氨基酸序列同一性。变体多肽通常不包含与亲本/参考多肽的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
当与多核苷酸或基因结合使用时,术语“变体”是指与亲本或参考多核苷酸或基因具有特定程度的同源性/同一性的多核苷酸,或能够在严格条件下与亲本或参考多核苷酸或基因序列、或其补体杂交。例如,变体多核苷酸可以合适地与亲本多核苷酸具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的核苷酸序列同一性。变体多核苷酸或基因通常不包含与亲本/参考多核苷酸或基因的核苷酸序列具有100%同一性的核苷酸序列。
如本文所使用的,术语“组氨酸激酶”是指存在于细菌、酵母、丝状真菌和植物中的信号传导因子,其介导组氨酸磷酸化作用。组氨酸激酶主要是跨膜受体,这些中的极少数是可溶性细胞质蛋白。在任一形式中,这些激酶是模块化的,具有连接到不同感觉结构域的高度保守的催化传送区域。受体组氨酸激酶通过跨膜结构域将其感觉结构域连接到其细胞质传送区域。传送区域由两个结构域组成:N-末端DHp(二聚化和组氨酸磷酸转移)结构域和C-末端CA(催化和ATP结合)结构域(Stock,A.M.等人,Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴](2000)69:183-215)。除了少数例外,组氨酸激酶作为同源二聚体起作用,并且它们的二聚化由形成四螺旋束的DHp结构域介导(Goodman等人,Genes Dev.[基因开发](2009)23:249-59)。
如本文所使用的,术语“混合型组氨酸激酶”是组氨酸激酶结构域和应答调节结构域存在于相同的蛋白质中的一种组氨酸激酶的类型。在酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,仅有一种混合型组氨酸激酶基因(SLN1)存在于基因组中(Ota,I.M.等人,Science[科学](1993)262,566-569)。在酵母中,Sln1参与高渗透压响应。该响应涉及甘油作为细胞中主要相容性溶质的积累(Posas,F.等人,Cell[细胞](1996)86,865-875)。在植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,9个混合型和3个常规的组氨酸激酶基因存在于基因组中,并且12个组氨酸激酶基因中的2个可以与酵母sln1突变体互补(Reiser,V.等人,J.Cell Biol.[细胞生物学杂志](2003)161,1035-1040)。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)也具有能够与酵母sln1突变体互补的SLN1同系物(Furukawa,K.等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学](2002)68,5304-5310)。在丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中,与Sln1同系物不同的混合型组氨酸激酶Os-1/Nik-1参与了os(渗透敏感)信号转导途径,并且是适应于高渗透压条件所需要的(Alex,L.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1996)93,3416-3421)。
如本文所使用的,术语“组III组氨酸激酶”是指具有由HAMP结构域重复组成的独特的N-末端区域的组氨酸激酶,该HAMP结构域重复发现于信号传导相关蛋白中,这些信号传导相关蛋白包括组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基受体趋化性蛋白和磷酸酶(Aravind L,Ponting CP,FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯](1999)176:111-116)。例如,粗糙脉孢菌Os-1p(也被称为Nik1p)、灰葡萄孢霉(B.fuckeliana)Daf1p(也被称为BcOs1p)和异旋孢腔菌(C.heterostrophus)Dic1p(也被称为ChNik1p)特征在于由HAMP结构域重复组成的独特的N-末端区域(Catlett,N.L.等人,Cell[细胞](2003)2,1151-1161)。系统发育分析揭露了真子囊菌(异旋孢腔菌、串珠状赤霉(G.moniliformis)、粗糙脉孢菌和灰葡萄孢霉)组氨酸激酶的11个主要的组。这些组中的许多包含在丝状子囊菌中高度保守的组氨酸激酶。其他组更具相异性,包含在物种内已扩展的基因家族以及很少的物种之间的明确的直向同源物。这些分组表明,一些组氨酸激酶基因对于大多数或所有子囊菌共享的基本功能(例如,渗透感)是必需的,而其他可能已经进化以适应病原体的生活方式的特定方面。这些结构域的精确功能是未知的;然而,在NIK1HAMP重复区域中的突变是最严重的渗透敏感性和二甲酰亚胺抗性表型的原因(Miller,T.K.等人,Fungal Genet.Biol.[真菌遗传与生物学](2002)35:147-155)。
如本文所使用的,术语“真菌”是指包括微生物(例如酵母和霉菌以及蕈类)的大量真核生物体的任何成员。将这些生物分类为与植物、动物、原生生物和细菌分离和不同的一个界,真菌。一个主要区别是真菌细胞具有含几丁质的细胞壁,这与植物和一些原生生物的含纤维素的细胞壁不同,并且也与细菌的细胞壁不同。
如本文所使用的,术语“子囊菌真菌菌株”是指真菌界中的子囊菌门中的任何生物体。子囊菌真菌细胞的实例包括但不限于盘菌亚门的丝状真菌,例如木霉属、曲霉属、毁丝霉属和青霉属的物种。
如本文所使用的,术语“丝状真菌”是指真菌门和卵菌门的所有丝状形式。例如,丝状真菌包括但不限于支顶孢属、曲霉属、翘孢霉属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属物种。在一些实施例中,丝状真菌可以是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉。在一些实施例中,丝状真菌是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、或镰孢霉(Fusariumvenenatum)。在一些实施例中,丝状真菌是特异腐质霉(Humicola insolens)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、嗜热色串孢(Scytalidiumthermophilum)、或土生梭孢壳(Thielavia terrestris)。在一些实施例中,丝状真菌是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉,例如RL-P37(Sheir-Neiss等人,Appl.Microbiol.Biotechnology[应用微生物学和生物技术],20(1984)pp.46-53;Montenecourt B.S.,Can.,1-20,1987)、QM9414(ATCC No.26921)、NRRL 15709、ATCC13631、56764、56466、56767或绿色木霉例如ATCC 32098和32086。在一些实施例中,丝状真菌是里氏木霉RutC30,作为里氏木霉ATCC 56765其可获自美国典型培养物保藏中心。与此相关,在一些实施例中,本披露提供了本文所述的丝状真菌中的任一种的全细胞液体制剂。
“异源的”核酸构建体或序列具有不是其被表达的细胞天然的或以天然形式存在的序列的一部分。关于控制序列,异源的是指在自然界中不起调节与其目前正在调节的基因表达相同的基因的功能的控制序列(即启动子或增强子)。通常,异源的核酸序列对于它们存在的细胞或部分基因组不是内源的,并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有与在天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
如本文所使用的,术语“宿主细胞”可以合适地是任何真菌的细胞,无论是单细胞生物体、来源于多细胞生物体并且被置于组织培养物中的细胞、或作为多细胞生物体的一部分存在的细胞,其易于用根据本发明的核酸构建体进行转化。宿主细胞(例如酵母和其他真菌细胞)可以用于复制DNA并生产由如在本发明中使用的核苷酸序列编码的多肽。合适的细胞通常是丝状真菌或酵母。特别优选的是来自丝状真菌的细胞,优选地来自曲霉属例如黑曲霉和塔宾曲霉(A.tubingensis)的细胞。其他优选的生物体包括米曲霉、泡盛曲霉、嗜热毁丝霉、里氏木霉、绿色木霉或长柄木霉。
如本文所使用的,术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中整合并表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所使用的,术语“工程改造的真菌菌株”是指使用遗传工程技术构建的真菌菌株。
如本文所使用的,术语“亲本菌株”是指其基因组可以突变一次、两次或更多次以产生工程改造的菌株的微生物菌株。
如本文所使用的,术语“转化的”是指已经通过使用重组DNA技术转化的细胞。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列,即对于待转化的细胞而言不是天然的序列,例如融合蛋白。
术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“创建的”,并且通常表示一种指定的材料在另一种指定的材料中找到它的起源或具有可以参考另一种指定材料描述的特征。
如本文所使用的,术语“基因”意指涉及产生多肽的DNA的区段,该区段可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域,例如,5'非翻译区(5’UTR)或“前导”序列以及3’UTR或“尾部”序列,以及个体编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。在某些实施例中,基因可以合适地编码某些商业上重要的工业蛋白质或肽,例如酶,例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶或脂肪酶。目的基因可以是天然存在的基因、突变的基因或合成的基因。
如本文所使用的,术语“突变”是指核酸序列中的任何变化或改变。存在若干种类型的突变,包括点突变、框位移突变和剪接突变。可以特异性地进行突变(例如定点诱变)或随机地进行突变(例如经由化学试剂、通过修复减去的细菌菌株)。
如本文所使用的,术语“改进蛋白质生产”是指蛋白质生产过程,凭借该蛋白质生产过程从该过程生产的蛋白质的量增加。如此生产的蛋白质可以生产到培养基中或宿主细胞内,但优选是前者。增加的生产可以被检测为如与亲本宿主生物体相比更高的最大水平的蛋白质或酶活性,例如纤维素酶或半纤维素酶活性,或生产的总的细胞外蛋白质。
如本文所使用的,术语“比生产力”是指在给定时间段内生产的蛋白质的总量/细胞/时间。
如本文所使用的,术语“%同一性”与术语“%同源性”可互换使用,并且两者是指当使用序列比对程序进行比对时,编码任何一个本发明多肽或本发明多肽的氨基酸序列的核酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
III.具有改进的蛋白质生产的工程改造的真菌菌株
在第一方面,本披露涉及能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,并且在第二方面涉及遗传修饰真菌菌株使得其具有生产改变水平的目的蛋白的能力的方法。此外,本披露涉及通过使此类工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵生产的目的蛋白,并且进一步涉及包含如此生产的目的蛋白的组合物。此外,本披露涉及使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株生产目的蛋白的方法,以及生产和使用包含目的蛋白的组合物的方法。本披露还涉及用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白。
在第一方面,本披露提供工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或能够表达变体组氨酸激酶。在一些实施例中,本披露提供了与其亲本菌株相比能够生产显著更大量的目的蛋白的工程改造的真菌菌株。例如,该工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、或甚至至少约150%更高的量的目的蛋白。
在第二方面,本披露提供了转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株,这些真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该转化的真菌菌株或该衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或能够表达变体组氨酸激酶基因。
在第三方面,本披露提供了与其天然的、非工程改造的、未转化的或非衍生的亲本菌株相比通过工程改造的、转化的、或衍生的真菌菌株改进蛋白质生产的方法,该方法包括使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或能够表达变体组氨酸激酶基因。
在本文提供的任何方面,变体组氨酸激酶是野生型组氨酸激酶的变体。在一些实施例中,变体组氨酸激酶包含如下多肽或氨基酸序列,该多肽或氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性、但不是与SEQ ID NO:1具有100%同一性。在其他实施例中,变体组氨酸激酶包含如下多肽或氨基酸序列,该多肽或氨基酸序列与SEQ ID NO:43具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性、但不是与SEQ ID NO:43具有100%同一性。例如,该变体组氨酸激酶合适地是由变体组氨酸激酶基因编码的变体组氨酸激酶,其中该变体组氨酸激酶包含如下氨基酸序列,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约60%(例如,至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或甚至更高%)同一性,并且在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的位置743处具有突变以及在SEQ ID NO:43的位置786处具有突变。
A.组氨酸激酶
组氨酸激酶是传感器蛋白质,其可以检测外部信号并将其转化为可转导的细胞事件。外部刺激的检测和将细胞内的这些信号转移以产生适当的响应对于生物体在其生命周期中适应不同的环境条件来说是至关重要的。信号传导机制作为两个组分系统或者作为更复杂生物体中的磷酸转移系统发现于所有活细胞中。这样的系统赋予磷酰基基团从通常是膜结合的组氨酸激酶到响应调节蛋白的信号传递,从而触发各种生理响应。磷酸化作用可以促进寡聚化(Weiss,V.、F.Claverie-Martin和B.Magasanik,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1992)89:5088-5092;Webber,C.A.和R.J.Kadner,Mol.Microbiol.[分子微生物学](1997)24:1039-1048)、二聚化(Cobb,M.H.和E.J.Goldsmith,TrendsBiochem.Sci.[生物化学科学趋势](2000)25:7-9)、与其他蛋白质的相互作用(Blat,Y.和M.Eisenbach,Biochemistry[生物化学](1994)33:902-906;Newton,A.C.,Chem.Rev.[化学综述](2001)101:2353-2364)、与DNA的相互作用(Aiba,H.、F.Nakasai、S.Mizushima和T.Mizuno,J.Biochem.[生物化学杂志](1989)106:5-7)、或者这些机制的组合(Harlocker,S.L.、L.Bergstrom和M.Inouye,J.Biol.Chem.[生物化学杂志](1995)270:26849-26856)。磷酸转移系统已经涉及调节致病和非致病细菌和真菌中的分化过程、趋化性、次生代谢物生产和毒力相关过程(Grebe,T.W.和J.B.Stock,Adv.Microb.Physiol.[微生物生理学进展](1999)41:139-227;Wolanin,P.M.、P.A.Thomason和J.B.Stock,Genome Biol.[基因组生物学](2002)3:综述3013)。
混合型组氨酸激酶、磷酸转移信号传导系统由两个组分作为基本信号传导因子组成:自磷酸化组氨酸激酶和从其接受磷酸以将信息发送到下游区域的响应调节器,该信号传导系统参与植物、粘液霉菌、真菌和细菌中、但不参与动物中的若干种信号转导途径(Catlett,N.L.等人,Cell[细胞](2003)2,1151-1161)。它们在对环境刺激的响应中起关键作用,并且调节各种过程,包括植物和动物病原体中的毒力(Wolanin,P.M.、P.A.Thomason和J.B.Stock,2002,Genome Biol.[基因组生物学](2002)3:综述3013)。
在真菌中,将组氨酸激酶分类为11个组(Catlett,N.L.等人,Cell[细胞](2003)2,1151-1161)。通常,除了HisKA结构域之外,混合型组氨酸激酶基因包含REC(信号接收器)结构域(PF00072)、HATPase(组氨酸样ATP酶,PF02518)结构域、和不同的信号传导结构域,例如HAMP-(组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基受体蛋白和磷酸酶;PF00672)和ATP酶结构域(PF13191)。组III组氨酸激酶具有由HAMP结构域重复组成的独特的N-末端区域,该HAMP结构域重复发现于信号传导相关蛋白中,这些信号传导相关蛋白包括组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基受体趋化性蛋白和磷酸酶(Aravind L、Ponting CP,FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯](1999)176:111-116)。
组III组氨酸激酶被称为环境应激响应、致病性、菌丝发育和孢子形成的介导子(Li,S.等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志](1998)17:6952-6962;Hohmann,S.,Mol.Biol.Rev.[分子生物学综述](2002)66:300-372;Nemecek,J.C.等人,Science[科学](2006)312:583-588;Viaud,M.等人,Mol.Plant Microbe Interact.[分子植物与微生物相互作用](2006)19:1042-1050;Islas-Flores等人,Asian J.Biochem.[亚洲生物化学杂志](2011)6:1-14)。这些组氨酸激酶基因的突变导致对苯基吡咯和二甲酰亚胺杀真菌剂的抗性并且还导致增加的渗透敏感性(Cui,W.;Beever,R.E.、Parkes,S.L.、Weeds,P.L.和Templeton,M.D.,Fungal Genet.Biol.[真菌遗传学与生物学](2002)36,187-198;Ochiai,N.;Fujimura,M.、Motoyama,T.、Ichiishi,A.、Usami,R.、Horikoshi,K.和Yamaguchi,I.,Pest.Manag.Sci.[有害生物管理科学](2001)57,437-442)。在异旋孢腔菌中,dic1的无效突变体和在HAMP结构域重复中具有缺失或点突变的突变体对渗透胁迫高度敏感,并且对前述杀真菌剂具有高度抗性(Yoshimi A、Tsuda M、Tanaka C,Mol Genet Gennomics[分子遗传与基因组学](2004)271:228-236。在粗糙脉孢菌os-1和灰葡萄孢霉daf1中观察到由突变产生的相似效应(Cui,W.;Beever,R.E.、Parkes,S.L.、Weeds,P.L.和Templeton,M.D.,Fungal Genet.Biol.[真菌遗传学与生物学](2002)36,187-198;Ochiai,N.;Fujimura,M.、Motoyama,T.、Ichiishi,A.、Usami,R.、Horikoshi,K.和Yamaguchi,I.,Pest.Manag.Sci.[有害生物管理科学](2001)57,437-442)。在异旋孢腔菌dic1的激酶结构域或调节器结构域内的单个氨基酸变化改变了对渗透胁迫的敏感性,并且赋予了对杀真菌剂的中等抗性。因此,组III组氨酸激酶被认为是推定的渗透传感器(Schumacher,M.等人,CURR MICROBIOL[现代微生物学](1997)34,340-347)。此外,组III组氨酸激酶的成员被认为是商业杀有害生物剂的靶标,该杀有害生物剂是例如咯菌腈、异菌脲和抗真菌天然产物安布替星(Motoyama,T.;Ohira,T.、Kadokura,K.、Ichiishi,A.、Fujimura,M.、Yamaguchi,I.和Kubo,T.,Curr.Genet.[现代遗传学](2005b)47,298-306;Dongo A、Bataillé-Simoneau N、Campion C、Guillemette T、Hamon B等人,Appl,Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学](2009)75:127-134)。
在一个实例中,本披露中通过生物信息学分析里氏木霉组氨酸激酶基因(TrNik-1)的结构域架构,并且已显示TrNik-1含有5个HAMP功能结构域、1个HisKA功能结构域、1个HATPase结构域和1个REC功能结构域(图1)。根据该结构域架构,TrNik-1属于组III组氨酸激酶。里氏木霉组氨酸激酶(TrNik1)的氨基酸或多肽序列在下文显示为SEQ ID NO:1:
MIEDTAALAAAAELIASLACDPASASASSSLVSVGPGSSIKLPGRENPAKRTLEIELEKLVLRISQLESRASASANASVFPETPNEVNDTLFNDDVDPSVNGRPPLTKEALQGLRDHVDDQSKLLDSQRQELAGVNAQLLEQKQLQERALAMLEQERVATLERELWKHQKANEAFQKALREIGEIVTAVARGDLTMKVRMNSVEMDPEITTFKRTINAMMDQLQTFASEVSRVAREVGTEGLLGGQARIGGVDGVWKELTDNVNIMAQNLTDQVREIASVTTAVAHGDLTKKIERPAKGEILQLQQTINTMVDQLRTFASEVTRVARDVGTEGILGGQADVGGVKGMWNDLTVNVNAMANNLTTQVRDIIKVTTAVAKGDLTQKVQAECRGEMFKLKSTINSMVDQLQQFAREVTKIAREVGTEGRLGGQATVHDVEGTWRDLTENVNGMAMNLTTQVREIAKVTTAVARGDLTKKIGVEVKGEILELKNTINQMVDRLGTFAVEVSKVAREVGTDGTLGGQAQVANVEGKWKDLTENVNTMASNLTVQVRSISAVTQAIANGDMSQTIDVEANGEIQVLKETINNMVSRLSSFCYEVQRVAKDVGVDGKMGAQADVAGLNGRWKEITTDVNTMASNLTTQVRAFSDITNLATDGDFTKLVDVEASGEMDELKKKINQMISNLRDSIQRNTQAREAAELANKTKSEFLANMSHEIRTPMNGIIGMTQLTLDTDLTQYQREMLNIVNDLANSLLTIIDDILDLSKIEARRMVIEEIPYTLRGTVFNALKTLAVKANEKFLDLTYKVDSSVPDYVIGDSFRLRQIILNLVGNAIKFTEHGEVSLTIQEQEDKRHVGPGEYAIEFIVEDTGIGIAKDKLNLIFDTFQQADGSMTRKFGGTGLGLSISKRFVNLMGGDLWVNSEVGKGSEFHFTCRVKLADVHAESVQQQLKPYRGHQVLFVDKSQSNAATHIGEMLEEIGLHPVVVNSEKSSALTRLKEGGALPYDAIIVDSIDTARRLRAVDDFKYLPIVLLAPVVHVSLKSCLDLGITSYMTMPCKLIDLSNGMIPALENRATPSLADVTKSFEILLAEDNTVNQKLAVKILEKYHHVVTVVGNGWEAVEAVKQKKFDVILMDVQMPIMGGFEATGKIREYERGMGTHRTPIIALTAHAMMGDREKCIQAQMDEYLSKPLQQNQLIQTILKCATLGGALLEKNRERELALQAEAKAYQDLPY
黑曲霉组氨酸激酶(AnNik1)的氨基酸或多肽序列在下文显示为SEQ ID NO:43:
MAGADETLAAAAAILKGLAKETPSSSAPPFDFEFSHPPANGYDTKLAKLPGETSSAKAAFEQELEALVRRVRHLEFQNVSHHQSTPKSSQSSLTPGEKDADFLWSFGLSRVSSRDGSDSCLSQHQKTTQQQQQQQPHGSRRSAIEPEDHEVEEDIDDEESDEDEELNSRTRLVREEDISYLRNHVQKQAEEISFQKDIIAQVRDELQQQEEQTRRALTKVENEDVVLLERELRKHQQANEAFQKALREIGGIITQVANGDLSMKVQIHPLEMDPEIATFKRTINTMMDQLQVFGSEVSRVAREVGTEGILGGQAQITGVHGIWKELTENVNIMAKNLTDQVREIAAVTTAVAHGDLSQKIESRAQGEILELQQTINTMVDQLRTFATEVTRVARDVGTEGVLGGQAQIEGVQGMWNELTVNVNAMANNLTTQVRDIATVTKAVAKGDLTQKVQANCKGEIAELKNIINSMVDQLRQFAQEVTKIAKEVGTDGVLGGQATVNDVEGTWKDLTENVNRMANNLTTQVREIADVTTAVAKGDLTKKVTANVQGEILDLKSTINGMVDRLNTFAFEVSKVAREVGTDGTLGGQAKVDNVEGKWKDLTDNVNTMAQNLTSQVRSISDVTQAIAKGDLSKKIEVHAQGEILTLKVTINHMVDRLAKFATELKKVARDVGVDGKMGGQANVEGIAGTWKEITEDVNTMAENLTSQVRAFGEITDAATDGDFTKLITVNASGEMDELKRKINKMVSNLRDSIQRNTAAREAAELANRTKSEFLANMSHEIRTPMNGIIGMTQLTLDTDDLKPYTREMLNVVHNLANSLLTIIDDILDISKIEANRMVIESIPFTVRGTVFNALKTLAVKANEKFLSLTYQVDNTVPDYVIGDPFRLRQIILNLVGNAIKFTEHGEVKLTICKSDREQCAADEYAFEFSVSDTGIGIEEDKLDLIFDTFQQADGSTTRRFGGTGLGLSISKRLVNLMGGDVWVTSEYGHGSTFHFTCVVKLADQSLSVIASQLLPYKNHRVLFIDKGENGGQAENVMKMLKQIDLEPLVVRNEDHVPPPEIQDPSGKESGHAYDVIIVDSVATARLLRTFDDFKYVPIVLVCPLVCVSLKSALDLGISSYMTTPCQPIDLGNGMLPALEGRSTPITTDHSRSFDILLAEDNDVNQKLAVKILEKHNHNVSVVSNGLEAVEAVKQRRYDVILMDVQMPVMGGFEATGKIREYERESGLSRTPIIALTAHAMLGDREKCIQAQMDEYLSKPLKQNQMMQTILKCATLGGSLLEKSKESRISSSGEMHPVHHSGPDGKSQQRPGLEPRSVTATSTINRGGGLASPNVDRADELAVERALLRSNSS
B.包含突变或敲除的组氨酸激酶的工程改造的真菌菌株
在一个实施例中,里氏木霉天然的nik1组氨酸激酶等位基因的修饰可以引起分泌型蛋白的量的增加。nik1修饰是开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:1)中将Nik1蛋白的位置743处的氨基酸从Met(ATG)改变为Thr(ACG)的单个核苷酸T至C取代。
已经进行了含有修饰的nik1M743T组氨酸激酶等位基因的菌株与含有nik1野生型(天然的)等位基因的宿主菌株的蛋白质生产的比较,并且发现RLP37 Nik1M743T基于供给糖的单位总蛋白质生产速率和单位产量显示比RLP37的显著改进(图4)。这表明将修饰的nik1组氨酸激酶引入宿主里氏木霉菌株导致蛋白质生产增加。
在其他实施例中,黑曲霉天然的nik1组氨酸激酶等位基因的修饰可以引起分泌型蛋白的量的增加。nik1修饰是开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO:43)中将Nik1蛋白的位置786处的氨基酸从Met(ATG)改变为Thr(ACG)的单个核苷酸T至C取代。
已经进行了含有修饰的nik1M786T组氨酸激酶等位基因的菌株与含有nik1野生型(天然的)等位基因的宿主菌株的蛋白质生产的比较,并且发现GICC2071 Nik1M786T的蛋白质生产和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)底物的酶活性显示出比野生型亲本GICC2071的改善(图15和16)。这表明将修饰的nik1组氨酸激酶引入宿主黑曲霉菌株导致蛋白质生产增加。
在一些实施例中,变体组氨酸激酶是天然组氨酸激酶的变体,因为其包含任何种类的突变,例如单个或多个(例如,少数,即1、2、3、4、5、6、7、8、9个或甚至10个或更多个)突变,例如置换、插入、缺失、转座、终止(引入终止密码子)和点突变。在某些情况下,可以发生单碱基对取代,凭借此单个核苷酸碱基被相同位置处的不同核苷酸碱基取代,其中DNA的另一条链上的互补碱基发生相应取代。任何这样的单碱基对取代在本文中考虑为本发明的实施例,因此与野生型、亲本组氨酸激酶基因相比,变体组氨酸激酶可以由包含单碱基对取代的多核苷酸序列编码。变体多核苷酸的突变可以出现在蛋白质编码区域或出现在编码核糖体或转移RNA的区域中。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些突变,这些诱变程序例如是定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如,若干个)突变的技术。通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变,所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常,消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的,从而允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见,例如,Scherer和Davis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1979)76:4949-4955;以及Barton等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究](1990)18:7349-4966。还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见,例如,美国专利申请公开号2004/0171154;Storici等人,Nature Biotechnol.[自然生物技术](2001)19:773-776;Kren等人,Nat.Med.[自然医学](1998)4:285-290;以及Calissano和Macino,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯](1996)43:15-16。在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
随机诱变可以通过各种方法之一来实现。一种方法是在诱变试剂例如2-氨基嘌呤(2AP)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或甲磺酸乙酯(EMS)等存在下通过生长进行化学诱变(Foster,P.L.,Methods Enzymol[酶学方法](1991)204:114-125)。用于化学诱变的方法是本领域熟知的并且由Miller,J.H.详细描述(A short course in bacterialgenetics:a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and relatedbacteria.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.1992[细菌遗传学的短期课程:大肠杆菌和相关细菌的实验室指南和手册,纽约州普莱恩维尤市冷泉港实验室出版,1992年])。如由Selifonova等人(Appl Environ.Microbio.[应用与环境微生物学](2001)l67:3645-3649)所述的,诱变也可以通过从质粒表达突变基因例如mutD5来完成。也可以通过转座子诱变、基因组改组、基因从质粒的过表达或其他细胞工程技术操纵细胞基因组(Kleckner,N.、Bender,J.和Gottesman,S.,Methods Enzymol[酶学方法](1991)204:139-180;Patnaik,R.,Biotechnol.Prog.[生物技术进展](2008)24:38-47)。如在Miroux和Walker的方法中(美国专利号6,361,966),突变细胞也可以通过简单地快速生长细胞并允许复制错误以自然发生而产生。为了获得越来越好的突变体,可以进行2轮或更多轮的诱变,并且每轮可以使用相同或不同的诱变方法。
在某些实施例中,变体组氨酸激酶是变体组III组氨酸激酶,并且可以是TrNik-1或AnNik-1的天然存在的变体,该TrNik-1或AnNik-1的天然存在的变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的氨基酸序列同一性,但是该变体组氨酸激酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43不具有100%相同的序列。
在某些实施例中,该变体组氨酸激酶可以通过对某些化合物的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈的存在下)进行筛选来鉴定。
在一些实施例中,变体组氨酸激酶可以从非里氏木霉或黑曲霉的真菌菌株获得,并且该变体组氨酸激酶基因包含如下多肽序列,该多肽序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至约99%同一性,但是该变体组氨酸激酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43不是100%相同。
在一些实施例中,组氨酸激酶来源于木霉属物种,特别是里氏(长柄)木霉。组氨酸激酶也可以来源于另一种真菌,例如犁头霉属的物种;支顶孢属的物种;Agancus属的物种、厌氧鞭菌属的物种(Anaeromyces spp);曲霉属的物种,包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黄曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、反丁烯二酸曲霉(A.fumaricus)、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor);Aeurobasidium spp.;头孢菌属的物种(Cephalosporum spp.);毛壳菌属的物种(Chaetomium spp.);金孢子菌属的物种(Chrysosporium spp);鬼伞属的物种(Coprinus spp);Dactyllum属的物种;镰刀菌属的物种,包括F.conglomerans、拾胞镰孢菌(F.decemcellulare)、爪哇镰刀菌(F.javanicum)、F.lim、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和腐皮镰刀菌(F.solani);胶枝霉属的物种(Gliocladium spp.);腐质霉属的物种,包括特异腐质霉(H.insolens)和绵毛状腐质菌(H.lanuginosa);毛霉属的物种;毁丝霉属的物种,包括嗜热毁丝霉;脉孢菌属的物种(Neurospora spp.),包括粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食链孢霉(N.sitophila);新美鞭菌属的物种(Neocallimastix spp);根囊鞭菌属的物种(Orpinomyces spp.);青霉属的物种;平革菌属的物种(Phanerochaete spp.);射脉菌属的物种(Phlebia spp.);瘤胃壶菌属的物种(Piromyces spp.);假单胞菌属的物种;根霉属的物种(Rhizopus spp.);裂褶菌属的物种(Schizophyllum spp.);栓菌属的物种(Trametesspp);木霉属的物种,包括里氏木霉、里氏木霉(长柄木霉)和绿色木酶(T.viride);或接霉属的物种(Zygorhynchus spp.)。类似地,可以设想组氨酸激酶可以在细菌中找到,该细菌例如是芽孢杆菌属的物种、纤维单胞菌属的物种(Cellulomonas spp.);梭菌属的物种(Clostridium spp.)、毁丝霉属的物种(Mysoliophthora spp.);高温单孢菌属的物种(Thermomonospora spp);链霉菌属的物种,产橄榄色链霉菌(S.olivochromogenes);产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes);并且该酵母菌包括念珠菌(Candidatorresn);C.parapsllosis;清酒假丝酵母(C.sake);涎沫假丝酵母(C.zeylanoides),小毕赤酵母(Pichia minuta);黏红酵母(Rhodotorula glutinis);胶红酵母(R.mucilaginosa)或红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)。
在一个实例中,构建Nik1缺失菌株(RLP37 ΔNik1),以便确定nik1M743T等位基因是否导致功能获得或功能丧失。RLP37 ΔNik1菌株与含有野生型等位基因的RLP37宿主菌株的蛋白质生产和其他特征的比较表明,nik1M743T等位基因是功能获得等位基因,导致功能获得表型(图12)。
在某些实施例中,该变体组氨酸激酶基因编码作为响应外部渗透压的信号传导途径的一部分起作用的多肽。可以预期,这一信号传导途径的其他组分的突变也将是有益的。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。
出于本发明的目的,术语“渗透压”是指阻止水穿过丝状真菌的细胞膜的净流量所需要的静水压力。例如,暴露于真菌细胞的渗透压可以通过在培养真菌细胞的生长培养基中的组分例如盐或山梨糖醇(例如高达1.2M)的浓度而变化。细胞耐受高渗透压的能力是有益的,并且可以与细胞生产更大量的目的蛋白的能力相关联。按照这些原则,本发明的工程改造的真菌菌株或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比具有改进的耐受渗透压的能力。
C.蛋白质生产的检测
为了证实工程改造的真菌菌株具有生产改进水平的目的蛋白的能力,可以进行各种筛选方法。表达载体可以编码用作可检测标签的与靶蛋白的多肽融合物,或者靶蛋白本身可以用作可选择或可筛选的标记。可以经由蛋白质印迹、斑点印迹(可获自冷泉港试验方案网站(Cold Spring Harbor Protocols website)的方法)、ELISA、或者(如果标记为GFP)全细胞荧光或FACS来检测经标记的蛋白质。例如,将包含6-组氨酸标签作为与靶蛋白的融合物,并且该标签将通过蛋白质印迹检测。如果靶蛋白以足够高的水平表达,可以进行与考马斯/银染色结合的SDS-PAGE以检测与野生型相比突变体表达的增加,在这种情况下不需要标记。此外,可以使用其他方法来确认目的蛋白的改进水平,例如,检测蛋白质活性或每个细胞中的量、蛋白质活性或每毫升培养基中的量的增加,从而允许培养或发酵有效地继续更长时间,或通过这些方法的组合。
比生产力的检测是评估蛋白质生产的另一种方法。比生产力(Qp)可以通过以下公式确定:
Qp=gP/gDCW·hr
其中“gP”是在罐中生产的蛋白质的克数,“gDCW”是在罐中的干细胞重量(DCW)的克数,“hr”是从接种时间开始的几小时内的发酵时间,其包括生产时间以及生长时间。
在一些实施例中,该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约0.5%,例如,至少约0.5%、至少约0.7%、至少约1%、至少约1.5%、至少约2.0%、至少约2.5%、或甚至至少约3%、或更多的目的蛋白。
D.使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株来生产目的蛋白
在一个方面,本披露提供了产生目的蛋白的方法,该方法包括使工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株分泌目的蛋白,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株在其组氨酸激酶基因中包含突变。
用于转化真菌和培养真菌的标准技术是本领域公知的,并且可以用于转化本发明的改进的宿主以生产重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化;电穿孔;核显微注射;转导;转染,例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染;与磷酸钙DNA沉淀一起孵育;用DNA包被的微粒高速轰击;基因枪(gene gun或biolistic)转化和原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见,例如Ausubel等人(1987),同上,第9章;Sambrook等人(2001),同上;以及Campbell等人,Curr.Genet.[现代遗传学](1989)16:53-56。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725;6,268,328;Harkki等人,Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术](1991)13:227-233;Harkki等人,BioTechnol.[生物技术](1989)7:596-603;EP 244,234和EP 215,594中。对于曲霉属菌株的转化,还参考了Cao等人,Science[科学](2000)9:991-1001。
通常,使用已经进行了渗透性处理的原生质体或细胞转化木霉属的物种,通常以105至107/mL、特别是2×106/mL的密度进行。将100μL体积的在合适的溶液(例如1.2M山梨糖醇和50mM CaCl2)中的这些原生质体或细胞与所希望的的DNA混合。通常,向摄取溶液中添加高浓度的聚乙二醇(PEG)。也可以将添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中以促进转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。参见,例如美国专利号6,022,725和6,268,328,其两者都通过引用并入本文。
在一些实施例中,本发明提供了产生目的蛋白的方法,该方法包括使工程改造的真菌菌株或转化的真菌菌株和衍生的真菌菌株发酵,其中该工程改造的或转化的和衍生的真菌菌株分泌目的蛋白。在本领域中熟知的发酵方法可以用于使工程改造的或转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中,真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。经典的分批发酵是封闭的系统,其中在发酵开始时设定培养基的组成,并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时,用一种或多种所希望的生物体接种培养基。在这种方法中,允许发酵发生而不向系统添加任何组分。通常,分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格,并且经常对控制因素(例如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在分批培养中,细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期,最后进入生长速率减少或停止的稳定期。如果不经处理,处于稳定期的细胞最终死亡。通常,在对数期的细胞负责产物的大量生产。
标准分批系统的一个合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中,随着发酵的进展,将底物以增量添加。当分解代谢物抑制可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下,补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的,并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO2)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是熟知的。
连续发酵是一个开放的系统,在该系统中,将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中,同时除去等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度,其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如,在一个实施例中,将限制营养素(例如碳源或氮源)维持在固定的速率,并且允许调节所有其他参数。在其他系统中,影响生长的许多因素可以不断改变,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳定态的生长条件。因此,由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
E.由工程改造的、转化的或衍生的菌株生产的目的蛋白
在某些方面,本披露提供了通过使工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵产生的目的蛋白,其中工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或能够表达变体组氨酸激酶。
目的蛋白可以是任何内源和异源的蛋白质。蛋白质可以含有一个或多个二硫键,或者是其功能形式是单体或多聚体的蛋白质,即蛋白质具有四级结构并且由多个相同(同源的)或不相同的(异源的)亚基构成,其中目的蛋白优选是具有目的性质的蛋白质。目的蛋白或目的变体蛋白可以是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、这些酶中的两种或更多种的混合物、任何这些酶的功能片段、或任何这些酶的混合物及其功能片段。目的蛋白或变体蛋白质的非限制性实例还可以包括淀粉代谢中涉及的蛋白质或酶;糖原代谢中涉及的蛋白质或酶;乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02-氧化还原酶,EC 1.1.3.5)、其变体、其功能片段或其组合。
目的蛋白还可以合适地是肽激素、生长因子、凝固因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如,HBV表面抗原、HPV E7等)、其变体、其功能片段、或任何以上这些物质的混合物。
其他类型的目的蛋白或变体可以包括能够为食品或作物提供营养价值的那些蛋白质或变体。非限制性实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白质(例如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)。
F.由此制成的组合物的用途
在某些方面,本披露提供了包含由工程改造的真菌细胞生产的目的蛋白的组合物,其中该工程改造的真菌细胞包含变体组氨酸激酶基因和/或能够表达变体组氨酸激酶。该组合物使用本文提供的方法合适地生产。组合物包含由目的基因编码、使用本文所述的方法表达的目的蛋白。该组合物可用于各种有用的工业应用中,例如像用于生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理等中。
例如,可以将由本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于木质纤维素生物质水解。木质纤维素是世界上最大的可再生生物质资源,主要由木质素、纤维素和半纤维素构成,其中后者中大部分是木聚糖。将木质纤维素原料转化成乙醇具有以下优点:大量原料的即时可得性、避免燃烧或填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残留物、草本作物和市政固体废物已经被认为是用于乙醇生产的原料。一旦木质纤维素被转化为可发酵糖,例如葡萄糖,可发酵糖就容易被酵母发酵成乙醇。纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物生产水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。木聚糖是由1,4-β-糖苷连接的D-吡喃木糖形成的多糖。木聚糖酶(例如内切-1,4-β-木聚糖酶,EC3.2.1.8)水解木聚糖中的内部β-1,4-木糖苷键以产生较小分子量的木糖和木糖低聚物。本披露为这样的木质纤维素生物质用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,可以将通过本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于清洁应用。酶促清洁组分是受欢迎的,因为它们能够分解常规化学洗涤剂不容易分解的土壤、污渍和其他杂物。可用于清洁的众所周知的酶包括蛋白酶和淀粉酶,连同其他酶例如脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶,甚至是某些纤维素酶,这些酶各自提供一组不同的功能。蛋白酶与基于蛋白质的污渍相抗衡;淀粉酶对碳水化合物和淀粉起作用;并且脂肪酶分解例如脂质或脂肪。本披露为在清洁应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,可以将通过本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于谷物加工。淀粉是植物中最常见的储存碳水化合物,由植物本身以及由微生物和由高等生物使用。多种酶能够催化淀粉水解。来自所有植物来源的淀粉以颗粒的形式发生,但是取决于植物来源的种类,淀粉呈现明显不同的大小和物理特征。淀粉的酸水解在过去被广泛使用,然而这一过程现在已经在很大程度上被酶促加工所替换,已知所述酶促加工要求更少的耐腐蚀材料和其他益处,需要更少的加热能量,并且比酸处理相对更容易控制。本披露为在淀粉降解和谷物加工中的这样的用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,可以将通过本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于食品应用。由细菌、酵母和霉菌(molds或moulds)产生的酶数千年以来已经用于食品应用,以制作食品例如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒。今天,酶被用于面包店、奶酪制作、淀粉加工、以及果汁和其他饮料的生产中,提供各种益处,例如改善的质地、外观和营养价值,产生理想的香味和香气等。食品酶典型地来源于动物和植物(例如淀粉消化酶,即淀粉酶,可以从大麦种子发芽获得)以及来自一系列有益微生物。酶被认为是传统基于化学的技术的可行和理想的替代品,在许多工艺中替代合成的化学药品。酶可以帮助改善食品生产过程的环境性能,降低能源消耗并改善废物或副产品的生物降解性。就其作用而言,酶比合成的化学药品更具特异性,因此,酶促加工常常提供更少的副反应和废物或副产物,因此生产更高质量的产品并降低污染的可能性。酶促加工通常也是唯一可行的加工。这方面的一个实例是浓缩苹果清汁的生产,其依赖于酶(果胶酶)的使用。大多数食品酶由微生物例如芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属或克鲁维酵母属生产。本披露为在食品应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在另一个实例中,可以将通过本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于动物饲料添加剂。纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶和碳水化合物酶已经广泛用于动物饲料工业。由于许多基于植物的饲料包含具有减少动物生长的抗营养因子的物质,所以添加到此类饲料中的酶通过降解纤维、蛋白质、淀粉和植酸来改善这些抗营养因子的可消化性,使它们更易被动物消化,并且使得能够使用更便宜和通常在本地生产的饲料,同时使肉、蛋或奶的生产力最大化。同时,添加到此类饲料中的酶还可以提供支持肠道健康和增强的动物性能的益处。本披露为在动物饲料应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
在又进一步的实例中,可以将通过本披露的工程改造的宿主细胞生产的组合物、和/或使用与此一道提供的方法或过程用于纺织品应用。酶已经成为纺织品加工的一个不可分割的部分。在纺织品工业中存在两个已确立起来的酶应用。首先,酶(例如淀粉酶)通常用于预精整区域以用于退浆。第二,酶(例如纤维素酶)通常用于精整区域以用于软化、生物石化和减少棉制品的起球倾向。其他酶例如像果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶等也用于织物品加工。此外,有各种需要酶的应用,包括牛仔布和非牛仔布的褪色、生物洗擦、生物磨光、羊毛精整、过氧化物去除、染料的脱色等(Cavaco-Paulo A和Gübitz GM,Textile Processing with Enzymes[用酶进行纺织品加工]2003年,第1版;Chelikani P、Fita I、Loewen PC,Cell Mol Life Sci[细胞与分子生命科学](2004)61:192-208;Nalankilli.G.,Colourage,1998,XLV(10),17-19;Shenai,V.A.和Saraf,N.M.,Technologyof Finishing[精整的技术](1990),第X卷,第II版。本披露为在纺织品应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞,该真菌细胞已经被证明具有改进的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。
G.用于鉴定能够生产改变水平的目的蛋白的真菌菌株的筛选方法
在进一步的方面,本披露提供了用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株相比于亲本菌株能够生产改变水平的目的蛋白,该方法包括以下步骤:
(a)将菌株接种到具有渗透剂和/或二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂的琼脂板的表面上;并且
(b)选择或筛选比亲本菌株生长更快或更慢的菌株。
在一些实施例中,与亲本(未改变的)菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
在一些实施例中,与亲本(未改变的)菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂具有改变的敏感性或抗性的突变。
在一些实施例中,与亲本(未改变的)菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对渗透压具有改变的敏感性或抗性以及对二甲酰亚胺或苯基吡咯杀真菌剂具有改变的敏感性或抗性的突变。
据信,在这一信号传导途径的其他组分中的突变也将有益于真菌菌株的生产力。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。
在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的渗透试剂的存在下)进行筛选来鉴定。通常,将菌株接种到具有各种水平的渗透剂的营养琼脂板的表面上使得个体菌落出现并且可以在培养时区分,该渗透剂可以是一种或多种糖、糖醇或盐(例如葡萄糖、蔗糖、果糖、低聚果糖、果糖低聚糖、转化糖、山梨糖醇、木糖醇、半乳糖基山梨糖醇、氯化钠或氯化钾)中的一种或组合。突变体的生长显著受损;它倾向于形成超分支和肿胀的不规则形状的菌丝的小块。这些结果表明,突变体在高渗透压条件下不能形成明确定义的菌丝体。
改变的敏感性本身可以表现为在高渗透压的条件下比亲本、非突变的细胞生长更快的能力(即,对高渗透压的抗性),或者其在高渗透压的条件下与亲本、非突变的细胞相比生长速率降低(即,对高渗透压的敏感性)。
通过在相同条件下在浸没(液体培养)中的生长挑取比亲本类型生长更快或更慢的个体菌落用于进一步评估,并且比较它们的单位总分泌型蛋白生产速率和基于供给糖的产量。以这种方式,鉴定了与亲本菌株相比,具有改变的对渗透压的敏感性和增加的分泌型蛋白生产速率的突变的真菌菌株。
实例
根据以下实例可以进一步理解本发明菌株、组合物和方法的方面,这些实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
实例1
产生在nik1基因中具有一个突变的工程改造的真菌菌株
1.1 nik1M743T基因置换盒的产生
通过将含有nik1基因座上游5'区域的DNA片段、loxP侧翼的潮霉素B抗性标记盒以及含有启动子和nik1基因(包括将位置743处的氨基酸从甲硫氨酸变为苏氨酸的T至C取代)的两个DNA片段与含有2μ主链的酵母载体pRS426(来自大肠杆菌中的pRS426噬菌粒,77107TM)融合来制备基因置换构建体(图2)。
以下引物由整合DNA科技公司(DNA Technologies,Inc.)(美国爱荷华州科拉尔维尔市(Coralville,IA,USA))制备
RRab88(正向)-
5’-
CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGCCTAGGTGGCTTTGAGCGGTGTTGATGTGTA-3’(SEQ ID NO:2),将其用于扩增具有AvrII限制位点和载体主链尾部悬突的nik1上游(5'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab89(反向)-5’-TACACATCAACACCGCTCAAAGCCACCTAGGCCCTGGCGTTACCCAACTTAATCG-3’(SEQ ID NO:3),将其用于扩增具有AvrII限制位点和5'侧翼尾部悬突的载体主链(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab90(正向)-5’-CTGCTCGAGAAGAACCGTGAGCGAGCCTAGGGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGC-3’(SEQ ID NO:4),将其用于扩增具有AvrII限制位点和3'侧翼片段2尾部悬突的载体主链(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab91(反向)-5’-GCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACCCTAGGCTCGCTCACGGTTCTTCTCGAGCAG-3’(SEQ ID NO:5),将用于扩增具有AvrII限制位点和载体主链尾部悬突的nik1DNA序列(3'侧翼,片段2)(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab92(正向)-5’-GAATCCACGTGCCGCGAGGCTCAGCATTTAAATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGGGCTTGTGACTGGTCGCGA-3’(SEQ ID NO:6),将其用于扩增具有loxP位点连同SwaI限制位点和5'侧翼尾部悬突的潮霉素抗性标记(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab93(反向)-5’-TCGCGACCAGTCACAAGCCCAGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATTTAAATGCTGAGCCTCGCGGCACGTGGATTC-3’(SEQ ID NO:7),将其用于扩增具有SwaI限制位点和hph+loxP位点尾部悬突的nik1上游(5'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab94(正向)-5’-CGTAACACCCAATACGCCGGCCGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCGGCCGCGCCCAGGATCACAAACCCACCGCAG-3’(SEQ ID NO:8),将其用于扩增具有NotI限制位点和hph+loxP位点尾部悬突的nik1基因(3'侧翼片段1)(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab95(反向)-5’-CTGCGGTGGGTTTGTGATCCTGGGCGCGGCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGGCCGGCGTATTGGGTGTTACG-3’(SEQ ID NO:9),将其用于扩增具有loxP位点连同NotI限制位点和3'侧翼片段1尾部悬突的潮霉素抗性标记(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab110(正向)-5’-GAAATTGCCTCCGTCACAACAGCCGTCGCTCACGGCGATCTGACAAAGAA-3’(SEQ ID NO:10),将其用于扩增具有3'侧翼片段1悬突的nik1DNA序列(3'侧翼片段2)(用于质粒pRRabnik1M743T)。
RRab111(反向)-5’-TTCTTTGTCAGATCGCCGTGAGCGACGGCTGTTGTGACGGAGGCAATTTC-3’(SEQ ID NO:11),将其用于扩增具有3'侧翼片段2悬突的nik1基因(3'侧翼片段1)(用于质粒pRRabnik1M743T)。
使用PfuUltraII Fusion HS DNA聚合酶(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA))和Tetrad 2热循环仪(美国加利福利亚州赫拉克勒斯市伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))进行PCR扩增。在EX凝胶(LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA)上分离PCR产物,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))纯化正确长度的片段。四个DNA片段中的每一个具有与相邻DNA片段互补的5'引物延伸,以提供用于重组的足够长的同源序列,并且使用酵母的天然重组机器将它们全部重组到酿酒酵母菌株YPH499(ATCC 76625)中的最终构建体中。将Frozen EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))用于酵母转化。将转化体涂板在SD-U板上以选择尿苷营养缺陷型的互补体。使用ZymoprepTMYeast PlasmidMiniprep II试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。从每个小量制备品(miniprep)中将1μL直接转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(美国纽约格兰德艾兰市生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA))中,并且将其涂板在含有羧苄青霉素的LB平板上。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。以此方式获得的DNA在Sequetech公司(美国加利福尼亚州山景城市(Mountain View,CA,USA))上进行测序,并且选择具有正确序列的质粒用于DNA扩增。使用以下引物用PCR扩增基因置换盒:
RRab156(5’-TGGCTTTGAGCGGTGTTGATGTGTA-3’)(SEQ ID NO:12);以及
RRab157(5'-CTCGCTCACGGTTCTTCTCGAGCAG-3')(SEQ ID NO:13)。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(QiagenInc.,Valencia,CA,USA))纯化和浓缩PCR产物。
1.2.RLP37宿主菌株的用含有nik1M743T等位基因的基因置换盒进行的转化、候选菌选
择、验证和表征
使用PEG介导的转化(Penttila等人,Gene[基因],61(2):155-64(1987)),将纯化的浓缩基因置换盒转化到里氏木霉宿主菌株RLP37中(由Sheir-Neiss等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]20:46-53(1984))描述)。使用涂盖物将转化体涂板在含有100μg/mL潮霉素B的Vogzl培养基(Vogel,Microbial Genet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))上,并且在28℃下孵育。使用NucleoPlantII试剂盒(美国宾夕法尼亚州伯利恒市Machery-Nagel公司)提取对潮霉素B有抗性的稳定转化体的基因组DNA。然后将该基因组DNA用作诊断PCR的模板,以确认基因置换在天然nik1基因座处的同源重组。指定用于诊断PCR的引物对RRab117和RRab167。
RRab117(5’-CGAACTGTGACCTTTCAAGT-3’)(SEQ ID NO:14);以及RRab167(5'-GCACACACATCTCGGCCTTA-3')(SEQ ID NO:15)。
选择具有包含nik1M743T的基因置换盒的经验证的同源整合的菌株(标记为RLP37Nik1M743T)并且对其进行孢子纯化。通过将在PDA平板培养物上产生的成熟气生分生孢子收获在水中、制备10x连续稀释的分生孢子悬浮液、将悬浮液的系列稀释液涂板在PDA板上、并且在28℃下将它们孵育过夜来进行孢子纯化。将所选择的经孢子纯化的菌株用于确定基因置换对蛋白质生产和剩余实验的影响。当与宿主RLP37菌株相比时,RLP37 Nik1M743T菌株在PDA板上的表型由较慢的生长和较低的分生孢子产量组成(图3A和3B)。当将山梨糖醇添加到Vogel基本培养基中时,与RLP37相比,菌株的菌落生长受到限制,表明对山梨糖醇的敏感性最有可能是由于不能调节对渗透胁迫的响应(图3C和3D)。
1.3使里氏木霉RLP37 Nik1M743T发酵以评估总蛋白质生产
将里氏木霉菌株RLP37 NikM743T和RLP37在相同的条件下在浸没(液体培养)中生长,并且在2L(DASGIP)和14L发酵罐中比较其单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。
为了产生种子培养物,将每种菌株的孢子分别添加到250mL烧瓶中的50ml柠檬酸盐基本培养基中。将培养物在振荡培养箱中在30℃和170rpm下生长48h。48h后,用种子培养物接种调节至pH 3.5的145.6mL的50%葡萄糖和0.6g/kg的CaCl2。此后,将温度维持在30℃,并且将pH维持在3.5。此后,引入葡萄糖-槐糖进料,并将温度降至25℃,pH增加至4.8。
测量干细胞重量、总蛋白质浓度和其他参数,并且计算单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。在天然基因座上含有nik1M743T等位基因的RLP37 Nik1M743T菌株显示出与含有天然nik1等位基因的RLP37宿主相比改进的单位总蛋白质生产速率(图4A)和基于供给糖的产量(图4B)。
对于14L发酵,将RLP37 NikM743T和RLP37菌株在相同条件下在浸没(液体培养)中生长,并且还比较了其总蛋白质生产和单位蛋白质生产速率。使用类似制备的种子培养物并且在14L发酵罐中进行发酵试验。发酵后,比较总蛋白质生产和单位蛋白质生产速率。
RLP37 Nik1M743T菌株显示出单位总蛋白质生产速率增加了101%(图5A),基于供给糖的产量提高了46%(图5B),表明将修饰的nik1组氨酸激酶引入宿主里氏木霉菌株中导致蛋白质生产增加。
实例2
产生具有nik1基因缺失的真菌菌株
2.1 Δnik1::hph缺失盒的设计和产生
通过将含有nik1基因的5'侧翼的DNA片段、loxP侧翼的潮霉素B抗性盒以及含有nik1基因的3'侧翼的DNA片段与含有2μ主链的酵母载体pRS426(来自大肠杆菌中的pRS426噬菌粒,77107TM)融合来制备基因置换构建体(图6)。以下引物由整合DNA科技公司(DNA Technologies,Inc.)(美国爱荷华州科拉尔维尔市(Coralville,IA,USA))制备
RRab266(正向)-5’-CCTGGGGAACCCCCCAGCGCCCGGCGAGCTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGGGCTTGTGACTGGTCGCGAGC-3’(SEQ ID NO:16),将其用于扩增具有loxP位点连同SacI限制位点和5'侧翼尾部悬突的潮霉素抗性标记(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab267(反向)-5’-CTTTCGCCGTCCAGGCGTCCAGACACCTGGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGGCCGGCGTATTGGGTGTTACGGA-3’(SEQ ID NO:17),将其用于扩增具有loxP位点连同SexAI限制位点和3'侧翼尾部悬突的潮霉素抗性标记(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab268(正向)-5’-TCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACCAGGTGTCTGGACGCCTGGACGGCGAAAGA-3’(SEQ ID NO:18),将其用于扩增具有SexAI限制位点和hph+loxP位点尾部悬突的nik1下游(3'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab269(反向)-5’-CGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACGGCCATAATGGCCGCTGGGTTCTGAACCTGTAAAGTAC-3’(SEQ ID NO:19),将其用于扩增具有SfiI限制位点和载体主链尾部悬突的nik1下游(3'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab270(正向)-5’-GTACTTTACAGGTTCAGAACCCAGCGGCCATTATGGCCGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCG-3’(SEQ ID NO:20),将其用于扩增具有SfiI限制位点和3'侧翼尾部悬突的载体主链(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab271(反向)-5’-TGTAGGTAAGGTAGATCGAACTGTGAAGCTTCCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGC-3’(SEQ ID NO:21),将其用于扩增具有HindIII限制位点和载体主链尾部悬突的nik1上游(5'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab272(正向)-5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGAAGCTTCACAGTTCGATCTACCTTACCTACA-3’(SEQ ID NO:22),将其用于扩增具有HindIII限制位点和载体主链尾部悬突的nik1上游(5'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabΔnik1)。
RRab273(反向)-5’-GCTCGCGACCAGTCACAAGCCCAGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAGCTCGCCGGGCGCTGGGGGGTTCCCCAGG-3’(SEQ ID NO:23),将其用于扩增具有SacI限制位点和hph+loxP位点尾部悬突的nik1上游(5'侧翼)的DNA序列(用于质粒pRRabΔnik1)。
使用PfuUltraII Fusion HS DNA聚合酶(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA))和Tetrad 2热循环仪(美国加利福利亚州赫拉克勒斯市伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))进行PCR扩增。在EX凝胶(LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA)上分离PCR产物,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))纯化正确长度的片段。四个DNA片段中的每一个具有与相邻DNA片段互补的5'引物延伸,以提供用于重组的足够长的同源序列,并且使用酵母的天然重组机器将它们全部重组到酿酒酵母菌株YPH499(ATCC 76625)中的最终构建体中。将Frozen EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))用于酵母转化。将转化体涂板在SD-U板上以选择尿苷营养缺陷型的互补体。使用ZymoprepTMYeast PlasmidMiniprep II试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。从每个小量制备品中将1μL直接转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(美国纽约格兰德艾兰市生命技术公司(LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA))中,并且将其涂板在含有羧苄青霉素的LB平板上。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(QiagenInc.,Valencia,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。以此方式获得的DNA在Sequetech公司(美国加利福尼亚州山景城市(Mountain View,CA,USA))上进行测序,并且选择具有正确序列的质粒用于DNA扩增。使用引物RRab 296和RRab297扩增基因缺失盒。
RRab296(正向)5’-CACAGTTCGATCTACCTTACCTACA-3’(SEQ ID NO:24)
RRab297(反向)5’-GCTGGGTTCTGAACCTGTAAAGTAC-3’(SEQ ID NO:25)
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(QiagenInc.,Valencia,CA,USA))纯化和浓缩PCR产物。
2.2 RLP37宿主菌株的用Δnik1::hph缺失盒进行的转化、候选菌选择、验证和表征
使用PEG介导的转化将纯化的浓缩的Δnik1::hph盒转化到里氏木霉宿主菌株RLP37中(M.、Nevalainen,H.、M.、Salminen,E.和Knowles,J.,A versatiletransformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichodermareesei[用于纤维素分解丝状真菌里氏木霉的通用型转化系统],Gene[基因](1987)61:155-164)。使用涂盖物将转化体涂板在含有100μg/mL潮霉素B的Vogel基本培养基上,并且在28℃下孵育。使用NucleoPlantII试剂盒(美国宾夕法尼亚州伯利恒市Machery-Nagel公司)提取对潮霉素B有抗性的稳定转化体的基因组DNA。然后将该基因组DNA用作诊断PCR的模板,以确认缺失盒在天然nik1基因座处的同源重组。
选择具有Δnik1::hph缺失盒的经验证的同源整合的菌株(标记为RLP37Nik1M743T)并且对其进行孢子纯化。通过将在PDA平板培养物上产生的成熟气生分生孢子收获在水中、制备10x连续稀释的分生孢子悬浮液、将悬浮液的系列稀释液涂板在PDA板上、并且在28℃下将它们孵育过夜来进行孢子纯化。将所选择的经孢子纯化的菌株用于确定基因置换对蛋白质生产和剩余实验的影响。当与宿主RLP37菌株相比时,RLP37ΔNik1菌株在PDA板上的表型由较慢的生长和较低的分生孢子产量组成(图3B和3E)。当将山梨糖醇添加到Vogel基本培养基中时,与菌株RLP37相比,菌株的菌落生长受到限制,表明对山梨糖醇的敏感性可能是由于不能调节对渗透胁迫的响应(图3D和3F)。
2.3使里氏木霉RLP37ΔNik1发酵以评估总蛋白质生产
在2L DASGIP发酵罐中测试RLP37宿主菌株和RLP37ΔNik1菌株的总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。根据与实例1中所述相同的方式进行种子培养和发酵程序。
测量干细胞重量、总蛋白质浓度和其他参数,并且计算单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。与RLP37对照菌株相比,菌株RLP37ΔNik1的总蛋白质生产速率降低了85%,基于供给糖的产量提高了39%。这表明nik1基因的缺失对总蛋白质生产有害,并且与用nik1M743T等位基因对天然nik1等位基因的置换不具有相同的作用。这也表明nik1M743T等位基因是功能获得型等位基因,导致功能获得型表型(图7)。
实例3
工程改造的真菌菌株作为目的纤维素酶的表达宿主
3.1过表达CBH1的里氏木霉宿主菌株的用含有nik1M743T等位基因的基因置换盒进行的
转化、候选菌选择、验证和表征
使用PEG介导的转化,将实例1.1中所述的纯化的浓缩的基因置换盒转化到过表达CBH1的里氏木霉宿主菌株中(Penttila等人,Gene[基因],61(2):155-64(1987))。使用涂盖物将转化体涂板在含有30μg/mL潮霉素B的Vogel基本培养基上,并且在28℃下孵育。使用NucleoPlantII试剂盒(美国宾夕法尼亚州伯利恒市Machery-Nagel公司)提取对100μg/mL潮霉素B有抗性的稳定转化体的基因组DNA。然后将该基因组DNA用作诊断PCR的模板,以确认基因置换在天然nik1基因座处的同源重组。将引物对RRab117(SEQ ID NO:14)和RRab167(SEQ ID NO:15)用于诊断PCR。
选择具有包含nik1M743T的基因置换盒的经验证的同源整合的菌株(标记为Cbh1Nik1M743T)并且对其进行孢子纯化。通过将在PDA平板培养物上产生的成熟气生分生孢子收获在水中、制备10x连续稀释的分生孢子悬浮液、将悬浮液的系列稀释液涂板在PDA板上、并且在28℃下将它们孵育过夜来进行孢子纯化。将所选择的经孢子纯化的菌株用于确定基因置换对蛋白质生产和剩余实验的影响。
当将山梨糖醇添加到Vogel基本培养基中时,Cbh1 Nik1M743T菌株的菌落生长受到限制,表明对山梨糖醇的敏感性可能是由于不能调节对渗透胁迫的响应(图8E-8H)。在不过表达CBH1纤维素酶(NoCbh1)的里氏木霉菌株中,天然的nik1WT被nik1M743T等位基因置换。它显示出对山梨糖醇的相同响应,证实了nik1M743T是这种响应的原因(图8A-8D)。
3.2使里氏木霉Cbh1 Nik1M743T发酵以评估总蛋白质生产
将如上所述的里氏木霉CBH1过表达菌株和里氏木霉Cbh1 Nik1M743T在相同条件下在浸没(液体)培养中生长。在2L(DASGIP)和14L规模发酵罐中比较了各自的单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。
为了产生种子培养物,将每种菌株的孢子分别添加到250mL烧瓶中的50ml柠檬酸盐基本培养基中。将培养物在振荡培养箱中在30℃和170rpm下生长48h。48h后,用种子培养物接种调节至pH 3.5的145.6mL的50%葡萄糖和0.6g/kg的CaCl2。此后,将温度维持在32℃,并且将pH维持在3.5。此后,引入葡萄糖-槐糖进料,并将温度降至28℃,pH增加至4.5。
测量干细胞重量、总蛋白质浓度和其他参数,并且计算单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。与菌株Cbh1相比,Cbh1 Nik1M743T菌株显示出总单位蛋白质生产速率提高19%,并且基于供给糖的产量提高46%(图9)。
对于14L发酵,里氏木霉Cbh1菌株和里氏木霉Cbh1 Nik1M743T在相同条件下在浸没(液体培养)中生长,并且比较了其总蛋白质生产和单位蛋白质生产速率。使用类似制备的种子培养物并且在14L发酵罐中进行发酵试验。发酵后,比较总蛋白质生产和单位蛋白质生产速率。
与Cbh1菌株相比,Cbh1 Nik1M743T菌株显示出单位总蛋白质生产速率增加了30%(图10A),并且基于供给糖的产量提高了20%(图10B),表明将修饰的nik1组氨酸激酶引入过表达里氏木霉CBH1的菌株中导致蛋白质生产增加。
实例4
通过在里氏木霉宿主中用nik1wt等位基因置换nik1M743T等位基因来逆转功能获得型表型
4.1 nik1WT基因置换盒设计与产生
通过将含有nik1基因座上游5'区域的DNA片段、loxP侧翼的潮霉素B抗性盒以及含有启动子和nik1野生型基因的DNA片段与含有2μ主链的酵母载体pRS426(来自大肠杆菌中的pRS426噬菌粒,77107TM)融合来制备基因置换构建体(图11)。
将引物对RRab88(SEQ ID NO:2)和RRab89(SEQ ID NO:3);RRab90(SEQ ID NO:4)和RRab91(SEQ ID NO:5);RRab92(SEQ ID NO:6)和RRab93(SEQ ID NO:7);RRab94(SEQ IDNO:8)和RRab95(SEQ ID NO:9);RRab110(SEQ ID NO:10)和RRab111(SEQ ID NO:11)用于扩增DNA片段(如上面实例1.1中所描述的)。
使用PfuUltraII Fusion HS DNA聚合酶(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA))和Tetrad 2热循环仪(美国加利福利亚州赫拉克勒斯市伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))进行PCR扩增。在EX凝胶(LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA)上分离PCR产物,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))纯化正确长度的片段。四个DNA片段中的每一个具有与相邻DNA片段互补的5'引物延伸,以提供用于重组的足够长的同源序列,并且使用酵母的天然重组机器将它们全部重组到酿酒酵母菌株YPH499(ATCC 76625)中的最终构建体中。将Frozen EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))用于酵母转化。将转化体涂板在SD-U板上以选择尿苷营养缺陷型的互补体。使用ZymoprepTMYeast PlasmidMiniprep II试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。
从每个小量制备品中将1μL直接转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(美国纽约格兰德艾兰市生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA))中,并且将其涂板在含有羧苄青霉素的LB平板上。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。以此方式获得的DNA在Sequetech公司(美国加利福尼亚州山景城市(Mountain View,CA,USA))上进行测序,并且选择具有正确序列的质粒用于DNA扩增。使用引物RRa156(SEQ ID NO:12)和RRab157(SEQ ID NO:13)来扩增基因置换盒,并且使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))纯化和浓缩PCR产物。
4.2里氏木霉菌株TR Nik1M743T的用含有nik1WT等位基因的基因置换盒进行的转化、候
选菌选择、验证和表征
使用PEG介导的转化(Penttila等人,Gene[基因],61(2):155-64(1987)),在天然nik1基因座处将纯化的浓缩的含有nik1WT的基因置换盒转化到含有nik1M743T的里氏木霉TRNik1M743T宿主菌株中。TR Nik1M743T宿主菌株来源于菌株RLP37。使用涂盖物将转化体涂板在含有30μg/mL潮霉素B的Vogzl基本培养基(Vogel,Microbial Genet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))上,并且在28℃下孵育。使用NucleoPlantII试剂盒(美国宾夕法尼亚州伯利恒市Machery-Nagel公司)提取对100μg/mL潮霉素B有抗性的稳定转化体的基因组DNA。然后将该基因组DNA用作诊断PCR的模板,以确认基因置换在天然nik1基因座处的同源重组。将引物对RRab117(SEQ IDNO:14)和RRab167(SEQ ID NO:15)用于诊断PCR。
选择具有包含nik1WT的基因置换盒的经验证的同源整合的菌株(标记为TRNik1WT),并且对其进行孢子纯化。通过将在PDA平板培养物上产生的成熟气生分生孢子收获在水中、制备10x连续稀释的分生孢子悬浮液、将悬浮液的系列稀释液涂板在PDA板上、并且在28℃下将它们孵育过夜来进行孢子纯化。将所选择的经孢子纯化的菌株用于确定基因置换对蛋白质生产和剩余实验的影响。当与TR Nik1M743T菌株相比时,TR Nik1WT菌株在Vogel基本培养基上的表型由较快的生长和较高的分生孢子产量组成(图8I和8J)。
当将山梨糖醇添加到Vogel基本培养基中时,与TR Nik1M743T相比,菌株的菌落生长不受限制,表明由于不能调节对渗透胁迫的响应,对山梨糖醇的敏感性可能被逆转(图8K和8L)。
4.3使里氏木霉Nik1WT发酵以评估总蛋白质生产
将里氏木霉菌株TR Nik1WT和TR Nik1M743T在相同的条件下在浸没(液体培养)中生长,并且在2L(DASGIP)发酵罐中比较了其单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。
为了产生种子培养物,将每种菌株的孢子分别添加到250mL烧瓶中的50ml柠檬酸盐基本培养基中。将培养物在振荡培养箱中在30℃和170rpm下生长48h。48h后,用种子培养物接种调节至pH 3.5的145.6mL的50%葡萄糖和0.6g/kg的CaCl2。此后,将温度维持在30℃,并且将pH维持在3.5。此后,引入葡萄糖-槐糖进料,并将温度降至25℃,pH增加至4.8。
测量干细胞重量、总蛋白质浓度和其他参数,并且计算单位总蛋白质生产速率和基于供给糖的产量。与在nik1基因座处含有nik1M743T等位基因的TR Nik1M743T菌株相比,在天然nik1基因座处含有nik1WT等位基因的TRNik1WT菌株显示出单位总蛋白质生产速率降低36%,并且基于供给糖的产量降低29%(图12)。这表明用天然的nik1WT等位基因置换nik1M743T等位基因将使功能获得型表型回到野生型表型,证实了单独的nik1M743T等位基因是改进的总蛋白质产生速率和基于供给糖的产量的原因。
实例5
对渗透敏感性或抗性以及改进的分泌型蛋白生产力进行筛选
可以使用任何方法来产生里氏木霉突变细胞的群体。例如,可以从里氏木霉菌株中获得分生孢子,并且将其用UV照射、X射线照射、γ射线照射进行处理或者用诱变剂例如NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)或EMS(甲磺酸乙酯)进行化学诱变(Davis,R.H.和DeSerres,F.J.(1970)Genetic and microbiological research techniques forNeurospora crassa[粗糙脉孢菌的遗传和微生物学研究技术],在:Methods inEnzymology[酶学方法],第17A卷,编辑Tabor,H.和Tabor,C.W.,第79-143页)。可替代地,可以依赖自发突变。另外,可以使用分子生物学诱变方法,例如经由土壤杆菌转化的插入诱变(Sugui,J.A.、Chang,Y.C.和Kwon-Chung,K.J.(2005)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:1798-17802)。
对突变细胞群体进行筛选以鉴定对高渗透压具有改变的敏感性的细胞。改变的敏感性可以表现为其在高渗透压的条件下比亲本、非突变的细胞生长更快的能力(即,对高渗透压的抗性),或者其在高渗透压的条件下与亲本、非突变的细胞相比生长速率降低(即,对高渗透压的敏感性)。
为了对高渗透压的改变的敏感性进行筛选,将里氏木霉细胞接种到具有各种水平的添加的糖、糖醇或盐的营养琼脂板的表面上,使得出现个体菌落并且可以在培养时区分。营养琼脂是具有葡萄糖的Vogel基本培养基(Vogel,Microbial Genet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))。该培养基补充有1M-1.2M山梨糖醇、或0.7M-1.4M氯化钠、或0.5M-1.4M氯化钾。通过在相同条件下在浸没(液体培养)中的生长挑取比亲本类型生长更快或更慢的个体菌落用于进一步评估,并且比较它们的单位总分泌型蛋白生产速率和基于供给糖的产量。以这种方式,鉴定了与亲本菌株相比,具有改变的对渗透压的敏感性和增加的分泌型蛋白生产速率的里氏木霉的突变菌株。
实例6
对杀真菌剂的抗性以及改进的分泌型蛋白生产力的进行筛选或选择
可以使用任何方法来产生里氏木霉突变细胞的群体。例如,可以从里氏木霉菌株中获得分生孢子,并且将其用UV照射、X射线照射、γ射线照射进行处理或者用诱变剂例如NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)或EMS(甲磺酸乙酯)进行化学诱变(Davis,R.H.和DeSerres,F.J.(1970)Genetic and microbiological research techniques forNeurospora crassa[粗糙脉孢菌的遗传和微生物学研究技术],在:Methods inEnzymology[酶学方法],第17A卷,编辑Tabor,H.和Tabor,C.W.,第79-143页)。可替代地,可以依赖自发突变。另外,可以使用分子生物学诱变方法,例如经由土壤杆菌转化的插入诱变(Sugui,J.A.、Chang,Y.C.和Kwon-Chung,K.J.(2005)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:1798-17802)。
也可以对突变细胞的群体进行筛选以鉴定对二甲酰亚胺和苯基吡咯杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈具有改变的敏感性的那些细胞。改变的敏感性可以表现为其在杀真菌剂的存在下比亲本非突变的细胞生长更快的能力(即,对杀真菌剂的抗性),或者其在杀真菌剂的存在下与亲本非突变的细胞相比生长速率降低(即,对杀真菌剂的敏感性)。
为了选择对异菌脲或咯菌腈的抗性,将里氏木霉细胞接种到具有各种水平的这些杀真菌剂的营养琼脂板的表面上,使得出现个体菌落并且可以在培养时区分。营养琼脂是具有葡萄糖的Vogel基本培养基(Vogel,Microbial Genet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))。通过在相同条件下在浸没(液体培养)中的生长挑取比亲本类型生长更快的个体菌落用于进一步评估,并且比较它们的单位总分泌型蛋白生产速率和基于供给糖的产量。以这种方式,鉴定了与亲本菌株相比,具有对异菌脲或咯菌腈具有抗性和具有增加的分泌型蛋白生产速率的里氏木霉的突变菌株。
为了用于液体培养基杀真菌剂筛选,收获来自里氏木霉菌株RLP37和RLP37NikM743T的分生孢子并且将其稀释至10,000/ml的浓度。将相等数量的孢子接种到含有0、11.25、22.5、45或90μM的异菌脲或咯菌腈的液体YEG培养基(5g/L酵母提取物、22g/l葡萄糖、H2O)中,并允许其在28℃下萌发过夜。RLP37分生孢子在没有异菌脲或咯菌腈的培养基中萌发并且产生细长的菌丝。在11.25μM异菌脲或咯菌腈下,该菌株的萌发是明显的,但是对菌丝生长有明显的抑制作用。在异菌脲或咯菌腈的高于11.25μM的浓度下,菌株RLP37存在萌发和生长的完全抑制。相比之下,RLP37 NikM743T分生孢子在测试的所有异菌脲或咯菌腈浓度下萌发并产生细长的菌丝。这清楚地表明,NikM743T突变赋予了对杀真菌剂异菌脲和咯菌腈的抗性。此外,当接种培养物按比例扩大到107个孢子/ml时,RLP37的敏感性和RLP37 NikM743T的抗性持续存在。
为了用于琼脂(固体)培养基杀真菌剂筛选或选择,收获来自里氏木霉菌株RLP37和RLP37 NikM743T的分生孢子,并且将其稀释至如下浓度,该浓度使得已知数量的孢子涂板在每10cm的具有葡萄糖的含有营养琼脂Vogel基本培养基的板上(Vogel,MicrobialGenet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))。将各种菌株的相等数量的孢子散布在含有0、11.25、22.5、45或90μM异菌脲的营养琼脂板的表面上,并允许其在32℃下生长3天。在11.25和22.5μM下,RLP37菌落不能生长到任何大于大头针尖的大小。在45μM及以上,RLP37菌落根本无法生长。相比之下,RLP37 NikM743T菌落与在没有异菌脲的营养琼脂板上生长的菌落的生长相似。这清楚地表明,nik1M743T突变赋予对固体琼脂培养基中的异菌脲的抗性(图13)。为了在对包含野生型nik1的细胞大群体中罕见发生的nik1突变体的选择中建立异菌脲的敏感性,将已知数量的RLP37 NikM743T孢子(低至5个孢子)与已知的、数量多得多的RLP37(105-108)混合。将这种混合的孢子群体散布到含有45μM异菌脲的Vogel基本培养基琼脂上,并允许其在32℃下生长3天。使用以下引物,对菌落计数并通过PCR和测序(美国加利福尼亚州山景城市Sequetech公司)评估nik1M743T突变的存在:
RRab126(正向)5’-CGGCATGGCCATGAACCTCA-3’(SEQ ID NO:40)
RRab161(反向)5’-GCACTGAAGCCGGTTAGTTC-3’(SEQ ID NO:41)
RRab128(正向)5’-CTGTCCAGCTTCTGCTACGA-3’(SEQ ID NO:42)
在45μM的异菌脲上进行选择性涂板是足够敏感的,以检测在106个野生型孢子中的少至5个突变体。当每10cm板涂板超过106个孢子时发生高的假阳性率。
由于nik1M743T突变赋予山梨糖醇敏感性以及异菌脲抗性,非山梨糖醇敏感性孢子的耗尽可能富集具有所希望的特征的nik1突变体。在将已知数量的孢子涂板在含有45μM异菌脲的Vogel基本培养基琼脂上之前,将RLP37和RLP37 NikM743T在含有1.2M山梨糖醇的YEG中在28℃下生长过夜,然后通过4层Miracloth(美国宾夕法尼亚州拉德纳市VWR公司(VWR,Radnor,PA,USA))过滤。与未过滤的RLP37相比,Miracloth过滤导致RLP37菌落数量减少了98%。相比之下,过滤后对于RLP37 NikM743T仅观察到2%-8%的降低。然而,尽管>90%的RLP37 NikM743T孢子通过Miracloth过滤器,但是只有1%-2%的通过过滤器的RLP37NikM743T孢子能够在板上回收。取决于nik1的自发突变的频率,这种耗尽方法可能在含有异菌脲的琼脂板上的选择之前提供优势。如果积累了足够的突变体,尽管山梨糖醇耗尽可能消除大多数的突变体,但是从过滤在山梨糖醇下萌发的野生型孢子也存在假阳性的减少,因此增加潜在的生产量。山梨糖醇敏感性和二甲酰亚胺杀真菌剂抗性两者都是与蛋白质生产力的期望结果相关的特征,因此通过将山梨糖醇耗尽方法与杀真菌剂板上的选择结合,生产量的潜在增加可以提高鉴定具有所希望的比生产力的自发突变体的机会。
为了选择自发突变以具有杀真菌剂抗性的细胞,收获来自里氏木霉菌株RLP37的分生孢子并且将其稀释使得将106个孢子散布到含有45μM异菌脲的每个营养琼脂板的表面上。营养琼脂是具有葡萄糖的Vogel基本培养基(Vogel,Microbial Genet.Bull.[微生物遗传学公报]13:42-43(1956);Vogel,Am.Nat.[美国博物学家]98:435-446(1964))。挑取生长的个体菌落用于通过nik1基因座的测序来进一步评估。对杀真菌剂有抗性的菌落在nik1的编码区中含有至少一个突变。通过这个方法,获得了在nik1中含有突变的里氏木霉的异菌脲抗性突变菌株。
实例7
产生在nik1基因中具有一个突变的工程改造的真菌菌株
7.1 nik1M786T基因置换盒的产生
通过将含有nik1基因座上游5'区域的DNA片段、pyrG标记盒以及含有启动子和nik1基因(包括将位置786处的氨基酸从甲硫氨酸变为苏氨酸的T至C取代)的三个DNA片段与含有2μ主链的酵母载体pRS426(来自大肠杆菌中的pRS426噬菌粒,77107TM)融合来制备基因置换构建体(图14)。
以下引物由整合DNA科技公司(DNA Technologies,Inc.)(美国爱荷华州科拉尔维尔市(Coralville,IA,USA))制备:
RN0286(正向)-5’-CGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGGTTCCTGAATAGACTTGGGGTTG-3’(SEQ ID NO:26),将其用于扩增nik1上游的DNA序列(5’片段)(用于质粒pRNnik1M786T),并且包含载体主链尾部悬突。
RN0508(反向)-5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGCCCAGTACTAGATAGATACCTG-3’(SEQ ID NO:27),将其用于扩增nik1上游的DNA序列(5’片段)(用于质粒pRNnik1M786T),并且包含pyrG标记盒尾部悬突。
RN0428(正向)-5’-GCCAGTGCCAAGCTTATCACC-3’(SEQ ID NO:28),将其用于扩增pyrG标记盒(用于质粒pRNnik1M786T)。
RN0172(反向)-5’-CCATGATTACGAATTCGAGCT-3’(SEQ ID NO:29),将其用于扩增pyrG标记盒(用于质粒pRNnik1M786T)。
RN0509(正向)-5’-GATAAGGGACGGTGATAAGCTTGGCACTGGCGGATTTGCTGCCAGCTTTAC-3’(SEQ ID NO:30),将其用于扩增nik1上游的DNA序列和nik1的5’末端(3’片段1)(用于质粒pRNnik1M786T),并且包含pyrG盒尾部悬突。
RN489(反向)-5’-CTTCAACTCTGCGATCTCTCC-3’(SEQ ID NO:31),将其用于扩增nik1上游的DNA序列和nik1的5’末端(3’片段1)(用于质粒pRNnik1M786T)。
RN0495(正向)-5’-CACGGTTACCAAGGCTGTGG-3’(SEQ ID NO:32),将其用于扩增nik1(3’片段2)(用于质粒pRNnik1M786T)。
RN0498(反向)-5’-CCAATGATACCGTTCGTGGGCGTCCGGATCTCG-3’(SEQ ID NO:33),将其用于扩增nik1(3’片段2)(用于质粒pRNnik1M786T),并且并入M786T突变。
RN0161(正向)-5’-CCGGACGCCCACGAACGGTATCATTGGTATGACGCAGTTGAC-3’(SEQ IDNO:34),将其用于扩增nik1(3’片段3)(用于质粒pRNnik1M786T),并且并入M786T突变。
RN0182(反向)-5’-CGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCGGGTGCATTTCACCACTACTTGAG-3’(SEQ ID NO:35),将其用于扩增nik1(3’片段3)(用于质粒pRNnik1M786T),并且包含载体主链悬突。
使用PfuUltraII Fusion HS DNA聚合酶(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA))和Tetrad 2热循环仪(美国加利福利亚州赫拉克勒斯市伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))进行PCR扩增。在E凝胶(LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA)上分离PCR产物,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒或QIAquickPCR纯化试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))纯化正确长度的片段。通过用BamHI(美国纽约州格兰德艾兰市赛默科技公司(Thermo Scientific,Grand Island,NY,USA))消化使载体主链线性化,随后通过碱性磷酸酶(美国印第安纳州印第安纳波利斯市罗氏公司(Roche,Indianapolis,IN,USA))进行去磷酸化,并且使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。
五个DNA片段中的每一个都在两个末端包含与相邻DNA片段的序列重叠的序列,以提供用于重组的足够长的同源序列,并且使用酵母的天然重组机器将它们全部重组到酿酒酵母菌株YPH499(ATCC 76625)中的最终构建体中。将Frozen EZ Yeast TransformationIITM试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))用于酵母转化。将转化体涂板在SD-U板上以选择尿苷营养缺陷型的互补体。使用ZymoprepTMYeast Plasmid Miniprep II试剂盒(美国加利福尼亚州橙市Zymo研究公司(Zymo Research,Orange,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。从每个小量制备品中将1μL直接转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(美国纽约格兰德艾兰市生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA))中,并且将其涂板在含有羧苄青霉素的LB平板上。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(美国加利福尼亚州巴伦西亚市凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))选择来自转化平板的个体菌落以提取质粒DNA。以此方式获得的DNA在Sequetech公司(美国加利福尼亚州山景城市(MountainView,CA,USA))进行测序,并且通过用SnaBI(美国纽约州格兰德艾兰市赛默科技公司(Thermo Scientific,Grand Island,NY,USA))的限制性消化使具有正确序列的质粒线性化,随后通过碱性磷酸酶(美国印第安纳州印第安纳波利斯市罗氏公司(Roche,Indianapolis,IN,USA))进行去磷酸化。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(美国加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA))或乙醇沉淀法纯化所得的基因置换盒。
7.2.GICC2071宿主菌株的用含有nik1M786T等位基因的基因置换盒进行的转化、候选菌
选择、验证和表征
使用PEG介导的转化(Campbell等人,“Improved transformation efficiency ofAspergillus niger using the homologous niaD gene for nitrate reductase[使用硝酸还原酶的同源niaD基因对黑曲霉的改进的转化效率]”,Current Genetics[现代遗传学],16:53-56,1989),将纯化的浓缩的基因置换盒转化到黑曲霉宿主菌株GICC2071(来源于葡糖淀粉酶过量生产突变体的非重组菌株,UVK143f,其本身来源于黑曲霉泡盛变种NRRL3112,并且具有无活性的pyrG基因)中。使用涂盖物将转化体涂板在不含尿苷的基本培养基上,并且在32℃下孵育。使用CelLyticTM Y细胞裂解试剂(美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA))提取来自转化体的基因组DNA。然后将该基因组DNA用作诊断PCR的模板,以确认基因置换在天然nik1基因座处的同源重组。下面指定用于诊断PCR的引物对。
RN0591(5’-GACGTGAATACGATGGCCGA-3’)(SEQ ID NO:36);以及
RN0592(5'-AACGTTTGGGCTTGCGAGG-3')(SEQ ID NO:37)。
RN0577(5’-AGGTCGACTATCCGGTTAGAC-3’)(SEQ ID NO:38);以及
RN0583(5'-GCGACTCCCAAGCAGAAGC-3')(SEQ ID NO:39)。
通过测序(美国加利福尼亚州山景城市Sequetech公司)来证实nik1M786T突变的整合。
选择了具有包含nik1M786T的基因置换盒的经验证的同源整合的三个菌株(标记为GICC2071 Nik1M786T突变体#99、117和121)。将所选择的菌株用于确定基因置换对蛋白质生产的影响。
7.3使黑曲霉GICC2071 Nik1M786T发酵以评估总蛋白质生产
黑曲霉对照菌株GICC2071和GICC2071 NikM786T突变体#99、117和121在相同条件下在50ml浸没(液体)培养中生长,并且在摇瓶中比较它们的总蛋白质生产。
为了产生种子培养物,将每种菌株的孢子分别添加到250mL烧瓶中的50ml的YEG(5g/L酵母提取物、22g/l葡萄糖、H2O)中。将培养物在振荡培养箱中在37℃和200rpm下生长24小时。在24小时后,将5ml的种子培养物一式三份添加到在250-ml具有4个挡板的摇瓶中的45ml的Promosoy特殊培养基(Ward,M.等人(2004)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]70:2567-2576)中用于蛋白质生产。将烧瓶在37℃下以200rpm摇动孵育4天。通过在Eppendorf 5804 R(美国宾夕法尼亚州匹兹堡市飞世尔科技公司(FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA))中以4000rpm旋转离心培养物25分钟来收获分泌型蛋白并收集上清液。
通过SDS-PAGE(美国纽约州格兰德艾兰市生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA))、并且通过用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质、随后通过BCA蛋白测定(美国纽约州格兰德艾兰市赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,GrandIsland,NY,USA))评价总蛋白质产生。也评估了使用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA))作为底物的蛋白质(例如葡糖淀粉酶)的活性。
基于制造商提供的试验方案,将来自含有野生型nik1等位基因的对照菌株GICC2071以及GICC2071 Nik1M786T突变体#99、117和121中每一个的4μl上清液体积在4%-12% NuPAGE凝胶(美国纽约州格兰德艾兰市生命技术公司(Life Technologies,GrandIsland,NY,USA))上运行。SDS-PAGE揭示了,GICC Nik1M786T突变菌株#99以低于GICC2071对照的水平生产蛋白质,然而GICC Nik1M786T突变体#117和121显示出与含有天然nik1等位基因的GICC2071对照相比改进的总蛋白质(图15)。
对于BCA蛋白质测定,将来自对照菌株GICC2071、GICC2071 Nik1M786T突变体#99、117和121的上清液沉淀在三氯乙酸中,并且在BCA蛋白测定之前重悬浮于0.1N氢氧化钠中。根据制造商试验方案进行BCA蛋白测定。与含有天然nik1等位基因的GICC对照相比,GICCNik1M786T突变体#99和#121显示出降低的总蛋白,并且与GICC2071对照相比,突变体#117具有等量的总蛋白。
评估了上清液酶对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷-PNPG底物(美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA))的活性。将来自对照菌株GICC2071和GICC2071 Nik1M786T突变体#99、117和121的上清液等分到96孔板(美国纽约州康宁市康宁公司(Corning,Corning,NY,USA))的孔中,随后与PNPG一起孵育8分45秒。通过添加0.1M硼酸盐溶液(pH 9.2)停止酶反应,并且在400nm处读取吸光度。与含有野生型nik1等位基因的GICC2071相比,GICC Nik1M786T突变体#99对PNPG底物显示出降低的上清液酶活性,然而与GICC2071对照相比,GICC Nik1M786T突变体#117和121对PNPG底物显示出更高的上清液酶活性(图16)。
GICC2071 Nik1M786T突变体#117显示出比GICC2071对照更高的蛋白质生产,如在SDS凝胶上所看见的(图15),以及更高的PNPG活性(图16),表明将突变的nik1M786T组氨酸激酶基因等位基因引入黑曲霉可以导致蛋白质生产的增加。
Claims (55)
1.一种工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该工程改造的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因。
2.一种工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
3.一种工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对杀真菌剂具有改变的敏感性或抗性的突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
5.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含氨基酸序列的多肽,并且与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性,该氨基酸序列在SEQ ID NO:1的位置743处包含突变。
7.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含氨基酸序列的多肽,并且与SEQ ID NO:43具有至少60%同一性,该氨基酸序列在SEQ ID NO:43的位置786处包含突变。
8.如权利要求6所述的工程改造的真菌菌株,其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M743T。
9.如权利要求7所述的工程改造的真菌菌株,其中在位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M786T。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。
11.如权利要求1-9中任一项所述的工程改造的真菌菌株,其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程改造的真菌菌株,该工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、或至少约100%更多的目的蛋白。
13.一种转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株,该转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,其中该转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因或包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
14.如权利要求13所述的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
15.如权利要求13或14所述的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
16.如权利要求13-15中任一项所述的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQ ID NO:1的位置743处的突变,以及与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽。
17.如权利要求16所述的真菌菌株,其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M743T。
18.如权利要求13-15中任一项所述的真菌菌株,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQ ID NO:43的位置786处的突变,以及与SEQ ID NO:43具有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽。
19.如权利要求18所述的真菌菌株,其中在位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M786T。
20.如权利要求13-19中任一项所述的真菌菌株,其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。
21.如权利要求13-19中任一项所述的真菌菌株,其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。
22.如权利要求13-21中任一项所述的真菌菌株,该真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、或至少约100%更多的目的蛋白。
23.一种用于改进蛋白质生产的方法,该方法包括使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株,该真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因,或包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
24.如权利要求23所述的方法,其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
25.如权利要求23或24所述的方法,其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQID NO:1的位置743处的突变,以及与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽。
27.如权利要求26所述的方法,其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M743T。
28.如权利要求23-25中任一项所述的方法,其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQID NO:43的位置786处的突变,以及与SEQ ID NO:43具有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽。
29.如权利要求28所述的方法,其中在位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变,即M786T。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法,其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。
31.如权利要求23-29中任一项所述的方法,其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。
32.如权利要求23-29中任一项所述的方法,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、或至少约100%更多的目的蛋白。
33.一种生产目的蛋白的方法,该方法包括使如权利要求1-12中任一项所述的工程改造的真菌菌株或如权利要求13-22中任一项所述的转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株发酵,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株分泌该目的蛋白,其中该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因,或包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
34.如权利要求33所述的方法,其中该目的蛋白是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其功能片段、或这些酶及其片段中的一种或多种的混合物。
35.如权利要求33或34所述的方法,其中该目的蛋白是乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、其功能片段或其一种或多种的混合物。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法,其中该目的蛋白是肽激素、生长因子、凝固因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其功能片段、或其一种或多种的混合物。
37.一种目的蛋白,其通过应用如权利要求33至36中任一项所述的方法来生产。
38.一种组合物,其包含如权利要求37所述的目的蛋白。
39.一种在生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物或纺织品处理中使用如权利要求38所述的组合物的方法。
40.一种用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法,该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白,该方法包括以下步骤:
(a)将该菌株接种到具有渗透剂的琼脂板的表面上;并且
(b)选择比该亲本菌株生长更快或更慢的菌株。
41.如权利要求40所述的方法,其中与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的真菌菌株包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。
42.如权利要求40或41所述的方法,其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。
43.如权利要求42所述的方法,其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法,其中该工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约50%、或至少约100%更多的目的蛋白。
45.如权利要求40-44中任一项所述的方法,其中该渗透剂包括糖、糖醇或盐中的一种或多种。
46.如权利要求45所述的方法,其中该糖可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、低聚果糖、果糖低聚糖或转化糖。
47.如权利要求45所述的方法,其中该糖醇可以是山梨糖醇、木糖醇或半乳糖基山梨糖醇。
48.如权利要求45所述的方法,其中该盐是氯化钠或氯化钾。
49.一种筛选或选择具有增加的比生产力的突变体的方法,该方法在浸没培养和/或固体琼脂培养基中使用杀真菌剂抗性来进行。
50.一种对具有组氨酸激酶的修饰或具有参与调节渗透性内稳态的其他基因的修饰的突变体进行筛选或选择的方法,该方法在浸没培养和/或固体琼脂培养基中使用杀真菌剂抗性来进行。
51.一种对具有nik1基因的修饰的突变体进行筛选或选择的方法,该方法在浸没培养和/或固体琼脂培养基中使用杀真菌剂抗性来进行。
52.一种对具有增加的比生产力的突变体进行筛选或选择的方法,该方法是通过同时或相继地组合浸没培养和/或固体琼脂培养基中的渗透敏感性和杀真菌剂抗性来进行的。
53.一种对具有组氨酸激酶的修饰或具有参与调节渗透性内稳态的其他基因的修饰的突变体进行筛选或选择的方法,该方法是通过同时或相继地组合浸没培养和/或固体琼脂培养基中的渗透敏感性和杀真菌剂抗性来进行的。
54.一种对具有nik1基因的修饰的突变体进行筛选或选择的方法,该方法是通过同时或相继地组合浸没培养和/或固体琼脂培养基中的渗透敏感性和杀真菌剂抗性来进行的。
55.如权利要求49-54中所述的方法,其中该杀真菌剂是二甲酰亚胺或苯基吡咯,例如异菌脲或咯菌腈。
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