JP2018504936A - 真菌株および使用方法 - Google Patents
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- C12Y207/13—Protein-histidine kinases (2.7.13)
- C12Y207/13003—Histidine kinase (2.7.13.3)
Abstract
Description
本出願は、現在係属中の2015年2月9日に出願された米国仮特許出願第62/113,905号明細書および2015年6月10日に出願された米国仮特許出願第62/173,511号明細書に対する優先権の利益を主張するものである。
「40733−PCT−SEQ_Listing.txt」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、2015年2月8日に作成され、サイズは30KBであり、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、その寄託が参照により本明細書に組み込まれる生物学的材料の寄託についての言及を含有する。詳細には、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)菌株RLP37 Nik1(M743T)であるCBS140022は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約にしたがって、オランダ王立芸術科学アカデミー(KNAW)の機関であるCentraalbureau voor Schimmelcultures,Fungal Biodiversity Centre(Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht,the Netherlands)に寄託された。
(a)菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質および/またはジカルボキシイミド系殺真菌剤とともに接種する工程;および
(b)親菌株より迅速または緩徐に増殖する菌株をスクリーニングまたは選択する工程を含む方法を提供する。
本菌株および本方法は、その野生型親糸状菌細胞から変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含むように、および/またはその変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされる変異ヒスチジンキナーゼを発現するように遺伝子組換えされている変異または突然変異糸状菌細胞であって、その細胞のヒスチジンキナーゼ媒介性シグナル伝達機序が実質的に変更または排除されている変異または突然変異糸状菌細胞に関する。そのような菌株は、改善された生産性レベルで関心対象のタンパク質の大規模生産するために良好に適する。
本菌株、本組成物および本方法について記載する前に、下記の用語および語句について定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
本開示は、第一態様では、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え、形質転換または誘導真菌株に関し、および第二態様では、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有するように真菌株を遺伝子組換えする方法に関する。さらに、本開示は、そのような組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質、およびさらにこうして生成された関心対象のタンパク質を含む組成物に関する。さらに、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用して関心対象のタンパク質を生成する方法、ならびに関心対象のタンパク質を含む組成物を生成および使用する方法に関する。本開示はさらに、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法に関する。
ヒスチジンキナーゼは、外部シグナルを検出して外部シグナルを形質導入可能な細胞事象に形質変換させることのできるセンサータンパク質である。外部刺激の検出および適切に反応するために細胞内のこれらのシグナルの伝達は、生物にとって生物のライフサイクル中の様々な環境条件に順応するために極めて重要である。シグナル伝達機序は、より複雑な生物では二成分系またはリン酸リレー系として全ての生細胞において見いだされる。そのような系は、ホスホリル基の頻回に膜結合したヒスチジンキナーゼから反応調節因子タンパク質へのシグナル伝達を付与し、したがって様々な生理学的反応を始動させる。リン酸化は、オリゴマー化(Weiss,V.,F.Claverie−Martin,and B.Magasanik.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:5088−5092;Webber,C.A.,and R.J.Kadner.Mol.Microbiol.(1997)24:1039−1048)、二量体化(Cobb,M.H.,and E.J.Goldsmith.Trends Biochem.Sci.(2000)25:7−9)、他のタンパク質との相互作用(Blat,Y.,and M.Eisenbach.Biochemistry(1994)33:902−906;Newton,A.C.Chem.Rev.(2001)101:2353−2364)、DNAとの相互作用(Aiba,H.,F.Nakasai,S.Mizushima,and T.Mizuno.J.Biochem.(1989)106:5−7)またはこれらの機序の組み合わせ(Harlocker,S.L.,L.Bergstrom,and M.Inouye.J.Biol.Chem.(1995)270:26849−26856)を促進できる。リン酸リレー系は、病原性および非病原性細菌および真菌における分化工程、走化性、二次代謝産物産生ならびに毒性関連工程の原因に関連付けられてきた(Grebe,T.W.,and J.B.Stock.Adv.Microb.Physiol.(1999)41:139−227;Wolanin,P.M.,P.A.Thomason,and J.B.Stock.Genome Biol.(2002)3:Reviews 3013)。
1つの実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)天然nik1ヒスチジンキナーゼ対立遺伝子の改変は、分泌タンパク質の量の増加を誘発することができる。nik1改変は、Nik1タンパク質の743位のアミノ酸をMet(ATG)からThr(ACG)へ変化させるオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号1)内の単一ヌクレオチドTからCへの置換であった。
組換え真菌株が改善されたレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有することを確証するために、様々なスクリーニング法を実施することができる。発現ベクターは、検出可能な標識として機能する標的タンパク質へのポリペプチド融合をコードできる、または標的タンパク質自体が選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとして機能できる可能性がある。標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング(ウェブサイトのCold Spring Harbor Protocolsから入手できる方法)、ELISA、または標識がGFPである場合は、全細胞蛍光法またはFACSによって検出することができる。例えば、6−ヒスチジンタグは標的タンパク質への融合体として含まれ、このタグがウェスタンブロッティングによって検出されるであろう。標的タンパク質が十分に高いレベルで発現すると、野生型に比した突然変異体発現の増加を検出するためには、クマシー/銀染色と組み合わせたSDS−PAGEを実施することができ、その場合には標識が必要とされない。さらに、関心対象のタンパク質の改善されたレベルを確証するためには、培養または発酵がより長期間にわたり効率的に持続することを可能にする、例えば細胞毎のタンパク質活性または量、培地1mL当たりのタンパク質活性または量の増加の検出などの他の方法、またはこれらの方法の組み合わせを使用できる。
Qp=gP/gDCW・hr
(式中、「gP」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「gDCW」はタンク内の乾燥細胞重量(DCW)のグラム数であり、「hr」は、生成時間ならびに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間(時間)である)によって決定できる。
1つの態様では、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程を含む関心対象のタンパク質を生成する方法であって、組換え、形質転換または誘導真菌株が関心対象のタンパク質を分泌し、組換え、形質転換または誘導真菌株がそのヒスチジンキナーゼ遺伝子内に突然変異を含む方法を提供する。
所定の態様では、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質であって、組換え、形質転換または誘導真菌株が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および/または変異ヒスチジンキナーゼを発現できる関心対象のタンパク質を提供する。
所定の態様では、本開示は、組換え真菌細胞によって生成された関心対象のタンパク質を含む組成物であって、組換え真菌細胞が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および/または変異ヒスチジンキナーゼを発現できる組成物を提供する。この組成物は、好適には、本明細書に提供した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工、動物栄養、食品組成物、織物処理などの様々な有用な工業用途において使用することができる。
また別の態様では、本開示は、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法であって、
(a)菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質および/またはジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤とともに接種する工程;および
(b)親菌株より迅速または緩徐に増殖する菌株を選択またはスクリーニングする工程を含む方法を提供する。
nik1遺伝子内に1つの突然変異を含む組換え真菌株を創出する
1.1.nik1M743T遺伝子置換カセットの生成
遺伝子置換構築物は、nik1遺伝子座の上流の5’領域を含有する1つのDNA断片、loxP−隣接ハイグロマイシンB耐性マーカーカセットならびにプロモーターおよびnik1遺伝子を含有する2つのDNA断片(743位のアミノ酸をメチオニンからトレオニンに変化させるTからCへの置換を含む)を、2μの骨格含有酵母ベクターpRS426(大腸菌(E.coli)内のpRS426ファージミド(ATCC(登録商標)77107(商標))由来)を用いて融合させることによって作成した(図2)。
RRab88(フォワード)−
5’−
CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGCCTAGGTGGCTTTGAGCGGTGTTGATGTGTA−3’(配列番号2)、プラスミドpRRabnik1M743TのためのAvrII制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるnik1の上流のDNA配列(5’隣接)を増幅させるために使用された。
RRab89(リバース)−5’−
TACACATCAACACCGCTCAAAGCCACCTAGGCCCTGGCGTTACCCAACTTAATCG−3’(配列番号3)、プラスミドpRRabnik1M743TのためのAvrII制限部位および5’隣接末端突出部を備えるベクター骨格を増幅させるために使用された。
RRab90(フォワード)−5’−
RRab91(リバース)−5’−GCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACCCTAGGCTCGCTCACGGTTCTTCTCGAGCAG−3’(配列番号5)、プラスミドpRRabnik1M743TのためのAvrII制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるnik1 DNA配列(3’隣接、断片2)を増幅させるために使用された。
RRab92(フォワード)−5’−
RRab93(リバース)−5’−
RRab94(フォワード)−5’−
RRab95(リバース)−5’−
RRab110(フォワード)−5’−GAAATTGCCTCCGTCACAACAGCCGTCGCTCACGGCGATCTGACAAAGAA−3’(配列番号10)、プラスミドpRRabnik1M743Tのための3’隣接断片1突出部を備えるnik1 DNA配列(3’隣接断片2)を増幅させるために使用された。
RRab111(リバース)−5’−TTCTTTGTCAGATCGCCGTGAGCGACGGCTGTTGTGACGGAGGCAATTTC−3’(配列番号11)、プラスミドpRRabnik1M743Tのための3’隣接断片2突出部を備えるnik1遺伝子(3’隣接断片1)を増幅させるために使用された。
RRab156(5’−TGGCTTTGAGCGGTGTTGATGTGTA−3’)(配列番号12);および
RRab157(5’−CTCGCTCACGGTTCTTCTCGAGCAG−3’)(配列番号13)を使用してPCRにより増幅させた。
精製濃縮遺伝子置換カセットは、PEG媒介性形質転換法(Penttila et al.,Gene,61(2):155−64(1987))を使用してT.リーゼイ(T.reesei)宿主菌株RLP37内に形質転換させた(Sheir−Neiss,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46−53(1984)によって記載された)。形質転換体は、100μg/mLのハイグロマイシンを含有するVogelの培地(Vogel,Microbial Genet.Bull.13:42−43(1956);Vogel,Am.Nat.98:435−446(1964))上でオーバーレイ方式で平板培養し、28℃でインキュベートした。ハイグロマイシンBに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムDNAは、NucleoSpin(登録商標)PlantIIキット(Machery−Nagel,Bethlehem,PA,USA)を使用して抽出した。次に、天然nik1遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するためにこのゲノムDNAを診断的PCRのための鋳型として使用した。診断的PCRのために使用されたプライマー対RRab117およびRRab167を下記に明記する。
RRab117(5’−CGAACTGTGACCTTTCAAGT−3’)(配列番号14);および
RRab167(5’−GCACACACATCTCGGCCTTA−3’)(配列番号15)。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)菌株RLP37 Nik1M743TおよびRLP37を液中(液体培地)の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を2L(DASGIP)および14Lの発酵槽内で比較した。
nik1遺伝子欠失を含む真菌株を創出する
2.1.Δnik1::hph欠失カセットの設計および創出
遺伝子置換構築物は、nik1遺伝子の5’隣接を含有する1つのDNA断片、loxP−隣接ハイグロマイシンB耐性マーカーカセットおよびnik1遺伝子の3’隣接を含有する1つのDNA断片を、2μの骨格含有酵母ベクターpRS426(大腸菌(E.coli)内のpRS426ファージミド(ATCC(登録商標)77107(商標))由来)を用いて融合させることによって作成した(図6)。下記のプライマーは、Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA,USA)によって作成された。
RRab266(フォワード)−5’−
RRab267(リバース)−5’−
RRab268(フォワード)−5’−
RRab269(リバース)−5’−
RRab270(フォワード)−5’−
RRab271(リバース)−5’−
RRab272(フォワード)−5’−
RRab273(リバース)−5’−
RRab296 (フォワード)5’−CACAGTTCGATCTACCTTACCTACA−3’(配列番号24)
RRab297 (リバース)5’−GCTGGGTTCTGAACCTGTAAAGTAC−3’(配列番号25)
精製濃縮Δnik1::hphカセットは、PEG媒介性形質転換法を使用してT.リーゼイ(T.reesei)宿主菌株RLP37内に形質転換させた(Penttila,M.,Nevalainen,H.,Ratto,M.,Salminen,E.,and Knowles,J.A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene(1987)61:155−164.)。形質転換体は、100μg/mLのハイグロマイシンBを含有するVogelの最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、28℃でインキュベートした。ハイグロマイシンBに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムDNAは、NucleoSpin(登録商標)PlantIIキット(Machery−Nagel,Bethlehem,PA,USA)を使用して抽出した。次に、天然nik1遺伝子座での欠失カセットの相同組換えを確証するために、このゲノムDNAを診断的PCRのための鋳型として使用した。
RLP37宿主菌株およびRLP37ΔNik1菌株を全タンパク質生成率および供給糖に対する収率について2LのDASGIP発酵槽内で試験した。種培養および発酵手技は、上記の実施例1に記載した同一方法にしたがって実施した。
関心対象のセルラーゼの発現宿主としての組換え真菌株
3.1.nik1M743T対立遺伝子含有遺伝子置換カセットを用いたT.リーゼイ(T.reesei)宿主菌株の形質転換、候補選択、検証および特性解析
実施例1.1に記載した精製濃縮遺伝子置換カセットは、PEG媒介性形質転換法を使用して、CBH1を過剰発現するT.リーゼイ(T.reesei)宿主菌株内に形質転換させた(Penttila et al.,Gene,61(2):155−64(1987))。形質転換体は、30μg/mLのハイグロマイシンBを含有するVogelの最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、28℃でインキュベートした。100μg/mLのハイグロマイシンBに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムDNAは、NucleoSpin(登録商標)PlantIIキット(Machery−Nagel,Bethlehem,PA,USA)を使用して抽出した。次に、天然nik1遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムDNAを診断的PCRのための鋳型として使用した。プライマー対RRab117(配列番号14)およびRRab167(配列番号15)を診断的PCRのために使用した。
上述のトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)CBH1過剰発現菌株およびトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)Cbh1 Nik1M743Tは、液中(液体)培地中の同一条件下で増殖させた。各全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を、2L(DASGIP)および14Lスケールの発酵槽内で比較した。
T.リーゼイ(T.reesei)宿主内のnik1M743T対立遺伝子のnik1wt対立遺伝子との置換による機能獲得表現型の復帰
4.1.nik1WT遺伝子置換カセットの設計および創出
遺伝子置換構築物は、nik1遺伝子座の上流の5’領域を含有する1つのDNA断片、loxP−隣接ハイグロマイシンB耐性マーカーカセットならびにプロモーターおよびnik1野生型遺伝子を含有する1つのDNA断片を、2μの骨格含有酵母ベクターpRS426(大腸菌(E.coli)内のpRS426ファージミド(ATCC(登録商標)77107(商標))由来)を用いて融合させることによって作成した(図11)。
精製濃縮nik1WT含有遺伝子置換カセットは、PEG媒介性形質転換法を使用して、天然nik1遺伝子座でnik1M743Tを含有するT.リーゼイ(T.reesei)TR Nik1M743T宿主菌株内に形質転換させた(Penttila et al.,Gene,61(2):155−64(1987))。TR Nik1M743T宿主菌株は、菌株RLP37に由来した。形質転換体は、30μg/mLのハイグロマイシンBを含有するVogelの最少培地(Vogel,Microbial Genet.Bull.13:42−43(1956);Vogel,Am.Nat.98:435−446(1964))上でオーバーレイ方式で平板培養し、28℃でインキュベートした。100μg/mLのハイグロマイシンBに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムDNAは、NucleoSpin(登録商標)PlantIIキット(Machery−Nagel,Bethlehem,PA,USA)を使用して抽出した。次に、天然nik1遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムDNAを診断的PCRのための鋳型として使用した。プライマー対RRab117(配列番号14)およびRRab167(配列番号15)を診断的PCRのために使用した。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)菌株TR Nik1WTおよびTR Nik1M743Tを液中(液体)培地の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を2L(DASGIP)の発酵槽内で比較した。
浸透圧感受性または耐性についてのスクリーニングおよび改善された分泌タンパク質生産性
1集団のトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)突然変異細胞を創出するためには任意の方法を使用できる。例えば、分生子は、T.リーゼイ(T.reesei)の菌株から入手して、UV照射、X線照射、γ線照射または例えばNTG(N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)またはEMS(エチルメタンスルホネート)などの突然変異誘発剤を用いる化学的突然変異誘発法を用いる処理にかけた(Davis,R.H.and De Serres,F.J.(1970)Genetic and microbiological research techniques for Neurospora crassa.In,Methods in Enzymology Vol17A.Eds.Tabor,H.and Tabor,C.W.pp79−143)。または、自然突然変異に依存することができる。さらに、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換による挿入突然変異誘発法などの突然変異誘発の分子生物学的方法を使用することができる(Sugui,J.A.,Chang,Y.C.and Kwon−Chung,K.J.(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:1798−17802)。
殺真菌剤に対する耐性および改善された分泌タンパク質生産性についてのスクリーニングまたは選択
1集団のトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)突然変異細胞を創出するためには任意の方法を使用できる。例えば、分生子は、T.リーゼイ(T.reesei)の菌株から入手して、UV照射、X線照射、γ線照射または例えばNTG(N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)またはEMS(エチルメタンスルホネート)などの突然変異誘発剤を用いる化学的突然変異誘発法を用いる処理にかけた(Davis,R.H.and De Serres,F.J.(1970)Genetic and microbiological research techniques for Neurospora crassa.In,Methods in Enzymology Vol17A.Eds.Tabor,H.and Tabor,C.W.pp79−143)。または、自然突然変異に依存することができる。さらに、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換による挿入突然変異誘発法などの突然変異誘発の分子生物学的方法を使用することができる(Sugui,J.A.,Chang,Y.C.and Kwon−Chung,K.J.(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:1798−17802)。
RRab126(フォワード)5’−CGGCATGGCCATGAACCTCA−3’(配列番号40)
RRab161(リバース)5’−GCACTGAAGCCGGTTAGTTC−3’(配列番号41)
RRab128(フォワード)5’−CTGTCCAGCTTCTGCTACGA−3’(配列番号42)を使用して評価した。
nik1遺伝子内に1つの突然変異を含む組換えアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)菌株を創出する
7.1.nik1M786T遺伝子置換カセットの生成
遺伝子置換構築物は、nik1遺伝子座の上流の5’領域を含有する1つのDNA断片、pyrGマーカーカセットならびにプロモーターおよびnik1遺伝子を含有する3つのDNA断片(786位のアミノ酸をメチオニンからトレオニンに変化させるTからCへの置換を含む)を、2μの骨格含有酵母ベクターpRS426(大腸菌(E.coli)内のpRS426ファージミド(ATCC(登録商標)77107(商標))由来)を用いて融合させることによって作成した(図14)。
RN0286(フォワード)−5’−CGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGGTTCCTGAATAGACTTGGGGTTG−3’(配列番号26)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1の上流のDNA断片(5’隣接)を増幅させるために使用され、ベクター骨格末端突出部を含有する。
RN0508(リバース)−5’−CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGCCCAGTACTAGATAGATACCTG−3’(配列番号27)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1の上流のDNA断片(5’断片)を増幅させるために使用され、pyrGマーカーカセット末端突出部を含有する。
RN0428(フォワード)−5’−GCCAGTGCCAAGCTTATCACC−3’(配列番号28)、プラスミドpRNnik1M786TのためのpyrGマーカーカセットを増幅させるために使用された。
RN0172(リバース)−5’−CCATGATTACGAATTCGAGCT−3’(配列番号29)、プラスミドpRNnik1M786TのためのpyrGマーカーカセットを増幅させるために使用された。
RN0509(フォワード)−5’−GATAAGGGACGGTGATAAGCTTGGCACTGGCGGATTTGCTGCCAGCTTTAC−3’(配列番号30)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1およびnik1の5’末端の上流のDNA配列(3’断片1)を増幅させるために使用され、pyrGカセット末端突出部を含有する。
RN489(リバース)−5’−CTTCAACTCTGCGATCTCTCC−3’(配列番号31)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1およびnik1の5’末端の上流のDNA配列(3’断片1)を増幅させるために使用された。
RN0495(フォワード)−5’−CACGGTTACCAAGGCTGTGG−3’(配列番号32)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1(3’断片2)を増幅させるために使用された。
RN0498(リバース)−5’−CCAATGATACCGTTCGTGGGCGTCCGGATCTCG−3’(配列番号33)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1(3’断片2)を増幅させ、M786T突然変異を組み込むために使用された。
RN0161(フォワード)−5’−CCGGACGCCCACGAACGGTATCATTGGTATGACGCAGTTGAC−3’(配列番号34)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1(3’断片3)を増幅させ、M786T突然変異を組み込むために使用された。
RN0182(リバース)−5’−CGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCGGGTGCATTTCACCACTACTTGAG−3’(配列番号35)、プラスミドpRNnik1M786Tのためのnik1(3’断片3)を増幅させるために使用され、ベクター骨格突出部を含有する。
精製濃縮遺伝子置換カセットは、PEG媒介性形質転換法を使用して、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)宿主菌株GICC2071(それ自体はアスペルギルス・ニガー変種アワモリ(Aspergillus niger var.awamori)NRRL3112に由来するグルコアミラーゼ過剰生成突然変異体UVK143fに由来する、不活性pyrG遺伝子を有する非組換え菌株)内に形質転換させた(Campbell et al.,“Improved transformation efficiency of Aspergillus niger using the homologous niaD gene for nitrate reductase”,Current Genetics,16:53−56,1989)。形質転換体は、ウリジンを含まない最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、32℃でインキュベートした。形質転換体由来のゲノムDNAは、CelLytic(商標)Y細胞溶解試薬(Sigma−Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)を使用して抽出した。次に、天然nik1遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムDNAを診断的PCRのための鋳型として使用した。診断的PCRのために使用したプライマー対は下記に明記した。
RN0591(5’−GACGTGAATACGATGGCCGA−3’)(配列番号36);および
RN0592(5’−AACGTTTGGGCTTGCGAGG−3’)(配列番号37)。
RN0577(5’−AGGTCGACTATCCGGTTAGAC−3’)(配列番号38);および
RN0583(5’−GCGACTCCCAAGCAGAAGC−3’)(配列番号39)。
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)コントロール菌株GICC2071およびGICC2071 NikM786T突然変異体99番、117番および121番は、50mLの液中(液体)培養中の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質生成を振とうフラスコ内で比較した。
Claims (55)
- 親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む組換え真菌株。
- 親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、前記親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む組換え真菌株。
- 親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、前記親菌株と比較して殺真菌剤に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む組換え真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第III群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号1の743位で突然変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、配列番号1と少なくとも60%の同一性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号43の786位で突然変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、配列番号43と少なくとも60%の同一性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 743位での前記突然変異は、その位置の前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM743Tである、請求項6に記載の組換え真菌株。
- 786位での前記突然変異は、その位置の前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM786Tである、請求項7に記載の組換え真菌株。
- 前記親菌株は、子嚢菌(Ascomycete)真菌株である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 前記親菌株は、糸状菌株である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- その親菌株と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%または少なくとも約100%以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
- 親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる形質転換真菌株または誘導真菌株であって、前記親菌株と比較して、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子または外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む形質転換真菌株または誘導真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項13に記載の真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第III群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項13または14に記載の真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号1の743位で突然変異を含むポリペプチドをコードし、配列番号1と少なくとも60%同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項13〜15のいずれか一項に記載の真菌株。
- 743位での前記突然変異は、その位置でメチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM743Tである、請求項16に記載の真菌株。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号43の786位で突然変異を含むポリペプチドをコードし、配列番号43と少なくとも60%同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項13〜15のいずれか一項に記載の真菌株。
- 786位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM786Tである、請求項18に記載の真菌株。
- 前記親菌株は、子嚢菌(Ascomycete)真菌株である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の真菌株。
- 前記親菌株は、糸状菌株である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の真菌株。
- その親菌株と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%または少なくとも約100%以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項13〜21のいずれか一項に記載の真菌株。
- タンパク質生成を改善するための方法であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子、または親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用する工程を含む方法。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項23に記載の方法。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第III群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項23または24に記載の方法。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号1の743位で突然変異を含むポリペプチド、および配列番号1と少なくとも60%同一性であるアミノ酸配列をコードする、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 743位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM743Tである、請求項26に記載の方法。
- 前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号43の786位で突然変異を含むポリペプチドおよび配列番号43と少なくとも60%同一性であるアミノ酸配列をコードする、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 786位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりM786Tである、請求項28に記載の方法。
- 前記親菌株は、子嚢菌(Ascomycete)真菌株である、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親菌株は、糸状菌株である、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%または少なくとも約100%以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 関心対象のタンパク質を生成する方法であって、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組換え真菌株または請求項13〜22のいずれか一項に記載の形質転換真菌株または誘導真菌株を発酵させる工程を含み、前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、前記関心対象のタンパク質を分泌し、前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子、または親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む方法。
- 前記関心対象のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの機能的断片またはそれらの酵素および断片の1つ以上の混合物である、請求項33に記載の方法。
- 前記関心対象のタンパク質は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、それらの機能的断片またはそれらの1つ以上の混合物である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記関心対象のタンパク質は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの機能的断片またはそれらの1つ以上の混合物である、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法を適用することによって生成される関心対象のタンパク質。
- 請求項37に記載の関心対象のタンパク質を含む組成物。
- バイオマス加水分解、クリーニング用途、穀粒加工、動物栄養、食品組成物または織物処理における請求項38に記載の組成物を使用する方法。
- 親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法であって、
(a)前記菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質とともに接種する工程;および
(b)前記親菌株より迅速または緩徐に増殖する前記菌株を選択する工程を含む方法。 - 親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる前記組換え真菌株は、前記親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記親菌株は、子嚢菌(Ascomycete)真菌株である、請求項40または41に記載の方法。
- 前記親菌株は、糸状菌株である、請求項42に記載の方法。
- 前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%または少なくとも約100%以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記浸透物質は、糖、糖アルコールまたは塩のうちの1つ以上を含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖は、グルコース、スクロース、フルクトース、オリゴフルクトース、フルクト−オリゴ糖または転化糖であってよい、請求項45に記載の方法。
- 前記糖アルコールは、ソルビトール、キシリトールまたはガラクトシロソルビトール(galactosylosorbitol)であってよい、請求項45に記載の方法。
- 前記塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項45に記載の方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用して増加した比生産性を備える突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用して浸透圧恒常性の調節に関係するヒスチジンキナーゼまたは他の遺伝子における改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用してnik1遺伝子の改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせて増加した比生産性を備える突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせて浸透圧恒常性の調節に関係するヒスチジンキナーゼまたは他の遺伝子における改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 液中培養中および/または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせてnik1遺伝子の改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
- 前記殺真菌剤は、ジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系、例えばイプロジオンまたはフルジオキソニルである、請求項49〜54に記載の方法。
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