JP6830891B2 - 真菌宿主株、dna構築物および使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年12月1日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第62/085834号に対する優先権を主張する。
連邦規則法典第37巻規則1.52(e)を順守してEFSを介して提出された配列表は、これにより本明細書に組み込まれる。EFSを介して提出された配列表テキストファイルは、サイズが13.4キロバイトである、2015年10月11日に作成されたファイル「2015−580_40676−WO−PCT_ST25.txt」を含有する。
a)染色体DNA内の少なくとも1つの制限酵素部位を含む真菌宿主細胞を入手する工程;および
b)関心対象の1つ以上の遺伝子を発現させるために操作可能である配列、少なくとも1つの選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列との実質的相同性を備える配列を含有する核酸分子を入手する工程であって、前記相同配列は相同性組換え事象を誘発して前記関心対象の遺伝子の発現を生じさせる工程;
ならびにb)の核酸分子をa)の真菌宿主細胞に染色体制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で形質転換させる工程、を含む標的遺伝子組込み法を提供する。
本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えDNA構築物に関する。真菌宿主株は、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象のタンパク質を発現させるために特に安定性および有用である。本開示はさらに、そのように構築された真菌宿主株、関心対象のタンパク質およびそのような改良された真菌宿主株の発酵により調製されるそのような関心対象のタンパク質を含む組成物の使用に関する。
本特許の菌株、組成物および方法について記載する前に、下記の用語および語句について定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えDNA構築物に関する。真菌宿主株は、当分野において公知の他の発現方法と比較して、より高い信頼性および/または発現レベルにおけるより低い可変性を備える、これらの宿主内での関心対象の遺伝子もしくは変異体の発現を提供するために使用できる。真菌宿主株は、特定の実施形態では、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象の遺伝子を発現させるための遺伝子組込みを効率的に標的とするために有用である。
第1態様では、本開示は、遺伝的に安定性の形質転換真菌宿主株を構築する方法であって、a)線状化DNAと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体DNA内で二本鎖切断を生成できる工程;およびb)工程a)において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を提供する。
関心対象のタンパク質のための生成宿主としての真菌株の使用は、長年にわたり経済的に実行可能であると見なされてきて、これまでの期間は商業的環境において広範に使用されてきた。真菌に対する形質転換および菌株構築のために、PEG/プロトプラスト形質転換(Hinnen et al.,1978)、電気的形質転換(Karube et al.,1985)、バイオリスティクス(Armaleo et al.,1990)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介性形質転換(ATMT) (de Groot et al.,1998)およびRNA緩衝(RNAi)技術(Akashi et al.,2005)による標準方法を含む様々な遺伝子法が開発されてきた。
PEG−プロトプラスト系をベースとする制限酵素媒介性組込み(REMI)は、最初にS.セレビシアエ(S.cerevisiae)において確立され(Schiest and Petes,1991)、例えばコクリオボルス・ヘテロストロフス(Cochliobolus heterostrophus)(Lu et al.,1994)およびアルテルナリア・アルテルナタ(Alternaria alternata)(Tanaka et al.,1999)などの数種の真菌植物病原体において上首尾で適用されてきた。今日、REMI技術は、病原性遺伝子の同定ならびに他の遺伝子機能評価において有用な極めて多数もしくは高百分率の真菌突然変異体を生成することに成功してきた。例えば、線虫捕捉真菌であるアルトロボトリス・オリゴスポラ(Arthrobotrys oligospora)を最適化REMI法を用いて処理すると、1μgの線状プラスミドDNA当たり、および総数2,000個超の形質転換体中で34〜175個の形質転換体が生じた。さらに、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)の突然変異体ライブラリー内でREMIによってスクリーニングした11個の興味深い突然変異体およびコムギ瘡痂病、CBL1およびMSY1における菌力と関連するまた別の2つの遺伝子もまた同定された(Seong et al.,2005)。さらに、病原性または植物防御化合物に対する耐性に関連する数種のタンパク質は、F.オキシスポラム(F.oxysporum)からREMI技術によって同定された(Duyvesteijn et al.,2005;Imazaki et al.,2007;Madrid et al.,2003)。これらをまとめると、改良された突然変異体(形質転換体)頻度および単一コピー挿入率は、REMIによって確実に得ることができる。
1つの態様では、本開示は、第1部では、染色体DNA内に少なくとも1つの制限酵素部位を含有する真菌宿主細胞;および第2部では、1つ以上の関心対象の遺伝子を発現させるために操作できる配列、選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列と実質的に相同性を備える配列を含有する核酸分子を含む真菌発現系であって、このとき相同性配列は関心対象の遺伝子の発現を結果として生じる相同性組換え事象を誘発する真菌発現系を提供する。さらに、本開示は、上述の態様の真菌発現系を使用する方法であって、制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で前記核酸分子を真菌宿主細胞内に形質転換させる工程を含む方法を提供する。
1つの態様では、本開示は、好適な培地中で、a)線状化DNAと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体DNA内で二本鎖切断を生成できる工程;およびb)工程a)において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を使用して得られている形質転換真菌株を発酵させる方法を提供する。
1つの態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされ、関心対象の遺伝子を発現させるによって生成された関心対象のタンパク質であって、その方法は、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換真菌株を増殖および発酵させる工程を含み、その菌株は:a)線状化DNAと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体DNA内で二本鎖切断を生成できる工程;およびb)工程a)において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を使用して得られる関心対象のタンパク質を提供する。
1つの態様では、本開示は、関心対象のタンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。タンパク質性組成物は、好適には、本明細書に提供した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工処理、動物栄養、食品組成物、織物処理などの様々な有用な工業用途において使用することができる。
A.AclAmy1発現ベクターの構築
1)pTrex3gM−AclAmy1
ここで関心対象のモデルタンパク質として使用する酵素AclAmy1は、(配列番号1)(ボールド体およびイタリック体で記載したシグナル配列を備える)のアミノ酸配列を有するアスペルギルス・クラバタス(Aspergillus clavatus)を起源とする酸性安定性真菌α−アミラーゼを意味する。
プライマー1(5’−ggggcggccgccaccATGAAGCTTCTAGCTTTGACAAC−3’)(配列番号3);および
プライマー2(5’−cccggcgcgccttaTCACCTCCAAGAGCTGTCCAC−3’)(配列番号4).
発現ベクターpTrex8gM−AclAmyl1を構築するために、A.クラバタス(A.clavatus)Amy1をコードする断片を最初に(上述のような)プラスミドpTrex3gM−AclAmy1からpDonor221ベクター内に供給業者(Life Technologies,Carlsbad CA)の勧告にしたがってGateway(登録商標)BP反応を介して再クローン化した。生じたpEntry−AclAmy1プラスミドおよびその機能エレメントは、図2に示した。
A.クラバタス(A.clavatus)α−アミラーゼをコードするENTRYベクターDNA断片をさらにGateway(登録商標)LR反応によってさらにpTREX8gMに移すと、結果としてプラスミドpTREX8gM−AclAmy1が生じた(図3)。pTREX8gM−AclAmy1の機能エレメントは、図3に列挙した。
1.プロトプラストの調製
トリコデルマ(Trichoderma)属菌株の胞子は、50mLのYEG培養培地(5g/Lの酵母抽出物、20g/Lのグルコース)中に接種し、50mmの動程を備える撹拌式インキュベーター(Infors−HT,Switzerland)内の28℃で250mLの撹拌フラスコ内で180rpmの速度で一晩増殖させた。一部の実験では、cbh1、cbh2、egl1およびegl2a遺伝子の欠失を伴うT.リーゼイ(T.reesei)菌株RL−P37の誘導体を使用し、一部の他の実験では、他のT.リーゼイ(T.reesei)菌株を使用した。任意の好適なトリコデルマ(Trichoderma)属菌株は、本明細書に開示した実験のような実験のために機能するであろう。
一部の実験では、プロトプラストを形質転換させるためにPCR産物を直接的に使用した。約5〜20μgのDNA(PCR産物)は、200μLのプロトプラストに加え、氷上で20分間インキュベートした。その後、形質転換混合物を室温に移し、2mLの25%のPEG6000、CaCl2、10mMのTris−HCl(pH7.5)および4mLの1.2Mのソルビトール、10mMのCaCl2、10mMのTris−HCl(pH7.5)を加えた。
プライマー1:5’GAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTG(配列番号5);and
プライマー2:3’CGATACACGCACCAGGTACCCCAGTGGGGAAGC)(配列番号6).
グルコース/ソホロース産生培地中で増殖させた後、Megazyme,UK(「Ceralpha法」)からのα−アミラーゼ活性キットを用いる活性アッセイを使用してA.クラバタス(A.clavatus)α−アミラーゼの発現レベルについて発酵サンプルを分析した。
固体の多孔性マトリックスからラクトースを遊離させるように構成された24ウエルプレート内に上述のT.リーゼイ(T.reesei)菌株RL−P37の誘導体由来のトリコデルマ(Trichoderma)属形質転換体を接種した。各ウエルは、1.25mLのNREL培地(9g/Lのカザミノ酸、5g/Lの(NH4)2SO4、4.5g/LのKH2PO4、1g/LのMgSO4 *7H2O、1g/LのCaCl2 *2H2O、33g/LのPIPPSバッファー(pH5.5)、0.25%のT.リーゼイ(T.reesei)微量元素(100%:175g/Lのクエン酸(無水)、200g/LのFeSO4 *7H2O、16g/LのZnSO4 *7H2O、3.2g/LのCuSO4.5H2O、1.4g/LのMnSO4.H2O、0.8g/LのH3BO3(ホウ酸)、16g/Lのグルコース)を含有していた。透明化懸濁液は、Ceralpha法(Megazyme,UK)を使用してα−アミラーゼ活性について分析した。
A.T.リーゼイ(T.reesei)におけるI−SceI活性を測定するためのレポーター菌株の構築
1.I−SceIランディング部位カセットの構築:方法
I−SceIランディング部位を備えるプラスミドpBJP6を設計し、下記および図6に示したように構築した。
GSPL(フォワード)5’−TCTAGAGGCTGTGCATTTCCGTTCTC−3’(配列番号7)
GSP2(リバース)5’−TGGTTACGGCAACAAACCTG−3’(配列番号8)
PP1(フォワード)
5’−CAGGTTTGTTGCCGTAACCAATTTGCCTGCTTGACCGACTG−3’(配列番号9)
PP2(リバース)
5’−GGAACGATGGGTTTGCGTCCATATGGGGTAAGTCACTTACGGCAGC−3’(配列番号10)
GSP3(フォワード)5’−CCATATGGACGCAAACCCATCGTTCC−3’(配列番号11)
GSP4(リバース)5’−GGTACCGGTTCACCGCCTTATGTGAG−3’(配列番号12)
FwpGAN−ISceIPmel(フォワード)
5’−GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATTCGCCCTTGCTCTAGATAAC−3’(配列番号13)
RevpGAN−ISCELPmel(リバース)
5’−GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATAATTCGCCCTTGACTAGTGC−3’(配列番号14)
GSP5(フォワード)5’−GCGATCGCACGCAAACCCATCGTTCC−3’(配列番号15)
GPS6(リバース)5’−GCGATCGCGGTTCACCGCCTTATGTGAG−3’(配列番号16)
T.リーゼイ(T.reesei)内のメガヌクレアーゼI−SceIの活性を監視するためにレポーター構築物pBJP6を使用し、アッセイ法については図8に描出した。
pBJP6は、プライマーGSP1およびGSP4(プライマーの場所は図6に示した)を用いてPCR増幅させ、上述のようにI−SceI活性を監視するための7.5kbのPCR産物/カセット(5’UTR cbh2−Pcbh1−GFPn*−I−SceI−pyrG−I−SceI−GFPc*−Tcbh2構築物)は、PEG媒介性プロトプラスト形質転換法によってT.リーゼイ(T.reesei)菌株P37delta cbhIpyrG−26に形質転換させる。
1.I−SceI発現ベクターの構築
T.リーゼイ(T.reesei)における発現のために、I−SceI配列(GenBankアクセッション番号GU575293.1)のコドン最適化合成遺伝子を作成した(Geneart,Germany)。合成I−SceIヌクレオチド配列(配列番号17)は、下記に示した:
pTTT−I−SceI構築物を使用してI−SceIランディング部位を含有する菌株ならびにI−SceIランディング部位を含有していない陰性コントロール菌株を形質転換させた。形質転換後、amdS陽性形質転換体を最小培地上で精製し、グルコースおよび窒素源としてのアセトアミドを含有してプレーティングし、炭素源としての2%のグルコース(非誘導条件)もしくは2%のラクトース(誘導条件)を含有する9cmのペトリ皿の中央に点接種した。形質転換結果は図9に示した。
1.標的組込みのためのグルコアミラーゼ発現カセットの構築
米国特許第8138321号明細書に記載されている、cbhIプロモーターの制御下でT.リーゼイ(T.reesei)の野生型グルコアミラーゼ遺伝子を運ぶプラスミドptrex6gGA/wtは、I−SceIランディング部位で組み込むことのできるグルコアミラーゼ発現カセットを構築するための出発点として使用された。
I−SceIによって媒介されるDSB(二本鎖切断)がT.リーゼイ(T.reesei)における形質転換および組換え効率を増加させられるかどうかを決定するために、グルコアミラーゼ発現カセットを標的組込みのために線状断片としてI−SceI制限部位およびI−SceI発現カセット(JP7.7.12)を運んでいる菌株内に形質転換させた。
標的組込みグルコアミラーゼ発現カセットを用いた形質転換体のグルコアミラーゼ活性の可変性をランダム組込みに由来するグルコアミラーゼ活性の可変性と比較するために、菌株をマイクロタイタープレート内で増殖させ、培地をグルコアミラーゼ活性について試験した。
1.I−SceI添加による標的組込み
I−SceIによって媒介される標的組込みは、さらにI−SceI制限部位(JP7.7)を運んでいるプロトプラストと線状化グルコアミラーゼ標的組込みカセット(pJP8)との混合物中にI−SceI制限酵素を直接的に添加することによって試験されている。
標的組込みグルコアミラーゼ発現カセットを用いた形質転換体のグルコアミラーゼ活性の可変性をランダム組込みに由来するグルコアミラーゼ活性の可変性と比較するために、菌株をマイクロタイタープレート内で増殖させ、培地をグルコアミラーゼ活性について試験した。
A.2つの異なるDNA断片を用いたT.リーゼイ(T.reesei)の形質転換
2つの異なる線状DNA断片は、関心対象のまた別のタンパク質を発現させるために構築し、共形質転換によりT.リーゼイ(T.reesei)内に導入した。1つの断片は、選択マーカーとしてのpyr2遺伝子を有し、他の断片は選択マーカーとしてamdS遺伝子を有していた。形質転換は、任意の制限酵素を用いずに、または制限酵素であるSwaIもしくはPacIを用いて実施した。形質転換体は、両方のマーカーの存在について同時に選択した。制限酵素を全く加えていない場合に比較して、形質転換中の様々な量の様々な制限酵素を包含する効果を決定するために、数回の形質転換を実施した。下記は、得られた形質転換体の数および安定性であった百分率を示している結果の概要である。
形質転換効率および形質転換体の安定性に複数の制限酵素を使用することが及ぼす効果を見るために、T.リーゼイ(T.reesei)菌株は、溶解性セルロースモノオキシゲナーゼ(EG4)コーディング配列を含むPCR断片および任意の制限酵素を用いて処理していない、20単位のAsiSIだけで処理した、各7単位のAsiSI、PacIおよびSwaIを用いて処理した、または各7単位のAsiSI、PacIおよびPmeIを用いて処理したpyr2選択マーカーを用いて形質転換させた。形質転換は、上記に記載したように標準PEGプロトコルにしたがって実施し、形質転換体は1Mのソルビトールを含む最小培地プレート上で増殖させた。結果は、図17Aおよび17Bに示した。同一総量の制限酵素による消化を行うと、3種の異なる酵素を用いた消化は、1つだけの制限酵素(50%)を用いた消化に比較して、安定性T.リーゼイ(T.reesei)形質転換体(80%まで)の百分率を増加させたが、これは形質転換効率を低下させると思われる。
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Claims (20)
- 遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ(Trichoderma)属菌株を構築する方法であって、
a)線状化もしくは環状DNAと複数の制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ(Trichoderma)属細胞を形質転換させる工程であって、前記制限酵素は、前記トリコデルマ(Trichoderma)属細胞の前記染色体DNA内で二本鎖切断(DSB)を生成でき、かつ、少なくとも8塩基対の制限部位を認識する、PacI、SwaI、PmeI、AscI、AsiSI、FseI、NotI、SrfI、およびSgfIから選択される、工程;および
b)a)において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ(Trichoderma)属菌株を選択する工程であって、前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率は、前記制限酵素の処理を用いずに入手できる前記安定性形質転換体の百分率より少なくとも20%高い工程を含む方法。 - 前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の前記百分率は、前記制限酵素の処理を用いない安定性形質転換体の前記百分率より少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%もしくは90%高い、請求項1に記載の方法。
- 前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の前記百分率は、少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記制限酵素の処理を用いた形質転換効率は、制限酵素の処理を用いない形質転換効率より少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%もしくは90%高い、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制限酵素は、形質転換トリコデルマ(Trichoderma)属細胞の前記染色体DNA内で適合する付着端を生成できる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トリコデルマ(Trichoderma)属細胞は、線状化DNAを用いて形質転換させられる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トリコデルマ(Trichoderma)属細胞は、環状DNAを用いて形質転換
させられる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記線状化もしくは環状DNAは、1つ以上の関心対象の遺伝子を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの2つ以上の混合物をコードする、請求項8に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの2つ以上の混合物をコードする、請求項8に記載の方法。
- 前記線状化もしくは環状DNAは、選択マーカーをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記選択マーカーは、als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、sucA、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子またはチミジンキナーゼマーカーである、請求項11に記載の方法。
- 前記方法は、トリコデルマ(Trichoderma)属ゲノム配列と相同であるDNAまたはRNA配列を使用する工程を含まない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、トリコデルマ(Trichoderma)属ゲノム配列と相同であるDNAまたはRNA配列を使用する工程を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、前記制限酵素によって切断される部位で相同性組換えによって前記トリコデルマ(Trichoderma)属染色体DNAと再結合するトリコデルマ(Trichoderma)属ゲノム配列と相同性であるDNA配列を使用する工程を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記トリコデルマ(Trichoderma)属菌株は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)菌株である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 線状化もしくは環状DNAと複数の制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ(Trichoderma)属細胞を形質転換させる工程を含むトリコデルマ(Trichoderma)属形質転換体の安定性を改良する方法であって、
前記制限酵素は、トリコデルマ(Trichoderma)属細胞の前記染色体DNA内で二本鎖切断(DSB)を生成することができ、かつ、少なくとも8塩基対の制限部位を認識する、PacI、SwaI、PmeI、AscI、AsiSI、FseI、NotI、SrfI、およびSgfIから選択され、
前記制限酵素の処理を用いて生じた安定性形質転換体の前記百分率が前記制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の前記百分率より少なくとも20%高い方法。 - 遺伝的に安定性のトリコデルマ(Trichoderma)属形質転換体を選択する工程をさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 関心対象のタンパク質を発現させる方法であって、
a)請求項1に記載の方法を用いて形質転換トリコデルマ(Trichoderma)属菌株を構築して、該菌株を使用する工程であって、前記関心対象の遺伝子は前記関心対象のタンパク質をコードする工程;および
b)前記トリコデルマ(Trichoderma)属菌株から前記関心対象のタンパク質を生成する工程
を含む方法。 - 前記関心対象のタンパク質は、分泌タンパク質である、請求項19に記載の方法。
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