DE10159396A1

DE10159396A1 - Genetische Stammoptimierung zur verbesserten Herstellung von Riboflavin

Info

Publication number: DE10159396A1
Application number: DE10159396A
Authority: DE
Inventors: Henning Althoefer; Doval Jose L Revuelta
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2001-12-04
Publication date: 2003-06-12
Also published as: CN1599796A; KR20050044861A; WO2003048367A1; AU2002358083A1; EP1456388A1; JP2005511053A

Abstract

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin, indem man einen zur Riboflavinproduktion fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe rib1, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschließend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. Durch die spezielle Auswahl von Genen der Riboflavinbiosynthese bzw. deren Kombination in Organismen der Gattung Ashbya und deren Expression wird die Riboflavinproduktion in diesen Organismen gesteigert.
Vitamin-B2, auch Riboflavin genannt, wird von allen Pflanzen und einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt. Für Mensch und Tier ist es essentiell, da sie nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren. Riboflavin spielt eine wichtige Rolle im Metabolismus. So ist es beispielsweise an der Verwertung von Kohlenhydraten beteiligt. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auftreten. Vitamin-B2 hat deshalb eine große wirtschaftliche Bedeutung beispielsweise als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Es wird verschiedensten Lebensmitteln zugesetzt. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. verwendet.
Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, eingesetzt werden müssen.
Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die fermentative Herstellung des Vitamin B2 durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z. B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin- Produzenten beschrieben. In EP-A-0 405 370 und EP-A-0 821 063 wird die Herstellung von Riboflavin mit rekombinanten Bakterienstämmen beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation mit Riboflavin-Biosynthesegenen aus Bacillus subtilis erhalten wurden.
In WO 95/26406 bzw. WO 94/11515 wird die Klonierung der für die Riboflavin-Biosynthese spezifischen Gene aus den eukaryontischen Organismen Ashbya gossypii bzw. Saccharomyces cerevisiae, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden, und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese beschrieben.
WO 99/61623 beschreibt die Nutzung der Auswahl von Riboflavin- Biosynthesegenen (rib3, rib4, rib5) zur Erhöhung der Riboflavinbildung.
In beiden oben genannten Organismen katalysieren 6 Enzyme ausgehend von Guanosintriphosphat (GTP) und von Ribulose-5- Phosphat die Bildung von Riboflavin. Hierbei setzt die GTP-Cyclohydrolase-II (rib1-Genprodukt) GTP zu 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidinon-5-phosphat um. Diese Verbindung wird anschließend durch die 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4- (3H)-pyrimidinon-5-phosphat Reduktase (rib7 Genprodukt) zu 2,5-Diamino-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidin-5-phosphat reduziert und dann durch eine spezifische Deaminase (rib2-Genprodukt) zu 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion- 5-phosphat deaminiert. Durch eine unspezifische Phosphatase wird daraufhin das Phosphat abgespalten.
Ribulose-5-phosphat, neben GTP das zweite Ausgangsprodukt der letzten enzymatischen Schritte der Riboflavinbiosynthese, wird durch die 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (rib3-Genprodukt) zu 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DBP) umgesetzt.
Sowohl DBP als auch 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H, 3H)-Pyrimidindion sind die Edukte der enzymatischen Synthese von 6,7-Dimethyl- 8-ribityllumazin. Diese Reaktion wird durch das rib4-Genprodukt (DMRL-Synthase) katalysiert. DMRL wird daraufhin durch die Riboflavin-Synthase (rib5-Genprodukt) zu Riboflavin umgesetzt (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).
Trotz dieser Fortschritte in der Herstellung von Riboflavin besteht nach wie vor ein Bedarf zur Verbesserung und Steigerung der Vitamin B2-Produktivität um den steigenden Bedarf zu decken und die Herstellung von Riboflavin effizienter zu gestalten.
Es bestand daher die Aufgabe die Vitamin B2-Produktivität weiter zu verbessern. Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin, indem man einen zur fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya, züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe rib1, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschließend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert.
Vorteilhaft wird das Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, durchgeführt, bei dem beispielsweise die Kombination der folgenden rib-Genprodukte (die Zahlen geben jeweils das entsprechende rib-Genprodukt an) eine erhöhte Aktivität aufweisen: 1+2, 1+4, 1+7, 2+4, 2+7, 4+7.
Besonders bevorzugt sind solche Organismen bei denen die Kombination der folgenden rib-Genprodukte (die Zahlen geben jeweils das entsprechende rib-Genprodukt an) eine erhöhte Aktivität aufweisen: 1+2+4, 1+2+7, 1+4+7, 2+4+7.
Die erhöhte Aktivität der rib Genprodukte wird dabei im Vergleich zu dem Ashbya gossypii Stamm ATCC 10895 bewertet, der als Referenzorganismus dient. Die entsprechenden Verfahren zur Messung der Aktivität der rib-Genprodukte, d. h. die Enzymaktivitäten sind dem Fachmann geläufig und in der Literatur beschrieben.
Weiter vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B2-Produktivität ist die Kombination von Steigerung der natürlichen Enzymaktivität und Einbringen der oben genannten Genkombination zur Erhöhung der Genexpression.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich prinzipiell alle Organismen der Gattung Ashbya, die in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren.
Als rib Genprodukte werden nicht nur die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 beschriebenen Polypeptidsequenzen bezeichnet, sondern auch solche von diesen Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von bis zu 5% bevorzugt bis zu 3%, besonders bevorzugt bis zu 2% der Aminosäurecodons erhältliche Polypeptidsequenzen bezeichnet. Solche Sequenzen kommen beispielsweise als natürliche Allelvariationen vor oder können durch Mutationsbehandlung des Ausgangsstammes beispielsweise durch mutagene Substanzen oder elektromagnetische Strahlung und anschließende Selektion auf erhöhte Riboflavinproduktivität erhalten werden.
Die erfindungsgemäße Kombination der rib-Gene rib1, rib2, rib4 und rib7 und/oder die Aktivitätserhöhung der Gene und ihrer Genprodukte führt zu einer deutlich gesteigerten Riboflavin- Produktivität. Die genannten Gene lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vorteilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektroporation, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Als vorteilhaft seien beispielhaft Methoden wie das Einbringen der DNA über homologe oder heterologe Rekombination beispielsweise mit Hilfe des ura-3-Gens, speziell des ura-3- Gens von Ashbya, wie in der deutschen Anmeldung DE 198 01 120.2 beschrieben und/oder über die im folgenden beschriebene REMI- Methode (= "Restriktion-Enzyme-Mediated-Integration"), genannt.
Die REMI-Technik basiert auf der Kotransformation eines linearen DNA-Konstruktes, das an beiden Enden mit derselben Restriktionsendonuklease geschnitten wurde, zusammen mit der Restriktionsendonuklease, die für diese Restriktion des DNA-Konstrukts verwendet wurde, in einen Organismus. Die Restriktionsendonuklease schneidet daraufhin die genomische DNA des Organismus, in den das DNA-Konstrukt zusammen mit dem Restriktionsenzym eingebracht wurde. Dies führt zu einer Aktivierung der zelleigenen Reparaturmechanismen. Diese Reparaturmechanismen reparieren die durch die Endonuklease hervorgerufene Strangbrüche der genomischen DNA und bauen dabei mit einer gewissen Frequenz auch das kotransformierte DNA-Konstrukt mit ins Genom ein. In der Regel bleiben dabei die Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der DNA erhalten.
Diese Technik wurde von Bölker et al. (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) für die Insertionsmutagenese von Pilzen beschrieben. Von Schiestl und Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589) wurde die Methode zur Aufklärung, ob es bei Saccharomyces eine heterologe Rekombination gibt, verwendet. Zur stabilen Transformation und regulierten Expression eines induzierbaren Reportergens wurde die Methode von ßrown et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 1996 : 75-80) beschrieben. Das System wurde bisher noch nicht als gentechnisches Werkzeug zur Optimierung von Stoffwechselwegen oder zur kommerzielle überexpression von Proteinen eingesetzt.
Am Beispiel der Riboflavinsynthese wurde gezeigt, dass mit Hilfe der REMI-Methode Biosynthesegene in das Genom der oben genannten Organismen integriert werden kann und damit Produktionsverfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten des Primär- oder Sekundärmetabolismus speziell von Biosynthesewegen beispielsweise von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin oder Tryptophan, Vitaminen wie Vitamin A, B2, B6 B12, C, D, E, F, S-Adenosylmethionin, Biotin, Panthotensäure oder Folsäure, Carotinoiden wie β-Carotin, Lycopin, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin oder Proteinen wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z. B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Polypetidhormone wie Vassopressin, Endorphine, Endostatin, Angiostatin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder α_vβ111, Rezeptoren wie die verschiedenen Glutamatrezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angiotensin optimiert werden können.
Mit Hilfe der REMI-Methode können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente oder andere der oben genannten Gene an transcriptionsaktive Stellen im Genom plaziert werden.
Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit einem mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotikaresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Biosynthesegene wie die Riboflavingene, das Luciferasegen, β-Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidasegen, β-Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine bis zu Faktor 2 unterschiedliche Produktivität zeigen (siehe Fig. 1). Fig. 1 zeigt die Klone Lu21#1 und LU21#2, die nach Integration erhalten wurden, mit ihren unterschiedlichen Vitamin B2-(= Riboflavin)Produktivitäten.
Im Falle, dass die Biosynthesegene selber eine leichte Detektierbarkeit ermöglichen, kann wie beispielsweise im Falle des Riboflavins auf ein zusätzliches Reportergen verzichtet werden.
Sollen mehrere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Auch Genfragmente, die für die jeweiligen Aktivitäten kodieren können in der REMI-Technik eingesetzt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Integration von Biosynthesegenen in das Genom von Organismen eignen sich prinzipiell alle bekannten Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme, die nur 4 Basenpaare als Restriktionsschnittstelle erkennen, sind weniger bevorzugt, da sie zu häufig im Genom oder im zu integrierenden Vektor schneiden, bevorzugt sind Enzyme die 6, 7, 8 oder mehr Basenpaare als Schnittstelle erkennen wie BamHI, EcoRI, BglII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, Bpn1, NotI, SrfI oder SfiI um nur einige der möglichen Enzyme zu nennen. Von Vorteil ist, wenn die verwendeten Enzyme keine Schnittstellen mehr in der einzuführenden DNA haben, dies erhöht die Effizienz der Integration. In der Regel werden 5 bis 500 U, bevorzugt 10 bis 250, besonders bevorzugt 10 bis 100 U der Enzyme im REMI-Ansatz verwendet. Die Enzyme werden vorteilhaft in einer wässrigen Lösung eingesetzt, die Substanzen zur osmotischen Stabilisierung wie Zucker wie Saccharose, Trehalose oder Glucose, Polyole wie Glycerin oder Polyethylenglycol, eine Puffer mit einer vorteilhaften Pufferung im Bereich von pH 5 bis 9, bevorzugt 6 bis 8, besonders bevorzugt 7 bis 8 wie Tris, MOPS, HEPES, MES oder PIPES und/oder Substanzen zur Stabilisierung der Nukleinsäuren enthalten wie anorganische oder organische Salze von Mg, Cu, Co, Fe, Mn oder Mo. Es können gegebenenfalls noch weitere Stoffe enthalten sein wie EDTA, EDDA, DTT, β-Mercaptoethanol oder Nukleasehemmstoffe. Es ist aber auch möglich die REMI-Technik ohne diese Zusätze durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C durchgeführt. Für das Verfahren eignen sich alle bekannten Methoden zur Destabilisierung von Zellmembranen wie beispielsweise die Elektroporation, die Fusion mit beladenen Vesikeln oder die Destabilisierung über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calziumsalze bevorzugt sind die Lithiumsalze.
Die Nukleinsäuren können nach dem Isolieren direkt oder nach Aufreinigung für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Kombination der rib-Gene in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.
Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten die Enzymaktivität der rib-Genprodukte in der Zelle zu erhöhen.
Eine Möglichkeit besteht darin, die endogenen rib-Gene 1, 2, 4 und 7 so zu verändern, dass sie für Enzyme mit gegenüber den Ausgangsenzymen erhöhter rib 1, 2, 4 bzw. 7-Aktivität kodieren. Eine andere Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung der katalytischen Zentren ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzyminhibitoren aufgehoben wird, das heißt sie weisen eine erhöhte spezifische Aktivität auf oder ihre Aktivität wird nicht gehemmt. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform durch Erhöhung der Enzymsynthese in der Zelle erfolgen, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymsynthese reprimieren oder durch Erhöhung der Aktivität von Faktoren oder Regulatorelementen, die eine verstärkte Synthese fördern, oder bevorzugt durch Einbringen weiterer Genkopien. Durch diese Maßnahmen wird die Gesamtaktivität der Genprodukte in der Zelle erhöht, ohne die spezifische Aktivität zu verändern. Es kann auch eine Kombination dieser Methoden verwendet werden, das heißt Erhöhung der spezifischen Aktivität sowie Erhöhung der Gesamtaktivität. Diese Änderungen können prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die Nukleinsäuresequenzen der Gene, Regulationselemente oder deren Promotoren eingebracht werden. Hierzu können die Sequenzen beispielsweise einer Mutageneses wie einer "site directed mutagenesis" unterzogen werden wie sie in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird.
Von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben.
Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschrieben.
Von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrieben.
Die veränderten Nukleinsäuresequenzen werden anschließend wieder über Vektoren in die Organismen zurückgebracht.
Es können zur Erhöhung der Enzymaktivitäten auch veränderte Promotorbereiche vor die natürlichen Gene gebracht werden, so dass die Expression der Gene gesteigert wird und damit die Aktivität letztlich angehoben wird. Auch am 3'-Ende können Sequenzen eingebracht werden, die beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöhen und dadurch eine erhöhte Translation ermöglichen. Dies führt ebenfalls zu einer höheren Enzymaktivität.
Vorzugsweise werden weitere Genkopien der rib-Gene 1, 2, 7 und 4 gemeinsam in die Zelle eingebracht. Diese Genkopien können der natürlichen Regulation unterliegen, einer veränderten Regulation, wobei die natürlichen Regulationsregionen derart verändert wurden, das sie eine erhöhte Expression der Gene ermöglicht oder aber es können Regulationssequenzen fremder Gene oder sogar artfremder Gene verwendet werden.
Besonders vorteilhaft ist eine Kombination der oben genannten Methoden.
Vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kombination der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 oder deren funktionelle Äquivalente.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Genexpression der rib-Gene 1, 2, 7 und 4 kann vorteilhaft durch Erhöhen der rib1, 2, 7, 4 Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die rib1, 2, 7 und 4 Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der rib1, 2, 7 und 4 mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.
Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die rib-Gene 1, 2, 7 und 4, oder homologer Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen rib-Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält.
Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken. Alternativ kann auch jedes der beschriebenen Gene in einen einzelnen Vektor gebracht und in den jeweiligen Produktionsorganismus transformiert werden.
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment sind die rib-Gensequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 oder deren funktionelle Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 oder deren funktionelle Äquivalente inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die rib-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, TS-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U 87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die rib-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen.
Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben genannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2αM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York- Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions-. signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.
Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2αm Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987). Dabei können die Gene rib1, rib2, rib4 und rib7 einzeln im Genom an verschiedenen Orten oder auf verschiedenen Vektoren vorliegen oder gemeinsam im Genom oder auf einem Vektor vorliegen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen, die die Kombination der rib-Gene 1, 2, 7 und 4 oder deren funktionelle Äquivalente enthalten, zeigen eine erhöhte Riboflavin-Produktion.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für die Herstellung von Riboflavin verwendeten Organismen in einem Medium, das das Wachstum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.
Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zuckerquellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bisphosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronensäure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren wie Glycin oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden.
Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kontrolle der Fe²⁺- oder Fe³⁺-Ionenkonzentration im Produktionsmedium.
Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.
Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, dass die Organismen optimal wachsen und dass die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, besonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.
Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL-Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtbedingungen sind für Bacillus und weitere Organismen beispielsweise der Schrift EP-A-0 405 370 speziell dem Beispiel 9, für Candida der Schrift WO 88/09822 speziell Tabelle 3 und für Ashbya der Schrift von Schmidt et al. (Microbiology, 142, 1996: 419-426) zu entnehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich in batch- oder fed-batch-Weise durchgeführt werden.
Abhängig davon wie hoch die Ausgangsproduktivität des verwendeten Organismus ist, lässt sich die Riboflavin-Produktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich stark steigern. In der Regel lässt sich die Produktivität vorteilhaft um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 20%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% jeweils gegenüber dem Ausgangsorganismus steigern.

Beispiele

Die Isolierung der rib-Gene 1, 2, 3, 4, 5 und 7 aus Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae wird in den Patenten WO 95/26406 und WO 93/03183 und speziell in den Beispielen beschrieben und wurde entsprechend durchgeführt. Auf diese Schriften wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
Sequenz 1 zeigt das DNA-Konstrukt, das neben dem zur Transformation notwendigen Selektionsmarker die Genfragmente von rib1, rib2, rib4 und rib7 trägt.
Allgemeine Nukleinsäureverfahren wie z. B. Klonierung, Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Verknüpfen von DNA- Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wenn nichts anderes beschrieben wurde wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Beispiel 1

Klonierung des DNA-Konstruktes, das die rib1, rib2, rib4 und rib7 Genkopien enthält (Vektor Tef-G418-Tefrib1, 2, 7, 4)

Expressionskonstrukte der rib-Gene: Der Vektor TefG418Tefrib3,4,5 ist in WO 99/61623 beschrieben. Dieser Vektor wurde mit KpnI geschnitten, gefällt und wieder gelöst und anschließend partiell mit NheI verdaut. Das größere, einmal mit NheI und KpnI geschnittene Fragment ist aus einem Agarosegel aufgereinigt worden. Das rib7 Gen wurde aus Vektor pJR765 (beschrieben in WO 95/26406) mit Hilfe der PCR amplifiziert (Primer: TCGAGGTACCGGGCCCCCCCTCGA; TCGAACTAGTAGACCAGTCAT). Das spezifische PCR Produkt wurde mit KpnI/SpeI geschnitten und mit dem oben beschriebenen KpnI/NheI geschnittenen Vektor ligiert. Es entstand Vektor TefG418Tefrib7,4.
Das rib2-Gen ist aus dem Vektor pJR758 (WO 95/26406) mit PCR amplifiziert worden und das resultierende Produkt mit SpeI und NheI geschnitten worden (Primer: CCCAACTAGTCTGCAGGACAATTTAAA; AGTGCTAGCCTACAATTCGCAGCAAAAT). Dieses DNA-Fragment ist mit dem NheI geschnittenen und mit Phosphatase behandelten Vektor TefG418Tefrib7,4 ligiert worden. Es entstand Vektor TefG418Tefrib7,4,2.
Das rib1-Gen ist aus Vektor pJR765 (WO95/26406) durch PCR amplifiziert worden (Primer: GTAGTCTAGAACTAGCTCGAAACGTG; GATTCTAGAACTAGAACTAGTGGATCCG) und wurde mit XbaI geschnitten. Dieses DNA-Fragment ist mit dem mit NheI geschnittenen und Phosphatase behandelten Vektor TefG418Tefrib7,4,2 ligiert worden. Das resultierende DNA-Konstrukt stellt den Vektor Tef-G418- rib1,2,7,4 dar.

Beispiel 2

Transformation des DNA-Konstruktes in den Pilz Ashbya gossypii

Das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Konstrukt (Vektor Tef-G418- rib1,2,4,7) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI vollständig geschnitten und das Insert, das die rib-Gen Sequenzen trägt durch Agarosegelauftrennung aufgereinigt.
MA2-Medium (10 g/l Bacto-Peptone, 1 g/l Hefeextrakt, 0,3 g/l myo- Inositol und 10 g/l D-Glucose) wurde mit Ashbya gossypii Sporen angeimpft. Die Kultur wurde 12 h bei 4°C und anschließend unter Schütteln für 13 h bei 28°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde abzentrifugiert und das Zellpellet in 5 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 25 mM DTT aufgenommen. Nach einer 30minütigen Wärmebehandlung bei 28°C wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert und in 25 ml STM-Puffer (270 mM Saccharose, 10 mM TRIS- HCl pH 7,5, 1 mM MgCl₂) aufgenommen. 0,5 ml dieser Suspension wurden dann mit ca. 3αg des oben aufgereinigten Inserts und 40 U SpeI Enzym versetzt und in einem Biorad Gene Pulser (100 Ω, 20 αF, 1,5 kv) elektroporiert. Nach der Elektroporation sind die Zellen mit 1 ml MA2-Medium versetzt und auf MA2-Agarkulturplatten ausgestrichen worden. Zur Antibiotikaselektion überschichtet man die Platten nach 5 h Inkubation bei 28°C mit 5 ml "Low-Melting"- Agarose, die das Antibiotikum G418 (200αg/ml) enthält. Die Transformanten wurden durch Mikromanipulation klonal aufgereinigt (Steiner und Philipsen (1995) Genetics, 140; 973-987). Die erfolgreiche Integration des Konstrukts wurde durch PCR-Analyse der genomischen DNA der Transformanten verifiziert. Die Isolation der genomischen DNA wurde wie von Carle und Olson (Proc. Natl. Acad. Sci, 1985, 82, 3756-3760) und Wright und Philipsen (Gene, 1991, 109, 99-105) beschrieben durchgeführt. Die PCR mit für das Konstrukt spezifischen Primern ist nach R. Saiki (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20) durchgeführt worden. Die Analyse der PCR-Fragmente geschieht durch Auftrennung über ein Agarosegel.
Bei allen Transformanten konnte eine erfolgreiche Integration ins Genom durch PCR nachgewiesen werden.

Beispiel 3

Riboflavinbestimmung im rekombinanten Ashbya gossypii Klon Ashbya gossypii LU21 (Wildtypstamm, ATCC 10895) und die daraus durch Transformation mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukt hervorgegangenen Stämme LU21#1 und #2 wurden auf Agarmedium bei 28°C 4 Tage lang angezogen. Von dieser Platte wurden drei 100 ml Erlenmeyerkolben mit 10 ml Medium (27,5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l MgSO₄, 50 ml/l Sojaöl, pH 7,0) beimpft. Nach 40 h Stunden Inkubation bei 28°C, 180 rpm auf dem Schüttler wurde je 1 ml der Kulturbrühe in 250 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml YPD- Medium überführt (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Bactopepton, 20 g/l Glucose). Inkubation 28°C, 300 rpm. Nach 190 h wurde aus jedem Kolben eine 1 ml Probe entnommen und mit 1 ml 1 M Perchlorsäure versetzt. Die Probe wurde filtriert und der Riboflavingehalt mit HPLC-Analytik bestimmt. Dabei wurde eine Eichung mit Riboflavinstandards (10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l, 50 mg/l) vorgenommen.
Parameter der HPLC-Methode zur Riboflavinbestimmung:
Säule: ODS Hypersil 5 mm 200 × 2,1 mm (HP)
Eluent A: Wasser mit 340 ml H₃PO₄ (89%) auf pH 2, 3
Eluent B: 100% Acetonitril
Gradient:
Stopzeit: 0 bis 6 min: 2% B auf 50% B
6 bis 6,5 min: 50% B auf 2% B
Fluss; 0,5 ml/min
Detektion: 280 nm
Temperatur; 40°C
Injektion: 2 bis 10 αl.
Die Ansätze mit Klon#1 und #2, die eine zusätzliche Genkopie der rib-Gene 1, 2, 4 und 7 enthalten, zeigen im Vergleich zum Ausgangsstamm eine deutlich erhöhte Riboflavinproduktivität (Fig. 1).
Fig. 1 zeigt die Riboflavinausbeuten der verschiedenen Klone. Durch Einbringen der rib1, 2, 4 und 7 Gene konnten Steigerungen der Riboflavinausbeuten von bis zu 135% im Vergleich zum unniodifizierten Stamm erreicht werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin indem man einen zur Riboflavinproduktion fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya, züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe rib1, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschließend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß drei Genprodukte aus der Gruppe rib1, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vier Genprodukte aus der Gruppe rib1, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweisen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die höhere Genaktivität der rib Genprodukte durch eine erhöhte Genexpression bewirkt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erhöhte Genexpression durch eine erhöhte Genkopienzahl bewirkt wird.

6. Verfahren nach einem der o. g. Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das rib-Genprodukt eine Polypeptidseguenz wie in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 dargestellt, oder eine von diesen Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von bis zu 5% der Aminosäurecodons erhältliche Polypeptidsequenz besitzt.