DE10134660A1

DE10134660A1 - Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren

Info

Publication number: DE10134660A1
Application number: DE10134660A
Authority: DE
Inventors: Ivo Feusner; Ellen Hornung; Christian Pernstich
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2003-02-06
Also published as: WO2003012091A2; US20050166271A1; AR036178A1; EP1412489A2; WO2003012091A3; CA2454372A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen; Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Organismen, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Außerdem betrifft die Erfindung Fettsäuregemische sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen; Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Organismen enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Außerdem betrifft die Erfindung Fettsäuregemische sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie werden aber auch vorteilhaft aus Tieren wie Fischen gewonnen. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt.
Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, so sind z. B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit einer Herzerkrankung haben. Sie finden in verschiedenen diätetischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.
Besonderes wertvolle und gesuchte ungesättigte Fettsäuren sind die sogenannten konjugierten ungesättigten Fettsäuren wie die konjugierte Linolsäure. Für konjugierte Fettsäuren sind eine Reihe positiver Effekte nachgewiesen worden, so reduziert die Verabreichung von konjugierter Linolsäure das Körperfett in Mensch und Tier bzw. erhöht den Futterumsatz in Körpergewicht bei Tieren (WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118). Durch Gabe von konjugierter Linolsäure lassen sich auch beispielsweise Allergien (WO 97/32008) oder Krebs (Banni et al., Carcinogenesis, Vol. 20, 1999: 1019-1024, Thompson et al., Cancer, Res., Vol. 57, 1997: 5067-5072) positiv beeinflussen.
Die chemische Herstellung konjugierter Fettsäuren beispielsweise Punicinsäure oder konjugierter Linolsäure wird in US 3,356,699 und US 4,164,505 beschrieben. Punicinsäure kommt natürlich in Punica granatum vor (El-Shaarawy und Nahapetian, Fette Seifen Anstrichmittel, 85, 1983: 123-126; Melgarejo et al., Sci. Food Agric., 69, 1995, 253-256; Melgarejo und Artes, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80, 1452-1454). Konjugierte Linolsäure findet sich beispielsweise in Rindfleisch (Chin et al., Journal of Food Composition and Analysis, 5, 1992: 185-197), in Milch (Dhiman et al., Journal of Dairy Science, 1999, 82, 2146-56) und Milchprodukten.
Biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Punicinsäure liegen nicht vor, wohl aber zur Biosynthese von Calendulasäure (Crombie et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 1984: 953-955 und J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1985: 2425-2434; Fritsche et al., FEBS Letters, 462, 1999, 249-253; Cahoon et al., J. Biol. Chem., 276, 2001, 2637-2643; Qiu et al., Plant Physiology, 125, 2001, 847-855). Demnach erfolgt die Biosynthese von konjugierten Fettsäuren wie Calendulasäure, Eleostearinsäure oder Punicinsäure über die Desaturierung von Ölsäure zu Linolsäure durch eine Δ-12-Desaturase und einer weiteren Desaturierung, verbunden mit einer Umlagerung der Doppelbindung zur Konjutrien Fettsäure durch eine spezifische Konjutrien-bildende Desaturase. Neben der Herstellung konjugierter Calendulasäure wird von Qiu et al., (Plant Physiology, 125, 2001, 847-855) auch die Herstellung von konjugierte Linolsäure durch die enzymatische Aktivität der Desaturase beschrieben. Von Nachteil ist bei dieser Nebenaktivität jedoch, dass durch die enzymatische Wirkung das unerwünschte 8,10-Isomer der konjugierten Linolsäure entsteht.
Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712 und WO 96/21022 beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).
In Hefen konnte sowohl eine Verschiebung des Fettsäurespektrums zu ungesättigten Fettsäuren hin als auch eine Steigerung der 1 Produktivität nachgewiesen werden (siehe Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al., Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Die Expression der verschiedenen Desaturasen in transgenen Pflanzen zeigte allerdings nicht den gewünschten Erfolg. Eine Verschiebung des Fettsäurespektrum zu ungesättigten Fettsäuren hin konnte gezeigt werden, gleichzeitig zeigte sich aber, dass die Syntheseleistung der transgenen Pflanzen stark nachließ, das heißt gegenüber den Ausgangspflanzen konnten nur geringere Mengen an Ölen isoliert werden.
Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese und speziell konjugierte ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren und in einem technischen Maßstab herzustellen.
Es bestand daher die Aufgabe weitere Desaturasen für die Synthese ungesättigter konjugierter Fettsäuren zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit einer Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, oder
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 75% Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors (beides wird weiter unten beschriebenen) in einen Öl produzierenden Organismus;
b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride.

Die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren können nach dem Isolieren anschließend nach dem Fachmann bekannten Methoden saure oder alkalische Hydrolyse freigesetzt werden.
Für das erfindungsgemäße beschriebene Verfahren ist es vorteilhaft in den Organismus in Verfahrensschritt (a) zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure einzubringen, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Δ-5-Desaturase, einer Δ-6-Desaturase, einer Δ-8-Desaturase oder Δ-12-Desaturase, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder
c) Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder
d) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90% Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.

Für das beschriebene Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren beispielsweise ungesättigten konjugierten Fettsäuren wie Punicinsäure beispielsweise aus Ölsäure ist neben der erwähnten Punicinsäure-Desaturase (= SEQ ID NO: 2) eine weitere Δ-12-Desaturase wie die Δ-12-Desaturase mit SEQ ID NO: 5 vorteilhaft.
Die Bildung von Konjutrien Fettsäuren beispielsweise aus Ölsäure ist besonders vorteilhaft, da Ölsaaten wie Raps einen kostengünstigen und einfachen Zugang zu Konjutrien durch ihren hohen Gehalt an Ölsäure ermöglichen würden. Da sie aber nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678-81) ist die Verwendung der genannten Δ-12-Desaturasen zur Herstellung der Linolsäure vorteilhaft.
Unter Derivate(n) sind beispielsweise funktionelle Homologe des von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 kodierten Enzyms oder dessen enzymatischer Aktivität, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie das von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 kodierte Enzym katalysieren, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung ungesättigter konjugierter Fettsäuren. Unter ungesättigten Fettsäuren sind im folgenden einfach und mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu verstehen, deren Doppelbindungen konjugiert oder nicht konjugiert sein können. Die in SEQ ID NO: 2 genannte Sequenz kodiert für eine neue unbekannte Desaturase, die an der Synthese von Punicinsäure in Punica granatum beteiligt ist. Das Enzym setzt bevorzugt (9Z,12Z) Octadecadien/Linolsäure um zu (9Z, 11E, 13Z) Octadecakonjutrien/Punicinsäure um. Im folgenden wird sie als Punicinsäure-Desaturase bezeichnet. Weitere Substrate dieses Enzyms sind beispielsweise γ-Linolensäure, die zu verschiedenen 18 : 4 Konjutetrensäure-Isomeren umgesetzt wird (Fig. 3B). Auch Ölsäure wird von dem Enzym umgesetzt. Es entsteht vorteilhaft 9_cis11_trans konjugierte Linolsäure.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologiescreening verwendet werden.
Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontischen Organismen wie Pflanzen wie Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Algen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die im Falle von SEQ ID NO: 2 mindestens 75% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85% Homologie, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie aufweisen. Im Falle von SEQ ID NO: 5 weisen die Derivate eine Homologie von 90%, bevorzugt 95% besonders von 98% auf. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Unter Homologie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym. Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 6 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID No. 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.
Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Desaturasegenen in dem Fachmann bekannterweise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenzen SEQ ID No: 2 oder SEQ ID NO: 5 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Vorteilhaft kann das Punicinsäure-Desaturase-Gen im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Insbesondere die Kombination mit der unter SEQ ID NO: 5 und 6 aufgeführten Δ-12-Desaturase ist vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Sequenzen sind Desaturasesequenzen wie Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase- oder Δ-8-Desaturasesequenzen, Acetyltransferasesequenzen oder Elongasesequenzen.
Unter den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die enzymatische Aktivität des in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich verändert wird. Diese nicht wesentlich veränderten Proteine sind daher noch enzymatisch aktiv, das heißt funktionell. Unter nicht wesentlich verändert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10%, bevorzugt 20%, besonders bevorzugt 30% der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Oder deren enzymatische Aktivität im Vergleich zum Ausgangsenzym bzw. der Ausgangsaminosäuresequenz um mindestens 10%, bevorzugt um 50%, besonders bevorzugt um mindestens 100% gesteigert ist. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.
Unter den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten oder -fragmenten sind die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 genannten Sequenzen, Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt) kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Das Calendulasäure- Desaturase-Gen kann in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 9321334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Fettbiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der usp-Promotor, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin-Promotor.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Im Nukleinsäurefragment(en) [= Genkonstrukt(en), Nukleinsäurekonstrukt(en)] können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die erfindungsgemäßen Desaturase- Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ-15-, Δ-12-, Δ-9-, Δ-6-, Δ-5-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die Acetylenase, die Acyl-ACP-Thioesterasen, β-Ketoacyl-ACP-Synthasen oder β-Ketoacyl-ACP-Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im gleichen Nukleinsäurekonstrukt verwendet bevorzugt das Δ-12-Desaturasegen, wie in Seq ID NO: 5 und 6 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden zur Expression in einem Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2αM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente.
Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.
Vorteilhafterweise enthalten die Nukleinsäurefragmente zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt (der Singulat soll im folgenden auch den Plural umfassen) auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz bestehen.
Vorteilhafterweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure- sequenz (der Singulat soll im folgenden auch den Plural umfassen) zusammen mit mindestens einem Reportergen in ein Nukleinsäurekonstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6- phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Wirtsorganismus enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des Nukleinsäurekonstrukts oder des Vektors in Organismen beispielsweise Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.
Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen, insbesondere von Ölhaltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter, Blattstücke, Hypocotylstücke oder Wurzeln in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die Nukleinsäurekonstrukte oder die Vektoren eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula, Punicaceae wie Punica granatum oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Färbersaflor, Flachs, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere beispielsweise C. elegans verwendbar.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung sind wie oben beschriebenen transgene Pflanzen, die eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäure oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt enthalten. Diese transgenen Pflanzen können auch einen Vektor, der eine erfindungsgemäße funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäure oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukte enthält. Unter nicht funktionell ist im Gegensatz zu funktionell zu verstehen, dass kein enzymatisch aktives Protein mehr synthetisiert wird. Außerdem ist unter nicht funktionellen Nukleinsäuren oder Nukleinsäurekonstrukten auch eine sogenannte Antisense-DNA zu verstehen, die zu transgenen Pflanzen führt, die eine Reduktion der enzymatischen Aktivität oder keine enzymatischen Aktivität aufweisen. Dabei wird in der Regel eine Reduktion der enzymatischen Aktivität von 5 bis 100%, bevorzugt von 10 bis 90%, besonders bevorzugt von 20 bis 80%, ganz besonders bevorzugt von 30 bis 70% erreicht. Mit Hilfe der Antisense-Technik, speziell wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz mit anderen Fettsäuresynthesegene in der Antisense- DNA kombiniert wird, ist es möglich Öle und/oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren bzw. gesättigte Fettsäuren zu synthetisieren. Unter transgenen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen auf Festmedien oder in Flüssigkultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die Nukleinsäuren oder Expressionskassetten an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind die oben genannten transgenen Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in ihren funktionellen oder nicht funktionellen Formen zur Herstellung von transgenen Pflanzen gehört deshalb auch zu den Erfindungsgegenständen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer nicht funktionellen Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens eines nicht funktionellen Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4 oder eines Vektors, der derartige nicht funktionelle Nukleinsäuren oder Nukleinsäurekonstrukte enthält, in einen Öl produzierenden Organismus;
b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride.

Aus den so erhaltenen Ölen und/oder Triglyceriden können die gesättigten Fettsäuren über dem Fachmann bekannte Verfahren freigesetzt werden. Die Freisetzung erfolgt dabei über eine sogenannte saure oder alkalische Hydrolyse der Esterbindungen. Die alkalische Hydrolyse beispielsweise mit NaOH oder KOH ist bevorzugt. Sollen die Alkylester wie die Methyl- oder Ethylester der gesättigten oder wie weiter oben geschrieben der ungesättigten Fettsäuren hergestellt werden, so kann die Hydrolyse vorteilhaft mit den entsprechenden Alkoholaten durchgeführt werden.
Für die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren und ggf. deren anschließender Freisetzung über Hydrolyse werden als Organismen bevorzugt Pflanzen besonders bevorzugt Ölfruchtpflanzen oder Mikroorganismen verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren, die für ein Protein codieren, das eine Fettsäure der allgemeinen Struktur I,

die zwei durch eine Methylengruppe voneinander getrennte Doppelbindungen aufweist, zu einer dreifach ungesättigten Fettsäure der allgemeinen Struktur II

umsetzt, wobei die drei Doppelbindungen der Fettsäure in Konjugation sind und wobei die Substituenten und Variablen in den Verbindungen der allgemeinen Struktur I und II folgende Bedeutung haben:
R¹ = Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-,

R² = substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder gesättigtes C₁-C₉-Alkyl-
R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₂₂-Alkylcarbonyl- oder Phospho-,
n = 1 bis 14, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 4 bis 7, ganz besonders bevorzugt 7.
R¹ bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, oder
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt.
Bevorzugte Reste für R¹ sind Wasserstoff und

R² bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder gesättigtes C₁-C₉-Alkyl-.
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte C₁-C₉-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl- propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl oder n-Nonyl genannt. Bevorzugt ist C₁-C₅-Alkyl, besonders bevorzugt ist C₄- und C₅-Alkyl, ganz besonders bevorzugt ist der Butyl-Rest.
R³ und R⁴ bezeichnen unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₂₂-Alkylcarbonyl- oder Phospho-.
Wobei unter C₁-C₂₂-Alkylcarbonyl Reste wie Methylcarbonyl, Ethylcarbonyl, n Propylcarbonyl, 1 Methylethyl carbonyl, n Butylcarbonyl, 1 Methylpropylcarbonyl, 2 Methylpropylcarbonyl, 1,1 Dimethylethylcarbonyl, n Pentylcarbonyl, 1 Methylbutylcarbonyl, 2-Methylbutylcarbonyl, 3 Methylbutylcarbonyl, 1,1 Dimethylpropylcarbonyl, 1,2 Dimethylpropylcarbonyl, 2,2 Dimethylpropylcarbonyl, 1 Ethylpropylcarbonyl, n Hexylcarbonyl, 1 Methylpentylcarbonyl, 2 Methylpentylcarbonyl, 3 Methylpentylcarbonyl, 4 Methylpentylcarbonyl, 1,1 Dimethylbutylcarbonyl, 1,2 Dimethylbutylcarbonyl, 1,3 Dimethylbutylcarbonyl, 2,2 Dimethylbutylcarbonyl, 2,3 Di- methylbutylcarbonyl, 3,3 Dimethylbutylcarbonyl, 1 Ethylbutylcarbonyl, 2 Ethylbutylcarbonyl, 1,1,2 Trimethylpropylcarbonyl, 1,2,2 Trimethylpropylcarbonyl, 1 Ethyl 1 methylpropylcarbonyl und 1 Ethyl 2 methylpropylcarbonyl, Heptylcarbonyl, Nonylcarbonyl, Decylcarbonyl, Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecyl- carbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl oder n-Eicosylcarbonyl zu verstehen sind.
Bevorzugte Substituenten für R³ und R⁴ sind gesättigtes oder ungesättigtes C₁₆-C₂₂-Alkylcarbonyl.
Als Substituenten der genannten Reste seien beispielsweise Halogen wie Fluor oder Chlor, Alkyl oder Hydroxyl genannt.
Bei der Umsetzung mit dem erfindungsgemäßen Protein bzw. Enzym wird eine Doppelbindung in die Fettsäure eingeführt und eine Doppelbindung verschoben, so dass die an der Reaktion beteiligten drei Doppelbindungen in Konjugation liegen. Weiterhin wird ein Doppelbindung isomerisiert (von cis zu trans).
Das Enzym (= Punicinsäure-Desaturase) katalysiert vorteilhaft die Umsetzung von Linolsäure (18: 2, 9Z, 12Z) zu Punicinsäure (18 : 3, 9Z, 11E, 13Z). Das Enzym führt eine cis-Doppelbindung an Position C₁₃ ein und bewirkt die spezifische Verschiebung einer cis-Doppelbindung in Position C₁₂ zu einer trans-Doppelbindung in Position C₁₁, wobei die Isomerisierung regiospezifisch erfolgt.
Die Reaktion erfolgt wahrscheinlich zunächst über eine 1,4 Eliminierung und eine nachfolgende 11, 14 Desaturierung. Als Substrat kommt auch γ-Linolensäure (18: 3, 6Z, 9Z, 12Z) in Frage, diese wird dann zum entsprechenden Konjutetraen (18: 4, 6Z, 9Z, 11E, 13Z) umgesetzt.
Weiterhin kommen auch Ölsäure (18: 1, 9Z) und Vaccensäure (18: 1, 11Z) als Substrat in Frage, die dann zu konjugierter Linolsäure umgesetzt wird. Es entsteht bei der Umsetzung vorteilhaft bevorzugt das 9_cis,11_trans-Isomer.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuregemischen mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass man min- destens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen bevorzugt Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und das in dem Organismus enthaltene Öl und/oder Triglycerid isoliert und die im Öl und/oder Triglycerid enthaltenden Fettsäuren freisetzt.
Auch ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert, gehört zu den Erfindungsgegenständen.
Beide Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese von Fettsäuregemischen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an Punicinsäure.
Weitere erfindungsgemäße Gegenstände sind ein Verfahren zur Herstellung von gesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine nicht funktionelle oben genannte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein nicht funktionelles erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht, dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die im Öl enthaltenden Fettsäuren freisetzt und ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine nicht funktionelle oben genannte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein nicht funktionelles erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert. Für diese beiden Verfahren wird die sogenannte Antisense-Technologie verwendet (siehe oben).
Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Punica, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Calendula, Punica oder Saccharomyces cerevisiae.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch Weise, semi batch Weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.
Pflanzen werden nach Transformation zunächst wie oben beschrieben regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Überschuss an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuss von Lösungsmittel zu Biomasse von 1 : 4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise verseift.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Fettsäuregemische mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren sowie Öle und/oder Trigylceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, die nach den oben genannten Verfahren hergestellt wurden sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.
Die Erfindung wird im Folgenden an Beispielen erläutert:

Beispiele

Über RT-PCR und RACE-Techniken wurde aus mRNA von Punica granatum eine cDNA kloniert. Bei Expression dieser cDNA in Hefe wird Linolsäure in das Octadecakonjutrien Punicinsäure (9Z, 11E, 13Z) umgesetzt. Es handelt sich hierbei unseres Wissens nach um die erstmalige Beschreibung einer Punicinsäure-Desaturase. Das Enzym bewirkt eine regiospezifische Verschiebung einer cis-Doppelbindung in Position C₁₂ zu einer trans-Doppelbindung in Position C₁₁ und führt eine neue cis-Doppelbindung an Position C₁₃ ein. Weiterhin wurde eine cDNA kloniert, die für eine funktionale Δ-12-Desaturase codiert.
Transgene Hefen und Pflanzen mit erhöhter Expression der Punicinsäure-Desaturase-cDNA weisen Punicinsäure in ihren Lipiden auf. Die Synthese von Punicinsäure kann erhöht werden durch zusätzliche Expression einer Δ-12-Desaturase, die zu einer Erhöhung des Gehaltes an Linolsäure führt, die wiederum das Substrat für Punicinsäure-Desaturase darstellt.

Beispiel 1

RNA-Isolierung aus Samen von Punica granatum

Aus Punica granatum-Samen wurde nach der in Fritsche et al. (FEBS Letters, 462, 1999, 249-253) beschriebenen Methode RNA isoliert. Folgende Schritte wurden dabei modifiziert: Nach der 18stündigen Zentrifugation und Waschen des Pellets mit 70%igen Ethanol, erfolgte die anschließende Extraktion anstelle von 15 min für 1 h bei 65°C im Wasserbad, mit Vortexen alle 10 min. Die mRNA wurde mit dem Poly-Attract-Kit von Promega nach Hersteller-Angaben aus 3 mg Gesamt-RNA isoliert. Die Herstellung von ss-cDNA erfolgte mit Oligo(dT)-Primer, Superscript II von Gibco-BRL nach Herstellerangaben aus 1 µg mRNA. Diese ss-cDNA wurde als Template in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt.

Beispiel 2

Isolierung und Klonierung der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase aus Punica granaturn

Um DNA-Sequenzen aus Punica granatum zu isolieren, die für eine Punicinsäure-Desaturase und für eine Δ-12-Desaturase kodieren, wurden verschiedene degenerierte Oligonukleotidprimer von Aminosäure-Sequenzen der konservierten Histidin-Boxen verschiedener Δ-12-Desaturasen abgeleitet.
Primer A: 5'-TGG GTI AWH GCH CAY GAR TGB GG-3' Forward primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz W V I A H E C
Primer B: 5'-GGC ATI GTI GAR AAS ARR TGR TGV AGY MAC-3' Reverse primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz V T/A H H L F S T I
Primer C: 5'-CCD TAY TTC TCI TGG AAR WWH AGY CAY CG-3' Forward primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz P Y F S W K Y/I S H R
Primer D: 5'-CCA RTY CCA YTC IGW BGA RTC RTA RTG-3' Reverse primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz H Y D S S/T E W D/N W
Die Buchstaben in Primer A, B, C und D haben folgende Bedeutung:
R = A/G
Y = C/T
W = A/T
H = A/C/T
B = C/G/T
D = A/G/T
I = Inositol
In einer PCR mit Punica-Einzelstrang-cDNA (hergestellt nach Beispiel 1) als Template wurden mit den Primerkombinationen A/B und A/D ein DNA-Fragmente amplifiziert. Für die Amplifikation wurde die Tfl-Polymerase von Biozym eingesetzt.

Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	0,50 µl
Forward Primer (10 µM)	2,50 µl
Reverse Primer (10 µM)	2,50 µl
Template (ss-DNA)	1,00 µl
20 × Tfl-Puffer	1,25 µl
MgCl2 (25 mM)	2,50 µl
Tfl-Polymerase (1 U/µl)	0,25 µl
Wasser	14,50 µl
Gesamtvolumen	25,00 µl

Es wurde folgendes PCR-Programm verwendet:

1.	2 min 94°C
2.	30 sec 94°C
3.	45 sec 50°C (Bindungstemperatur)
4.	1 min 72°C
5.	10 × 2. bis 4.
6.	0 sec 94°C
7.	45 sec 50°C
8.	1 min 72°C, Zeitincrement 5 sec pro Zyklus
9.	20 × 5. Bis 7.
10.	2 min 72°C

Bei den Primerkombinationen A/B und A/D wurden PCR-Fragmente erhalten. Diese wurden aus einem präparativem Agarosegel ausgeschnitten, mit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech eluiert und in pGEM-T-Vector- System (Promega) nach Herstellerangaben kloniert. Voneinander verschiedene Klone wurden mit M13-Primern seguenziert.
Die Sequenzen dieser ca. 570 bp langen PCR-Produkte sind SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4 zu entnehmen.

Beispiel 3

Gewinnung und Sequenzierung vollständiger cDNA-Klone

Um Vollängen-Klone zu erhalten, wurde die Fragmente SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4 mittels 5'- und 3'-RACE (rapid amplification of cDNA ends) verlängert. Ausgehend von 1 µg mRNA (isoliert nach Beispiel 1) wurde mit dem "Marathon cDNA Amplification Kit" von CLONTECH (Heidelberg) eine "Marathon cDNA-Bank" nach Herstellerangaben erstellt.
Die 5'- und 3'-RACE-PCR wurde mit dem Advantage cDNA PCR-Kit von Clontech nach Herstellerangaben mit folgenden genspezifischen RACE-Primern durchgeführt:
Primer E: 5'-ACG GAA CGA GGA GCG CTG AGT G-3' Spezifische Primer für 5'-RACE von Punicinsäure-Desaturase
Primer F: 5'-CTG ATC GTG AAC GCA TTC CTG G-3' Spezifischer Primer für 3'-RACE von Punicinsäure-Desaturase
Primer G: 5'-GGG ACG AGG AGC GAT GTG TGG AG-3' Spezifischer Primer für 5'-RACE von Δ-12-Desaturase
Primer H: 5'-AGT CCT CAT ATT AAA TGC ATT CGT GG-3' Spezifischer Primer für 3'-RACE von Δ-12-Desaturase

Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	1,0 µl
RACE-Primer (10 µM)	1,0 µl
Adaptor-Primer (10 µM)	1,0 µl
Template (1 : 50 verdünnte Marathon-cDNA-Bank)	1,0 µl
10 × Puffer	5,0 µl
Polymerase (1 U/µl)	1,0 µl
Wasser	38,5 µl
Gesamtvolumen	50,0 µl

Die RACE-PCR erfolgte nach folgendem Programm:

1. 1 min 94°C

2. 30 sec 94°C

3. 3 min 68°C

4. 10 × 2.-3.

5. 30 sec 94°C

6. 30 sec 65°C

7. 3 min 68°C

8. 25 × 4.-6.

9. 5 min 68°C
Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden wie in Beispiel 2 beschrieben aus einem präparativem Agarosegel ausgeschnitten, mit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech eluiert und in pGEM-T-Vector-System (Promega) nach Herstellerangaben kloniert und sequenziert. Die 5'-RACE-Produkte reichten über das Startkodon in den 5'-nicht-translatierten-Bereich (5'-UTR), die 3'-RACE-Produkte über das Stopkodon in den 3'-UTR hinein. In SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 sind die zusammengesetzten DNA-Sequenzen der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase dargestellt. Die Sequenzen umfassen den kodierenden Bereich sowie einen Abschnitt des 5'-UTR und 3'-UTR.
Der kodierende Bereich von SEQ ID NO: 2 (Punicinsäure- Desaturase) reicht von Nukleotid 131 bis 1252, der von SEQ ID NO: 5 (Δ-12-Desaturase) von Nukleotid 94 bis 1254.
Um durchgängige Volllängen-Klone zu erhalten, wurden die kodierenden Bereiche der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase amplifiziert und kloniert. Dies erfolgte mit dem Expand High Fidelity-PCR-System (Roche Diagnostics) und den Primern I und J für Punicinsäure-Desaturase bzw. den Primern K und L für delta-12-Desaturase sowie mit Punica-cDNA als Template.
Primer I: 5'-AAG CTT ATG GGA GCT GAT GGA ACA ATG TCT C-3' Forward Primer (mit HindIII-Schnittstelle)
Primer J: 5'-GGA TCC ATT CAG AAC TTG CTC TTG AAC CAT AG-3' Reverse Primer (mit BamHI-Schnittstelle)
Primer K: 5'-GTC GAC ATG GGA GCC GGT GGA AGA ATG AC-3' Forward Primer (mit SalI-Schnittstelle)
Primer L: 5'-AAG CTT TGA TCA GAG GTT CTT CTT GTA CCA G-3' Reverse Primer (mit HindIII-Schnittstelle)

Die PCR-Ansätze setzten sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	1,0 µl
Forward-Primer (10 µM)	4,0 µl
Reverse-Primer (10 µM)	4,0 µl
Template 3,0 µl (1 : 50 verdünnte Marathon-cDNA-Bank)	3,0 µl
10 × Puffer 2	5,0 µl
Polymerase (3,5 U/µl)	0,5 µl
Wasser	32,5 µl
Gesamtvolumen	50,0 µl

Die PCR erfolgte nach folgendem Programm:

1.	2 min 94°C
2.	30 sec 94°C
3.	30 sec 58°C
4.	1 min 72°C
5.	10 × 2.-4.
6.	30 sec 94°C
7.	30 sec 58°C
8.	1 min 72°C, Zeitinkrement 5 sec pro Zyklus
9.	15 × 5.-7.
10.	5 min 72°C

Die PCR-Produkte mit einer Länge von 1,2 kb wurden in den Vektor pGEM-T (Promega, Mannheim) kloniert und in E. coli XL1 blue Zellen transformiert. Die Insert-DNA wurde mit einem 373 DNA- Sequencer (Applied Biosystems) doppelsträngig sequenziert und war identisch mit den kodierenden Bereichen von Punicinsäure- Desaturase und Δ-12-Desaturase.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PuFADX (SEQ ID NO: 2) mit annotierten Proteinsequenzen der SWISS-PROT und SP-TREMBL-Datenbanken ergab die höchste Homologie zu einer Δ-12-Desaturase aus Solanum commersonii (60% identische Aminosäuren), einer Δ-12-Desaturase aus Corylus avellana (60% identische Aminosäuren) und einer Ω - 6 Fettsäure Desaturase aus Baumwolle (58% identische Aminosäuren) über den gesamten kodierenden Bereich. Fig. 1A zeigt einen Vergleich der Aminosäure-Sequenzen von PuFADX mit Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annuus, Arabidopsis thaliana, Glycine max und Corylus avellana.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PuFADI2 (SEQ ID NO: 5) mit annotierten Proteinsequenzen aus SWISS-PROT und SP-TREMBL-Datenbanken ergab die höchsten Homologien zu Δ-12-Desaturasen aus Sesamum indicum (78% identische Aminosäuren), aus Corylus avellana (78% identische Aminosäuren) und aus Solanum commersonii (77% identische Aminosäuren). Fig. 1B zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von PuFAD12 mit Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annus, Arabidopsis thaliana, Glycine max und Corylus avellana.

Beispiel 4

Expression der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase in Hefe

Um die Funktionalität von PuFADX nachzuweisen, wurde in einem ersten Ansatz der kodierende Bereich der cDNA in einem Hefe- Expressionsvektor kloniert und in S. cerevisiae exprimiert. Die in der Hefe produzierte Punicinsäure-Desaturase sollte zugesetzte Linolsäure in Punicinsäure umsetzen. Diese wiederum sollte in hydrolisierten und transmethylierten Lipidextrakten über GC und GC/MS als Methylester nachgewiesen werden.
In einem zweiten Ansatz wurde zusätzlich zu PuFADX die Δ-12-Desaturase PuFAD12 in Hefe exprimiert, so dass die Hefezellen endogen Linolsäure produzieren, die dann wiederum durch die Aktivitität von PuFADX in Punicinsäure umgesetzt werden kann. Letztere sollte wiederum über GC und GC/MS nachgewiesen werden.
Sämtliche Fest- und Flüssigmedien für Hefe wurden nach Protokollen von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) hergestellt.
Die PuFADX cDNA wurde über Restriktionsverdau mit HindIII/BamHI aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten, in den HindIII/BamHI geschnittenen shuttle-Vektor pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, USA) kloniert und der so entstandene Vektor pYES2-PuFADX in E, coli XL1 blue transformiert. pYES2-PuFADX wurde mit Hilfe der LiAc- Methode in S. cerevisiae INCSc1 (Invitrogen, Carlsbad, USA) transformiert, wo die Expression der PuFADX-cDNA unter der Kontrolle des GAL1-Promotors stand.
Um im zweiten Ansatz zusätzlich zu PuFADX auch PuFAD12 in Hefe exprimieren zu können, wurde zunächst die PuFAD12-cDNA über Restriktionsverdau mit SalI/HindIII aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten, in den SalI/HindIII geschnittenen shuttle-Vektor pESC-Leu (Stratagene) kloniert und der so entstandene Vektor pEST-Leu-PuFADX in E. coli XL1 blue transformiert. pYES2-PuFAD12 wurde mit Hilfe der LiAc-Methode in S. cerevisiae INCSc1 (Invitrogen, Carlsbad, USA) transformiert, wo die Expression der PuFAD12-cDNA unter der Kontrolle des GAL1-Promotors stand.
Die Expression von PuFADX in S. cerevisiae INVSc1 erfolgte modifiziert nach Avery et al. (Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: 3960-3966) und Girke et al. (The Plant Journal, 5, 1998: 39-48). Um eine Starterkultur herzustellen, wurden 20 ml SD-Medium mit Glucose und Aminosäurelösung ohne Histidin mit einer Hefe-Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C bei 140 rpm inkubiert. Die Zellkultur wurde zwei mal gewaschen durch Abzentrifugieren und Resuspendieren in SD-Medium ohne Supplemente und ohne Zucker. Mit den gewaschenen Zellen wurde eine Hauptkultur auf eine OD₆₀₀ von 0,1 bis 0,3 angeimpft. Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in 25 ml SD-Medium mit 2% (w/v) Galaktose, Aminosäurelösung ohne Histidin, 0,02% Linolsäure (2%ige Stammlösung in 5% Tergitol NP40), 10% Tergitol NP40 72 h lang bei 30°C. Die Ernte der Hauptkultur erfolgte über Zentrifugation. Das Zellpellet wurde bei -20°C eingefroren und anschließend für ca. 18 h lyophilisiert.
Die Expression von PuFAD12 erfolgte analog, mit folgenden Unterschieden: es wurde nicht auf Histidin- sondern auf Leucinprototrophie selektioniert, das Volumen der Hauptkultur betrug 50 ml, die Anzuchtbedingungen der Hauptkultur waren 240 h bei 16°C.
Für Untersuchungen zur Substratspezifität der Punicinsäure- Desaturase wurden der Hefekultur anstelle von Linolsäure andere Fettsäuren zugesetzt, wie z. B. Ölsäure, cis-Vaccensäure, trans- Vaccensäure, gamma-Linolensäure, alpha-Linolensäure.

Beispiel 5

Lipidextraktion der Fettsäuren aus transgener Hefe und GC bzw. GC/MS Analyse

Die lyophilisierten Hefezellen wurden in 1,35 ml Methanol/Toluol (2 : 1) und 0,5 ml Natrium-Methoxid-Lösung extrahiert. Das Zellmaterial wurde mit einem Glasstab möglichst fein zermörsert und dann 1 h lang bei Raumtemperatur (Raumtemperatur = RT bedeutet in dieser Anmeldung ca. 23°C) unter Schütteln inkubiert.
Anschließend wurden 1,8 ml 1 M NaCl-Lösung und 3 ml n-Heptan zugegeben und 10 min lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach Phasentrennung durch Zentrifugation (10 min. 400 rpm, 4°C) wurde der Heptan-Überstand in ein Reagenzglas überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 3 mal 0,3 ml Hexan aufgenommen, in ein Eppendorf-Gefäß überführt und wiederum unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 µl MeCN aufgenommen und die Probe per GC bzw. GC/MS analysiert.
Zur GC-Analyse der Fettsäure-Methylester (FAME) wurden 7 µl der Probe (in MeCN) in ein Probenröhrchen überführt und 1 µl injiziert. Die GC-Analyse erfolgte über eine HP-INNOWax-Säule (Cross-linked PEG; 30 m × 0,32 mm × 0,5 µm Beschichtungsdicke) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min. Als Trägergas diente Helium. Die Injektionstemperatur betrug 220°C. Folgender Temperaturgradient wurde angelegt: 1 min 150°C, 150°C bis 200°C (15°C/min), 200°C bis 250°C (2°C/min), 5 min 250°C. Die Detektion der FAME erfolgte über einen Flammen-Ionisations-Detektor (FID) bei 275°C. Die Retensionszeiten von Octadecakonjutrien FAME betragen 16,6 min für Punicinsäure, 17,0 min für Eleosterarinsäure und 17,4 min für Calendulasäure (Fig. 2C). Die Retensionszeiten von Octadecakonjutetraen FAME betragen 17,0 min für 18 : 4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) und 17,4 min für 18: 4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) (nicht gezeigt).
In Fig. 2 ist die Produktion von Punicinsäure in Hefezellen dargestellt, die mit der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum transformiert wurden. Fig. 2A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben 72 h lang bei 30°C mit 0,02% Linolsäure angezogen. Das Gas- Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionszeit von Punicinsäure auf. In Fig. 2B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pYES2-PuFADX dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4 beschrieben 72 h lang bei 30°C mit 0,02% Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogram weist einen deutlichen Peak mit einer Retensionszeit von 16,6 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. Fig. 2A) und die gleiche Retensionszeit wie Punicinsäure aufweist (vgl. Fig. 2C).
Zur GC/MS-Analyse der FAME wurden 20 µl der Probe (in MeCN) in ein Probenröhrchen überführt und 4 µl injiziert. Bei der GC-Analyse wurde eine HP-5 Säule (5% Diphenyl-95% Polydimethyl Siloxan, 30 m × 0,25 mm, 0,25 µm Beschichtungsdicke, Agilent, Waldbronn) benutzt. Als Trägergas diente Helium (40 cm/s). Die Proben wurden im EI-Modus gemessen, die Injektionstemperatur betrug 250°C. Das benutzte Temperaturprogramm lautete: 60°C bis 110°C (25°C/min), 1 min 110°C, 110°C bis 270°C (10°C/min), 10 min 270°C.
Verschiedene C₁₈-Fettsäuren haben bei Verwendung der HP-5 Säule unter den beschriebenen Bedingungen folgende Retensionszeiten:
18: 0 = 15,7 min
18: 1 9Z = 15,6 min
18: 2 9Z, 12Z = 15,2 min
18: 3 9Z, 11E, 13Z = 16,4 min
18: 4 6Z, 9Z, 11E, 13Z = 16,25 min
In Fig. 2D ist das Massenspektrum der Verbindung dargestellt, die nach GC mit einer HP-5 Säule eine Retensionszeit von 16,4 min aufweist. Analysiert wurde ein Lipidextrakt von Hefezellen, die mit pYES2-PuFADX transformiert wurden, also Punicinsäure- Desaturase exprimieren. Durch das Massenspektrum ließ sich die Verbindung eindeutig als Methylester eines Octadecakonjutriens identifizieren.
Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Punicinsäure- Desaturase in Hefe zur Bildung von Punicinsäure durch Umsetzung von Linolsäure führt. Der Nachweis von Punicinsäure aus transformierten Hefezellen gelang nur nach Hydrolyse der Lipide. In den freien Fettsäuren dieser Zellen konnte keine Punicinsäure nachgewiesen werden, das heißt Punicinsäure wird in Hefe in Lipide eingebaut. Da Hefe kaum Triacylglyceride enthält, muss man davon ausgehen, dass der Großteil der nachgewiesenen Punicinäure in den Phospholipiden der Hefe gebunden war.
In Fig. 3 ist die Bildung von Octadecakonjutetraen Fettsäuren in Hefezellen dargestellt, die mit der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum transformiert und mit γ-Linolensäure wie in Beispiel 4 beschrieben angezogen wurden. Fig. 3A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Kontrollzellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden 72 h lang bei 30°C mit 0,02% γ-Linolensäure angezogen. Das Gas- Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionzeit von Octodecakonjutetraen Fettsäuren auf (17,0-17,4 min).
In Fig. 3B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pYES2-PuFADX dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4 beschrieben 72 h lang bei 30°C mit 0,02% γ-Linolensäure angezogen. Das Gas-Chromatogram weist deutliche Peaks mit Retensionszeiten von 17,0 min und 17,4 min auf, die im Kontrollansatz nicht auftreten (vgl. Fig. 3A) und die gleiche Retensionszeit wie 18: 4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) aufweist.
Eine GC/MS-Analyse dieser Verbindung, extrahiert aus transgenen Hefezellen mit pYES2-PuFADX, die mit γ-Linolensäure angezogen wurden, ist in Fig. 3C dargestellt. Anhand des Massenspektrums lässt sich die Verbindung eindeutig als Methylester eines Octadecakonjutetraens identifizieren.
Die in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Punicinsäure- Desaturase in Hefe γ-Linolensäure zu Octadecakonjutetraen Fettsäuren umsetzt. α-Linolensäure hingegen führte nicht zur Bildung von Octadecakonjutetraenen (nicht gezeigt). Die genannten Octadecakonjutetraene werden bei Hefe in Lipide eingebaut, hauptsächlich in Phospholipide.
In Fig. 4 ist die Bildung von Linolsäure in Hefezellen dargestellt, die mit der Δ-12-Desaturase aus Punica granatum transformiert wurden. Fig. 4A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pESC-Leu transformiert wurden. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben 240 h lang bei 16°C angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionszeit von Linolsäure auf. Der Gehalt an Ölsäure (Retensionszeit = 10,0 min) beträgt xxx% der Gesamtfettsäuren. In Fig. 4B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pESC-PuFAD12 dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4 beschrieben 240 h lang bei 16°C angezogen. Das Gas-Chromatogram weist einen deutlichen Peak mit einer Retensionszeit von 10,75 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. Fig. 4A) und die gleiche Retensionszeit wie Linolsäure aufweist (vgl. Fig. 4C). Der Gehalt an Ölsäure beträgt xxx%, ist also um x% niedriger als in Kontroll- Hefezellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von PuFAD12 in Hefe zur Umsetzung von Ölsäure zu Linolsäure führt. Eine Coexpression von PuFAD12 und PuFADX in Hefe führt daher zur Bildung von Punicinsäure, auch ohne Zugabe von Linolsäure.

Beispiel 6

Expression der Punicinsäure-Desaturase in Pflanzen

Die Expression der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum in transgenen Pflanzen ist vorteilhaft, um den Punicasäure-Gehalt in diesen Pflanzen zu erhöhen. Dazu wurde die PuFADX cDNA in binäre Vektoren kloniert und über Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus und Linum usitatissimum übertragen. Die Expression der CalDes cDNA stand dabei unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35 S-Promotors bzw. des samenspezifischen USP-Promotors.
Arabidopsis ist als Modellpflanze besonders geeignet, da sie eine kurze Generationszeit und ausreichende Mengen an Linolsäure, dem Substrat von PuFADX zur Herstellung von Punicinsäure, als auch ausreichende Mengen an Ölsäure aufweist, dem Substrat von PuFADX zur Herstellung von Konjudien Fettsäuren wie CLA.
Tabak und Hoch-Linolsäure-Sorten von Lein, wie die Varietät Linola, sind als Ölsaaten mit einem hohen Gehalt an Linolsäure besonders geeignet zur heterologen Expression von PuFADX, da Linolsäure das Substrat von PuFADX zur Bildung von Punicinsäure darstellt.
Raps ist als Ölsaat mit einem hohen Gehalt an Ölsäure besonders geeignet, um durch Expression von PuFADX Ölsäure zu Konjudien Fettsäuren wie CLA umzusetzen und zu akkumulieren. Weiterhin kann durch Expression von PuFADl2 in Raps eine Erhöhung des Linolsäuregehalts erreicht werden und durch Coexpression von PuFAD12 und PuFADX die Akkumulation von Punicinsäure erreicht werden.
Als Expressionsvektoren wurden der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science, 66, 1990 221-230) bzw. das pBinAR Derivat pBinAR-USP, bei dem der CaMV 35 S-Promotor gegen den USP- Promotor aus V. faba ausgetauscht war, verwendet. Ebenfalls verwendet wurden die Vektoren pGPTV und pGPTV-USP. Zur Umklonierung musste die CalDes-cDNA aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten und in pBinAR bzw. pBinAR-USP kloniert werden.
Die entstandenen Plasmide pBinAR-PuFADX, pBinAR-USP-PuFADX, pGPTV-PuFADX, pGPTV-USP-PuFADX, pBinAR-PuFAD12, pBinAR-USP- PuFAD12, pGPTV-PuFAD12, pGPTV-USP-PuFAD12 wurden in Agrobacterium tumefaciens transformiert (Höfgen und Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 1988: 9877). Die Transformation von A. thaliana erfolgte mittels "floral dip" (Clough und Bent, Plant Journal, 16, 1998: 735-743), die von N. tabacum über Cokultivierung von Tabakblattstückchen mit transformierten A. tumefaciens Zellen, die von Lein und Raps durch Cokultivierung von Hypokotylstücken mit transformierten A. tumefaciens Zellen.
Die Expression der PuFADX und PuFAD12-Gene in transgenen Arabidopsis-, Tabak-, Raps- und Leinpflanzen wurde über Northern- Blot Analyse untersucht. Ausgewählte Pflanzen wurden auf ihren Gehalt an Punicinsäure bzw. anderen konjugierten Fettsäuren wie CLA im Samenöl untersucht.
Analog zum USP-Promotor kann auch der Napin-Promotor verwendet werden, um eine samenspezifische Expression von PuFADX und PuFAD12 zu erreichen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, oder

b) Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder

c) Derivate der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 75% Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz.

4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.

6. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Organismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

8. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.

9. Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 oder mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 5 in einen Öl produzierenden Organismus;

b) Anzucht dieses Organismus und

c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren freigesetzt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass in den Organismus in Verfahrensschritt (a) zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure eingebracht wird, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Δ-5-Desaturase, einer Δ-6-Desaturase, einer Δ-8-Desaturase oder Δ-12-Desaturase, oder

b) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder

c) Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder

d) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90% Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigten Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Punicinsäure aufweisen.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigte Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Octadecakonjutetraen Fettsäuren aufweisen.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigten Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Octadecakonjudien Fettsäuren aufweisen.

15. Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer nicht funktionellen Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens eines nicht funktionellen Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4 in einen Öl produzierenden Organismus;

b) Anzucht dieses Organismus und

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren freigesetzt werden.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder einen Mikroorganismus handelt.

18. Öle oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen Anspruch 9 bis 14.

19. Fettsäuregemisch mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 10.

20. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

21. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, Anspruch 24 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.

22. Verwendung von Triglyceriden oder Fettsäuregemischen gemäß Anspruch 17 oder 18 mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika.

23. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, das eine Fettsäure der allgemeinen Struktur I,

die zwei durch eine Methylengruppe voneinander getrennte Doppelbindungen aufweist, zu einer dreifach ungesättigten Fettsäure der allgemeinen Struktur II

umsetzt, wobei die drei Doppelbindungen der Fettsäure in Konjugation sind und wobei die Substituenten und Variablen in den Verbindungen der allgemeinen Struktur I und II folgende Bedeutung haben:
R¹ = Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-,

R² = substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder gesättigtes C₁-C₉-Alkyl-
R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₂₂-Alkylcarbonyl- oder Phospho-,
n = 1 bis 14

24. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,

b) Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten,

c) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90% Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.

25. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24.

26. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

27. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26.

28. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 27.

29. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24 oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26.