BRPI0716075A2 - sÍntese de Ácidos graxos - Google Patents

Abstract

SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS A invenção atual relaciona-se às enzimas que possuem a atividade de desaturase, de conjugase, de epoxidase e/ou de hidroxilase que podem ser usadas nos métodos de sintetizar ácidos graxos.

Description

SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se às enzimas que possuem atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase, e/ou hidroxilase quem pode ser usadas em métodos de síntese de ácidos graxos.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Os produtos primários da biossíntese de ácido graxo na maioria dos organismos são compostos de 16- e 18-carbonos. Entretanto, a razão relativa de comprimentos de cadeia e grau de insaturação destes ácidos graxos varia extensamente entre as espécies. Os mamíferos e insetos, por exemplo, produzem primeiramente ácidos graxos saturados e monosaturados, enquanto a maioria das plantas mais elevadas produz ácidos graxos com uma, duas, ou três ligações duplas, os últimos dois compreendendo ácidos graxos poliinsaturados (PUF's).

Duas famílias principais de PUFAs são os ácidos graxos ômega-3 (representados também como os ácidos graxos "n-3"), exemplificado pelo ácido eicosapentanóico (EPA, 20:5, n-3), e os ácidos graxos ômega-6 (representados também como os ácidos graxos "n-6"), exemplificado pelo ácido araquidônico (ARA, 20:4, n-6). Os PUFAs são componentes importantes das membranas plasmática de células, predominantemente esterifiçados na forma de fosfolipídios, e tecido adiposo em triglicerídeos.

A habilidade de células em modular o grau de insaturação em suas membranas é principalmente determinada pela ação de desnaturases de ácido graxo. As enzimas desnaturase introduzem ligações insaturadas em posições específicas em seus substratos de cadeia de acila graxa. As enzimas desnaturase geralmente mostram seletividade considerável para o comprimento de cadeia do substrato e para a posição de ligações duplas existentes na cadeia de acila graxa (Shanklin e Cahoon, 1998) e podem ser classificadas nesta base. Outra classificação de desnaturases de ácido graxo é baseada na porção a qual as cadeias de hidrocarboneto de seus substratos são aciladas. As desnaturases reconhecem os substratos que são ligados à proteína carreadora de acila, à coenzima A, ou às moléculas lipídicas, tais como fosfolipídios (Murata e Wada, 1995; Shanklin e Cahoon, 1998).

A desnaturação de ácidos graxos em glicerolipídios é essencial para a função apropriada de membranas biológicas. A introdução de insaturação na posição Δ9 de ácido palmítico ou esteárico fornece a fluidez aos lipídios de membrana e portanto as desnaturases Δ9 são encontradas universalmente em sistemas vivos.

O ácido linoléico (LA; 18:2, Δ9, 12) é produzido do ácido oléico (18:1 Δ9) por uma A12-desnaturase enquanto o ácido α-linolênico (ALA; 18:3) é produzido do ácido LA por uma Δ15-desnaturase. O ácido estearidônico (18:4, Δ6, 9, 12, 15) e ácido γ-linolênico (18:3, Δ6, 9, 12) são produzidos da ALA e LA, respectivamente, por uma Δ6- desnaturase. Entretanto, os mamíferos não podem desnaturar além da posição Δ9 e portanto não podem converter o ácido oléico em LA. Quatorze espécies de inseto (de Renobales, 1987) foram mostradas por produzir o ácido linoléico de novo do 14C-acetato, sugerindo a presença de atividade de Δ12-desnaturase nativa. A atividade de Δ12-desnaturase de Acheta domesticus o grilo de casa foi a primeira deste tipo relatada por utilizar oleoil-CoA (Cripps, 1990). Entretanto, nenhum gene responsável para a conversão de ácido oléico ao LA foi identificado de um inseto apesar de esforço extensivo. Do mesmo modo, o ALA não pode ser sintetizado por mamíferos. Os ácidos graxos poli- insaturados principais de animais portanto são derivados da dieta através da desnaturação e alongamento subsequentes de LA e ALA dietéticos. Outros eucariotos incluindo fungos, nematóides e plantas, tem as enzimas que desnaturam nas posições de carbono 12 e carbono 15. As desnaturases Δ12 associadas à membrana de Arahidopsis sp. e grão de soja usam substratos de lipídio de acila.

Menos comum, ácidos graxos saturados podem ser insaturados inicialmente em posições além da posição 9 por desnaturases com especificidades incomuns. 0 ácido petroselínico (ácido cis-6-octadecenóico) é concentrado nos óleos de semente das famílias de planta Umbelliferae (Apiaceae), Araliaceae e Garryaceae, onde pode alcançar 85% do ácido graxo de lipídio total (Kleiman e Spencer, 1982). A desnaturase do coentro (Coriandrum sativum) foi caracterizada o que faz o lipídio incomum. Uma desnaturase Δ4 de proteína carreadora acil-acila (ACP) localizada no plastídeo age no ACP-ácido palmítico para produzir o ácido eis-4-hexadecenóico que é transferido do plastídeo à semente em desenvolvimento onde é alongado ao ácido cis-6- octadecenóico (Cahoon e col. 1992). Uma desnaturase relacionada com 83% de identidade de seqüência foi obtida da Hera Inglesa (Hedra helix L.) que produz o ácido cis-4- hexadecenóico e ácido cis-6-octadecenóico quando expressa em Arabidopsis (Whittle e col. 2005). 0 ácido eis-5- eicosnóico (C20:l Δ5) é um componente principal do óleo de semente de espuma do prado (Limnanthes alba) e espécies de Limnathes relacionadas. A enzima responsável para a produção do óleo incomum em L. douglasii foi identificada como uma desnaturase Α-Δ5 coenzima de acila cuja a preferência de substrato é ácido eicosanóico (Cahoon e col., 2000). A expressão gênicas de desnaturase L. douglasii Δ5 e elongase de ácido graxo em embriões de grão de soja resultou na produção de ácido eis-5-eicosnóico (C20:1 Δ5) e ácido eis-5-docosenóico (C22:l Δ5). Sayanova e col. (2007) identificaram uma desnaturase de acila CoA-A5 que é relacionada à desnaturase de sp. de Limnathes, mas utilizam ácidos graxos saturados (C16:0, C18:0) e ácidos graxos insaturados (LA, ALA) para fazer ácidos monoenóicos Δ5 e ácidos graxos poliinsaturados. Os genes codificando enzimas similares não foram clonados dos animais, tal como insetos.

Alguns insetos lepidópteros realizam a desnaturação de Δ11 de ácidos graxos saturados (C16:0, C18:0) esterifiçados à acilaCoA como uma etapa na produção de uma diversidade de feromônios sexuais de traça (Rodriguez e col. 2004) . As desnaturases da traça Spodoptera littoralis foram expressas em Saccharomyces eerevisiae para produzir produtos mono- insaturados cis-ΔΙΙ de C14:0, C16:0 e C18:0 quando as células de levedura foram alimentadas de ácidos graxos saturados adicionais (Rodriguez e col. 2004). Além disso, o ácido trans-ΔΐΙ-tetradecenóico foi formado do ácido mistírico (C14:0) alimentado à levedura. Um subproduto menor da desnaturação de Δ11 foi a formação de ácido 11- hidróxi hexadecenóico ou octadecanóico (até 0,1% de ácidos graxos totais) (Serra e col., 2006). Moto e col. (2004) identificaram uma desnaturase acil-CoA bi-funcional da glândula de feromônio do bicho da seda que foi responsável para a biossíntese do precursor de feromônio. A desnaturase primeiramente utilizou ácido palmítico para fazer o ácido eis-11-hexadecenóico e então agiu neste para remover 2h alilico e para formar um ácido graxo de dieno conjugado (ácido trans-ΔΙΟ,cis-ΔΙ2-hexadecendienóico e algum ácido trans-Δ10,trans-Δ12-hexadecendienóico) e portanto possuiu ambas atividades desnaturase de conjugase e cis-ΔΙΙ. Na larva de traça da Nova Zelândia, Planotortrix octo, uma desnaturase foi identificada da glândula de feromônio que desnatura o ácido palmítico na posição Δ10 para formar o ácido eis-Δ10-hexadecenóico (Hao e col. 2002).

Os ômega-3 LC-PUFA são agora extensamente reconhecidos como compostos importantes para a saúde humana e animal e a inclusão de ômega-3 LC-PUFA, tal como EPA e DHA na dieta humana tem sido ligada com numerosos benefícios relacionados à saúde. Estes incluem a prevenção ou redução de doença de coração de coronária, hipertensão, diabetes tipo-2, doença renal, artrite reumatóide, colite ulcerativa, doença pulmonar obstrutiva crônica, vários distúrbios mentais, tais como esquizofrenia, distúrbio hiperativo de déficit de atenção e doença de Alzheimer, e ajudando o desenvolvimento e crescimento do cérebro (Simopoulos, 2000). Estes ácidos graxos podem ser obtidos das fontes dietéticas ou pela conversão de ácidos graxos linoléico (LA, ômega-6) ou α-linolênico (ALA, ômega-3), ambos que são considerados como ácidos graxos essenciais na dieta humana. Enquanto humanos e muitos outros animais vertebrados são capazes de converter LA ou ALA, obtidos de fontes de planta, à LC-PUFA, realizam esta conversão em uma taxa muito baixa. Além disso, a maioria das sociedades modernas desequilibrou as dietas em que pelo menos 90% de ácido(s) graxo(s) poliinsaturado(s) consistem de ácidos graxos ômega-6, em vez da razão 4:1 ou menos para ácidos graxos ômega-6:ômega-3 que é considerada como ideal (Trautwein, 2001). A fonte dietética imediata de LC-PUFA, tal como o ácido eicosapentanóico (EPA, 20:5) e o ácido docosahexanóico (DHA5 22:6) para humanos é na maior parte dos peixes ou óleo de peixes. Os profissionais de saúde recomendaram portanto, a inclusão regular de peixe contendo níveis significativos de LC-PUFA na dieta humana. Cada vez mais, os óleos de LC- PUFA derivados de peixe estão sendo incorporados em produtos alimentares e em fórmula infantil. Entretanto, devido a um declínio em peixarias globais e nacionais, fontes alternativas destes óleos melhoradores da saúde benéficos são necessárias. 2 0 Os ácidos graxos podem também ser hidroxilados, por

exemplo, ácido ricinoléico (ácido 12-hidróxi-octadec-cis-9- enóico) que compreende até 90% de ácido graxo em óleo de rícino de Ricinus communis e é um óleo de mercadoria agricultural importante. Outros ácidos graxos hidroxilados relacionados encontrados em óleos de planta incluem ácidos 12-hidróxi-octadeca-cís-9 , cís-15-díenóico (densipólico) e 14-hidróxi-eicosa-cis-ll,cis-17-dienóico (auricólico). A hidroxilase Δ12 de Ricinus age no substrato lipídico de ácido oléico para produzir o ácido ricinoléico; o gene de desnaturase responsável pela transformação é mais proximamente relacionado a, mas divergente das desnaturases de lipxdio de acila Δ12 da membrana de planta (van de Loo e col. 1995) . Há um ácido graxo hidroxilado C20 homólogo produzido em níveis elevados em óleo de semente de sp. de Lesguerella como 14-hidróxi-eicos-cis-ll-einóico (ácido lesquerólico) (Gunstone e col., 1994). O gene de hidroxilase de L.fendleri foi clonado e expresso em um mutante FAD2 de Arabidopsis que acumulou ácidos ricinoléico, lesquerólico e densipólico em sementes (Broun e col. 1998). Os ácidos graxos 2-hidróxi ocorrem em quantidades apreciáveis nos esfingolipídios de plantas e animais, mas estão também presentes como componentes menores de óleos de sementes, tais como 2-hidróxi-octadeca- 9,12,15-trienoato das sementes de Thymus vulgaris e ácidos 2-hidróxi-oléico e linoléico são encontrados em Salvia nilotica (Smith, 1971; Badami e Patil, 1981).

Os ácidos graxos podem também compreender os grupos epóxi. O ácido graxo epóxi natural conhecido mais amplamente é o ácido vernólico (ácido 12,13-epóxi-octadec- cis-9-enóico) dos óleos de semente de Vernonia spp. e Euphorbia lagascae (Cuperus e Derksen, 1996) . O gene de epoxigenase de C. palaestina, o qual é relacionado, mas divergente das desnaturases de A12-oleato da membrana de planta, foi funcionalmente caracterizado e mostrado por usar linoleato como um substrato (Lee e col. 1998).

Em alguns organismos, os ácidos graxos conjugados são produzidos pela atividade de um conjugase (Crombie e col., 1984; Crombie e col., 1985; Fritsche e col., 1999; Cahoon e col., 2001; Qiu e col., 2001). A biossíntese de ácidos graxos conjugados, tais como ácido calendúlico, ácido eleoesteárico ou ácidos punicíco procede através da desnaturação de ácido oléico ao ácido linoléico por uma Δ12-desnaturase e uma desnaturação adicional conjuntamente com um rearranjo da ligação dupla Z9- ou Z12- ao ácido graxo conjutriênico por uma conjutrieno formando desnaturase específico (conjugase).

Há uma necessidade para métodos adicionais de produção de ácidos graxos em células recombinantes e para produção mais eficiente ou produção de novos ácidos graxos.

Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos no presente relatório descritivo são unicamente com a finalidade de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como uma admissão que quaisquer ou todas estas matérias formam parte da base da técnica anterior ou eram de conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção por existir antes da data de prioridade de cada reivindicação desta aplicação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores identificaram novas enzimas tendo atividade de desnaturase, conjugase, epoxigenase, e/ou hidroxilase dos insetos da Ordem Coleoptera e Ortoptera.

Consequentemente, a presente invenção fornece uma célula eucariótica compreendendo um ácido nucléico exógeno

codificando um polipeptídeo que é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°:16 a 30, 73 a 78, 80 e 134;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii);

em que o polipeptídeo tem uma ou mais atividades selecionadas da atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase e hidroxilase.

Em uma modalidade, o polipeptídeo pode ser isolado de um inseto da Ordem Coleoptera ou Ortoptera. Exemplos de espécies de inseto das quais o polipeptídeo pode ser isolado incluem, mas não são limitados a, Tribolium, Chauliognathus ou Acheta.

Em uma modalidade, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico exógeno é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) ;

em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase Δ12 de acil-CoA.

Em outra modalidade, o polipeptídeo é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada na ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N°: 19;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a uma seqüência determinada em ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N° : 19, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ü) ;

em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase Δ5 de acil-CoA.

Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°: 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) ;

em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase

de acil-CoA Δ9.

Os presentes inventores são os primeiros a identificar um ácido nucléico codificando uma desnaturase de acil-CoA Δ12. Assim, a presente invenção fornece uma célula eucariótica compreendendo um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase de acil-CoA Δ12.

Em uma modalidade, a desnaturase de acil-CoA Δ12 compreende:

(i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N° : 28, 73, e/ou 134;

(ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) ·

Em uma modalidade, a célula eucariótica compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16:2A9,A12 e/ou 18:2A9,A12 relativos a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico exógeno.

Em ainda outra modalidade, a célula eucariótica compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16:2Δ9,Α12 e/ou 18: 2a9,A12 que esterif içados a CoA.

Os presentes inventores são também os primeiros a identificar uma desnaturase Δ5 de acil-CoA que tem uma preferência para um substrato de ácido graxo 18:0 e/ou 16:0 quando comparado a vários outros substratos. Consequentemente, em um aspecto adicional da presente invenção fornece uma célula eucariótica compreendendo um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase Δ5 acil- CoA, em que a desnaturase é mais ativa em um substrato de 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de um 18:1a9, 16:1a9, 2 0:0 e 20:2A11A14.

Em uma modalidade, a desnaturase Δ5 de acil-CoA compreende:

(i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N°: 19;

(ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N°: 19, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) · Era outra modalidade, a célula eucariótica compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16:1a5 e/ou 18:1a5 relativos a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico exógeno.

Em ainda outra modalidade, a célula eucariótica

compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16:1a5 e/ou 18:1a5 que são esterifiçados a CoA.

Os presentes inventores são também os primeiros a identificar uma desnaturase de acil-CoA Δ9 que é mais ativa

em um substrato 14:0 do que em determinadas substratos de ácido graxo esterificado â CoA. Assim, em um aspecto adicional a presente invenção fornece uma célula eucariótica compreendendo um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase de acil-CoA Δ9, em que a

desnaturase é mais ativa em um substrato 14 :0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

Em uma modalidade, a desnaturase de acil-CoA Δ9 compreende:

2 0 (i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada

em ID. de SEQ. N°: 23 ou ID. de SEQ. N°: 74;

(ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ. N°: 23 ou ID. DE SEQ. N°: 74, e/ou;

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ü) ·

Em uma modalidade particular, a célula eucariótica compreende um nível aumentado de 14:Ia9 relativo a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico

3 0 exógeno. Em ainda outra modalidade, a célula eucariótica compreende um nível aumentado de 14:1Δ9 que é esterifiçado a CoA.

Preferivelmente, a célula eucariótica compreendendo o ácido nucléico exógeno é uma célula de planta, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula de levedura.

Em uma modalidade, a célula eucariótica está em uma planta ou semente de planta.

Preferivelmente, a planta ou semente de planta é uma

planta de semente oleaginosa ou uma semente oleaginosa respectivamente.

Em um aspecto da invenção é fornecido um processo para identificar uma molécula de ácido nucléico envolvida na

modificação de ácido graxo compreendendo:

(i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência mais proximamente

relacionada à ID. de SEQ. N°: 28 do que à ID. de SEQ. N°: 13 5;

(ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo;

(iii) determinação se a composição de ácido graxo é

modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução da molécula de ácido nucléico; e

(iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido

nucléico que modificou a composição de ácido graxo. Em outro aspecto a presente invenção fornece um processo para identificação de uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo compreendendo:

(i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptideo compreendendo os aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134;

(ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo;

(iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução da molécula de ácido nucléico, e

(iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

Em uma modalidade, a etapa (iv) compreende a seleção de uma molécula de ácido nucléico codificando uma desnaturase de acil-CoA Δ12.

Em outra modalidade, a composição de ácido graxo modificada compreende um nível aumentado de 16:2δ9'λ12 e/ou 18 : 2Δ9Δ12 .

A presente invenção adicionalmente fornece um processo para identificação de uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo compreendendo:

(i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 18 e/ou 19;

(ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo;

(iii) determinação se a composição de ácido graxo é modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução do ácido nucléico, e

(iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

Em uma modalidade, a etapa (iv) compreende selecionar uma molécula de ácido nucléico uma desnaturase Δ5 de acil- CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de 18:1a9, 16:1a9, 20:0 e 20:2Δ11Δ14.

Em outra modalidade, a composição de ácido graxo modificada compreende um nivel aumentado de ácidos graxos

16:1a5 e/ou 18:1a5.

A presente invenção ainda fornece um processo para identificação de uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo compreendendo:

(i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76; (ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou em um sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo;

(iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução do ácido nucléico, e

(iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

Em uma modalidade, a etapa (iv) compreende selecionar uma molécula de ácido nucléico codificando uma desnaturase de acil-CoA Δ9, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato 14:0 do que em um substrato de ácido graxo esterifiçado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

Em outra modalidade, a composição de ácido graxo modificada compreende um nível aumentado de 14:1Δ9.

Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucléico é um polipeptídeo de inseto ou mutante do mesmo.

A presente invenção ainda fornece um polipeptídeo substancialmente purificado ou recombinante que é uma desnaturase de acil-CoA Δ12.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134, e/ou

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (Ü) ·

A presente invenção ainda fornece um polipeptídeo substancialmente purificado ou recombinante que é uma desnaturase Δ5 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de 18:1a9, 16:1δ9, 20:0 e 20:2δ11λ14.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo

uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. DE SEQ. N0:19;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ.

N°: 18 e/ou ID. de SEQ. N°: 19, e/ou

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) ·

A presente invenção ainda fornece um polipeptídeo substancialmente purificado ou recombinante que é uma desnaturase de acil-CoA Δ9, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 14:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo

uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 17 ou ID. DE SEQ. N0:74;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a uma ou mais das seqüências como determinadas em ID. de SEQ. N° : 17 e/ou ID. de SEQ. N° : 74, e/ou

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ü) .

A presente invenção ainda fornece um polipeptídeo substancialmente purificado ou recombinante que é:

(i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N0:16 a 30, 73 a 78, 80 e 134;

(ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma

ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N0: 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134, e/ou

(iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

(ii) ,

em que o polipeptídeo tem uma ou mais atividades

selecionadas da atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase e/ou hidroxilase.

Preferivelmente, o polipeptídeo compreende aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134.

Em uma modalidade, o polipeptídeo pode ser isolado de um inseto da Ordem Coleoptera ou Ortoptera.

Preferivelmente, o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase sob uma ligação carbono-carbono localizada em qualquer uma das posições Δ2 a Δ15 de um ácido graxo.

Em uma modalidade, o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase em um ácido graxo C16 ou C18.

Em outra modalidade, o polipeptídeo é uma proteína de 3 0 fusão compreendendo ainda pelo menos uma outra seqüência de polipeptídeo.

A presente invenção ainda fornece um polinucleotideo isolado e/ou exógeno compreendendo:

(i) uma seqüência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma de ID. de SEQ. N0: 1 a 15, 67 a 72, 79 e 133;

(ii) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção;

(iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 50% idêntica a uma ou mais seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 1 a 15, 67 a 72, 79 e/ou 133, e/ou

(iv) uma seqüência que hibridiza a qualquer um de (i) a (iii) sob condições rigorosas.

É também fornecido um vetor compreendendo um polinucleotideo da invenção.

Em uma modalidade, o polinucleotideo é ligado operavelmente a um promotor.

A presente invenção ainda fornece uma célula compreendendo o polipeptídeo recombinantes de acordo com a invenção, o polinucleotideo exógeno da invenção e/ou o vetor da invenção.

Preferivelmente, a célula é uma célula de planta, fúngica, de levedura, bacteriana ou animal. Mais preferivelmente, a célula é uma célula de eucariotos.

A presente invenção ainda fornece um método de produção do polipeptídeo de acordo com a invenção, o método compreendendo a expressão em uma célula ou sistema de expressão de livre de célula do polinucleotideo da invenção.

Em uma modalidade, o método compreende ainda isolar o polipeptídeo. A presente invenção ainda fornece um organismo não humano transgênico compreendendo uma célula de acordo com a invenção.

Em uma modalidade, o organismo é uma planta transgênica.

A presente invenção ainda fornece uma semente compreendendo a célula de acordo com a invenção.

A presente invenção ainda fornece o óleo produzido por, ou obtido da, célula de acordo com a invenção, o organismo não humano transgênico da invenção, ou a semente da invenção.

Em uma modalidade, o óleo compreende ácidos graxos 16:0, 16:1a5, 18:0 e 18:1Δ5, em que a razão da quantidade total de 18:1Δ5 a 18:0 no óleo está entre 100:1 e 1:2, e em que o ácido graxo do óleo compreende menos do que 10%, ou menos do que 5% (peso/peso) de 20:1Δ5.

Em outra modalidade, pelo menos 43%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, do ácido graxo C18 do óleo é 18:1a5.

Em ainda outra modalidade, o ácido graxo do óleo compreende pelo menos 3,0% (peso/peso), ou pelo menos 5% (peso/peso) ou pelo menos 10% (peso/peso), de 18:1a5 como uma porcentagem de ácido graxo total do óleo.

Em outra modalidade, o óleo compreende menos do que 10% (peso/peso), ou menos do que 5% (peso/peso), de 18. 3Δ,9Δ12,Δ15 (ALA) COmo uma porcentagem do ácido graxo total

no óleo.

Em uma modalidade, o óleo é obtido pela extração de óleo de uma semente oleaginosa.

A presente invenção ainda fornece um óleo compreendendo ácidos graxos 16:0, 16:1a5, 18:0 e 18:1Δ5, em que a razão da quantidade total de 18: 1Δ5 a 18:0 no óleo está entre 100:1 e 1:2, e em que o ácido graxo do óleo compreende menos do que 10% (peso/peso) , ou menos do que 5%, 20 : 1Δ5 .

A presente invenção ainda fornece um óleo compreendendo ácidos graxos, em que pelo menos 43%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, do ácido graxo C18 do óleo é 18 : Ia5 .

A invenção ainda fornece um óleo compreendendo ácidos graxos compreendendo pelo menos 3,0% (peso/peso), ou pelo menos 5% (peso/peso) ou pelo menos 10% (peso/peso) , de 18:1a5 como uma porcentagem do ácido graxo total do óleo.

Em uma modalidade, o óleo compreende menos do que 10% (peso/peso), ou menos do que 5% (peso/peso), de 18: 3Δ9-Δ12·Δ15 (ALA) como uma porcentagem do ácido graxo total no óleo.

A presente invenção ainda fornece um ácido graxo produzido por, ou obtido da, célula de acordo com a invenção, o organismo não humano transgênico da invenção, ou a semente da invenção.

A invenção também fornece um método de produção de óleo contendo ácidos graxos insaturados, o método compreendendo a extração de óleo da célula de acordo com a invenção, o organismo não humano transgênico da invenção, ou a semente da invenção.

A presente invenção ainda fornece uma composição compreendendo uma célula de acordo com a invenção, o polipeptídeo de acordo com a invenção, um polinucleotideo de acordo com a invenção, um vetor da invenção, um óleo de acordo com a invenção ou um ácido graxo da invenção. A invenção fornece também os alimentos, cosméticos ou os produtos químicos compreendendo o óleo de acordo com a invenção ou um ácido graxo da invenção.

A presente invenção também fornece um método de realização de uma reação de desnaturase, o método compreendendo contactar um substrato de ácido graxo saturado, monoinsaturado ou poliinsaturado esterificado a CoA com o polipeptídeo da invenção.

A presente invenção ainda fornece um anticorpo substancialmente purificado, ou fragmento do mesmo, que especificamente liga um polipeptídeo da invenção.

A invenção ainda fornece um método de tratamento ou prevenção de uma condição que se beneficiaria de um PUFA, o método compreendendo a administração a um indivíduo uma célula de acordo com a invenção, de polipeptídeo de acordo com a invenção, um polinucleotídeo de acordo com a invenção, um vetor da invenção, um óleo de acordo com a invenção, um ácido graxo da invenção e/ou um alimento da invenção.

Em uma modalidade, a condição é arritimia cardíaca, angioplastia, inflamação, asma, psoríase, osteoporose, pedras no rim, AIDS, esclerose múltipla, artrite reumatóide, doença de Crohn, esquizofrenia, câncer, síndrome alcóolica fetal, distúrbio de hiperatividade deficiente de atenção, fibrose cística, fenilcetonúria, depressão unipolar, hostilidade agressiva,

adrenoleucodistrofia, doença de coração coronária, hipertensão, diabetes, obesidade, doença de Alzheimer, doença pulmonar obstrutiva crônica, colite ulcerativa, restenose após angioplastia, eczema, pressão sangüínea elevada, agregação plaquetária, sangramento

gastrointestinal, endometriose, slndrome pré-menstrual, encefalomielite miálgica, fadiga crônica após infecções virais ou uma doença ocular.

A presente invenção também fornece o uso de uma célula de acordo com a invenção, o polipeptídeo de acordo com a invenção, um polinucleotídeo de acordo com a invenção, um vetor da invenção, um óleo de acordo com a invenção ou um ácido graxo da invenção e/ou um alimento da invenção para a manufatura de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma condição que se beneficiaria de um PUFA.

Como será aparente, as características e funcionalidades preferidas de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.

Durante todo este relatório descritivo a palavra "compreende", ou as variações como "compreendem" ou "compreendendo", serão compreendidas por implicar a inclusão de um elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas indicados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

A invenção é descrita a seguir por meio dos seguintes Exemplos não limitantes e com referência às figuras acompanhantes.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS ACOMPANHANTES

Figura 1. Uma comparação da seqüência de ácido nucléico obtida do programa de predição de gene e daquele do produto de RT-PCR autêntico para Tribdesat 2b. Os pontos indicam a identidade de seqüência, enquanto nucleotídeos diferentes são indicados. Figura 2. Uma comparação da seqüência de ácido nucléico obtida do programa de predição de gene e daquele do produto de RT-PCR autêntico para Tribdesat 3. Os pontos indicam a identidade de seqüência, enquanto os nucleotídeos diferentes são indicados.

Figura 3. Uma comparação da seqüência de ácido nucléico obtida do programa de predição de gene e daquela do produto de RT-PCR autêntico para Tribdesat 6b. Os pontos indicam a identidade de seqüência, enquanto os nucleotídeos diferentes são indicados.

Figura 4. Uma comparação da seqüência de ácido nucléico obtida do programa de predição de gene e daquela do produto de RT-PCR autêntico para Tribdesat 10. Os pontos indicam a identidade de seqüência, enquanto os nucleotídeos diferentes são indicados.

Figura 5. Uma comparação da seqüência de ácido nucléico obtida do programa de predição de gene e daquela do produto de RT-PCR autêntico para Tribdesat 11. Os pontos indicam a identidade de seqüência, enquanto os nucleotídeos diferentes são indicados.

Figura 6. Traço e espectro de CG/EM mostrando a produção de ácido linoléico (18: 2Δ9,Λ12) por Tribdesat 10 em Arabidopsis, com controle de Arabidopsis Fadl/Fae2.

Figura 7. A. A cromatografia gasosa (CG) de ésteres de metila de ácido graxo de levedura da S. cerivisiae expressando AdD12Des. B. Cromatografia gasosa (CG) de ésteres de metila de ácido graxo de levedura da S. cerivisiae, vetor somente. C. Confirmação das posições de ligação dupla de produtos C16:2 e C18:2 por espectrometria de massa-CG. Figura 8. A análise de CG de células olel de levedura expressando vector pYES2 somente (painel A) ou Δ12- desnaturase de A. domesticus em pXZP2 8 2 (painel B) após alimentado com a mistura de C14:0 e C15:0.

Figura y. Análise filoyenética de seqüências de

proteína de desnaturase acil-CoA representativas.

Figura 10. Análise filogenética proteína de desnaturase acil-CoA representativas.

CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA ID. de SEQ. N° : 1 - seqüência desnaturase de Tribolium 1

ID. de SEQ. N°: 2 ■ desnaturase de Tribolium 2a ID. de SEQ. N°: 3 ■ desnaturase de Tribolium 2b ID. de SEQ. N°: 4 ■ desnaturase de Tribolium 2c

ID. de SEQ. N°: 5 desnaturase de Tribolium 3

ID. de SEQ. N°: 6 desnaturase de Tribolium 4

ID. de SEQ. N°: 7 ■ desnaturase de Tribolium 5

ID. de SEQ. N°: 8 desnaturase de Tribolium 6a

ID. de SEQ. N°: 9 desnaturase de Tribolium 6b ID. de SEQ. N°: 10

ou acil-lipídio

de seqüências de ou acil-lipídio

de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de desnaturase de Tribolium 7a

ID. de SEQ. N°: 11 desnaturase de Tribolium 7b ID. de SEQ. N°: 12 desnaturase de Tribolium 8 ID. de SEQ. N°: 13 desnaturase de Tribolium 10

ID. de SEQ. N°: 14 desnaturase de Tribolium 11 ID. de SEQ. N°: 15

desnaturase de Tribolium 12

ID. de SEQ. N°: 16 desnaturase de Tribolium 1 ID. de SEQ. N°: 17 desnaturase de Tribolium 2a ID. de SEQ. N°: 18 desnaturase de Tribolium 2b

ID. de SEQ. N°: 19 desnaturase de Tribolium 2c ID. de SEQ. N° : 20

desnaturase de Tribolium 3 ID. de SEQ. N°: 21 desnaturase de Tribolium 4 ID. de SEQ. N°: 22 desnaturase de Tribolium 5 ID. de SEQ. N°: 23 desnaturase de Tribolium 6a

ID. de SEQ. N°: 24 desnaturase de Tribolium 6b ID. de SEQ. N°: 25

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de codificação de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de

seqüência de aminoácido de desnaturase de Triboliuw 7a

ID. de SEQ. N°: 26 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Tribolium 7b

ID. de SEQ. N° : 27 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Tribolium 8

ID. de SEQ. N°: 28 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Tribolium 10

ID. de SEQ. N°: 29 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Tribolium 11

ID. de SEQ. N° : 30 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Tribolium 12

ID. de SEQ. N°: 31 - seqüência de desnaturase de inseto conservada

ID. de SEQ. N°: 32 a 66 - primers de oligonucleotídeo ID. de SEQ. N°: 67 - seqüência de codificação de

desnaturase de Chauliognathus CLl

ID. de SEQ. N°: 68 - seqüência de codificação de desnaturase de Chauliognathus CL3

ID. de SEQ. N°: 69 - seqüência de codificação parcial de desnaturase de Chauliognathus CL6

ID. de SEQ. N°: 70 - seqüência de codificação parcial de desnaturase de Chauliognathus CL7

ID. de SEQ. N°: 71 - seqüência de codificação parcial de desnaturase de Chauliognathus CL8

ID. de SEQ. N°: 72 - seqüência de codificação parcial de desnaturase de Chauliognathus CL9

ID. de SEQ. N° : 73 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Chauliognathus CLl

ID. de SEQ. N° : 74 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Chauliognathus CL3 ID. de SEQ. N°: 75 - seqüência de aminoácido parcial de desnaturase de Chauliognathus CL6

ID. de SEQ. N°: 76 - seqüência de aminoácido parcial de desnaturase de Chauliognathus CL7

ID. de SEQ. N°: 77 - seqüência de aminoácido parcial de desnaturase de Chauliognathus CL8

ID. de SEQ. N°: 78 - seqüência de aminoácido parcial de desnaturase de Chauliognathus CL9

ID. de SEQ. N°: 79 - seqüência de codificação de desnaturase de Chauliognathus CNl

ID. de SEQ. N°: 80 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Chauliognathus CNl

ID. de SEQ. N°: 81 a 103 - primers de oligonucleotídeo ID. de SEQ. N° : 104 a 111 - porções de desnaturase conservada

ID. de SEQ. N°: 112 a 122 - boxes de histidina em seqüências de desnaturase

ID. de SEQ. N°: 123 a 126 - porções de assinatura ID. de SEQ. N°: 127 a 130 - oligonucleotídeos ID. de SEQ. N°: 131 e 132 - regiões conservadas ID. de SEQ. N°: 133 - seqüência de codificação de desnaturase de Acheta domesticus AdD12Des

ID. de SEQ. N°: 134 - seqüência de aminoácido de desnaturase de Acheta domesticus AdD12Des

ID. de SEQ. N° : 135 -desnaturase Δ12 de Arabidopsis thaliana FAD2

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas Gerais

A menos que especificamente definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui deverão ter o mesmo significado como geralmente compreendido por um de habilidade ordinária na técnica (por exemplo, na cultura celular, genéticas moleculares, imunologia,

imunohistoquímica, química de proteína, e bioquímica).

A menos que indicado de outra maneira, a proteína recombinante, cultura de célula, e técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrões, conhecidos bem àqueles hábeis na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas através da literatura em fontes tais como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook e col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D. M. Glover e B. D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), e F. M. Ausubel e col. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todos as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan e col. (editores) Current Protocols in Imunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente), e são incorporados aqui por referência.

Definições Selecionadas

Como usado aqui, o termo "ácido graxo" refere-se a um ácido carboxílico (ou ácido orgânico), freqüentemente com uma cauda alifática longa, saturado ou insaturado. Os ácidos graxos tipicamente tem uma cadeia ligada de carbono- carbono pelo menos de 8 átomos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 12 carbono em comprimento. Os ácidos graxos de ocorrência mais natural tem um número par de átomos de carbono, pois sua biosslntese envolve o acetato que tem dois átomos de carbono. Os ácidos graxos podem estar em um estado livre (não esterifiçado) ou em uma forma esterif içada, tal como parte de uma ligação de triglicerídeo, diacilaglicerídeo, monoacilaglicerídeo, acil-CoA (tio-éster) ou outra forma de ligação. 0 ácido graxo pode ser esterificado como um fosfolipídio, tal como formas de uma fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol.

Os "ácidos graxos saturados" não contêm nenhuma ligação dupla ou outros grupos funcionais ao longo da cadeia. 0 termo "saturado" refere-se ao hidrogênio, em que todos os carbonos (exceto do grupo de ácido carboxílico [- COOH]) contêm tantos hidrogênios quanto possíveis. Ou seja a extremidade ômega (ω) contém 3 hidrogênios (CH3-) e cada carbono dentro da cadeia contém 2 hidrogênios (-CH2-).

Os "ácidos graxos insaturados" são de forma similar aos ácidos graxos saturados, exceto que um ou mais grupos funcionais de alceno existentes ao longo da cadeia, com cada alceno substituindo parte de uma unicamente ligada "- CH2-CH2-" da cadeia com uma porção "-CH=CH-" duplamente ligada (isto é, uma dupla de carbono ligada a outro carbono). Os dois átomos de carbono seguintes na cadeia que são ligados a um dos lados da ligação dupla podem ocorrer em uma configuração eis ou trans.

Como usado aqui, o termo "ácido graxo monoinsaturado" refere-se a um ácido graxo que compreende pelo menos 12 átomos de carbono em sua cadeia de carbono e somente um grupo alceno na cadeia. Como usado aqui, os termos "ácido graxo poliinsaturado" ou "PUFA" referem-se a um ácido graxo que compreende pelo menos 12 átomos de carbono em sua cadeia de carbono e pelo menos dois grupos alcenos (ligações duplas de carbono-carbono). Ordinariamente, o número de átomos de carbono na cadeia de carbono dos ácidos graxos refere-se a uma cadeia de carbono não ramificada. Se a cadeia de carbono for ramificada, o número de átomos de carbono exclui aqueles nos grupos laterais. Em uma modalidade, o ácido graxo poliinsaturados de cadeia longa é um ácido graxo ω3, isto é, tendo uma desnaturação (ligação dupla de carbono-carbono) na terceira ligação carbono- carbono da extremidade metila do ácido graxo. Em outra modalidade, o ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa é um ácido graxo ω6, isto é, tendo uma desnaturação (ligação dupla de carbono-carbono) na sexta ligação carbono-carbono da extremidade metila do ácido graxo.

Como usado aqui, os termos "ácido graxo poliinsaturados de cadeia longa" ou "LC- PUFA" referem-se a um ácido graxo que compreende pelo menos 2 0 átomos de carbono em sua cadeia de carbono e pelo menos em duas ligações duplas de carbono-carbono.

Como usado aqui, o termo "desnaturase" refere-se a uma enzima que é capaz de introduzir uma ligação dupla de carbono-carbono no grupo acila de um substrato de ácido graxo, que está tipicamente em uma forma esterifiçada, tal como, por exemplo, ésteres de CoA de ácido graxo. 0 grupo acila pode ser esterificado a um f osf olipxdio, tal como fosfatidil colina, ou proteína carreadora de acila (ACP), ou em uma modalidade preferida a CoA. As desnaturases geralmente podem ser categorizadas em três grupos relativos.

Como usado aqui, o termo "desnaturase Δ12" refere-se a uma proteína que realiza uma reação de desnaturase que introduz uma ligação dupla de carbono-carbono localizada na 12a ligação da extremidade carboxila e tenha uma atividade maior em desnaturação nesta posição do que qualquer outra posição. Em uma modalidade, a atividade de desnaturase Δ12 inclui a atividade da desnaturase Δ12 de oleoil-CoA. Em outra modalidade, a atividade de desnaturase Δ12 inclui a atividade de desnaturase Δ12 de palmitoleoil-CoA. Estes ácidos graxos podem estar em uma forma esterifiçada, tal como, por exemplo, parte de um fosfolipídio. Exemplos de desnaturases Δ12 incluem proteínas compreendendo uma seqüência de aminoácido fornecida em ID. de SEQ. N°: 28, 78 e 134 .

Há dois tipos dos desnaturases Δ12; as desnaturases Δ12 de acil-CoA e desnaturases Δ12 de acil-PC, que são predominantemente ativas em acil-CoA e acil-PC ligadas aos substratos 18:1, respectivamente. Entretanto, as desnaturases Δ9 podem também ser ativas em uma acil-ACP (proteína carreadora de acila).

Como usado aqui, o termo "atividade de desnaturase Δ12 de acil-CoA" ou "desnaturase Δ12 de acil-CoA" refere-se à desnaturase tendo uma atividade maior em um substrato de acil-CoA do que um acil-lipídio (tal como acil-PC) e/ou substrato de acil-ACP. Em uma modalidade, a atividade é pelo menos duas vezes maior. Como usado aqui, uma "desnaturase Δ5" refere-se a uma proteína que realiza uma reação de desnaturase que introduz uma ligação carbono-carbono localizada na 5a ligação da extremidade carboxila e tenha atividade maior em desnaturação nesta posição do que qualquer outra posição. Em uma modalidade a desnaturase Δ5 tem a atividade de desnaturase Δ5 de acil-CoA-estearoil. Em outra modalidade, a desnaturase Δ5 tem a atividade de desnaturase de acil- CoA-palmitoil Δ5. Em uma modalidade, a enzima de desnaturase Δ5 catalisa a desnaturação de C2 0 LC-PUFA, convertendo o ácido dihomo-γ-linoléico DGLA ao ácido araquidônico (ARA, 20:4ω6) e ETA a EPA (20:5ω3).

Como usado aqui, o termo "atividade de desnaturase Δ5 acil-CoA" ou "desnaturase Δ5 de acil-CoA" refere-se à desnaturase tendo uma atividade maior em um substrato de acil-CoA do que um acil-lipídio (tal como acil-PC) e/ou substrato de acil-ACP. Em uma modalidade, a atividade é pelo menos duas vezes maior.

Como usado aqui, uma "desnaturase Δ9" refere-se a uma proteína que realiza uma reação de desnaturase que introduz uma ligação carbono-carbono localizada na 9 a ligação da extremidade carboxila e tenha atividade maior em desnaturação nesta posição do que qualquer outra posição. Exemplos de atividade de desnaturase Δ9 incluem a atividade de desnaturase Δ9 de miristoil-CoA, atividade de desnaturase Δ9 de estearoil-CoA, atividade de desnaturase Δ9 de palmitoil-CoA, atividade de desnaturase Δ9 de Iignoceroil-CoA e atividade de desnaturase Δ9 de behenoil- CoA.

Como usado aqui, o termo "atividade de desnaturase Δ9 de acil-CoA" ou "desnaturase Δ9 de acil-CoA" refere-se à desnaturase tendo uma atividade maior em um substrato de acil-CoA do que um acil-lipídio (tal como acil-PC) e/ou substrato de acil-ACP. Em uma modalidade, a atividade é pelo menos duas vezes maior.

Como usado aqui, o termo "conjugase" refere-se a uma conjutrieno formando desnaturase.

O termo "epoxidase" como usado aqui refere-se a uma enzima que introduz um grupo epóxi em um ácido graxo resultando na produção de um ácido graxo epóxi. Na modalidade preferida, o grupo epóxi é introduzido no 2° e/ou 12° carbono em uma cadeia de ácido graxo, especialmente de uma cadeia de ácido graxo C16 ou C18.

A "hidroxilase", como usada aqui, refere-se a uma enzima que introduz um grupo hidroxila em um ácido graxo resultando na produção de um ácido graxo hidroxilado. Em uma modalidade preferida, o grupo hidroxila é introduzido no 2o, 12° e/ou 17° carbono em uma cadeia de ácido graxo C18. Em outra modalidade preferida, o grupo hidroxila é 2 0 introduzido no 15° carbono em uma cadeia de ácido graxo C16 .

0 termo "planta" inclui plantas inteiras, estruturas vegetativas (por exemplo, folhas, troncos), raízes, orgãos/estruturas florais, semente (incluindo embrião,

2 5 endosperma, e revestimento de semente), tecido de planta

(por exemplo, tecido vascular, tecido fundamental, e similares), células e descendentes da mesma.

Uma "planta transgênica", "planta geneticamente modificada" ou variações das mesmas refere-se a uma planta

3 0 que contém uma construção genética ("transgene") não encontrada em uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. Um "transgene" como referido aqui tem o significado normal na técnica de biotecnologia e inclui uma seqüência genética que foi produzida ou alterada pela tecnologia de DNA ou RNA recombinante e que foi introduzido na célula de planta. 0 transgene pode incluir seqüências genéticas derivadas de uma célula de planta. Tipicamente, o transgene foi introduzido na planta pela manipulação humana tal como, por exemplo, pela transformação, mas qualquer método pode ser usado como um de habilidade na técnica reconhece.

Os termos "semente" e "grão" são usados permutavelmente aqui. "Grão" geralmente refere-se ao grão maduro, colhido, mas pode também referir-se ao grão após impregnação ou germinação, de acordo com o contexto. 0 grão maduro tem geralmente um teor de umidade de menos do que aproximadamente 18-20%.

"Operavelmente ligado" como usado aqui refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucléico (por exemplo, DNA) . Tipicamente, refere-se à relação funcional do elemento regulatório transcricional (promotor) a uma seqüência transcrita. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma seqüência de codificação, tal como um polinucleotídeo definido aqui, se estimular ou modular a transcrição da seqüência de codificação em uma célula apropriada. Geralmente, os elementos regulatórios transcricionais de promotor que são operavelmente ligados a uma seqüência transcrita são fisicamente contíguos à seqüência transcrita, isto é, eles agem em eis. Entretanto, alguns elementos regulatórios transcricionais, tais como melhoradores, não necessitam serem fisicamente contíguos ou localizados em proximidade às seqüências de codificação cuja transcrição eles melhoram.

Como usado aqui, o termo "gene" deve ser considerado em seu contexto mais amplo e inclui as seqüências de desoxiribonucleotídeo compreendendo a região de codificação de proteína de um gene estrutural e incluindo seqüências localizadas juntas à região de codificação em ambas extremidades 5' e 3' para uma distância de pelo menos aproximadamente 2 kb em qualquer extremidade e que são envolvidas na expressão do gene. As seqüências que são localizadas em 5' da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como seqüências não traduzidas 5'. As seqüências que são localizadas em 3' ou a jusante da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como seqüências não traduzidas 3'. 0 termo "gene" abrange ambas formas genômica e cDNA de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região de codificação que pode ser interrompida com seqüências não codificantes denominadas "íntrons" ou "regiões de intervenção" ou "seqüências de intervenção". íntrons são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear (hnRNA); os íntrons podem conter elementos regulatórios, tais como melhoradores. Os íntrons são removidos ou "separado" do transcrito nuclear ou primário; os íntrons estão portanto ausentes no transcrito de RNA mensageiro (mRNA). 0 mRNA funciona durante a tradução para especificar a seqüência ou ordem de aminoácidos em um polipeptídeo nascente. 0 termo "gene" inclui uma molécula de fusão ou sintética codificando toda ou parte das proteínas da invenção descrita aqui e uma seqüência de nucleotídeo complementar a qualquer uma da acima.

Como usado aqui, o termo "pode ser isolado de" significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo codificado é naturalmente produzido por um organismo, particularmente um inseto.

Polipeptideos/Peptídeos

Por "polipeptídeo substancialmente purificado" ou "polipeptídeo purificado" significa um polipeptídeo que foi geralmente separado dos lipídios, ácidos nucléicos, outros peptídeos, e outras moléculas contaminantes com que é associado em seu estado nativo. Preferivelmente, o polipeptídeo substancialmente purificado está pelo menos 60% livre, mais preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente pelo menos 90% livre dos outros componentes com que é naturalmente associado.

0 termo "recombinante" no contexto de um polipeptídeo refere-se ao polipeptídeo quando produzido por uma célula, ou em um sistema de expressão livre de célula, em uma quantidade alterada ou em uma taxa alterada comparada a seu estado nativo. Em uma modalidade a célula é uma célula que não produz naturalmente o polipeptídeo. Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um gene não endógeno que faz com que uma quantidade alterada do polipeptídeo seja produzida. Um polipeptídeo recombinantes da invenção inclui os polipeptídeos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de célula, em que é produzida, e os polipeptídeos produzidos em tais células ou sistemas livres de célula que são subseqüentemente purificados de pelo menos alguns dos outros componentes.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados geralmente permutavelmente.

0 % de identidade de um polipeptxdeo é determinada pela análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa CGG) com uma criação de gap penalidade=5, e uma extensão de gap penalidade=0,3. A seqüência de pesquisa é pelo menos 15 aminoácidos em comprimento, e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 15 aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de pesquisa é pelo menos 50 aminoácidos em comprimento, e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 50 aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de pesquisa é pelo menos 100 aminoácidos em comprimento e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 100 aminoácidos. Mesmo mais preferivelmente, a seqüência de pesquisa é pelo menos 250 aminoácidos em comprimento e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Mesmo mais preferivelmente, a análise de GAP alinha duas seqüências sobre seu comprimento total.

Como usado aqui um fragmento "biologicamente ativo" é uma porção de um polipeptídeo da invenção que mantém uma atividade definida do polipeptxdeo de comprimento total, especialmente possuindo atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase, e/ou hidroxilase. Os fragmentos biologicamente ativos podem ser de qualquer tamanho, desde que mantenham a atividade definida. Preferivelmente, o fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 10% de atividade da proteína de comprimento total.

Considerando um polipeptídeo/enzima definido, será apreciado que a % de identidade figura mais altamente do que aquelas fornecidas acima, abrangerão modalidades preferidas. Assim, onde aplicável, englobando a % mínima de a identidade figuras, prefere-se que o polipeptídeo/enzima compreenda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 60%, mais pref erivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 76%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8%, e mesmo mais preferivelmente pelo menos 99,9% idêntica à ID. de SEQ. N° relevante nominada.

No que diz respeito às desnaturases Δ5 de acil-CoA da invenção, esta é a primeira demonstração de uma desnaturase animal que pode produzir ácidos 5-hexadecenóico e 5- octadecenóico e usa um ácido graxo de acil-CoA como um substrato. No que diz respeito às desnaturases Δ12 de acil-CoA da invenção, esta é a primeira demonstração conhecida de atividade de desnaturase Δ12 por uma enzima produzida naturalmente por um animal. Além disso, esta é a primeira demonstração de uma desnaturase que pode produzir o ácido linoléico e usa um ácido graxo de acil-CoA como um substrato.

Os mutantes de seqüência de aminoácido dos polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados pela introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadas em um ácido nucléico da presente invenção, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado. Tais mutações incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos dentro da seqüência de aminoácido. Uma combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar na construção final, contanto que o produto de peptídeo final possua as características desejadas.

Os peptídeos mutantes (alterados) podem ser preparados usando qualquer técnica conhecida na técnica. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser submetido à mutagênese in vitro. Tais em técnicas de mutagênese in vitro incluem a sub-clonagem do polinucleotídeo em um vetor apropriado, transformando o vetor em uma cepa "de mutação", tal como E. coli XL-I vermelha (Stratagene) e propagando as bactérias transformadas para um número apropriado de gerações. Em outro exemplo, os polinucleotídeos da invenção são submetidos às técnicas de transferência de DNA como descritas amplamente por Harayama (1998). Os produtos derivados do DNA mutado/alterado podem prontamente ser selecionados usando as técnicas descritas aqui para determinar se possuem a atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase, e/ou hidroxilase.

Ao projetar mutantes de seqüência de aminoácido, a posição do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão de característica(s) a serem modificadas. Os sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, (1) primeiramente substituindo com escolhas de aminoácido conservativas e então com seleções mais radicais dependendo dos resultados conseguidos, (2) deletando o resíduo de alvo, ou (3) inserindo outros resíduos adjacente ao sítio localizado.

As deleções de seqüência de aminoácido variam geralmente de aproximadamente 1 a 15 resíduos, mais preferivelmente aproximadamente de 1 a 10 resíduos e tipicamente aproximadamente 1 a 5 resíduos contíguos.

Os mutantes de substituição tem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptídeo removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese substitucional incluem os sítios identificados como o (s) sítio(s) ativo(s). Outros sítios de interesse são aqueles em que resíduos particulares obtidos das várias cepas ou espécies são idênticos. Estas posições podem ser importantes para a atividade biológica. Estes sítios, especialmente aqueles que caem dentro de uma seqüência de pelo menos outros três sítios identicamente conservados, são preferivelmente substituídos em uma maneira relativamente conservativa. Tais substituições conservativas são mostradas na tabela 1 sob o título "substituições de exemplo". Tabela 1 - Substituições de exemplo. Resíduo original Substituições de exemplo Ala (A) vai; leu; ile; gly Arg(R) Iys Asn(N) gln; his Asp (D) glu Cys(C) ser Gln(Q) asn; his Glu(E) asp Gly(G) pro; ala His(H) asn; gln Ile(I) leu; vai; ala Leu(L) ile; vai; met; ala; phe Lys(K) arg Met(M) leu; phe Phe(F) leu; vai; ala Pro(P) giy Ser (S) thr Thr(T) ser Trp(W) tyr Tyr(Y) trp; phe Val(V) ile; leu; met; phe; ala

Em uma modalidade preferida um polipeptídeo mutante/variante tem uma ou duas ou três ou quatro mudanças de aminoácido conservativas quando comparado a um polipeptídeo de ocorrência natural. Os detalhes de mudanças de aminoácido conservativas são fornecidos na Tabela 1. Em uma modalidade preferida, as mudanças não são em uma ou mais das seguintes porções: AGAHRLW, SETDAD, FFFSHVG, QKKY, NSAAH, GEGWHNYHH, PWDY5 e GWAY. Em uma modalidade particularmente preferida, as mudanças não são em cada um das seguintes porções: AGAHRLW, SETDAD, FFFSHVG, QKKY, NSAAH, GEGWHNYHH, PWDY, e GWAY. Como uma pessoa hábil estaria ciente, tais mudanças menores podem razoavelmente ser preditas para não alterar a atividade do polipeptídeo quando expressas em uma célula recombinantes.

Além disso, se desejados, os aminoácidos não naturais ou análogos químicos de aminoácido podem ser introduzidos como uma substituição ou adição nos polipeptídeos da presente invenção. Tais aminoácidos incluem, mas não são limitados a, os D-isômeros de aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 2-aminobutirico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina,

hidróxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteíco, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, c ic lohexi lalanina, {3-alanina, f luoro-aminoácidos,

aminoácidos projetados, tais como aminoácidos de β-metila, aminoácidos de Ca-metila, aminoácidos de Να-metila, e análogos de aminoácido em geral.

São incluídos também dentro do escopo da invenção os polipeptídeos da presente invenção que são diferencialmente modificados durante ou após a síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicolização, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligante celular, etc. Estas modificações podem servir para aumentar a estabilidade e/ou bioatividade do polipeptídeo da invenção.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos em uma variedade de maneiras, incluindo a produção e recuperação de polipeptídeos naturais, produção e de recuperação de polipeptídeos recombinantes, e síntese química dos polipeptídeos. Em uma modalidade, um polipeptídeo isolado da presente invenção é produzido cultivando uma célula capaz de expressar o polipeptídeo sob condições eficazes para produzir o polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo. Uma célula preferida para cultivar é uma célula recombinantes da presente invenção. As condições de cultura eficazes incluem, mas não são limitados a, condições de meios eficazes, bioreactor, temperatura, pH e oxigênio que permitem a produção de polipeptídeo. Um meio eficaz refere-se a qualquer meio em que uma célula é cultivada para produzir um polipeptídeo da presente invenção. Tal meio tipicamente compreende um meio aquoso tendo fontes de carbono, nitrogênio e fosfato assimiláveis, e sais apropriados, minerais, metais e outros nutrientes, tais como vitaminas. As células da presente invenção podem ser cultivadas em bioreatores de fermentação, frascos de agitação, tubos de teste, pratos de microtítulo, e placas de petri convencionais. 0 cultivo pode ser realizado em uma temperatura, pH e teor de oxigênio apropriado para uma célula recombinante. Tais condições de cultivo estão dentro da perícia de um de habilidade ordinária na técnica.

PolinucIeotídeos

Por "polinucleotídeo isolado" significa um polinucleotídeo que foi geralmente separado das seqüências de polinucleotídeo com que está associado ou ligado em seu estado nativo. Preferivelmente, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 60% livre, mais preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente pelo menos 90% livre de outros componentes com que é naturalmente associado. Além disso, o termo "polinucleotídeo" é usado permutavelmente aqui com os termos "molécula de ácido nucléico", "gene" e "mRNA".

0 termo "exógeno" no contexto de um polinucleotídeo refere-se ao polinucleotídeo quando presente em uma célula, ou em um sistema de expressão livre de célula, em uma quantidade alterada comparada a seu estado nativo. Em uma modalidade, a célula é uma célula que não compreende naturalmente o polinucleotídeo. Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um polinucleotídeo não endógeno resultando em uma quantidade alterada de produção do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo exógeno da invenção inclui polinucleotídeos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de célula, em que está presente, e polinucleotídeos produzidos em tais células ou sistemas livres de célula que são subseqüentemente purificados de pelo menos alguns outros componentes. 0 polinucleotídeo exógeno (ácido nucléico) pode ser um estiramento contíguo de nucleotídeos existentes na natureza, ou compreende dois ou mais estiramentos contíguos de nucleotídeos das fontes diferentes (naturais e/ou sintéticas) unidas para formar um único polinucleotídeo. Tipicamente tais polinucleotídeos quiméricos compreendem pelo menos um quadro de leitura 3 0 aberto codificando um polipeptídeo da invenção operavelmente ligado a um promotor apropriado de direção da transcrição do quadro de leitura aberto em uma célula de interesse.

"Polinucleotídeo" refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou qualquer fragmento do mesmo. Pode ser DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, dupla-fita ou fita-simples, e combinado com carboidrato, lipxdios, proteína, ou outros materiais para realização de uma atividade particular definida aqui. A % de identidade de um polinucleotídeo é determinada

pela análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa de CGG) com uma criação de gap penalidade=5, e uma extensão de gap penalidade=0,3. A seqüência de pesquisa é pelo menos 45 nucleotídeos em comprimento, e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 4 5 nucleotídeos. Preferivelmente, a seqüência de pesquisa é pelo menos 150 nucleotídeos em comprimento, e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 150 nucleotídeos. Mesmo mais preferivelmente, a seqüência de pesquisa é pelo menos 300 nucleotídeos em comprimento e a análise de GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 300 nucleotídeos. Mesmo mais preferivelmente, a análise de GAP alinha duas seqüências sobre seu comprimento total. No que diz respeito aos polinucleotídeos definidos,

será apreciado que a % de identidade figura mais altamente do que aqueles fornecidos acima abrangerão modalidades preferidas. Assim, onde aplicável, considerando a % mínima de figuras de identidade, prefere-se que o polinucleotídeo compreende uma seqüência de polinucleotídeo que é pelo menos 60%, mais pref erivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais pref erivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais pref erivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8%, e mesmo mais preferivelmente pelo menos 99,9% idêntica à ID. de SEQ. N0 relevante nominada.

Um polinucleotideo da presente invenção pode seletivamente hibridizar a um polinucleotideo que codifica um polipeptideo da presente invenção sob condições rigorosas. Como usado aqui, sob condições rigorosas são aqueles que (1) empregam a força iônica e alta temperatura para lavar, por exemplo, 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% NaDodSO4 em 50°C; (2) empregam durante a hibridisação de um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (vol/vol) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino, 0,1% de Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidona, 50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio em 4 2 °C; ou (3) emprega 50% de formamida, 5 χ SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 g/ml), 0,1% de SDS e sulfato de dextrano 10% em 42°C em 0,2 χ SSC e 0,1% de SDS.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem possuir, quando comparado às moléculas de ocorrência natural, uma ou mais mutações que são deleções, inserções, ou substituições de resíduos de nucleotídeo. Os mutantes podem ser de ocorrência natural (isto é, isolado de uma fonte natural) ou sintética (por exemplo, realizando mutagênese dirigida ao sítio ou transferência de DNA no ácido nucléico como descrito acima). É assim aparente que polinucleotídeos da invenção podem ser de ocorrência natural ou recombinante.

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser RNA, DNA, ou derivados dos mesmos. 0 tamanho mínimo de tais oligonucleotídeos é o tamanho requerido para a formação de um híbrido estável entre um oligonucleotídeo e uma seqüência complementar em um polinucleotídeo da presente invenção. Preferivelmente, os oligonucleotídeos são pelo menos 15 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos, mesmo mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento. A presente invenção inclui os oligonucleotídeos que podem ser usados como, por exemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucléico, ou primers para produzir moléculas de ácido nucléico. Os oligonucleotídeos da presente invenção usados como uma sonda são tipicamente conjugados com um marcador, tal como um radioisótopo, uma enzima, biotina, uma molécula fluorescente ou uma molécula quimioluminescente.

Vetores Recombinantes

Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinantes, que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotideo isolada da presente invenção, inserido em qualquer vetor capaz de liberar a molécula de polinucleotideo em uma célula hospedeira. Tal vetor contém seqüências de polinucleotideo heterólogas, que são seqüências de polinucleotideo que não são encontradas naturalmente adjacente às moléculas de polinucleotideo da presente invenção e que preferivelmente são derivadas de uma espécie à exceção das espécies das quais a(s) molécula(s) de polinucleotideo é derivada. 0 vetor pode ser RNA ou DNA, procariótico ou eucariótico, e é tipicamente um transposon (tal como descrito na U. S. 5.792.294), um vírus ou um plasmidio.

2 0 Um tipo de vetor recombinante compreende uma molécula

de polinucleotideo da presente invenção operavelmente ligado a um vetor de expressão. A frase "operavelmente ligado" refere-se à inserção de uma molécula de polinucleotideo em um vetor de expressão em uma maneira, tal que a molécula é capaz de ser expressa quando transformada em uma célula hospedeira. Como usado aqui, um vetor de expressão é um vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e efetuar a expressão de uma molécula de polinucleotideo especificada.

3 0 Preferivelmente, o vetor de expressão é também capaz de replicar dentro da célula hospedeira. Os vetores de expressão podem ser procarióticos ou eucarióticos, e são tipicamente virus ou plasmídios. Os vetores de expressão da presente invenção incluem quaisquer vetores que funcionam (isto é, expressão direta de gene) em células recombinantes da presente invenção, incluindo células bacterianas, fúngicas, endoparasitas, artrópodes, animais, e plantas. Particularmente os vetores de expressão preferidos da presente invenção podem dirigir a expressão gênica em levedura e/ou células de plantas.

Em particular, os vetores de expressão da presente invenção contêm seqüências regulatórias, tais como seqüências de controle de transcrição, seqüências de controle de tradução, origens de replicação, e outras seqüências regulatórias que são compatíveis com a célula recombinante e que controlam a expressão de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção. Em particular, as moléculas recombinantes da presente invenção incluem seqüências de controle de transcrição. As seqüências de controle de transcrição são as seqüências que controlam a iniciação, alongamento, e terminação de transcrição. Particularmente as seqüências de controle de transcrição importantes são aquelas que controlam a iniciação de transcrição, tal como seqüências promotoras, melhoradoras, operadoras e repressoras. As seqüências de controle de transcrição apropriadas incluem qualquer seqüência de controle de transcrição que pude funcionar em pelo menos uma das células recombinantes da presente invenção. Uma variedade de tais seqüências de controle de transcrição é 3 0 conhecida àqueles hábeis na técnica. Particularmente as seqüências de controle de transcrição preferidas são promotoras ativas em dirigir a transcrição em plantas, constitutivamente ou estágio e/ou específico de tecido, dependendo do uso da planta ou partes dos mesmos. Estes promotores de planta incluem, mas não são limitados a, os promotores mostrando a expressão constitutiva, tal como o promotor 3 5S de Vírus Mosaico de Couve-Flor (CaMV), aqueles para expressão específica de fruta, tal como o promotor de poligalacturonase (PG) do tomate.

As moléculas recombinantes da presente invenção podem

também (a) conter sinais secretórios (isto é, seqüências de ácido nucléico de segmento de sinal) para permitir um polipeptídeo expresso da presente invenção para ser secretado da célula que produz o polipeptídeo e/ou (b)

contém as seqüências de fusão que conduzem à expressão de moléculas de ácido nucléico da presente invenção como proteínas de fusão. Os exemplos de segmentos de sinal apropriados incluem qualquer segmento de sinal capaz de dirigir a secreção de um polipeptídeo da presente invenção.

Os segmentos de sinal preferidos incluem, mas não são limitados a, o peptídeo de sinal de Nicotiana nectarin (US 5.939.288), sinal de extensina de tabaco, o corpo de óleo de oleosina de soja ligando o sinal de proteína. Adicionalmente, uma molécula de ácido nucléico da presente

2 5 invenção pode ser unida a um segmento de fusão que

direciona o polipeptídeo codificado ao proteosoma, tal como um segmento de fusão de ubiquitina. As moléculas recombinantes podem também incluir as seqüências de intervenção e/ou não traduzidas cercando e/ou dentro das

3 0 seqüências de ácido nucléico de moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Células Hospedeiras

Outra modalidade da presente invenção inclui uma célula recombinante compreendendo uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção. A transformação de uma molécula de polinucleotídeo em uma célula pode ser realizada por qualquer método pelo qual uma molécula de polinucleotídeo pode ser inserida na célula. As técnicas de transformação incluem, mas não são limitados a, transfecção, eletroporação, microinjecção, lipofecção, adsorção, e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. As moléculas de polinucleotídeo transformadas da presente invenção podem permanecer extracromossomiais ou podem integrar em um ou mais sítios dentro de um cromossomo da célula transformada (isto é, recombinante) em tal maneira que sua habilidade para ser

expressa é retida. 2 0 As células hospedeiras apropriadas para transformação

incluem qualquer célula que pode ser transformada com um polinucleotídeo da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser endogenamente (isto é, naturalmente) capazes de produzir polipeptídeos da presente invenção ou podem ser capazes de produzir tais polipeptídeos após serem transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína da presente invenção, e incluem células de planta, bacterianas, fúngicas (incluindo levedura), parasitas, e artrópodes. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de planta, artrópode ou levedura. Exemplos não limitantes de células de artrópode incluem células de inseto, tais como células de Spodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, células de Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, e células de Drosófila S2 .

Um exemplo de uma célula bacteriana útil como uma célula hospedeira da presente invenção é Synechococcus spp. (conhecida também como Synechoeystis spp.), por exemplo Synechocoeeus elongatus.

As células podem ser de um organismo apropriado para um processo de fermentação. Como usado aqui, o termo "processo de fermentação" refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo uma etapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação, processos de fermentação usados para produzir álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido citrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico) ; gases (por exemplo, H2 e CO2) ; antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, betacaroteno); e hormônios. Os processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria alcóolica consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínio (por exemplo, produtos de laticínio fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. 3 0 Os processos de fermentação preferidos incluem processos de fermentação alcóolica, como são bem conhecidos na técnica. Os processos de fermentação preferidos são processos de fermentação anaeróbica, como são conhecidos bem na técnica.

As células fermentação apropriadas, tipicamente os

microorganismos podem fermentar, isto é, converter açúcares, tais como glicose ou maltose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos de fermentação de microorganismos incluem organismos fúngicos, tais como levedura. Como usado aqui, "levedura" inclui Saccharomyces spp., Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyees earlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Piehia spp., Hansenula spp., Triehoderma spp., Lipomyees starkey, e Yarrowia lipolytiea. A levedura preferida inclui cepas da Saccharomyees spp., e em particular, Saceharomyces eerevisiae. A levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, Red Star/Lesaffre Ethanol Red (disponível de Red Star/Lesaffre, EUA) FALI (disponível de Fleischmann's Yeast, uma divisão de Burns Philp Food Inc., EUA), SUPERSTART (disponível de Alltech) , GERT STRAND (disponível de Gert Strand AB, Suécia) e FERMI0L (disponível de DSM Specialties).

As tecnologias de DNA recombinantes podem ser usadas para melhorar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo transformada para manipular, por exemplo, o número de cópias da molécula de polinucleotídeo dentro de uma célula hospedeira, eficiência com que essas moléculas de polinucleotídeo são transcritas, a eficiência com que os transcritos resultantes são traduzidos, e a eficiência de modificações pós-traducionais. As técnicas recombinantes úteis para aumentar a expressão de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção incluem, mas não são limitados a, operavelmente ligando moléculas de polinucleotídeo aos plasmídios de elevado número de cópias, integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos de célula hospedeira, adição de seqüências de estabilidade de vetor aos plasmídios, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, melhoradores),

substituições ou modificações de sinais de controle translacionais (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, seqüências Shine-Dalgarno), modificação de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção para corresponder ao uso de códon da célula hospedeira, e a deleção de seqüências que desestabilizam transcritos.

Plantas Transgênicas

O termo "planta" como usado aqui como um substantivo refere-se às plantas inteiras, mas como usado como um adjetivo refere-se a qualquer substância que está presente, obtida de, derivada de, ou relacionada a uma planta, tal como por exemplo, órgãos de planta (por exemplo folhas, hastes, raízes, flores), células únicas (por exemplo, pólen), sementes, células de planta e similares. As plantas fornecidas por ou contempladas para o uso na prática da presente invenção incluem ambas monocotiledônias e dicotiledônias. Em modalidades preferidas, as plantas da presente invenção são plantas de colheita (por exemplo, cereais e leguminosas, milho, trigo, batatas, tapioca, arroz, sorgo, painço, mandioca, cevada, ou ervilha), ou outros legumes. As plantas podem ser cultivadas para a produção de raízes comestíveis, tubérculos, folhas, galhos, flores ou fruta. As plantas podem ser vegetais ou plantas ornamentais. As plantas da invenção podem ser: milho (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa spp.), Iinho (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secele cerale), sorgo (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare) , girassol (Helianthus annus) , trigo (Tritium aestivum) , grão de soja (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum) , amendoim (Araehis hypogaea) , algodão (Gossypium hirsutum) , batata doce (Lopmoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nueifera), abacaxi (Anana eomosus), limoeiro (Citrus spp.), cacau (Theobroma eaeao), chá (Camellia senensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangifer indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anaeardium occidentale), macadâmia (Macadamia intergrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Beta vulsgaris) aveia, ou cevada.

Em uma modalidade preferida, a planta é uma angioesperma.

Em uma modalidade, a planta é uma planta de semente oleaginosa, preferivelmente uma planta de colheita de semente oleaginosa. Como usado aqui, uma "planta de semente oleaginosa" é uma espécie de planta usada para a produção comercial de óleos das sementes da planta. A planta de semente oleaginosa pode ser semente oleaginosa de colza (tal como canola), milho, girassol, grão de soja, sorgo, 3 0 linho (semente de linho) ou beterraba. Além disso, a planta de semente oleaginosa pode ser outras Brassicas, plantas produtoras de algodão, amendoim, papoula, mostarda, grão de ricino, gergelim, açafrão, ou noz. A planta pode produzir níveis elevados de óleo em sua fruta, tal como a azeitona, palma de óleo ou coco. As plantas horticulturais as quais a presente invenção pode ser aplicada são alface, chicória, ou brássicas vegetais incluindo repolho, brócolis, ou couve-flor. A presente invenção pode ser aplicada em tabaco, abóboras, cenoura, morango, tomate, ou pimenta.

Em uma modalidade preferida adicional, a planta não

transgênica usada para produzir uma planta transgênica da invenção que produz óleo, especialmente na semente, que tem menos do que 20%, menos do que 10% ou menos do que 5%, 18:2 de ácidos graxos e/ou que tem menos do que 10% ou menos do

que 5%, 18:3 de ácidos graxos.

As plantas de transgênicas, como definidas no contexto da presente invenção incluem plantas (bem como, partes e células de referidas plantas) e seus descendentes que foram geneticamente modificados usando técnicas recombinantes

2 0 para causar a produção de pelo menos um polipeptídeo da

presente invenção na planta ou órgão de planta desejado. As plantas transgênicas podem ser produzidas usando técnicas conhecidas na técnica, tal como aquelas geralmente descritas em A. Slater e col. , Plant Biotechnology - The

Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), e P. Christou e H. Klee, Handbook of Plant Biotecnology, John Wiley e Sons (2004).

Em uma modalidade preferida, as plantas transgênicas são homozigotas para cada gene que foi introduzido

3 0 (transgene) de modo que seu descendente não segregasse para o fenótipo desejado. As plantas transgênicas podem também ser heterozigotas para o(s) transgene(s) introduzido, tal como, por exemplo, na descendência Fl que foi crescida da semente híbrida. Tais plantas podem fornecer vantagens, tais como vigor híbrido, bem conhecido na técnica.

As plantas transgênicas podem também compreender transgenes adicionais envolvidos na produção de LC-PUFAs tais como, mas não limitados a, uma desnaturase Δ6, uma elongase Δ9, uma desnaturase Δ8, uma elongase Δ6, uma desnaturase Δ5 com atividade em um substrato de 20:3, uma ômega-desnaturase, uma elongase Δ9, uma desnaturase Δ4, uma elongase Δ7 e/ou membros da via sintase de policetídeo. Exemplos de tais enzimas são conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos no WO 05/103253 (veja, por exemplo, a Tabela 1 do WO 05/103253).

Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso constitutivamente nas plantas transgênicas durante todos os estágios de desenvolvimento. Dependendo do uso da planta ou órgãos de planta, os polipeptídeos podem ser expressos em uma maneira estágio específica. Além disso, os polinucleotídeos podem ser expressos especificamente em tecido.

As seqüências regulatórias que são conhecidas ou descobertas por causar a expressão de um gene codificando um polipeptídeo de interesse em plantas podem ser usadas na presente invenção. A escolha das seqüências regulatórias usadas depende da planta alvo e/ou órgão alvo de interesse. Tais seqüências regulatórias podem ser obtidas das plantas ou vírus de planta, ou podem ser quimicamente sintetizadas. 3 0 Tais seqüências regulatórias são bem conhecidas àqueles hábeis na técnica.

Vários vetores apropriados para a transfecção estável de células de planta ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos em, por exemplo, Pouwels e col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; e Gelvin e col., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores de expressão de planta incluem, por exemplo, um ou mais genes de planta clonados sob o controle transcricional de seqüências regulatórias 5' e 3' e um marcador dominante selecionável. Tais vetores de expressão de planta podem também conter uma região regulatória promotora (por exemplo, uma região regulatória de controle indutível ou constitutiva, regulada ambientalmente ou desenvolvedora, ou expressão de célula ou tecido específica) , um sítio de começo de iniciação de transcrição, um sítio de ligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um sítio de terminação de 2 0 transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.

Vários promotores constitutivos que são ativos em células de planta foram descritos. Promotores apropriados para a expressão constitutiva em plantas inclui, mas não são limitados a, promotor 3 5S de vírus mosaico de couve- flor (CaMV), 35S de vírus mosaico de Escrofulária (FMV), o promotor de vírus de baciliforme da cana-de-açúcar, o promotor de vírus de matiz amarela de commelina, promotor indutível de luz da subunidade pequena da carboxilase ribulose-l,5-bis-fosfato, o promotor de isomerase triosefosfato citosólica de arroz, promotor fosforibosiltransferase de adenina de Arabidopsis, o promotor de gene 1 de actina de arroz, os promotores de sintase de manopina e sintase de octopina, o promotor de Adh, o promotor de sintase de sacarose, o promotor de complexo de gene R, e o promotor de gene de proteína de ligação a/p de clorofila. Estes promotores foram usados para criar vetores de DNA que foram expressos em plantas; veja, por exemplo, a publicação PCT WO 8402913. Todos estes promotores foram usados para criar vários tipos de vetores de DNA recombinante expressiveis em planta.

Com a finalidade de expressão em tecidos de fonte da planta, tais como a folha, semente, raiz ou galho, prefere- se que os promotores utilizados na presente invenção tenham a expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Para esta finalidade, um pode escolher de vários de promotores para genes com expressão de tecido ou célula específica ou melhorada. Exemplos de tais promotores relatados na literatura incluem o promotor GS2 sintetase de glutamina de cloroplasto de ervilha, o promotor de frutose- 1,6-bifosfatase de cloroplasto do trigo, o promotor ST-LSl fotosintético nuclear da batata, o promotor de quinase de serina/treonina e o promotor de glucoamilase (CHS) da Arabidopsis thaliana. Também relatados por serem ativos em tecidos fotosinteticamente ativos estão o promotor de carboxilase 5-bisfosfato do larício oriental (Larix laricina) , o promotor para o gene Cab, Cab6, da pinha, o promotor para o gene Cab-I do trigo, o promotor para o gene Cab-I do espinafre, o promotor para o gene Cab IR do arroz, o piruvato, promotor de diquinase ortofosfato (PPDK) de Zea 3 0 mays, o promotor para o gene Lhcbl*2 de tabaco, o promotor simporte de Suc2 sacarose-H30 de Arabidopsis thaliana, e o promotor para os genes de proteína de membrana tilacóide do espinafre (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS).

Outros promotores para as proteínas de ligação α/β de

clorofila podem também ser utilizadas na presente invenção, tal como os promotores para o gene LhcB e gene PsbP da mostarda branca (Sinapis alba) . Uma variedade de promotores de gene de planta que são regulados em resposta aos sinais ambientais, hormonais, químicos, e/ou de desenvolvimento, podem também ser usados para a expressão de genes de proteína de ligação de RNA em células de planta, incluindo os promotores regulados por (1) calor, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A de ervilha, promotor RbcS de milho); (3) hormônios, tais como ácido abscísico, (4) ferimento (por exemplo, Wunl); ou (5) produtos químicos, tais como jasminato de metila, ácido salicílico, hormônios esteróides, álcool, Safeners (WO 9706269), ou podem também ser vantajosos para empregar (6) promotores órgão específicos.

Com a finalidade de expressão em tecidos reservatórios da planta, tais como o tubérculo de planta de batata, a fruta de tomate, ou a semente de grão de soja, canola, algodão, Zea mays, trigo, arroz, e cevada, prefere-se que os promotores utilizados na presente invenção tenham a expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Vários promotores para genes com expressão de tubérculo específica ou melhorada são conhecidos, incluindo o promotor de patatina classe I, o promotor para os genes 3 0 ADPGPP de tubérculo de batata, ambas subunidades grandes e pequenas, o promotor de sintase de sacarose, o promotor para as proteínas principais de tubérculo incluindo complexos de proteína de 22 kD e inibidores de proteinase, o promotor para o gene de sintase de amido ligado a grânulo (GBSS), e outros promotores de patatinas classe I e II. Outros promotores podem também ser usados para expressar uma proteína em tecidos específicos, tais como sementes ou frutas. 0 promotor para β-conglicinina ou outros promotores específicos de semente, tais como os promotores de napina e faseolina, podem ser usados. Um promotor particularmente preferido para a expressão de endoesperma de Zea mays é o promotor para o gene de glutelina do arroz, mais particularmente o promotor Osgt-I. Exemplos de promotores apropriados para a expressão em trigo incluem aqueles promotores para as subunidades de pirosintase ADPglicose (ADPGPP), o grânulo ligado e outra sintase de amido, as enzimas de ramificação e desramificação, as proteínas abundantes de embriogênese, as gliadinas, e as gluteninas. Exemplos de tais promotores em arroz incluem aqueles

2 0 promotores para as subunidades ADPGPP, o grânulo ligado e a

outra sintase de amido, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sintases de sacarose, e as glutelinas. Um promotor particularmente preferido é o promotor para glutelina de arroz, gene Osgt-I. Exemplos de tais promotores para cevada incluem aqueles para as subunidades ADPGPP, o grânulo ligado e outra sintase de amido, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sintases de sacarose, as hordeinas, as globulinas de embrião, e as proteínas específicas de

3 0 aleurona. Os promotores específicos de raiz podem também ser usados. Um exemplo de tal promotor é o promotor para o gene de quitinase ácida. A expressão em tecido de raiz poderia também ser realizada utilizando os subdomínios específicos de raiz do promotor 35S de CaMV que foi identificado.

Em uma modalidade particularmente preferida, o promotor direciona a expressão em tecidos e órgãos em que a biossíntese de ácido graxo e óleo ocorre, particularmente em células de semente, tais como células de endoesperma e células do embrião em desenvolvimento. Os promotores que são apropriados são o promotor de gene de napina de colza de semente oleaginosa (US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baumlein e col., 1991), o promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor de Brassica Bce4 (WO 91/13980) ou o promotor de legumin B4 (Baumlein e col., 1992), e promotores que conduzem à expressão específica de semente em monocotiledônias tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e similares. Os promotores

2 0 notáveis que são apropriados são a cevada lpt2 ou promotor

de gene de Iptl (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, o gene de glutelina de arroz, o gene de orizina de arroz, o gene de prolamina de arroz, o gene de gliadina de trigo, o gene de glutelina de trigo, o gene de zeína de milho, o gene de glutelina de aveia, o gene de carisina de sorgo, o gene de secalina de centeio) . Outros promotores incluem aqueles descritos por Broun e col.

(1998) e US 20030159173.

3 0 A seqüência líder 5' não traduzida pode ser derivada do promotor selecionado para expressar a seqüência de gene heterólogo do polinucleotídeo da presente invenção, e pode ser especificamente modificada se desejado para aumentar a tradução de mRNA. Para uma revisão de otimização de expressão de transgenes, veja Koziel e col. (1996) . As regiões 5' não traduzidas podem também ser obtidas dos RNAs virais de planta (vírus do mosaico do Tabaco, vírus de enxerto do Tabaco, vírus do mosaico do Milho anão, vírus do mosaico da Alfalfa, entre outros) dos genes eucarióticos apropriados, genes de planta (líder de gene de proteína de ligação a/b de clorofila de trigo e milho) , ou de uma seqüência de gene sintética. A presente invenção não é limitada às construções em que a região não traduzida é derivada da seqüência 5' não traduzida que acompanha a seqüência promotora. A seqüência líder poderia também ser derivada de uma seqüência promotora ou de codificação não relacionada. As seqüências líderes úteis no contexto da presente invenção compreendem o líder Hsp7 0 de milho (US 5.362.865 e US 5.859.347), e o elemento TMV ômega. A terminação de transcrição é realizada por uma

seqüência 3' de DNA não traduzida ligada operavelmente no vetor quimérico ao polinucleotídeo de interesse. A região 3' não traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' do RNA. A região 3' não traduzida pode ser obtida dos vários genes que são expressos em células de planta. A região não traduzida 3' de sintase de nopaline, a região não traduzida 3' do gene Rubisco de subunidade pequena de ervilha, a região não traduzida 3' do gene de proteína de armazenamento de semente 7S de grão de soja são geralmente usadas nesta capacidade. As regiões não traduzidas, 3' transcritas contendo o sinal poliadenilado de genes de plasmídio indutor de tumor (Ti) Agrobacterium são também apropriados.

Quatro métodos gerais para a liberação direta de um gene em células foram descritos: (1) métodos químicos (Graham e col., 1973); (2) métodos físicos, tais como microinjeção (Capecchi, 1980); eletroporação (veja, por exemplo, WO 87/06614, US 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 e WO 93/21335); e inj etor de gene (veja, por exemplo, US 4.945.050 e US 5.141.131); (3) vetores virais (Clapp, 1993; Lu e col., 1993; Eglitis e col., 1988); e (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel e col., 1992; Wagner e col, 1992) .

Os métodos de aceleração que podem ser usados incluem, por exemplo, o bombardeamento de microprojétil e similares. Um exemplo de um método para liberação moléculas de ácido nucléico em transformação às células de planta é bombardeamento de microprojétil. Este método foi revisto por Yang e col., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994) . As partículas não biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidas com ácidos nucléicos e serem liberadas em células por uma força propelente. As partículas de exemplo incluem aquelas compreendidas de tungstênio, ouro, platina, e similares. Uma vantagem particular de bombardeamento de microprojétil, adicionalmente ao ser um meio eficaz de reprodutivelmente transformar monocotiledônias, é que nem a 3 0 isolamento de protoplastos, nem a suscetibilidade de infecção de Agrobacterium são requeridas. Uma modalidade ilustrativa de um método para liberação de DNA em células de Zea mays por aceleração é um sistema de liberação de a- partícula biolístico, que pode ser usado para propelir as partículas revestidas com DNA através de uma tela, tal como um aço inoxidável ou tela de Nytex, em uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Um sistema de liberação de partícula apropriado para o uso com a presente invenção é o injetor PDS-1000/He de aceleração de hélio disponível de Bio-Rad Laboratories.

Para o bombardeamento, as células em suspensão podem ser concentradas em filtros. Os filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de microprojétil. Se desejado, uma ou mais telas são também posicionadas entre o injetor e as células a serem bombardeadas.

Alternativamente, os embriões imaturos ou outras células alvo podem ser arranjados em meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de microprojétil. Se desejado, uma ou mais telas são também posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através do uso de técnicas determinadas aqui um pode obter até 1000 ou mais focos de células transientemente expressando um gene marcador. 0 número das células em um foco que expressa o produto de gene exógeno 4 8 horas após bombardeamento freqüentemente varia de uma a dez e na média de uma a três.

Na transformação de bombardeamento, um pode otimizar 3 0 as condições de cultivo de pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para render os números máximos de transformantes estáveis. Ambos parâmetros físicos e biológicos para o bombardeamento são importantes nesta tecnologia. Os fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do precipitado de DNA/microprojétil ou aqueles que afetam o voo e velocidade de macro- ou microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente após o bombardeamento, o ajuste osmótico de células alvo para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeamento, e também a natureza da transformação de DNA, tal como DNA linearizado ou plasmídios superespiralados intactos. Acredita-se que as manipulações de pré-bombardeamento são especialmente importantes para a transformação bem sucedida de embriões imaturos.

Em outra modalidade alternativa, os plastídeos podem ser estavelmente transformados. Os métodos divulgados para a transformação de plastídeo em plantas superiores incluem a liberação de injetor de partícula de DNA contendo um marcador e alvos selecionáveis do DNA ao genome de plastídeo através de recombinação homóloga (US 5.451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US. 5.932479, e WO 99/05265).

Consequentemente, contempla-se que um pode desejar ajustar vários aspectos dos parâmetros de bombardeamento em estudos de escala pequena para inteiramente otimizar as condições. Um pode particularmente desejar ajustar parâmetros físicos tais como distância de gap, distância de voo, distância de tecido, e pressão de hélio. Um pode também minimizar os fatores de redução de trauma modificando as condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que podem portanto influenciar eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação de tecido e o estágio de subcultura ou ciclo de célula das células receptoras podem ser ajustados para a transformação ótima. A execução de outros ajustes rotineiros será conhecida àqueles de habilidade na técnica à luz da presente divulgação.

A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema aplicável extensamente para introduzir genes em células de planta, pois o DNA pode ser introduzido em tecidos de planta inteiros, desse modo contornando a necessidade para a regeneração de uma planta intacta de um protoplasto. 0 uso de vetores integrando planta mediada por Agrobacterium para introduzir o DNA em células de planta é bem conhecido na técnica (veja, por exemplo, US 5.177.010, US 5.104.310, US 5.004.863, US 5.159.135). Além disso, a integração do T- DNA é um processo relativamente preciso resultando em poucos rearranjos. A região de DNA a ser transferida é 2 0 definida pelas seqüências de borda, e o DNA de intervenção é introduzido geralmente no genome de planta.

Os vetores de transformação de Agrobacterium modernos são capazes de replicação em E. coli bem como Agrobacterium, permitindo manipulações convenientes como descrito (Klee e col., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn e Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985). Além disso, os avanços tecnológicos em vetores para transferência de gene mediada por Agrobacterium melhoraram o arranjo de genes e sítios de restrição nos vetores para facilitar a construção de vetores capazes de expressar vários genes de codificação de polipeptideo. Os vetores descritos tem regiões de multi-ligante convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para a expressão direta de genes de codificação de polipeptideo inseridos e são apropriados para as finalidades presentes. Além disso, o Agrobacterium contendo ambso genes Ti armados e desarmados pode ser usado para as transformações. Nessas variedades de planta onde a transformação mediada por Agrobacterium é eficiente, é o método de escolha por causa da natureza fácil e definida da transferência de gene.

Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação de Agrohacterium tipicamente contém um único locus genético em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo hemizigóticas para o gene adicionado. Mais preferido é uma planta transgênica que é homozigota para o gene adicionado; isto é, uma planta transgênica que contenha dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida combinando sexualmente (autofecundação) uma planta transgênica segregante independente que contenha um único gene adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultes para o gene de interesse. 2 5 Deve também ser compreendido que duas plantas

transgênicas diferentes podem também ser acopladas para produzir descendentes contendo dois genes exógenos independentemente segregantes. A autofecundação de descendentes apropriada pode produzir as plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos. O retro cruzamento a uma planta progenitora e cruzamento externo com uma planta não transgênico são também contemplados, como é a propagação vegetativa. As descrições de outros métodos de reprodução que são geralmente usados para traços e colheitas diferentes podem ser descobertos em Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed. , American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987) .

A transformação de protoplastos de planta pode ser conseguida usando métodos baseados na precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com polietileno glicol, eletroporação, e combinações destes tratamentos. A aplicação destes sistemas às variedades de planta diferentes depende da habilidade de regenerar essa cepa de planta particular dos protoplastos. Os métodos ilustrativos para a regeneração de cereais dos protoplastos são descritos (Fujimura e col, 1985; Toriyama e col, 1986; Abdullah e col., 1986).

Outros métodos de transformação de célula podem também ser usados e incluídos, mas não são limitados à introdução de DNA em plantas por transferência direta de DNA no pólen, pela injeção direta de DNA em órgãos reprodutivos de uma planta, ou pela injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos seguida pela rehidratação de embriões dessecados.

A regeneração, desenvolvimento, e cultivo de plantas

dos únicos transformantes de protoplasto de planta ou vários explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e col., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Califórnia, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas, cultivo daquelas células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embriônico através de estágio de plântula enraizada. Os embriões e sementes transgênicos são regenerados similarmente. Os ramos enraizados transgênicos resultantes são em seguida plantados em um meio apropriado de crescimento de planta, tal como solo.

0 desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene extrangeiro, exógeno é bem conhecido na técnica. Preferivelmente, as plantas regeneradas são auto polinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Por outro lado, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas com semente de linhagens agronomicamente importantes. Inversamente, o pólen das plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar as plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um ácido nucléico exógeno desejado é cultivada usando os métodos bem conhecidos a um hábil na técnica.

Os métodos para transformar dicotiledônias, primeiramente pelo uso de Agrobacterium tumefaciens, e obtenção de plantas transgênicas foram publicados para algodão (US 5.004.863, US 5.159.135, US 5.518.908); grão de soja (US 5.569.834, US 5.416.011); Brassica (US 5.463.174); amendoim (Cheng e col., 1996); e ervilha (Grant e col., 1995) .

Os métodos para a transformação de plantas de cereal, tais como trigo e cevada para introduzir a variação 3 0 genética na planta pela introdução de um ácido nucléico exógeno e para a regeneração de plantas dos protoplastos ou embriões de planta imaturos são bem conhecidos na técnica, veja por exemplo, 0 Pedido de Patente Canadense N0 2.092.588, Pedido de Patente Australiano N° 61781/94, Patente Australiana N0 667939, Patente US N0 6.100.447, Pedido de Patente Internacional PCT/US97/10621, Patente US N0 5.589.617, Patente US N0 6.541.257, e outros métodos são estabelecidos no relatório descritivo da Patente W099/14314. Preferivelmente, as plantas de trigo ou cevada transgênicas são produzidas por procedimentos de transformação mediados por Agrobacterium tumefaciens. Os vetores carregando a construção de ácido nucléico desejada podem ser introduzidos em células de trigo regeneráveis de plantas ou explantados cultivados de tecido, ou sistemas de planta apropriados, tal como protoplastos.

As células de trigo regeneráveis são preferivelmente do escutelo de embriões imaturos, embriões maduros, calo derivado destes, ou o tecido meristemático.

Para confirmar a presença dos transgenes em células e plantas transgênicas, uma análise de amplificação de reação de cadeia polimerase (PCR) ou Southern blot pode ser realizado usando métodos conhecidos àqueles hábeis na técnica. Os produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados em qualquer de uma variedade de maneiras, dependendo da natureza do produto, e incluem o ensaio de enzima e Western blot. Uma maneira particularmente útil para quantificar a expressão de proteina e detectar a replicação em tecidos de planta diferentes é usar um gene repórter, tal como GUS. Uma vez que as plantas transgênicas foram obtidas, podem ser crescidas para produzir os tecidos ou partes de planta tendo o fenótipo desejado. O tecido de planta ou partes de planta, podem ser colhidos, e/ou a semente coletada. A semente pode servir como uma fonte para o crescimento de plantas adicionais com tecidos ou partes tendo as características desejadas.

Animais Não Humanos Transgênicos

Um "animal não humano transgênico" refere-se a um animal, à exceção de um humano, que contenha uma construção de gene ("transgene") não descoberta em um animal do tipo selvagem da mesma espécie ou raça. Um "transgene" como referido aqui tem o significado normal na técnica de biotecnologia e inclui uma seqüência genética que tenha sido produzida ou alterada pela tecnologia de DNA ou RNA recombinante e que tenha sido introduzida em uma célula animal. 0 transgene pode incluir as seqüências genéticas derivadas de uma célula animal. Tipicamente, o transgene foi introduzido no animal pela manipulação humana como, por exemplo, pela transformação, mas qualquer método pode ser usado como um de habilidade na técnica reconhece. As técnicas para produzir animais transgênicos são bem

conhecidas na técnica. Um livro texto geral útil neste assunto é Houdebine, Transgenic Animais - Generation and Use (Harwood Academic, 19 97).

0 DNA heterólogo pode ser introduzido, por exemplo, na ova de mamífero fertilizada. Por exemplo, as células tronco totipotente ou pluripotente podem ser transformadas por microinjeção, precipitação mediada por fosfato de cálcio, fusão de lipossoma, infecção retroviral ou outros meios, as células transformadas são então introduzidas no embrião, e 3 0 o embrião então desenvolve-se em um animal transgênico. Em um método altamente preferido, os embriões em desenvolvimento são infectados com um retrovirus contendo o DNA desejado, e os animais transgênicos produzidos do embrião infectado. Em um método mais preferido, entretanto, os DNAs apropriados são coinjetados no pró-núcleo ou citoplasma de embriões, preferivelmente no único estágio de célula, e os embriões permitidos desenvolverem-se em animais transgênicos maduros.

Outro método usado produzir um animal transgênico envolve a microinjeção de um ácido nucléico em ovos de estágio pró-nuclear por métodos padrões. Os ovos injetados são então cultivados antes da transferência nos ovidutos de receptores pseudográvidos.

Os animais transgênicos podem também ser produzidos porpela tecnologia de transferência nuclear. Usando este método, os fibroblasts dos animais doadores são transfectados estavelmente com um plasmídio incorporando as seqüências de codificação para um domínio de ligação ou parceiro de ligação de interesse sob o controle de seqüências regulatórias. Os transfectants estáveis são então fundidos a oócitos anucleados, cultivados e transferidos em receptores fêmeas.

Alimentos

A presente invenção inclui as composições que podem ser usadas como alimentos. Para finalidades da presente invenção, "alimentos" incluem qualquer alimento ou preparação para o consumo humano ou animal (incluindo para o consumo enteral e/ou parenteral) que quando colocados no corpo (a) servem para nutrir ou construir tecidos ou fornecer energia; e/ou (b) manter, restaurar ou suportar status nutricional ou função metabólico adequados. Os alimentos da invenção incluem composições nutritivas para bebês e/ou crianças novas.

Os alimentos da invenção compreendem, por exemplo, uma célula da invenção, uma planta da invenção, a parte de planta da invenção, a semente da invenção, um extrato da invenção, o produto do método da invenção, o produto do processo de fermentação da invenção, ou uma composição junto com um carreador (es) apropriado (s) . 0 termo "carreador" é usado em seu sentido mais amplo para abranger qualquer componente que possa ou não possa ter valor nutricional. Como o hábil apreciará, o carreador deve ser apropriado para uso (ou usado em uma concentração suficientemente baixa) em um alimento tal que não tenha o efeito deletério em um organismo que consuma o alimento.

0 alimento da presente invenção compreende um óleo, éster de ácido graxo, ou ácido graxo produzido diretamente ou indiretamente pelo uso dos métodos, células ou plantas divulgadas aqui. A composição pode estar em uma forma sólida ou líquida. Adicionalmente, a composição pode incluir macronutrientes, vitaminas, e/ou minerais comestíveis em quantidades desejadas para um uso particular. As quantidades destes ingredientes variarão dependendo se a composição é pretendida para o uso com

2 5 indivíduos normais ou para o uso com os indivíduos tendo

necessidades especializadas, tais como os indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e similares.

Exemplos de carreadores apropriados com valor nutricional incluem, mas não são limitados a,

3 0 macronutrientes tais como gorduras, carboidratos e proteínas comestíveis. Exemplos de tais gorduras comestíveis incluem, mas não são limitados a, óleo de coco, óleo de borragem, óleo fúngico, óleo corrente preto, óleo de soja, e mono- e diglicerídeos. Exemplos de tais carboidratos incluem (mas não são limitados a) : glicose, lactose comestível, e busca hidrolizada. Adicionalmente, exemplos de proteínas que podem ser utilizadas na composição nutricional da invenção incluem (mas não são limitados a) proteínas de soja, soro de leite eletrodializado, leite desnatado eletrodializado, soro de leite, ou hidrolisados destas proteínas.

Com respeito às vitaminas e minerais, o seguinte pode ser adicionado às composições de alimento da presente invenção: cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo, e vitaminas A, E, D, C, e o complexo B. Outras tais vitaminas e minerais podem também ser adicionadas.

Os componentes utilizados nas composições de alimento da presente invenção podem ser de origem semi-purifiçada ou purificada. Por semi-purifiçada ou purificada é significado um material que seja preparado por purificação de um material natural ou por síntese de novo.

Uma composição de alimento da presente invenção pode também ser adicionada ao alimento mesmo quando a 2 5 suplementação da dieta não é requerida. Por exemplo, a composição pode ser adicionada ao alimento de qualquer tipo, incluindo (mas não limitado a) : margarina, manteiga modificada, queijos, leite, yogurte, chocolate, doce, lanches, óleos de salada, óleos de cozinha, gorduras de cozinha, carnes, peixes e bebidas. O gênero Saccharomyces spp é usado na fabricação de cerveja e vinho e também como um agente no cozimento, particularmente de pão. A levedura é um constituinte principal de extratos vegetais. A levedura é também usada como um aditivo na alimentação animal. Será aparente que as cepas de levedura geneticamente projetadas podem ser fornecidas que são adaptadas para sintetizar LC-PUFA como descrito aqui. Estas cepas de levedura podem então ser usadas em alimentos e na fabricação de vinho e cerveja para fornecer os produtos que melhoraram o teor ácido graxo.

Adicionalmente, os ácidos graxos produzidos de acordo com a presente invenção ou células hospedeira transformadas para conter e expressar os genes em questão podem também ser usados como suplementos de alimento animal para alterar um tecido animal ou composição de ácido graxo de leite a um mais desejável para o consumo humano ou animal. Exemplos de tais animais incluem carneiros, gado, cavalos e similares.

Além disso, os alimentos da invenção podem ser usados na aquacultura para aumentar os níveis de ácidos graxos em peixes para o consumo humano ou animal.

Composições

A presente invenção abrange também composições, particularmente composições farmacêuticas, compreendendo um ou mais dos ácidos graxos e/ou óleos resultantes produzidos usando os métodos da invenção.

Uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos ácidos graxos e/ou óleos, em combinação com um carreador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável, bem conhecido, não tóxico, padrão, tal como solução salina tamponada de fosfato, água, etanol, polióis, óleos vegetais, um agente de molhabilidade ou uma emulsão, tal como uma emulsão água/óleo. A composição pode estar em uma forma líquida ou sólida. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um comprimido, cápsula, líquido ou pó ingerível, injetável, ou pasta ou creme tópico. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, e similares. Além de tais diluentes inertes, a composição pode também incluir os adjuvantes, tais como agentes de molhabilidade, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes edulcorantes, agentes flavorizantes e agentes perfumantes. As suspensões, além dos compostos ativos, podem

compreender agentes de suspensão, tais como álcoois isostearil etoxilado, ésteres de sorbitol e sorbitan polioxietileno, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar, e tragacanto ou misturas destas substâncias.

As formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas podem ser preparadas usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos graxos produzidos de acordo com a presente invenção podem ser comprimidos com bases de comprimido convencionais, tais como lactose, sacarose, e amido de milho em combinação com ligantes, tais como acácia, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes, tais como amido de batata ou ácido algínico, e um lubrificante, tal como ácido esteárico ou 3 0 estearato de magnésio. As cápsulas podem ser preparadas incorporando estes excipientes em uma cápsula de gelatina junto com antioxidantes e ácido(s) graxo(s) relevante(s).

Para a administração intravenosa, os ácidos graxos produzidos de acordo com a presente invenção ou derivados dos mesmos podem ser incorporados em formulaçãos comerciais.

Uma dosage típico de um ácido graxo particular é de 0,1 mg a 20 g, tomados de uma a cinco vezes por dia (até 100 g diariamente) e está preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1, 2, 5, ou 10 g diariamente (tomado em uma ou múltiplas doses). Como conhecido na técnica, um mínimo de aproximadamente 300 mg/dia de ácido graxo, especialmente LC-PUFA, é desejável. Entretanto, será apreciado que qualquer quantidade de ácido graxo será benéfica ao indivíduo.

As rotas de administração possíveis das composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, enteral (por exemplo, oral e retal) e parenteral. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada oralmente ou retalmente. Adicionalmente, uma mistura homogênea pode ser completamente dispersada em água, misturada sob condições estéreis com diluentes, conservantes, tampões ou propelentes fisiologicamente aceitáveis para formar um spray ou inalante. A dosagem da composição a ser administrada ao paciente

pode ser determinada por uma de habilidade ordinária na técnica e depende de vários fatores, tais como peso do paciente, idade do paciente, saúde total do paciente, histórico do paciente, status imune do pacientes, etc. Adicionalmente, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para finalidades cosméticas. Pode ser adicionada às composições cosméticas pré-existentes, tal que uma mistura é formada ou um ácido graxo produzido de acordo com a invenção desejada pode ser usado como único ingrediente "ativo" em uma composição cosmética.

Produção de óleos

As técnicas que são praticadas rotineiramente na técnica podem ser usadas para extrair, processar, e analisar os óleos produzidos por células, plantas, sementes, etc. da invenção instantânea. Tipicamente, as sementes de planta são cozidas, prensadas, e extraídas para produzir o óleo bruto, que é então desgomado, refinado, descorado, e deodorizado. Geralmente, as técnicas para esmagar a semente são conhecidas na técnica. Por exemplo, as sementes oleaginosas podem ser temperadas pulverizando- as com água para levantar o teor de umidade para, por exemplo, 8,5%, e esmagadas usando um rolo liso com um ajuste de espaço de 0,23 a 0,27 mm. Dependendo do tipo de semente, a água não pode ser adicionada antes de esmagar. A aplicação de calor desativa as enzimas, facilita ruptura adicional de célula, coalesce as gotas de óleo, e aglomera as partículas de proteína, que facilitam o processo de extração.

A maioria do óleo de semente é liberada pela passagem através de uma prensa de parafuso. Os bolos expelidos da prensa de parafuso são então extraídos por solvente, por exemplo, com hexano, usando uma coluna seguida de calor. Alternativamente, o óleo cru produzido pela operação de prensa pode ser passado através de um tanque de sedimentação com uma drenagem superior de fio ranhurada para remover os sólidos que são expressos com o óleo durante a operação de prensa. 0 óleo clarificado pode ser passado através de uma placa e um filtro de estrutura para remover quaisquer partículas sólidas finas restantes. Se desejado, o óleo recuperado do processo de extração pode ser combinado com o óleo clarificado para produzir um óleo cru misturado.

Uma vez que o solvente é retirado do óleo cru, as porções prensadas e extraídas são combinadas e submetidas aos procedimentos de processamento de óleo normais (isto é, desgomagem, refinamento cáustico, descoramento, e deodorização). A desgomagem pode ser realizada pela adição de ácido fosfórico concentrado ao óleo cru para converter fosfatidas não hidratáveis a uma forma hidratável, e para quelar metais menores que estão presentes. O goma é separada do óleo por centrif ugação. 0 óleo pode ser refinado pela adição de uma quantidade suficiente de uma solução de hidróxido de sódio para titular todos os ácidos graxos e remover os sabões assim formados. A deodorização pode ser realizada aquecendo o óleo a

260 0C sob vácuo, e lentamente inserindo vapor no óleo em uma taxa de aproximadamente 0,1 ml/minuto/100 ml de óleo. Após aproximadamente 3 0 minutos de lavagem, o óleo é permitido resfriar sob vácuo. O óleo é tipicamente transferido a um recipiente de vidro e limpado com argônio antes de ser armazenado sob refrigeração. Se a quantidade de óleo é limitada, o óleo pode ser colocado sob vácuo, por exemplo, em um reator de Parr e aquecido a 2600C para o mesmo comprimento de tempo que teria sido deodorizado. Este 3 0 tratamento melhora a cor do óleo e remove uma maioria das substâncias voláteis.

Anticorpos

A invenção fornece também anticorpos monoclonais ou policolonais aos polipeptídeos da invenção ou fragmentos dos mesmos. Assim, a presente invenção ainda fornece um processo para a produção de anticorpos monoclonais ou policolonais aos polipeptídeos da invenção.

O termo "se liga especificamente" refere-se à habilidade do anticorpo se ligar às proteínas da presente invenção, mas não aos outros polipeptídeos de desnaturase, conjugase, epoxidase e/ou hidroxilase conhecidos.

Como usado aqui, o termo "epítopo" refere-se a uma região de um polipeptídeo da invenção que é ligado pelo anticorpo. Um epítopo pode ser administrado a um animal para gerar anticorpos contra o epítopo, entretanto, os anticorpos da presente da invenção preferivelmente se ligam especificamente à região de epítopo no contexto do polipeptídeo inteiro.

Se os anticorpos policolonais são desejados, um mamífero selecionado (por exemplo, rato, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipeptídeo imunogênico, tal como aqueles fornecidos com a ID. de SEQ. N°: 16 a 30, 73 a 78, 80 e 134. 0 soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se o soro contendo anticorpos policolonais contiver anticorpos a outros antígenos, os anticorpos policolonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. As técnicas para produzir e processar antisoros policolonais são conhecidas na técnica. A fim de que tais anticorpos 3 0 possam ser feitos, a invenção também fornece peptídeos da invenção ou fragmentos haptenizados dos mesmos a outro peptídeo para uso como imunogenes em animais.

Os anticorpos monoclonais direcionados contra os polipeptídeos da invenção podem também prontamente ser produzidos por um hábil na técnica. A metodologia geral para fazer anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. As linhagens de célula produtoras de anticorpo immortais podem ser criadas pela fusão de célula, e também por outras técnicas tais como a transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com o vírus de Epstein-Barr. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos podem ser selecionados por várias propriedades; isto é, para a afinidade de isotipo e epítopo.

Uma técnica alternativa envolve a seleção das bibliotecas de exposição de fago onde, por exemplo, o fago expressa fragmentos scFv na superfície de seu revestimento com uma variedade grande de complementariedade que determina as regiões (CDRs). Esta técnica é bem conhecida na técnica.

Para as finalidades desta invenção, o termo

"anticorpo", a menos que especificado ao contrário, inclui fragmentos de anticorpos inteiros que retém sua atividade de ligação para um antígeno de alvo. Tais fragmentos incluem os fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2# bem como os anticorpos de cadeia simples (scFv). Além disso, os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser anticorpos humanizados, porque exemplo como descritos em EP-A-23 94 00.

Os anticorpos da invenção podem ser ligados a um suporte sólido e/ou empacotados em kits em um recipiente 3 0 apropriado junto com reagentes, controles, instruções apropriados e similares.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção são marcados detectavelmente. Os marcadores detectáveis de exemplo que permitem a medida direta de ligação de anticorpo incluem radiomarcadores, fluorofóros, tinturas, grânulos magnéticos, quimioluminecedores, partículas coloidais, e similares. Os exemplos de marcadores que permitem a medida indireta de ligação incluem as enzimas onde o substrato pode fornecer para um produto colorido ou fluorescente. Os marcadores detectáveis de exemplo adicionais incluem as enzimas covalentemente ligadas capazes de fornecer um sinal detectável de produto após a adição de substrato apropriado. Os exemplos de enzimas apropriadas para o uso em conjugados incluem a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, dehidrogenase de malato e similares. Onde não comercialmente disponíveis, tais conjugados de anticorpo-enzima são prontamente produzidos por técnicas conhecidas àqueles hábeis na técnica. Marcadores detectáveis de exemplo adicionais incluem a biotina, que liga com afinidade elevada à avidina ou estreptavidina; fluorocromos (por exemplo,

ficobiliproteínas, ficoeritrina e aloficocianinas; fluoresceína e vermelho de Texas), que podem ser usados com um classificador de célula ativado de fluorescência; haptenos; e similares. Preferivelmente, o marcador detectável permite a medida direta em um luminômetro de placa, por exemplo, biotina. Tais anticorpos marcadordos podem ser usados nas técnicas conhecidas na técnica para detectar polipeptídeos da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Identificação de desnaturases no genoma de Tribolium castaneum

As 64 seqüências de proteína de desnaturase de inseto de compromento total publicadas disponíveis no fim de 2005 foram alinhadas usando o programa Clustal X (Thompson e col., 1997). Deste alinhamento de seqüência, uma seqüência de peptídeo altamente conservada foi selecionada (HNYHHAYPWDYKAAEIGMPLNSTAS LIRLCASLGWAYDLKSV (ID. de SEQ. N° : 31) ) e usada para procurarar o genoma de Tribolium castaneum usando o programa de TBLASTN (Altschul e col., 1997) . Desta análise, 15 seqüências como desnaturase foram identificadas que foram denominadas, Tribdesatl (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N0:1, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°: 16), Tribdesat2a (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N°:2, seqüência de aminoácido fornecida como o ID. de SEQ. N° : 17), Tribdesat2b (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N0:3, seqüência de aminoácido fornecida como o ID. de SEQ. N°: 18), Tribdesat2c (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. Nc :4, seqüência de aminoácido fornecida como o ID. de SEQ. N° : 19) , Tribdesat3 (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N°:5, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:20), Tribdesat4 (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 6, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:21), Tribdesat5 (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 7, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°: 22), Tribdesat6a (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N0:8, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:23), Tribdesat6b (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N°:9, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:24), Tribdesat7a (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 10, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:25), Tribdesat7b (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 11, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N0:26), Tribdesat8 (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 12, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:27), TribdesatlO (seqüência de codificação fornecida como o ID. de SEQ. N°: 13, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:28) , Tribdesatll (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N°: 14, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:29) e Tribdesat12 (seqüência de codificação fornecida como ID. de SEQ. N°: 15, seqüência de aminoácido fornecida como ID. de SEQ. N°:30). As seqüências listadas acima como Tribdesat2a, 2b, 2c, 3, 4, 5, 6a, 8, 10, 11, 12 foram corrigidas na base de clonagem e sequenciamento dos cDNAs correspondentes (veja exemplos 2- 5) .

Cada um dos clones foi submetido então a um programa de predição de gene em Softberry

(http://www. softberry.com/cgi-bin/prograEM/gfin/fgenesh) . Os parâmetros para Drosophila., Anopheles, C. elegans e Brugia malaya foram testados para sua habilidade de predizer genes de desnaturase. Para cada uma das predições de gene, as proteínas foram submetidas a uma análise de BLASTP contra todas as proteínas na base de dados de NCBI para determinar se as desnaturases se assemelharam. Nem os parâmetros de Anopheles nem de Drosophila deram a predição correta para desnaturases com exceção de TribdesatlO que usou parâmetros de Anopheles. Para algumas das desnaturases, os parâmetros para predizer genes em C. elegans ou B. malaya predisseram genes similares às desnaturases. Para três das desnaturases, nenhuma das predições usando quaisquer dos parâmetros padrões predisseram os genes de desnaturase (Tribdesat4, Tribdesat7a e Tribdesat7b) .

Para três dos genes de desnaturase (2 clones) que não poderiam ser preditos usando os programas de predição de gene, as regiões genômicas foram submetidas a uma comparação de BLASTX com todas as proteínas na base de dados NCBI. A maioria da região 5' do fragmento genômico assemelhando as desnaturases foi notado e as seqüências de DNA a jusante foram traduzidas ín silico e examinadas visualmente para um resíduo de metionina. Esta foi considerada como sendo a metionina de começo da seqüência de proteína. A região 3' do fragmento genômico que se assemelhou as desnaturases foi examinada em uma maneira similar para um códon de parada. Cada uma destas seqüências de proteína foi inspecionada visualmente para todas as porções conservadas de desnaturases (tabela 2) . Para Tribdesat4, nenhuma predição razoável do N-terminal ou C- terminal da proteína poderia ser feita devido à seqüência incompleta do genoma nestas regiões.

Cada seqüência de proteína foi examinada também para a presença de três "boxes de histidina" (His boxes) que são porções que são fortemente conservadas em todas as desnaturases. Os resíduos de histidina nestas boxes são pensados por estarem envolvidos na ligação de átomos de ferro requeridos para a atividade de desnaturase. As posições de aminoácido e seqüências das His boxes nas proteínas e duas outras da Chauliognathus lugubris (veja exemplo 5) está listado na tabela 3, após correção das seqüências de proteína preditas da análise dos clones de cDNA (exemplos 2-5).

Tabela 2 - Presença (/) ou ausência (X) de porções de desnaturase conservadas em seqüências de aminoácido de Tribolium identificadas. (Nota: As porções nas seqüências podem não ser idênticas à porção de seqüência conservada correspondente).

15

20

25

30

Porçã o de seqüência conservada Gene identificado Tamanho de proteína predita (aminoácidos) 1 2 3 4 5 6 7 8 Tribdesatl 348 V V V χ V V V λ/ Tribdesat2a 320 V V V V V λ/ V V Tribdesat2b 297 V V V V V V V V Tribdesat2c 321 V V V V V V V V Tribdesat3 286 V X V λ/ V V V V Tribdesat5 353 V V V V V V V V Tribdesatóa 350 V V V V V V V V Tribdesatób 289 V X X V X χ V X Tribdesat8 374 V V V V V V V V TribdesatlO 366 V V λ/ V V V λ/ λ/ Tribdesatl 1 323 V λ/ V V V V V Tribdesatl 2 455 V V V V λ/ V V Seqüências de aminoácido concensus de porções: 1, AGAHRLW (ID. de SEQ. N°: 104); 2, SETDAD (ID. de SEQ. N° : 105); 3, FFFSHVG (ID. de SEQ. N° : 106); 4, QKKY (ID. de SEQ. N°: 107); 5, NSAAH (ID. de SEQ. N°: 108); 6, GEGWHNYHH (ID. de SEQ. N° : 109); 7, PWDY (ID. de SEQ. N°: 110); 8, GWAY (ID. de SEQ. N°: 111).

Tabela 3. Posição de aminoácido e seqüências de boxes de histidina em Tribolium e em seqüências de desnaturase de besouro soldado. O número para cada box corresponde à posição na proteína do primeiro resíduo de aminoácido da porção.

15

20

25

30

PrimeiroHIS box Segundo HIS box TerceiroHIS box Tribdesatl 90; HRLWTH (SEQ ID NO: 112) 109; HRVHH (SEQ ID NO: 116) 249; HNYHH (SEQ ID NO: 121) Tribdesat2a 60; HRLWSH (SEQ ID NO: 113) 97; HRAHH (SEQ ID NO: 117) 238; HNYIIH Tribdesat2b 62; HRLWAH (SEQ ID NO: 114) 99; HRIHH 240; HNYHH Tribdesat2c 5 5; HRLWAH 92; HRVHH 233; HNYHH Tribdesat3 65; HRLWAH 102; HQVHH (SEQ ID NO: 118) 243; HNYHH Tribdesat4 96 HRLWSH 133; HRVHIi 274; HNYHH TribdesatS 88 HRLWAH 125; HRVHH 265; HNYHH Tribdesatóa 88 HRLWAH 125; HRVHH 265; HNYHH Tribdesalób 15 HRLWAH 52; HRLHH (SEQ ID NO: 119) 189; WISYH (SEQ ID NO: 122) Tribdesat7a 57; HRLWSH 94; HRAHH 234; HNYHH Tribdesat8 93; HRLWAH 130; HRVHH 271; HNYHH TribdesatlO 75; HRLWAH 112; HRVHH 254; HNYHH Tribdesatl 1 77; HRLYSH (SEQ ID NO: 115) 114; HRQHH (SEQ ID NO: 120) 255; HNYHH Tribdesatl 2 104; HRLWAH 141; HRVHH 282; HNYHH CLl (SEQ ID NO: 73) 88; HRLWAH 125; HRVHH 265; HNYHH CL3 (SEQ ID NO: 74) 88; HRLWSH 125; HRVHH 265; HNYHH Exemplo 2 - Clonagem de Tribdesat4

Os inventores tentaram obter Tribdesat4 usando PCR inverso em cDNA, pois não poderiam predizer da seqüência de genoma o começo ou a extremidade do gene. A primeira síntese de fita foi realizada misturando 3 μΐ de RNA larval (24 pg) , 100 pmol de cada um dos primers de oligonucleotídeo de Clontech, Smart IV Oligo ' AACGAGTGGTATCAACCGAGAGTGCGCATTACGCGCGGG-3 1 (ID. de SEQ . N°: 32); e CDS/3' (5'ATTCTAGAGCGCGAGCGGCGCGACATG-d(T)3 OVN) (N=A, G, C ou T; V=A, G ou C (ID. de SEQ. N°: 33)). Isto foi incubado em 72 0C por 2 minutos depois o qual foi refrigerado imediatamente em gelo. Aos conteúdos do tubo foi adicionado 2 μΐ 5X de tampão de primeira fita (Powerscript; Clontech) , 1 μΐ de DTT (20 mM) , mistura de Ιμΐ de dNTP (concentração final de 2 00 μΜ cada dNTP) e 1 μΐ de trascriptase reversa de Powerscript (Clontech). A síntese de primeira fita de cDNA foi permitida ocorrer em 42 °C por 1 hora, depois a qual foi refrigerada imediatamente em gelo. NaOH (1 μΐ, 25 mM) foi adicionado e incubado em 680C por 30 minutos. Uma alíquota da síntese de primeira fita (6 μΐ) foi misturada com 5 μΐ de IOX Advantage 2 Buffer (Clontech), mistura de 1 μΐ 50X de dNTP, 1 μΐ de CDS/5 oligo (5' AACGAGTGGTATCAACCGAGAGT; Clontech (ID. de SEQ. N°: 34)), 1 μΐ CDS/3 oligo, 1 μΐ de 50X Advantage 2 Polymerase e feito a um volume final de 50 μΐ. A mistura então passou por um regime de temperatura como segue: 72°C/10 minutos; 95°C/l minuto; então 3 ciclos de 95°C/15 segundos, 68°C/8 min.

Uma alíquota (5 μΐ) foi separada em um gel de agarose 1% para assegurar que a amplificação ocorresse. A amostra foi então digerida com Sfil por 2 horas em 500C e a enzima de restrição removeu usando o kit de purificação de PCR de QIAgen de acordo com as instruções do fabricante. A amostra eluída foi diluída para ligação para assegurar ligações intramoleculares ao invés de ligação intermolecular. O DNA digerido (0,5 pg) foi diluído em uma mistura de ligação de 500 μΐ e incubado durante a noite em 16°C. A ligação foi concentrado por precipitação de glicogênio (150 pg de glicogênio, 1,4 ml de etanol 95% gelado em -80 0C por 2 horas) depois do qual o DNA foi peletizado por centrifugação (12000g, 20 minutos). O DNA foi ressuspenso em 10 μΐ de água estéril. A reação de PCR inversa foi realizada em 1 μΐ deste DNA precipitado e incluiu 5 μΐ de 10X de Advantage 2 PCR Buffer (Clontech), 10 pmol de Desat4 GSPl (5'ATTATGACGGGATCGCGTTCCAAGTC (ID. de SEQ. N°: 35), 10 pmol de Desat4 GSP2 (5'CGAAACAATTTGGAATTCGTTTTGGG (ID. de SEQ. N°: 36), 200 μΜ cada dNTP, 1 μΐ de 50X BD Advantage 2 Polymerase e água estéril a um volume final de 50 μΐ. As condições de PCR foram como segue: 95°C/l minuto, então 3 0 ciclos de 95°C/30 segundos, 68°C/3 minutos, então 68°C/3 min.

Uma alíquota (5 μΐ) de PCR foi separada em um gel de agarose 1%. Uma única faixa foi notada e clonada em pGEM-T- Easy. A inserção foi sequenciada em seqüência e mostrada por conter a maioria das extremidades 5' de Tribdesat4 e a extremidades 3' inteira de Tribdesat4. A extremidade 5' existente de Tribdesat4 foi então submetido à análise BLASTN contra seqüências disponíveis de ESTs de T. castaneum. Um EST foi identificado desta análise (N° de acesso DT795463) e o resto da extremidade 5' foi identificado.

Os primers foram projetados para extremidade 5' e 3' da região de codificação de Tribdesat4 e usados em uma reação de RT-PCR obter Tribdesat4 de comprimento total. A reação de RT-PCR consistiu de 25 μΐ de mistura de 2X Reaction (Invitrogen) , 37 ng RNA, 1 μΐ de polimerase de Superscript II RT/Platinum Taq DNA (Invitrogen) , 100 pmol de cada primer e água estéril a 5 0 μΐ. As condições de reação foram como segue: 50°C/3 0 minutos, 94°C/2 minutos, então 35 ciclos de 94°C/30 segundos, 55°C/1 minuto, 72°C/l minuto, então 72°C/5 minutos. Uma alíquota foi corrida em um gel de agarose 1%. Uma única faixa (aproximadamente Ikb) foi obtida e clonada em pGEM T Easy. A seqüência da inserção foi examinada e verificada como o comprimento total de cDNA. ID. de SEQ. N°: 6 mostra a seqüência de nucleotídeo da região de codificação do cDNA.

Exemplo 3 - Amplificação de seqüências de desnaturase de RNA de Tribolium adulto

0 RNA foi extraído dos besouros T. castaneum (cepa TC4) usando o método de Trizol (Invitrogen) . 100 mg de besouros adultos homogeinizados em 1 ml de reagente de Trizol e a mistura incubada por 5 minutos em 25°C, após a qual 200 μΐ de clorofórmio foi adicionado à amostra. A mistura foi agitada manualmente por 15 segundos e então permitida sedimentar por 3 minutos em 25°C. As camadas orgânica e aquosa foram separadas por centrifugação (12.000g, 15 minutos, 4°C). A camada aquosa superior foi transferida para um tubo fresco e o RNA precipitado pela adição de 500 μΐ de isopropanol. Após a incubação de 10 min em 25°C, o RNA foi peletizado por centrif ugação em 12.000 g/10 min em 4 0C. A pélete de RNA foi lavado uma vez com etanol 75% e então seco ao ar por 10 minutos. O RNA foi então dissolvido em 30 μΐ de água livre de RNase. Havia uma coloração marrom visível ao RNA que foi ainda purificada usando o mini protocolo RNeasy para a limpeza de RNA (QIAgen), de acordo com as instruções do fabricante.

As reações de amplificação de RT-PCR foram realizadas para 10 seqüências de desnaturase (Tribdesatl, 2a, 2b, 3, 5, 6a, 6b, 8, 10 e 11). A cada amostra foi adicionado 25 μΐ de mistura 2X Reaction (Invitrogen) , 3 7 ng de RNA, 1 μΐ de polimerase Superscript II RT/Platinum Taq DNA (Invitrogen), 100 pmol de cada primer e água estéril a 50 μΐ. As condições de reação foram como segue: 50°C/3 0 minuto, 940C/2 minuto, então 35 ciclos de 94°C/30 segundo, 55°C/1 minuto, 72°C/l minuto, então 72°C/5 minuto (condições de PCR 55/72).

Uma alíquota de cada amostra foi corrida em um gel de agarose 1%. Aquelas amostras contendo um único produto de amplificação de aproximadamente Ikb (Tribdesatl, 3, 5, 6a, 10, 11) foram purificadas usando o kit de purificação de PCR QIAquick (QIAgen) e clonadas em pGEM T Easy (Promega) . As misturas de ligação foram transformadas em E. coli DHlOB usando técnicas biológicas moleculares padrão (Sambrook e col. , 1989) . A seqüência de DNA de clones contendo inserções foi examinada. As comparações de predições de gene com aquelas de produtos RT-PCR obtidos para Tribedesat2b, 3, 6b, 10 e 11 são mostradas nas figuras 1 a 5. Foi aparente que as seqüências como preditas da seqüência de genoma não eram as mesmas que as seqüências de 3 0 c DNA observadas, em alguns casos isso seria devido às predições incorretas para seqüências de codificação da seqüência genômica. Em outros casos, as diferenças tais como polimorfismos de nucleotídeo simles podem ter sido devido aos alelos diferentes dos genes presentes nas populações dos insetos.

0 RNA foi também extraído das larvas de T. castaneum usando o método de Trizol como acima. As reações de RT-PCR foram realizadas para amplificar 6 seqüências de desnaturase (Tribdesat2a, 2b, 2c, 6b, 8 e 12) pelo método visto como acima. Nenhum produto de amplificação foi observado após uma primeira rodada de PCR e assim as reações foram submetidas a uma segunda rodada de PCR. Os produtos de amplificação de aproximadamente 1 kb foram observados nas amostras de Tribdesat2b, Tribdesat2c, Tribdesatl2 e Tribdesat8. Estes produtos foram extraídos de um gel de agarose usando o kit de extração de gel QIAquick (QIAgen) e clonados em pGEM T Easy (Promega). As seqüências de DNA de clones contendo inserções foram examinadas. As comparações de predições de gene com aquelas de produtos de 2 0 RT-PCR obtidos por Tribdesat2b e 6b são mostradas nas figuras 1 e 3, respectivamente.

Exemplo 4. Amplificação de fragmentos de gene de desnaturase dos Besouros Soldados (Chauliognathus lugubris) A amplificação de fragmentos de desnaturase internos Besouros Soldado

0 RNA dos foi extraído de 10 0 mg de besouros masculinos adultos dos C. lugubris usando o método de Trizol como descrito acima para Tribolium. A síntese de c DNA foi realizada usando Invitrogen Superscript II e usando um primer de poliT (5'ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ (ID. de SEQ. N°: 81)). O primer de poliT (100 pmol), RNA (2 μΐ) e água livre de RNase a um volume final 15,5 μΐ foram incubados em 70°C por 10 minutos e então resfriados no gelo. A este foi adicionado 10XPCR Buffer (2,5 μΐ) , 25 mM de MgCl2 (2,5 μΐ) , 10 mM de mistura dNTP (1 μΐ) e 0,1 M de DTT (2,5 μΐ). Esta mistura foi aquecida a 420C por 1 minuto depois de qual Superscript II Trascriptase Reversa (1 μΐ) foi adicionada e a mistura deixada por 50 minutos em 42°C. Superscript II Trascriptase Reversa foi inativada em 700C por 15 minutos e RNA degradado com 1 μΐ de RNaseH (2 unidades, 3 0 minutos em 37°C).

As reações de PCR ajustadas contendo 1 μΐ de dNTPs (200 μΜ de cada dNTP), 5 μΐ de tampão ThermoPol (NEB), 1,5 μΐ de F2 (5'TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG (ID. de SEQ. N°: 82)), 1,5 pL de R2 (5TGRTGGTAGTTGTGVHANCCCTC (ID. de SEQ. N°: 83)), 5 μΐ de cDNA, 0,1 U de Taq DNA Polimerase (NEB) e água estéril 50 μΐ. As condições de PCR foram como segue: uma desnaturação inicial de 94 0C por 3 minutos e então 3 0 ciclos de 94°C/15s, de 48°C/30s, de 72°C/2 minutos e então uma extensão final de 72°C/5 minutos. Uma alíquota foi separada em um gel de agarose 1,5% e uma faixa de aproximadamente 4 00 pb foi visualizada. A reação de PCR foi purificada usando o kit de purificação de PCR QIAgen de QIAquick de acordo com as instruções do fabricante e clonada em pGEM T Easy (Promega). Aproximadamente 3 0 clones contendo inserções foram examinados pela análise de seqüência de DNA. Um total de três seqüências de desnaturase únicas foram identificadas correspondendo a CL6 (ID. de SEQ. N°: 75), CL7 (ID. de SEQ. N°: 76) e CL8 (ID. de SEQ. N°: 77). Amplificação de fragmentos de desnaturase internos de Besouros Soldado fêmeas

RNA foi extraído e cDNA sintetizado como descritos acima. Dois PCRs degenerados foram realizados no RNA da fêmea adulta usando os primers degenerados F2/R2 e Clu_f (5' GCNCAYMGNYTNTGGGCNCA (ID. de SEQ. N°: 84)) / Clu-r (5' AANRYRTGRTGGTAGTTGIG (ID. de SEQ. N°: 85)) (veja a tabela 4) pelo mesmo método que acima. Os produtos de amplificação de aproximadamente 400 pb (F2/R2) e de 550 pb (Clu_f/Clu_r) foram visualizados e clonados em pGEM T Easy. Cada inserção de 70 colônias da transformação F2/R2 foi amplificada por PCR usando primers T7

(5' TAATACGACTCACTATAGGG (ID. de SEQ. N°: 86)) e SP6 (5' ATTTAGGTGACACTATAG (ID. de SEQ. N°: 87)) e analisados. Já que aproximadamente 70% dos clones sequenciados do tecido de besouro soldado masculino que teve a similaridade de seqüência com desnaturases foi CL6, os produtos de PCR foram digeridos com enzima de restrição JRsaI para remover clones CL6. Dos 70 produtos de PCR obtidos, somente 20 não foram digeridos com RsaI. Os fragmentos de desnaturase resultantes obtidos foram CL7, CL8 e um fragmento de desnaturase original novo chamado CL9.

Dezesseis clones adicionais foram obtidos de outra reação de PCR degenerada usando o RNA adultos fêmeas e primers Clu_f/Clu_r, e suas seqüências de nucleotídeo obtidas e comparadas aos clones precedentes. Uma destas foi de s i gnada CL1.

Tabela 4. A fonte de tecido de RNA e pares de primer degenerados usadas para isolar fragmentos de desnaturase internos de C. Iugubris. Fonte de tecido Primers degenerados Produtos de desnaturase internos Adulto macho F2/R2 CL6, CL7, CL8 Adulto fêmea F2/R2 CL9 Adulto fêmea Clu_f/Clu_r CLl Glândula de defesa de adulto macho/fêmea misturado XRF2b/Clu_r CL3, CL5

A amplificação de PCR degenerado do tecido de glândula de defesa

Uma população misturada de machos e fêmeas foi dissecada para obter seu tecido de glândula de defesa. Inicialmente, as cabeças e os élitros foram removidos. O tecido restante foi dividido em duas partes - a amostra de abdômen e tecido de glândula de defesa.

O RNA foi extraído e cDNA sintetizado como descrito acima. PCR degenerado foi realizado com três combinações diferentes de primers. Estes eram Clu_f/Clu_r, F2/Clu_r e XRP2b (5'TTYTTYTWYKCNCAYATGGGNTGG (ID. de SEQ. N°: 88))/Clu_r. Após a análise em um gel de agarose 1,5%, uma faixa de tamanho previsto foi observada somente na amostra com a combinação de XRF2b/Clu_r. Nenhum produto de amplificação foi observado com qualquer dos outros dois pares mesmo após 60 ciclos de PCR. Os produtos de PCR obtidos foram purificados usando o kit de purificação de PCR QIAgen de QIAquick e clonados em pGEM-T-Easy. Onze clones foram examinados pela análise de seqüência. Os fragmentos de gene de desnaturase novos foram obtidos e CL3 e CL 5 designados. 0 fragmento interno CL5 pareceu conter restos de um íntron, como determinado por uma seção que não mostrou similaridade de seqüência próxima com desnaturases e também afetou o quadro de leitura, inserindo desse modo um códon de parada. 5' e 3' RACE para obter informação de seqüência de comprimento total

Os primers para 5' e 3'-RACE (tabela 5) foram projetados baseados nas seqüências internas aos sítios de ligação de primer degenerado para cada um dos clones descritos acima.

Tabela 5. Primers (5' a 3') usados para 5' e 3' RACE.

Clone 5'RACE primer (CLXinícío) 3'RACE primer (CLXextremidade) CL6 CCCAGAGATATAACCGATACA (SEQ ID NO: 89) TTATATACGCCGACCCTATTC (SEQ ID NO: 90) CL7 CCTCTCCAAGTCCOAGAGAAG (SEQ ID NO: 91) TGGCTCATGTGCAAA AAGCAT (SEQ ID NO: 92) CLl TTGTGCCATCCCTCACCGTTG (SEQ ID NO: 93) TGGCTAACATCGAGACCCTG (SEQ ID NO: 94) CL3 GCCATATAGATGAGCAGCTGA (SEQ ID NO: 95) ATGGGATGGCATTATGTGCAG (SEQ ID NO: 96)

0 sistema de Clontech Creator™ SMART™ foi usado para obter ambos produtos de RACE 5' e 3' de acordo com as instruções do fabricante com RNA de qualquer tecido do abdômen ou glândula de defesa. Os primers de oligonucleotídeo Smart IV

(5 ' AACGAGTGGTATCAACCGAGAGTGCGCATTACGCGCGGG (ID . de SEQ . N0 : 97)) e CDS III/3' (5'ATTCTAGAGCGCGAGCGGCGCGACATG-d(T)30N-iN; N=A, G1C ou T; N-i=A, G ou C (ID. de SEQ. N°: 98)) foram usados para a transcrição reversa-PCR. As reações de RACE 5' usaram o primer CDS V 5'AACGAGTGGTATCAACCGAGAGT (ID. de SEQ. N°: 99), e primer CLXfront. As reações RACE 3' usaram primers CDS III/3' PCR e CLXend. Os clones foram selecionados por colônia PCR para

inserções. Quaisquer clones que deram uma faixa de tamanho previsto (-350 bp) foram examinados pela análise de seqüência de DNA. A seqüência de DNA foi inicialmente examinada para a similaridade de seqüência com desnaturases. As seqüências de comprimento total foram compiladas in silico usando a informação de seqüência da seqüência interna, os produtos de 5'RACE e 3'RACE foram examinados para um quadro de leitura aberto começando com um ATG e terminando em um códon de parada que quando traduzido possuíam todos as porções de desnaturases (tabela 2) .

Exemplo 5. Isolamento de cDNAs de desnaturase de C. Iugubris de comprimento total

Os clones de cDNA de comprimento total de CLl e outras seqüências como desnaturase foi obtidos usando um kit de RT-PCR de uma etapa de Invitrogen de acordo com as instruções do fabricante e as condições de PCR 55/72 (acima). Os primers usados foram GGTACCATCGCACCCAACCGCCAC (ID. de SEQ. N°: 100) e GAATTCTCACTTTTGTTTGTGAGT (ID. de SEQ. N°: 101). As faixas de aproximadamente 1 kb foram purificadas usando o kit de purificação de PCR QIAquick de QIAgen de acordo com as instruções do fabricante e clonadas em pGEM-T-Easy. Os clones positivos foram obtidos e examinados pela análise de seqüência de DNA. Após a verificação de seqüência, os clones de pGEM-T-Easy contendo cDNAs de desnaturase foram digeridos com enzimas de restrição para retirar as inserções, separadas em um gel de agarose 1% e os fragmentos de -Ikb retirados e purificados usando o kit de extração em gel QIAquick (QIAgen) para clonagem em vetores de expressão de levedura, tal como pYES2 (abaixo).

Exemplo 6. Isolamento de genes de desnaturase de Chauliosnathus nohiliatus

0 Chaulioenathus nohiliatus (Erichson) é outra espécie de besouro soldado, que se assemelha a C. Iugubris, mas é geralmente menor em tamanho e menos prevalente nas regiões do sudeste da Austrália. Estas espécies de besouro não são relacionadas proximamente às traças, tais como Tribolium, na verdade são separadas extensamente dentro do Insectae.

O RNA foi extraído dos adultos de C. nobiliatus usando

o método de Trizol como acima. 0 cDNA foi sintetizado usando o kit Superscript II da Invitrogen. Três PCRs degenerados foram realizados. 0 primeiro usou os primers degenerados F2/Clu_r, o segundo usou os primers degenerados XRF2b/Clu_r e o terceiro com primers degenerados Clu_f/Clu_r. Uma alíquota de cada reação foi separada em um gel de agarose 1,5% e uma faixa foi observada para as primeiras duas reações. Estes foram purificados usando o kit de purificação de PCR QIAquick (QIAgen) e clonados em pGEM-T-Easy. Um total de 12 clones do primeiro PCR e 14 do segundo PCR foram examinados pela análise de seqüência de DNA. Três seqüências de desnaturase únicas foram obtidas e seus ortólogos correspondentes de C. Iugubris, bem como a porção de assinatura como descrito por Knipple e col. (2002) são mostrados na tabela 6.

Tabela 6. Os fragmentos de desnaturase internos isolados de C. nobiliatus e seus ortólogos correspondentes em C. Iugubris. Também mostrados são a porção de assinatura e os primers usados para isolar estes fragmentos internos.

C. nobiliatus C. lugubris Assinatura Primers GPAE F2/CIu r CN8 CL8 (SEQ ID NO: 123) NPVE CL7end/CL7início CN7 CL7 (SEQ ID NO: 124) YPAE CLlend/CLlinício CNl CLl (SEQ ID NO: 125) SPVE CL9end/CL9início CN9 CL9 (SEQ ID NO: 126) Uma segunda abordagem usada para isolar fragmentos de desnaturase internos de C. nobiliatus foi para usar os primers específicos às desnaturases de C. Iugubris. O cDNA foi sintetizado como descrito acima foi usado como um molde para PCR com os primers específicos a CL6, CL7, CL9, e CLl. Uma alíquota de cada reação foi separada em um gel de agarose 1,5% e as faixas foram observadas com os primers específicos de CL7, CL9 e CLli mas nenhum produto foi observado para os primers de CL6 ou CLlO. Os produtos de CL7, CL9 e CLl foram purificados usando o kit de purificação de PCR QIAquick de QIAgen e clonados em pGEM-T- Easy. OS clones positivos foram obtidos e examinados pela análise de seqüência de DNA.

As seqüências de cDNA de comprimento total para os ortólogos de CL3 e CLl foram amplificadas do RNA de C. nobiliatus usando o kit reverso de Superscript II Trascriptase Reversa/Platinum Taq DNA Polimerase da Invitrogen como descrito no exemplo 5. Os primers usados são mostrados na tabela 7. Um clone obtido de cada reação foi sequenciado para confirmar a identidade de cada cDNA.

Tabela 7. Primers usados para obter ortólogos de C. nobiliatus de comprimento total de desnaturases selecionadas.

Gene Primer direto (5'—>3") Primer reverso (5"—>3") CLl GGTACCATGCCACCCAACGC CCAC (SEQID NO: 100) GAATTCTCACTTTTGTTTGTGA GT (SEQ ID NO: 101) CL3 AAGCTT ATGCTACCGGAGTT TTGC (SEQ ID NO: 102) CTC C AGCT AAG ACTG ATTATA GGC (SEQ ID NO: 103)

Exemplo 7. Isolamento de genes de desnaturase das bibliotecas de cDNA

Construção de uma biblioteca de cDNA de tecido de 3 0 abdômen de C. Iugubris. O RNA foi extraído do tecido de abdômen de C. Iugubris usando o método descrito acima. Uma biblioteca de cDNA foi construída usando o kit Invitrogen Cloneminer de acordo com as instruções do fabricante. Uma fração da biblioteca foi transformada em células competentes de E. coli DHlOB EletroMax (Invitrogen) e transformantes selecionados nas placas de ágar LB contendo 25 pg/ml de canamicina. Aproximadamente 9 0% dos clones continham inserções com um tamanho médio de inserção de 1,5 kb. Os clones de desnaturase foram identificados e isolados desta biblioteca por métodos de PCR ou pela seleção de hibridização usando as sondas derivadas dos clones descritos acima.

Método de PCR para selecionar a biblioteca de cDNA de plasmídio

Um volume de biblioteca de cDNA de plasmídio representando aproximadamente 5 0 colônias formando unidades foi semeado em placas de 96 poços contendo 3 00 μΐ de LB suplementado com 50 pg/ml de canamicina e crescido durante a noite em 370C com agitação. 100 μΐ de cada cultura de líquido dos poços através da placa foram colocados em tubos de 1,5 ml para render oito "escolhas de zona" e uma extração de plasmídio foi realizada usando um kit de rotação de minipreparação de QIAquick (Qiagen) de acordo com instruções dos fabricantes. 10 μΐ de cada eluente "escolha de zona" foi misturado em um tubo de 1,5ml criando uma "escolha de placa" . A seleção de PCR foi feita em cada de "escolha de placa" que usa primers específicos de gene e corridos em gel de agarose de 1% TAE para identificar as placas de escolha positivas. Uma vez que as placas positivas foram identificada a seleção de PCR foi repetida em cada "escolha de zona" correspondendo a uma "placa de escolha" positiva e corrida no gel de agarose 1% TAE para identificar as "zonas de escolha" positivas, e na seleção subsequente arredonda-se em únicos poços e colônias individuais para isolar os clones positivos. Os plasmidios que contiveram o gene de interesse foram analisados pela digestão de enzima de restrição e análise de seqüência.

Seleção usando hibridização de colônia não radioativa.

Ass diluições de série 10 vezes da biblioteca de cDNA foram feitas (1-106) e plaqueadas em ágar LB suplementado com 5 0 μΐ/ml de canamicina para determinar a diluição que produziu aproximadamente 3 00-500 colônias por 82mm de placa de petri. As bactérias transformadas de uma diluição apropriada foram espalhadas nas placas de ágar LB suplementadas com 5 0 pg/ml de canamicina e incubadas durante a noite em 37°C. As membranas de náilon (Hybond-N+, Amersham Biosciences) foram usadas para obter elevações de colônia e tratados de acordo com métodos padrões para a hibridização de colônia. As sondas de DNA marcadas com biotina foram preparadas usando fragmentos de gene de desnaturase marcados usando dNTPs mais Biotin-dATP e fragmento de polimerase I Klenow de DNA de acordo com o kit NEBlot phototope (New England Biolabs). As sondas foram hibridizadas às membranas durante a noite em temperaturas de 65°C (severidade elevada) ou 55°C (severidade moderada) . 0 DNA biotinilado hibridizado foi detectado de acordo com o manual de kit de detecção Phototope-Star (New England Biolabs) seguindo a modificação para hibridizações de colônia detalhadas no Apêndice C. A membrana foi exposta a Hiperfilm ECL (Amersham Biosciences) por 1 minuto e processada manualmente de acordo com as recomendações de Amersham Biosciences. Os clones positivamente hibridizados foram analisados pela digestão de enzima de restrição e análise de seqüência.

Exemplo 8. Construção de vetor de expressão de

levedura e análise funcional de genes

Cada um dos genes de desnaturase de comprimento total foi expresso em Saccharomyces cerevisiae para caracterização funcional usando os vetores de expressão de levedura pYES2 ou pVTlOO-U (Vernet, T e col. 1987) . Cada uma das regiões genômicas contendo genes de desnaturase putativos foi examinada para sítios de reconhecimento de nuclease de restrição. As enzimas de restrição foram escolhidas de modo que não cortassem as regiões genômicas, mas facilitariam a clonagem direcional em pYES2 ou pVTlOO- U. Os primers foram projetados (tabela 8) para a maioria de regiões 5' e 3' dos genes de desnaturase preditos com os sítios de restrição na extremidade 5' de cada um dos primers para permitir a clonagem direcional. 2 0 Os DNAs dos vetores de levedura foram preparados e

digeridos com enzimas de restrição correspondentes e então defosforilados usando Fosfatase Alcalina intestinal de Vitela (Roche). Após a defosforilação, os vetores digeridos purificado usando o kit de purificação de PCR QIAquick (QIAgen). Os fragmentos contendo desnaturase extraídos em gel foram ligados com o vetor digerido e as ligações transformadas em E. coli DHlOB com os transformantes selecionados em placas de ágar LB com 100 pg/ml de ampicilina. Os clones contendo inserções foram confirmados pela análise de enzima de restrição. Tabela 8 - Primers usados para clonagem direcional em pYES2. Os sítios de restrição são mostrados na parte em negrito.

Tribdesat No. Primer Seqüência de primer de oligonucleotídeo 1 Direto GGATCCATGGCCCCCAACAGCACA (SEQID NO: 37) 1 Reverso GAATTCTTAATCTCTGCGTGTGCG (SEQ ID NO: 38) 2a Direto GGATCCATGTCAACGCTTGAAACA (SEQ ID NO: 39) 2a Reverso GAATTCTTATCCTCGATTTCGTTC (SEQ ID NO: 40) 2b Direto GGATCCATGTCTAGCGAGCTAGCG (SEQ DD NO: 41) 2b Reverso GAATTCTTAATTTTTCGCCTTACA (SEQ ID NO: 42) 2c Direto GGATCCATGGAACGTGAAATCGCGTGG (SEQ ID NO: 43) 2c Reverso GAATTCTTATCCTGTTTGTGAAGC (SEQ ID NO: 44) 3 Direto GGATCCATGTTTTTACGTACAATA (SEQ IDNO:.45) 3 Reverso GAATTCTTAATAATCACAATCCCC (SEQ ID NO: 46) 4 Direto AAGCTTATGACGGAAGGCAGCGATGAA (SEQ ID NO: 47) 4 Reverso GCGGCCGCTCAGTTAAAATCCTCCATTTT (SEQ ID NO: 48) Direto GGATCCATGCCACCCTATGTGTCC (SEQ ID NO: 49) Reverso GCATGCTTAATTAAAATCGTCAGA (SEQ ID NO: 50) 6a Direto GGATCCATGACACCAAATGCTTCA (SEQ ED NO: 51) 6a Reverso GAATTCCTACGCACTCTTCCTATG (SEQ ID NO: 52) 6b Direto GGTACCATGCTAATCTTACTTTCC (SEQ ID NO: 53) 6b Reverso CTCGAGCTAATGAAATTTTGAAGG (SEQ ID NO: 54) 7a Direto GGATCCATGTTTCAAACACCCATCGTCTGG (SEQ ID NO: 55) 7a Reverso CTCGAGTTATTGCCCAGTCCTCAAAACCCGCTT (SEQ ID NO: 56) 7b Direto GGATCCATGGTAGATTTGTTTTTG (SEQ ID NO: 57) 7b Reverso GAATTCTTATTTTTGCAATTGTTT (SEQ ID NO: 58) 8 Direto GGATCCATGGCTCCAAATTCGCTC (SEQ ID NO: 59) 8 Reverso GAATTCrITACAGTTCTTTGCTACT (SEQ LD NO: 60) Direto GGATCCATGTCGGCCCAGACCATT (SEQ ID NO: 61) Reverso GAATTCTTAATCCTCCTTCCTGTT (SEQID NO: 62) 11 Direto AAGCTTATGGGAGCGCTCAAACAA (SEQ ID NO: 63) 11 Reverso GAATTCTTAACCATTTGCCGTAAC (SEQ ID NO: 64) 12 Direto GAATTCATGGCTCCTAATTTGCTAGGA (SEQ ID NO: 65) 12 Reverso CTCGAGTTAATCAAATTTCTCTCTACT (SEQ ID NO: 66)

Transformação de construções de expressão em Saccharomyces cerevisiae

Duas cepas hospedeiras de S. cerevisiae foram usadas como receptores para construções derivadas de ρYES. Estes foram S288C (genótipo MATa, SUC2 gal2 mal mel flol flo8-l hapl (Mortimer e Johnston (1986)) e OLEl (his3Al, leu2A0, ura3A0, YMR272C: : kanMX4) que é mutante para o gene codificando A9-desnaturase e poderia ser usado para a análise de complementação. Cinco cepas hospedeiras de S. cerevisiae foram usadas como receptores para construções derivadas de pVT-100. Estes foram S288C, 0LE1, e INVSCi (MATa. his3Dl leu2 trpl-289 ura3-52), YPH499 (MATa, ura3-52 Iys2-8 01_amber ade2-101_ochre trpl-A63 hisl-A200 Ieu2-Al) e EL0-1 (MATa his3Al leu2A0 metl5A0 ura3A0 AELOl). Estas 2 0 cepas foram tratadas iguais durante a transformação exceto que 17:1 (ácido cis-10-heptadecenóico, 1 mM) e tergitol (NP-40; 1%) foram adicionados em todos os meios em que OLEl S. cerevisiae foi crescida e geneticina (200 pg/ml) foi adicionada a todos os meios em que EL0-1 foi crescido. Para a transformação, cada cepa de S. cerevisiae foi

riscada em YPD (20g/l de peptone, 10 g/l de extrato de levedura, glicose 2%) e crescida por diversos dias em 30°C. As transformações foram realizadas usando o kit de Transformação de Levedura Sigma de acordo com instruções do fabricante. Os transformantes foram selecionados em placas de ágar SCMM-U (6,7 g/l de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 1,92 g/l de suplemento de meio de saída sintético de levedura sem uracila, glicose 2% e ágar 2%) em 3 0 0C por até 5 dias. Vários transf ormantes foram selecionados para cada construção e testados para a presença de plasmídio de DNA.

Confirmação de transformantes

Para confirmar a identidade das construções de expressão dentro dos transformantes, o DNA foi isolado de uma quantidade de alça de crescimento usando o kit de extração de DNA de levedura Y-DER de Pierce (Illinois) de acordo com as instruções do fabricante. A presença de plasmídio foi analisada e confirmada pela análise de PCR usando um primer reverso específico de gene e um primer T7 (primer de vetor). As faixas positivas foram observadas e os transformantes correspondentes foram retidos para uma análise adicional.

Avaliação de complementação de OLEl

Cinqüenta microlitros de transformantes OLEl crescidos em SCMM-U contendo ácido cis-10-heptadecenóico (1 mM) e 1% tergitol foi peletizado por centrifugação (13.000 rpm, 3 ses) e ressuspenso em 50μ1 de YP (20g/l de peptona, 10 g/l de extrato de levedura). A mistura ressuspensa foi diluída 1:10 e 20 μΐ de cada mistura foi espotada no YP contendo placas de galactose 2% para induzir a expressão gênica de desnaturase e estas incubadas por 3-5 dias em 300C. A presença ou ausência de crescimento foi notada. As placas de controle contendo ácido cis-10-heptadecenóico (1 mM) e tergitol 1% foram também usadas para assegurar a 3 0 viabilidade de levedura. Os resultados para os testes de complementação de OLEl para desnaturases de Tribolium e Chaulioganthus foram como segue. A complementação positiva foi observada para Tribdesat2a, Tribdesat5, Tribdesat6a e Tribdesatll, o último com uma fase Iag. A complementação possivelmente fraca foi observada para Tribdesat2b e Tribdesat8. Nenhuma complementação foi observada para Tribdesatl, Tribdesat2c, Tribdesat4, TribdesatlO,

Tribdesatl2, CLl e CL3 .

A complementação do fenótipo OLEl de levedura ocorre quando um gene expresso heterologamente expressa uma desnaturase Δ9 ou Δ11 funcional e resulta na produção de ácidos graxos palmitoléicos, oléicos, ou cis-11- octadecanóico. Portanto, concliu-se que Tribdesat2a, Tribdesat5, Tribdesat6a e Tribdesatll foram desnaturases capazes ao desnaturar os lipídios nativos de células de levedura OLEl para produzir um dos ácidos graxos complementando e portanto eram prováveis de serem desnaturases Δ9 ativas em C16:0 ou C18:0, ou desnaturases Δ11 ativas em C18:0, visto que Tribdesatl, Tribdesat2c, Tribdesat4, TribdesatlO, Tribdesatl2, CLl e CL3 foram improváveis de codificar uma destas atividades e portanto provável codificar uma desnaturase diferente.

Crescimento de S. cerevisiae transformada para experimentos de alimentação de substrato Transformantes de levedura derivados das manchas S288C

ou OLEl foram inoculados em 25 ml de meio definido mínimo sintético para levedura sem Uracila (meio de SCMM-U) contendo glicose 2% e adicionalmente 0,5 mM de ácido cis- 11-heptadecenóico para a cepa de OLEl. Esta cultura de inoculação foi crescida para 24 - 48 horas em 30°C com agitação. O ODSOO da cultura foi determinado. A partir disto, a quantidade de cultura necessária para obter um OD6OO de 0,4 em 50ml de meio de indução foi calculada. Esta quantidade de cultura de inoculação foi removida e as células peletizadas em 1500 χ g por 5 minutos em 4 °C. As células foram então ressuspensas em 10 ml de meio de indução, SCMM-U contendo galactose 2%, rafinose 1% e 0,5 mM de substrato de ácido graxo (adicionados em etanol/2 0% de tergitol) e adicionalmente 0,5 mM de ácido eis-11- heptadecenóico para transformantes derivados de OLEl. Cada cultura foi crescida por 24 - 48 h em 30°C com agitação. 2 ml ou a cultura total foram então usados para a análise de ácidos graxos após colhimento de células por centrifugação, armazenamento em -20°C se necessário. Extração de lipídios da S. cerevisiae transformada e

análise

As células de levedura dos experimentos de alimentação de ácido graxo foram lavadas em tergitol 1% em água e peletizadas em 1500 χ g por 5 minutos em 4°C. Os péletes de célula (200-500 mg) foram então ressuspensos em água, transferidos aos tubos de teste de vidro e as células novamente peletizadas. A água foi removida dos péletes de célula em um concentrador/secador Savant SpeedVac Plus SCllaA. Cada pélete foi usado ou diretamente usado ou lipídios foram extraídos com solvente como descritos abaixo.

Os lipídios foram extraídos baseados em um Método de Folch Modificado (Protocolo 7, pp22-24, Lipid Analysis, Hamilton e Hamilton, 1992). Os lipídios foram extraídos com 2 ml de clorofórmio/metanol (2:1), e 0,5 ml de uma solução salina, 0,9% peso/vol de NaCl em água, foram adicionados. Isto foi misturado completamente por vórtex. As camadas foram então permitidas separar; quando uma grande quantidade de resíduos de célula estava presente as amostras foram centrifugadas em 2500 χ g por 5 minutos. A camada aquosa superior foi removida e descartada. A camada de solvente inferior foi removida a um tubo de teste de vidro limpo. Isto foi então seco sob nitrogênio em 300C.

Os lipídios foram então derivatizado antes da análise por dois métodos diferentes de metilação. 0 primeiro foi a metilação básica de ácidos graxos incorporados, isto é, aqueles encontrados em glicerídeos de triacila ou fosfolipídios, ácidos graxos não livres, baseados no método de Christie (2003). A amostra de lipldio foi primeiramente dissolvida em 0,5 ml de hexano. 0 acetato de metila 60 μΐ, foi adicionado, seguido pelo metóxido de sódio de 5 0 μΐ em 0,5 M em metanol. 0 tubo de teste selado foi então misturado completamente e colocado em um bloco de aquecimento em 50°C por 10 minutos. Após ser deixado resfriar por 5 minutos, uma gota de ácido acético foi adicionada. A amostra foi seca em uma corrente delicada de nitrogênio em 30°C, dissolvida em 200 μΐ de hexano e transferida a um frasco antes da análise de CG.

0 segundo método foi uma metilação ácida de todos ácidos graxos livres e incorporados, baseado no método de Lewis e col. (2000). Uma solução metanólica, 2 ml de metanol/ácido cloridrico/clorofórmio (10:1:1), foi

adicionada ao pélete seco de levedura ou amostra de lipidio extraído. 0 tubo de teste selado foi misturado completamente e colocado em um bloco de aquecimento em 90°C por 60 minutos. Após ser permitido resfriar por 10 minutos, 1 ml de 0,9% de solução salina (NaCl em água) foi adicionado. Os ácidos graxos metilados foram então extraídos com 0,3 ml de hexano. A camada de hexano foi transferida a um frasco antes da análise.

Estas amostras de éster metil de ácido graxo (FAMA) foram analisadas por CG e CGEM. A análise de CG foi realizada com um cromatograma gasoso Varian 3800 ajustado com um detector de ionização de chama (FID) e uma coluna capilar BPX70 (30m de comprimento, i.d. 0,32 mm, espessura de filme 0,25 μπ\) . As injeções foram feitas no modo dividido usando hélio como o gás carreador e uma temperatura de coluna inicial de 100°C. A temperatura foi elevada em 3°C/minuto até 150°C, então elevada em 5oC/minuto até 170°C, mantida por 5 minutos, então elevada em 50°C/minuto até 255°C. A análise de CG/EM foi realizada sob condições de cromatografia similares, mas com uma temperatura de coluna inicial de 60°C, elevada em 20°C/minuto até 170°C, mantida por 5 minutos, então elevada em 50°C/minuto até 255°C. A detecção foi realizada usando qualquer um espectrômetro de massa de TEC Polaris Q fon Trap ou um Varian 1200 Single Quadrupole. Os espectros de massa foram adquiridos sob impacto de elétron positivo em modo de varredura total entre 5 0 - 4 00 amu na taxa de 2 varreduras por segundo. Os espectros de massa correspondendo a cada pico no chromatogram foram automaticamente comparados com espectros na biblioteca NIST computarizada. Os espectros de teste que combinaram os espectros de biblioteca com um alto grau de exatidão e 3 0 eluíram ao mesmo tempo como um padrão autêntico ou eluíram em um tempo plausível de retenção, foi identificado por tentativa. A confirmação da identidade de um ácido graxo foi conseguida pela conversão do ácido graxo a seu derivado de dimetiloxazolina (DMOX) usando o método de Yu e col.

(1988) e comparação com os espectros de massa DMOX descritos em Dobson e Christie (2002) e referências nesses.

Resultados de análise funcional em levedura.

A partir dos experimentos realizados como descrito acima e resumidos na Tabela 10 (abaixo) , concliu-se como segue:

Tribdesat2a teve a atividade de desnaturase Δ9 no comprimento de cadeia de carbono de ácido graxo saturado de CIO: 0 a C16:0 quando estes ácidos graxos foram alimentados aos transformantes de levedura. A atividade foi maior em 14:0, mas 15:0 e 16:0 foram também substratos eficientes. Não teve nenhuma atividade detectável de desnaturase em 18:0, 20:0 OU mesmo ácidos graxos saturados mais longos nas células de levedura. A proteína teve um tamanho predito de 320 aminoácidos e incluídos as 8 porções de desnaturase 2 0 conservadas e três His boxes (Tabela 3) . Na base da homologia de seqüência com as desnaturases de acil-CoA conhecidas, este enzima foi presumida em agir no substrato de acil-CoA. Esta enzima foi portanto caracterizada como uma desnaturase Δ9 de miristoil-CoA. Tribdesat2b e Tribdesat2c foram proteínas proximamente

relacionadas, tendo 64% de identidade de seqüência de aminoácido baseada no alinhamento global usando BLOSUM62, que catalisou a produção de ácidos 5-hexadecenóico e 5- octadecenóico a partir de ácido palmítico e ácido esteárico, respectivamente. Foram portanto caracterizados como desnaturases Δ5 que agem nos substratos saturados C16:0 e C18:0. A eficiência de conversão em células de levedura de C18:0 a C18:1A5 foi mais de duas vezes eficiente que a conversão de C16:0 a C16:1A5 (Tabela 9) . As enzimas foram capazes de converter pelo menos 8,0% do substrato ao produto em cada caso, pelo menos 4 0% para Tribdesat2b em C18:0. As enzimas não desnaturaram detectavelmente os substratos de C14 ou menores quando alimentadas às células de levedura, incluindo C14:0 ou C14:1Δ9, ou os substratos de C20 ou maiores incluindo C20:0 ou C20: iA13. Além disso, as enzimas não desnaturaram os ácidos graxos monoinsaturados ou poliinsaturados incluindo C16:1Δ9, C18:1A9, C18:2 ou C18:3. As proteínas incluíram as 8 porções de desnaturase conservada e três His boxes (Tabela 3) e mostrou a homologia de seqüência com desnaturases de acil-CoA conhecidas. Foram portanto caracterizadas como desnaturases Δ5 de estearoil-CoA. Tem também a atividade de desnaturase Δ5 de palmitoil-CoA.

Tabela 9. Composição de ácido graxo (% de ácidos 2 0 graxos totais) de células de levedura expressando Tribdesat2b, ou vetor pYes vazio, fornecido com 0,5 mM de 18 : 0 .

Desnaturase de besouro Composição de ácido graxo (% total de ácidos graxos) 12:0 14:0 15:0 16:0 16:1Δ5 17:0 17:1 18:0 18:1Δ5 TD2b+ 18:0 2.4 0.7 0.5 24.3 3.2 0.2 62.4 3.2 3.0 pYes vazio +18:0 1.6 0.4 0.4 22.7 0 0.4 65.7 8.9 0

Cahoon e col. (2000) isolaram um gene de Limnanthes (espuma do prado) que codificou uma desnaturase Δ5 que era mais ativa em C20:0 do que C18 : 0 ou C16:0 e é não era portanto uma desnaturase Δ5 de estearoil-CoA como definido aqui. Sayanova e col. (2007) clonou dois genes codificando as desnaturases Δ5 ativas em substratos de acil-CoA das sementes de Anemone leveillei. A desnaturase AL21 estava ativa nos substratos saturados e insaturados, C16:0, C18:0 e C20:2, enquanto ALIO estava ativo somente em C20:2, n-6. Entretanto, AL21 estava mais ativo no substrato insaturado do que no substrato saturado, assim não se consideraria como uma desnaturase Δ5 de estearoil-CoA como definida aqui. 0 grau de identidade em seqüências de aminoácido quando as proteínas foram comparadas sobre as seqüências inteiras foi: entre AL21 e Tribdesat2b, 25%; AL21 e Tribdesat2b, 27%; ALIO e Tribdesat2b, 24%; ALIO e Trib2c, 28%. Portanto, concluiu-se que havia pouca homologia ou insignificante entre as desnaturases dependentes de acil- CoA de planta e as dependentes de inseto.

Tribdesat5 e 6a mostrou a atividade em células de levedura como as desnaturases Δ9 que agiram primeiramente e muito eficientemente no ácido esteárico para produzir o ácido oléico. Tiveram também alguma atividade no ácido palmítico para produzir o ácido palmitoléico. As enzimas não detectavelmente desnaturaram substratos de C14 ou menores quando alimentados às células de levedura, incluindo C14:0 ou C14:1A9, ou os substratos de C2 0 ou maiores incluindo C20:0. Foram portanto caracterizadas como desnaturases Δ9 de estearoil-CoA.

Tribdesat8 foi capaz de desnaturar o ácido palmítico para produzir o ácido palmitoléico, assim que considerou-se ser uma desnaturase Δ9. Não teve atividade detectável de desnaturase nas células de levedura em substratos C14 ou 3 0 menores, ou em substratos saturados C18:0 ou maiores, ou nem substratos monoinsaturados ou poliinsaturados incluindo C16 : Ia9 , C18 : Ia9, C18 : 2 ou C18 : 3 . Portanto pareceu ser específico para o ácido palmítico. A proteína teve um tamanho predito de 3 74 aminoácidos e incluiu as 8 porções de desnaturase conservadas e três His boxes (Tabela 3) . Na base da homologia de seqüência com as desnaturases de acil- CoA conhecidas, esta enzima foi presumida agir no substrato de acil-CoA. Esta enzima foi portanto caracterizada como uma desnaturase Δ9 de palmitoil-CoA. TribdesatlO mostrou a atividade de desnaturase Δ12 em

ácidos palmitoléico e oléico resultando em C16:2A9,A:12 e C18: 2a9, A12 (LA), respectivamente. A conversão de substrato de ácido oléico (pelo menos 30% convertido) foi aproximadamente duas vezes tão eficiente em células de levedura comparada à conversão de ácido palmitoléico. Não havia nenhuma atividade detectável em C16:0, C18:0 ou substratos saturados maiores, ou C14 ou substratos menores incluindo C14:1A9, assim a enzima pareceu ser específica como uma desnaturase Δ12 agindo em substratos A9-mono- 2 0 insaturados de comprimento de C18 e C16 unidos a CoA. A proteína teve um tamanho predito de 366 aminoácidos e incluiu os 8 porções de desnaturase conservadas e três His boxes (Tabela 3). Na base da homologia de seqüência com as desnaturases de acil-CoA conhecidas, esta enzima foi presumida agir em substratos de acil-CoA. Esta enzima foi portanto caracterizada como uma desnaturase Δ12 de oleoil- CoA. Mostrou também a atividade de desnaturase Δ12 de palmitoleoil-CoA. Acreditou-se que este é o primeiro gene a ser caracterizado codificando tal enzima. Tribdesatll mostrou a atividade de desnaturase Δ9 nos substratos saturados tendo um comprimento cadeia de C14:0 a C24:0, com a melhor eficiência de conversão observada para C22:0 (conhecido como o ácido behênico ou docosanóico) e C24:0 (conhecido como ácido lignocérico ou teracosanóico) . Portanto, esta enzima foi considerada como sendo uma desnaturase Δ9 de Iignoceroil-CoA, embora tivesse também a atividade de desnaturase Δ9 de behenoil-CoA.

CLl mostrou a atividade de desnaturase Δ12 em ácidos palmitoléico e oléico resultando em C16:2A9,A12 e LA, respectivamente, o mesmo espectro de atividade que TribdesatlO embora a atividade foi menos eficiente do que para TribdesatlO.

CL3 mostrou a atividade de desnaturação eficiente em C14 :0 para produzir C14:1A9. O enzima não teve a atividade detectável para C12:0 ou C16:0 e portanto pareceu ser uma desnaturase Δ9 de miristoil-CoA específica. Não teve a atividade em substratos monoinsaturados, tais como C12:1Δ5 ou C2 0:1. Na base da homologia de seqüência com os desnaturases de acil-CoA conhecidas, esta enzima foi presumida agir no substrato de acil-CoA. Esta enzima foi portanto caracterizada como uma desnaturase Δ9 de miristoil-CoA. Substratos (n.p. - produto não detectado) 24:0 n.d. •d C •d C •d B' •d B •p-u •d B •p-u τ: fy^ ^t 3 » .o es < •p-u n.d. •d d I 22:0 •p-u -d B n.d. n.d. •p-u •d d ■d B ■d B 22: ΙΔ 9 50.3% •d B n.d. •pu 20:1Δ13 I •α C n.d. r 1 I I Ό d •p-U 20:0 n.d. •ρτι n.d. •p-u -p-U •p-u n.d. ■d d 20:1Δ9 14.7% n.d. ■d d n.d. 18:3 -α C I ■d B t n.d. •p-U I 18:2 ■ο B n.d. •d B n.d. -p-U •d B •d d •p-u -d d •d B I 18-.1Δ9 •p-u n.d. n.d. -p-u n.d. n.d. 18:2Δ9 Δ12 30.5% I •d B 18:2Δ9 Δ12 1.5% -d B 18:0 •d C Ι8:1Δ5 43.3% 18:1Δ5 19.0% •d B 18:1Δ9 88.7% 18:1Δ9 79.2% n.d. n.d. 18:1Δ9 35.6% ■d C I 'P'u n.d. 16:1Δ9 I ■β C -p-u •p-U n.d. ■d d n.d. 16:2Δ9 Δ12 15.9% n.d. 16:2Δ9 Δ12 0.1% ι n.d. o 16:1Δ 9 27.8% 16:1Δ 5 17.0% 16:1Δ 5 8.0% ■d C 16:1Δ 9 11.8% 16:1Δ 9 8.9% 16:1Δ I 9 5.0% n.d. 16:1Δ 9 8.3% -p-u •d C •p-u 15:0 15:1Δ 9 28.0% • t I « •d B I I 14:1Δ9 •pu •d C n.d. ■d d n.d. -p-u n.d. t n.d. I I n.d. ι ■p-U 14:0 14:1Δ9 48.6% •p-U n.d. ■d B •d B n.d. ■d d n.d. 14:1Δ9 12.0% n.d. •p-u 14:1Δ9 61.2% 12:1Δ5 I > ■ I I I ■d d n.d. 12:0 12:1Δ9 1.8% n.d. -p-u •d B •p-U n.d. ■d B n.d. n.d. In.d. n.d. n.d. 10:0 10:1Δ9 0.5% •d β •d B •d S n.d. n.d. •p-u ; •p-u ! n.d. •d d •d d -p-u Desnaturase Tribdesat 2a Tribdesat 2b Tribdesat 2c Tribdesat 4 Tribdesat 5 Tribdesat 6a Tribdesat 8 Tribdesat 10 Tribdesat 11 Tribdesat 12 CLl CL3

ID

m Exemplo 9. Clonagem de genes de desnaturase no vetor de entrada pENTRll Gateway.

Para construir genes funcionais ou genes a serem testados em um vetor de entrada Gateway, as construções de pGem-T-Easy contendo seqüências gênicas de comprimento total foram digeridas com enzimas de restrição para retirar as inserções. Estas foram separadas em um gel de agarose 1% e o DNA dos fragmentos de aproximadamente 1 kb purificado usando o kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 vetor de entrada Gateway pENTR 11 (Invitrogen) foi preparado e digerido com as enzimas de restrição requeridas e desfosforilado usando Fosfatase Alcalina de Intestino de Vitela (Roche). Os fragmentos de gene foram ligados com o vetor e transformado na cepa de E.coli JM109. Os transf ormantes foram selecionados nas placas de ágar LB contendo 5 0 pg/ml de canamicina. Os clones contendo as inserções foram confirmados pela enzima de restrição e análise de seqüência.

Clonagem de genes de desnaturase em vetores de destino

Gateway para criar clones de expressão.

Dois sistemas de expressão, as células de inseto SF9 e Arabidopsis, foram selecionados e vetores de expressão Gateway escolhidos para cada um. Para as células de inseto SF9, pDEST8 foi escolhido e a seleção para transformantes DHlOBac foi realizada em LB suplementado com canamicina (50 pg/ml), gentamicina (7 pg/ml) e tetraciclina (10 pg/ml), Bluo-gal (100 pg/ml) e IPTG (40 pg/ml) . Para a transformação de Arabidopsis, o vetor binário pXZP3 91 (CSIRO Plant Industry) foi escolhido e a seleção para transformantes realizada em LB suplementado com espectinomicina (50 pg/ml).

Os clones de pENTRll contendo as inserções de gene e vetores de pDEST apropriados foram preparados e submeteram- se a uma reação de recombinação de LR de acordo com as instruções dos fabricantes (mistura de enzima clonase LR Gateway, Invitrogen). As misturas de recombinação resultantes foram transformadas na cepa de E.coli JM 109 para pXZP391 ou DHlOBac (Invitrogen) para pDEST8. Os transformantes contendo inserções corretas foram confirmados pela análise de enzima de restrição e análise de seqüência usando primers específicos de vetor.

Exemplo 10. Produção de Baculovirus recombinante de desnaturases ou acetilenases de inseto. Os genes de Tribdesat2b e CL3 foram clonados no vetor

pDest8 (Invitrogen), usando a recombinação Gateway como acima. As células DHlOBac competentes (Invitrogen) foram transformadas com clones pDest8 pelo método de choque de calor. Os transformantes foram selecionados em ágar LB contendo canamicina, tetraciclina e gentamicina (50 pg/mL, pg/mL e 7 pg/mL, respectivamente) e IPTG e Xgal nas concentrações apropriadas, e purificados por inoculação de esgotamento neste meio. Uma vez que os eventos de recombinação ocorreram em DHlOBac, os bacmídioss recombinantes (chamados agora pFastbac) foram identificados usando primers diretos e reversos para varredura de colônia das inserções 2b e CL2 em pFastbac em células DHlOBac. Os clones positivos produziram uma faixa de aproximadamente 3kb. Os clones foram escolhidos para aplicações a montante 3 0 que não tiveram nenhuma evidência de contaminação de vetor vazio que poderia ser observada como um produto de 3 0 0bp.

Os transformantes contendo os plasmidios pFastbac tendo as inserções 2b e CL2 foram crescidos durante a noite no meio LB contendo os antibióticos. Um protocolo de isolamento de plasmídio de Iise alcalina modificado foi usado de acordo com as instruções do fabricante no manual de Sistema de Expressão Bac-to-Bac. 0 DNA isolado foi dissolvido em 40 pL IX TE tampão de pH 8,0 e quantificado usando o espectrofotômetro Nanodrop e armazenado em 4°C. Transfectando Células de Inseto

As células Sf 9 (linhagem celular de ovário de Spodopetera frugiperda) foram semeadas em uma placa de cultura de tecido de 6 poços em uma taxa de 9X105 células por poço, em 2 ml de meio livre de soro SF900II (Invitrogen). As células foram permitidas aderir à superfície de poço por 2 horas em 27°C. Para cada transfecção, 1 pg de DNA de bacmídio purificado foi diluído em 100 uL de Meio de Grace não suplementado (Invitrogen) ,

em

tubos de poliestireno. 6pL de Reagente Cellfectin

®

(Invitrogen) foi diluído em 100 pL de Meio de Grace não suplementado em tubos de poliestireno. 0 DNA e o Reagente de Cellfectin® foram então misturados juntos e incubados em temperatura ambiente por 3 0 minutos. Enquanto os complexos DNA:lipídio foram incubando, as células foram lavadas uma vez com 2mL de Meio de Grace não suplementado e o meio foi então removido. 0,8 mL de Meio de Grace não suplementado foi adicionado ao complexo DNA:lipídio, misturado e então adicionado às células SF9 lavadas. A transfecção foi permitida proseguir em 270C por 5 horas. Os complexos de DNA:lipídio foram removidos das células e 2mL de SF900II foram adicionados. As células foram incubadas em 27 0C até que sinais de infecção estivessem óbvios. Uma vez que as células pareceram infectadas, o vírus foi colhido por centrifugação do meio de cultura de célula em IKrpm por 5 minutos em 20°C. 0 meio de cultura de célula clarificado foi transferido aos tubos e armazenado em 4 °C. Isto foi chamado de estoque viral PI.

Amplificando os estoques de baculovirus As células Sf9 foram usadas para semear frascos de 25cm2 em uma taxa de IxlO6 células/mL em 5mL de meio. As células foram infectadas com o estoque viral Pl em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 partículas de vírus por célula, que foi estimada como sendo 5xl06 células/mL. Após 4 8 horas em 27°C, as células foram mostrando sinais de infecção e o meio de cultura de célula foi colhido como destacado acima. Isto foi chamado de estoque viral P2. 0 estoque P2 foi então usado para produzir um estoque P3. Os frascos de 75 cm2 foram semeados em uma taxa de IxlO6 células/mL em 15 mL de meio SF900II, e infectados em um MOI de 0,1 partícula de vírus por célula, que foi estimada como sendo 5xl06 células/mL. Após 48 horas em 27°C, as células estavam mostrando sinais de infecção e o meio de cultura de célula foi colhido como destacado acima. Isto foi chamado de estoque viral P3. Para determinar o título exato de cada estoque P3, uma

TCID50 (dose Infecciosa de Cultura de Tecido) foi realizada. Uma bandeja de 96 poços foi semeada com 3xl03 células por poço. As células foram incubadas em 270C durante a noite. Diluições de 10 vezes do vírus foram preparadas a IO"8. 50pL de diluições IO"3 - IO"8 foram adicionadas a 8 poços cada. 0 TCID50 foi então incubado por 7 dias em 210Q.. Os poços foram classificados positivo ou negativo para a infecção de vírus. Uma vez que os vírus foram titulados, as infecções de células SF9 com multiplicidade conhecida de infecções (MOI) poderiam proseguir. As células infestadas foram removidas e secas sob vácuo.

Os metil ésteres de ácidos graxos de células de inseto infectadas com a construção expressando Tribdesat2b foram obtidos usando o reagente de metanol ácido direto como previamente descrito e analisado por CG/EM. 0 traço e espectro de CG/EM mostraram a produção de C16:1A5 e C18:1Δ5 por SF9 expressar Tribdesat2b, em comparação ao controle de SF9. A eficiência de conversão de C16:0 a C16:ld5 nas células de inseto transduzidas com a construção foi de 16,9% e a eficiência de conversão de C18:0 a C18:ld5 foi de 29,7%. Estes dados portanto confirmaram os dados obtidos das células de levedura expressando Tribdesat2b e foi concluído que este gene codificou uma desnaturase Δ5 ativa em substratos C16:0 e C18:0, com atividade maior no último. Portanto quase certamente codificou uma desnaturase Δ5 estearoil-CoA, a qual a atividade não é previamente relatada para um gene clonado. As outras desnaturases são do mesmo modo esperadas mostrar atividade em células de inseto.

Exemplo 11. Expressão de genes de Tribolium e Chauliognathus em plantas

Os genes TribdesatlO e 2b de Tribolium foram clonados em pENTRll como descrito acima e então recombinados no 3 0 vetor de expressão de planta pXZP3 91 que fornece para a expressão da inserção de região de codificação sob o controle de um promotor de napina específico de semente (FpI) isolado de Brassica napus (Stalberg e col., 1993). 0 plasmídio de expressão foi transformado em tumefaciens AGLl de Agrobacterium, e usado para a transformação de planta no mutante duplo fad2/fael de Arabidopsis thaliana que não tem a atividade de desnaturase Δ12, por método de planta. As sementes de plantas inoculadas por pulverizador foram colhidas 3-4 semanas mais tarde e plaqueadas em meios seletivos. As plantas transformadas Tl foram identificadas em meios MS contendo 40mg/L de canamicina e lOOmg/L de timentina, e transferidas em jarros na estufa. As sementes T2 de cada planta Tl foram analisadas para a composição de ácido graxo por cromatografia gasosa. Os dados mostrados na Figura 6 demonstraram a atividade de desnaturase Δ12 de TribdesatlO em Arabidopsis, bem como LA foi produzido de ácido oléico na planta mutante fad2/fael.

Expressão de transgenes em calos de tabacco e plantas As regiões de codificação de Tribdesat 2b, CLl e CL2 foram clonadas na orientação 'senso' no vetor de expressão de planta pVEC8 (Wang e col., 1997) sob o controle do promotor de CaMV 3 5S de seqüências regulatórias e sinal de terminação/poliadenilação de transcrição de sintase de octopina (Gleave, 1992) , fornecendo a expressão constitutiva forte do transgene na maioria dos tecidos de planta. 0 transgene foi introduzido no tabaco pela transformação mediada de Agrobacterium de tecido de folha (Horsch e col., 1985) com seleção das linhagens de célula transgênicas no meio contendo higromicina. As células de 3 0 planta de transgênica foram selecionadas baseadas na resistência à higromicina, como conferenciado por um gene marcador de resistência hpt no vetor derivado de pVEC8. As linhagens de tabaco transformadas foram cultivadas para produzir calos ou regeneraram para produzir plantas inteiras, dependendo do regime de fitohormônio nos meios de seleção e crescimento (Murashige e Skoog, 1962; Horsch e col. , 1985). Os calos de tabaco transgênico não diferenciados foram produzido pela seleção em fitohormônios indutores de calos (0,5 mg/L de ácido acético indol (IAA) e 0,05 mg/L de cinetina) e os calos foram mantidos em placas de ágar. As plantas de tabaco diferenciadas foram produzidas primeiramente selecionando o material transgênico em meios indutores de broto pela adição de fitohormônios indutores de broto (100 pg/L de N-6- benziladinina (BAP) e 500 ng/L de IAA) . Após 3 semanas de crescimento neste meio, ápices de tabaco individuais foram cortados dos discos de folha e replantados em meios indutores de raiz contendo os fitohormônios indutores de raiz (50 ng/L de IAA). 3 semanas adicionais são requeridas para a formação de raízes. 0 material transgênico, calos ou plantas inteiras, foi selecionado para a análise como requerido.

O gene Tribdesat2b foi também recombinado usando clonase LR no vetor de expressão de planta pXZP3 93 (CSIRO Plant Industry) sob o controle do promotor de 35S CaMV constitutivo. 0 plasmídio de expressão pXZP384 resultante foi transformado em AGLl, e usado para a transformação de planta em folhas de tabaco como descrito acima. A composição de ácido graxo das folhas de tabaco transgênico e semente será analisada por CG e CG-EM para mostrar a modificação de composição de ácido graxo pela adição da atividade de desnaturase nova.

Exemplo 12. Clonagem de genes de desnaturase da Acheta domesticus.

Alguns insetos são pensados em possuir a atividade de

desnaturase Δ12, mas como ainda nenhum gene codificando tal enzima foi isolado apesar do esforço extensivo durante 20 anos. As razões para esta falha eram desconhecidas até o presente trabalho. Um inseto conhecido por possuir a atividade de desnaturase Δ12 é Acheta domesticus, o grilo comum. Em uma tentativa inicial de clonar um gene de desnaturase Δ12 de A. domesticus, um conjunto de primers degenerados AdD12Des-Fl (5'-TTGTTCTGTGTGGGTCAYGAYTGYGGWCA (ID. de SEQ. N°: 127)) e AdDl 2Des -Rl (5'- GTGATGGCGGACGTGACIGT YKGTRAT (ID. de SEQ. N°: 128) foram projetados baseados em regiões de box I de histidina conservada e box III de histidina de FAD2 desnaturase Δ12 A. thaliana (P46313), FAT-2 de desnaturase Δ12 de Caenorhabditis elegans (AAF63745) e FAT-I desnaturase Δ15 (L418 07), correspondendo a LFCVCHDCGH (resíduos de aminoácido 88-97) e ITNGHVAHH (resíduos de aminoácido 291- 299) de FAT-2. Entretanto, as reações de RT-PCR usando RNA total de corpo gorde de A. domesticus com este conjunto de primers não amplificaram nenhum produto específico apesar das tentativas repetidas e condições variadas, sugerindo que o gene(s) de A. domesticus codificando desnaturase Δ12 poderia compartilhar a baixa homologia para a planta ou genes de desnaturase Δ12 de nematóide.

Uma abordagem diferente foi considerada para clonar o 3 0 gene de desnaturase Δ12 de A. domesticus. Baseado na homologia de sequencia de aminoacido compartilhado entre desnaturases de Δ9, ΔΙΟ, Δ11 e Δ14 de acil-CoA de acido graxo de 55 insetos das especies incluindo Argyrotaenia velutinana (AAF44709) , Bombyx mori (BAD18122, AAF80355), Epiphyas postvittana (AAK94070), Helicoverpa assult (AAM28484, AAM28483) , H. zea (AAF81787, AAF81788) , Musca domestica (AAN31393), Ostrinia furnacalis (AAL27034, AAL32060, AAL35746), O. nubilalis (AAF44710, AAL35330, AAL35331) , Trichoplusia ni (AAB92583, 044390, AAD03775) etc., primers degenerados (AdD12Des-F2 5' -

TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG (ID. de SEQ. N° : 129) e AdD12Des- R2 5' -TGRTGGTAGTTGTGVHANCCCTC (ID. de SEQ. N0 : 130) ) foram projetados para que se direcionassem duas regioes conservadas destas desnaturases (FFFS/AHI/VGW (ID. de SEQ . N0 : 131) e EGY/W/FHNYHH (ID. de SEQ. N0 : 132), correspondendo aos residuos de aminoacido 145-152 e 263-270 de desnaturase Δ9 AAF44709 de A. velutinana) em uma tentativa de clonar um gene de desnaturase Δ12 de inseto. De forma surpreendente, RT-PCR de RNA total de corpo gordo de A. domesticus amplificou uma sequencia tipo desnaturase de 360 pb divergente, junto com outro fragmento de gene de desnaturase identico a parte da desnaturase Δ9 de A. domesticus conhecida. (AdD9Des, AF338466). A amplificagao rapida de extremidades de cDNA usando ο kit GeneRacer (Invitrogen) e as sequencias internas ao fragmento de 360 pb resultou em uma sequencia de cDNA de 1597 pb que foi designada AdD12Des (ID. de SEQ. : 133) codificagao para um peptideo de 357 residuos de aminoacido (ID. de SEQ. N0： 134).

As sequencias de cDNA de AdD9Des, AdD12Des e TribdesatlO foram cada uma clonadas no vetor de expressao de levedura pYES2 (Invitrogen), gerando os plasmidios pXZP277, pXZP282 e ρYES2-TriblO respectivamente. Os plasmidios pYES2, pXZP277, pXZP282 e pYES2-TriblO foram transformados na celula de Saccharomyces cerevisiae da cepa OLEl contendo uma mutagao silenciada de desnaturase Δ9, (Stukey e col., 1990) a fim de testar para a complementagao desta mutagao e portanto indicar a atividade de desnaturase Δ9. As celulas OLEl de levedura necessitaram ser fornecidas com um acido graxo insaturados, tal como C16 ： Ia9 para manter ο crescimento, a menos que uma desnaturase Δ9 seja expressa dentro das celulas, que foi a base do teste de complementagao. Os transformantes em celulas de OLEl foram selecionados na placa de agar de raeios de saxda (SD-Ura) fornecida com 0,5 mM de C16 ： 1Δ9 e 1% de NP-40. Os transformantes de OLEl de levedura carregando os plasmidios acima mencionados foram primeiramente crescidos em meios de YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%, dextrose 2%), fornecidos com 0,5 mM de C16 ： 1Δ9 e NP-40 1% em 30。C ate OD600 em torno de 1,0. As amostras foram entao ajustadas a um ODsoo de 1,0, diluldo na serie de 1:10 e aliquotas de 1 μΐ de cada diluigao colocada nas placas de agar YPG, que foi a mesma que os meios YPD a que Ies que continham galactose 2% em vez de dextrose para induzir a expressao genica dos vetores derivados de pYES2.〇 crescimento de celulas foi observado apos 2 dias em 30°C. A expressao de desnaturase Δ9 de A. domesticus em celulas OLEl claramente complementou ο fen6tipo de OLEl, enquanto a expressao de AdD12Des de A. domesticus nao complementou, indicando que

nao estava funcionando como uma desnaturase Δ9 em celulas de levedura. As celulas de OLEl expressando a desnaturase Δ12 de T. castaneum foram mostradas para ereseer na placa de YPG somente na presenga de C17：1 adicionado. Estes dados estabeleceram que 〇s genes de AdD12Des ou TribdesatlO clonados nao codificaram outro membro de uma famiIia de desnaturase Δ9.

Estes plasmidios de expressao foram tambem transformados em celulas de S288C Saccharomyces cerevisiae, que e uma cepa de levedura de laboratorio comum. A extragao de esteres de metila de acido graxo (FAMA) das celulas de levedura e analise foi realizada como descrito por Zhou, e col. (2006) . A expressao de AdD12Des em S. cerevisiae produziu acidos graxos de dieno novos C18：2 e C16：2 a partir de C18：1 e ClG：1, respectivamente, como demonstrado por cromatografia gasosa (CG) de esteres de metila de acido graxo de levedura (Fig· 7A) quando comparado as celulas com somente 〇 vetor pYES2 (Fig. 7B) , confirmado pelo tempo de retengao e espectro de massa identicos como ο padrao C18 ： 2Δ9,12 puro no primeiro exemplo. As posigoes de ligagao dupla dos produtos C18：2 e C16：2 foram confirmadas por espectrometria de massa-CG do derivado 4,4 -dimetiloxazolina (Fay e Richli, 1991) por estar nas posigoes Δ9 e Δ12 pelo intervalo de 12 unidades de massa atomica entre m/z 196 e 208, 236 e 248 (Fig. 2C). A produgao destes dienos demonstrou que AdDl2Des e TribdesatlO codificaram desnaturases Δ12 agindo em C16：1Δ9 ou C18：Ia9 .

Ao expressar em celulas de cepa de levedura OLEl, a desnaturase Δ12 de Γ. castaneum produzida de C18：2 a partir de C18 ： 1 em uma taxa de conversao de 30,5%, e Cl6:2 a

partir de C16：1 na taxa de conversao de 16,0% (tabela 11〉， 10

15

20

25

indicando uma preferencia da enziraa para ο substrato C18 sobre ο substrato C16. Houve uma diminuigao concomitante no nivel de acido graxo de substrato nas celulas.

Tabela 11. Composigao de acido graxo (% de acidos graxos totais) de celulas OLEl de levedura expressando a TribdesatlO desnaturase de Tribolium castaneum em pYES2 quando alimentado de substratos C16：1 ou C18：1, comparada a um controle de vetor pYES2 vazio.

Composigao de acido graxo (% total de acidos graxos)

12:0 14:0 15:0 16:0 16:1 17:0 16:2 17:1 18:0 18:1 18:2

pYES2+ C18:l

TribdesatlO + C18:l

pYES2 + C16:l

3.0 2.2 0.7 41.7 0.2 0.6 3.3 2.3 1.0 43.2 0.1 0.8 3.9 2.9 0.7 42.5 20.6 0.5

10.9 16.9 23.8 0 8.6 18.0 15.7 6.9 9.1 19.4 0.4 0

TribdesatlO + 4 2 31 Q 8 43 6 14.7 0.6 2.8 7.8 21.9 0.4

O

As regioes de codificagao de protelna desnaturase Δ12 de A. domesticus e T. castaneum foram tambem clonadas em um vetor de expressao de planta para gerar ο plasmxdio pXZP375 e pXZP376 respectivamente, sob ο controle do promotor especxfico de semente Fpl (Stalberg e col., 1993) . Estes plasmldios de expressao foram introduzidos em tecidos de um mutante duplo fad2/fael de A. thaliana (Smith e col., 2003) para produzir plantas transformadas atraves de Agrobacterium tumefaciens como descrito por Zhou e col., (2006) · A analise de CG de semente FAMEs foi essencialmente como descrito acima. Mostrado na Tabela 12 como um exemplo, seis linhagens transgenicas trans formadas com ο gene AdD12Des codificando a desnaturase Δ12 de A. domesticus

eficientemente produzirara C18：2, com niveis obtidos de pelo menos 42% do acido graxo total no oleo de semente, e pelo menos 20% de C18:3, ambos os quais foram produzidos na semente a partir de C18：1. Ja que ο mutante duplo fad2/fael de A. thaliana tinha ainda a desnaturase Δ15 do tipo selvagem (FAD3)· esta enzima foi presumida desnaturar C18：2, quando disponivel, em C18：3· Portanto, ο C18 ： 3 produzido nestas linhagens transgenicas foi tambem um produto de conversao de C18:1 a C18：2 pela desnaturase Δ12 de A· domesticus, e produto de desnaturase Δ12 de A. domesticus representado. Este resultado confirmou a atividade de desnaturase Δ12 do gene clonado, e representou a primeira demonstragao de uma desnaturase Δ12 de inseto recombinante em celulas transformadas.

Tabela 12. A composigao de acido graxo (% de acidos graxos totais) de sementes de Arabidopsis transgenicas expressancio 〇 AdD12Des de A. domesticus no mutante duplo fad2/fael.

Amostra C16:0 C16:l C18:0 C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20:l fad2/fael* 4.9 0.5 2.09 90.21 0.2 2.06 0.0 0.35 EYl 6.33 0.0 2.46 26.61 40.07 24.53 Trago Trago EY6 5.27 2.48 85.93 3.74 2.47 0.11 Trago EY7, 2.9 0.0 44.7 29.1 23.3. 0.0 EYl 3 2.3 0.0 43.1 31.0 23.6 0.0 EYl 5 3.9 0.0 25.4 46.2 24.6 0.0 EY20 4.16 0.0 0.05 55.81 19.20 21.11 Tra?o Tra?o

* fad2/fael corresponde as plantas de controle (nao 2 5 transformadas)

A analise filogenetica de sequencias de proteina de desnaturase de acil-lipidio ou acil-CoA representativas mostrou que as sequencias de aminoacido de AdD12Des e TribdesatlO se aglomeraram com outras desnaturases de acil- CoA (Iado direito da Figura 9 ； Figura 10) . Os niimeros de acesso e especies para as desnaturases de inseto usados na analise foram： AdD9, de Acheta domesticus AAK257 96； AdD12, de A. domesticus ID. de SEQ. N0 ： (ID. de SEQ. N° ： 135); BmDIO-ll, Bombyx mori AAF8 0355; BmDll, B. mori BADl8122； DmD9, de Drosophila melanogaster CAB69054; MdD9, de Musca domesticus AAN313 93； 0nD9, de Ostrinia nubilalis AAF44 710； OnDll, de O. nubilalis AAL35331；〇nD14, de O. nubilalis AAL35330； PoD9, de Planotortrix octo AAF73073； PoDlO, de P. octo AAG54 077； TcD9A, de Tribolium castaneum XP_969607； TcD9B, de T. castaneum XP_966962； TcD12, de T. castaneum TribdesatlO (ID. de SEQ. N0 ： 28); TnD9, de Trichoplusia ni AAB92583； TnDll, de T. ni 044390 ； outras desnaturases de animal AcD12-15, de Acanthamoeba castellanii ABK1555 7； CeD12, de Caenorhabditis elegans AAF63745； RnD9, de Rattus norvegicus P073 08； desnaturases bacterianas N3 6D9, de Nostoc sp. 36 CAF18423ANoD9, de Nostoc sp. PCC 7120 {Anabaena variabilis) BAA03434； NoD9, de Nostoc sp. PCC 7120 BAA03435； SyD9, Synechocistis PC 6803 BAA03982； SyD12, Synechocistis PC 6803 P203 88 ； desnaturases fiingicas LkD12, de Lachancea kluyveri BAD08375 ； MaD9, de Mortierella alpina BAA75927； Y1D12, de Yarrowia lipolytics CAJ812 09; ScD9, de Saccharomyces cerevisiae P2114 7； desnaturases de planta AtD9, de Arabidopsis thaliana AAK7 65 92； AtD12_FAD2 (desnaturase Δ12 de ER), de Arabidopsis thaliana P4 6313； AtD12_FAD6 (desnaturase Δ12 de plastxdio), de A. thaliana P4 6312； PgD9, de Picea glauca AAM12238). D9, DlO, Dll, D12, e D14 designam desnaturases Δ9, ΔΙΟ, Δ11, Δ12, e Δ14, respectivamente.

AdD12Des e TribdesatlO mostraram somente identidades

baixas (ate 23%) sobre as sequencias de aminoacido de comprimento total para desnaturases Δ9 bacterianas ou desnaturases Δ12 de planta, fiingicas e animais que formaram outro aglomerado principal predominantemente de desnaturases de acil-Iipidio (lado esquerdo da Figura 4). O baixo nivel de identidade de AdD12Des e TribdesatlO com as desnaturase Δ12 de outros animais, plantas ou fungos foi particularmente inesperado. Contrariamente, AdD12Des formou um aglomerado discreto com as desnaturases Δ9 de inseto incluindo aqueIes de grilo de casa e besouro de farinha vermelho sugerindo sua evolugao possivel dos genes de desnaturase Δ9. A extensao de identidade na sequencia de aminoacido AdD12Des a estes foi 65,2%, 55,2%, 55,5%, 53,5%, 53,5%, 55,3%, 59,4% e 53,6%, respectivamente, as desnaturases Δ9 de inseto do A. domesticus AF33 84 66, D. melanogaster CAB69054, M. domesticus AAN31393, O. nubilalis AAF44710, P. octo AAF73073, T. castaneum XP_9 6 96 07, T. castaneum XP_966962 e T. ni AAB9258. Em particularmente, AdD12Des era relativamente proximo em sequencia a proteina de desnaturase Δ9 da mesma especie, compartilhando aproximadamente 65% de identidade de aminoacido.

Enquanto TribdesatlO apareceu em um ramo separado da arvore filogenica as outras desnaturases de acil CoA incluindo desnaturases Δ9 de Tribolium a qual compartilhou ate 48% identidade, pode ter evoluxdo independentemente dos genes de desnaturase Δ9 de inseto. Como mostrado pelos dados na Figura 3, AdD12Des reteve baixos nlveis de atividade de desnatura^ao Δ9 nos acidos graxos saturados de cadeia media, C14：O e C15：O, quando expresso na levedura. A Figura 3A mostra ο grafico CG parcial de perfil de acido

3 0 graxo em celulas de levedura expressando somente ο vetor pYES2, enquanto 3B mostra ο perfil de acido graxo nas celulas de levedura expressando pXZP282, com picos de C14：1 e C15：1 extras. Entretanto, nenhuma atividade de desnatura9ao Δ9 detectavel foi vista na levedura expressando TribdesatlO. Estas descobertas sugerem que estas duas desnaturases Δ12 de inseto divergiram independentemente de uma desnaturase antiga. Foi tambem digno de nota que as outras desnaturases Δ12 de animal de Caenorhabditis elegans e Acanthamoeba castellanii foram relacionadas mais proximamente as desnaturases Δ12 de planta do que as desnaturases Δ12 de inseto AdDl2Des e TribdesatlO (27,2% e 38,6% de identidades de sequencia de aminoacido a desnaturase Δ12 FAD2 de Arabidopsis thaliana, respectivamente, 〇u 11；6% e 11,1% de identidades de sequencia de aminoacido para AdD12Des de A. domesticus, respectivamente).

Para testar se a desnaturase Δ12 de A. domesticus clonado usou C18：1 de aciI-CoA c〇m〇 substrato ao inves de C18 ： 1 de acil-PC, ο gene de desnaturase Δ12 de A. domesticus em pXZP282 foi expresso em celulas de levedura S288C. A regiao de codificaqao de gene de desnaturase Δ12 de Arabidopsis thaliana codificando FAD2 foi tambem clonado em pYES2, resultou na construgao pXZP279, e expresso em S288C como um gene de controle, como um exemplo de uma desnaturase Δ12 de planta que e conhecida por ser uma enzima do tipo acil-PC. As culturas dos transformantes de levedura foram incubadas na presenga de C14 marcado C18 ： 1 (5xl06 dpm) e celulas foram colhidas em 2, 5, e 30 minutos, el, 6 e 24 horas mais tarde. Para resultados otimos, as celulas foram lisadas usando granulos de vidro seguidos por passagens repetidas atraves de um desfibrador de tecido. Os acidos graxos ligados a CoA foram extraxdos como descrito por Domergue e col. (2005), convertidos a FAMEs e separados por cromatografia de camada fina-argentagao (TLC)· O acido oleico adicionado ao meio durante a indugao tornou-se imediatamente disponivel nas fragoes de acil-CoA, PC e TAG. Observou-se que FAD 2 de Arabidopsis acumulou ο produto C18：2 marcado na fragao de acil-CoA de 30 minutos adiante. Em contraste, a conversao de C18：1 a C18：2 marcado pela desnaturase de grilo foi observada em 2 minutos apos a adigao do substrato, indicando que esta enzima usa acil-CoA como substrato. Portanto, AdD12Des, e presumivelmente TribdesatlO, eram do tipo desnaturase Δ12 oleoil acil-CoA, ao inves de desnaturases Δ12 oleoil acil-PC. Os genes codificando a classe anterior de desnaturase Δ12 nao foram identificados previamente.

A clonagem das desnaturase Δ12 acil-CoA de inseto descrita aqui e esperada estimular a descoberta de outros novos genes de desnaturase de acido graxo poliinsaturado de inseto e fornecer uma perspectiva maior no metabolismo de acido graxo de inseto. O papel deste gene no desenvolvimento e fisiologia do inseto pode ser estudado em mutantes de inativagao. A caracterizagao destes genes de desnaturase Δ12 trara ideias na evolugao de desnaturases de inseto atraves de genes ancestrais. Finalmente, isto aumentara nossa compreensao de relagoes tipo sequencia- substrato entre desnaturases de acido graxo, ja que as desnaturases Δ12 de inseto associadas a membrana sao pensadas em usar substratos de acil-CoA (Cripps, e col. 1990), enquanto as desnaturases Δ12 de planta associadas a membrana utilizam a fosfatidilcolina (PC) como um substrato (Stymne e Appelqvist, 1978). REFERENCIAS

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<212> DNA <213> Tribolium castaneum <400> 12 atggctccaa attcgctcag caaatcggaa tatttgggag aaccagtcca aattattagt 60 aaaccaaatg ttgaatacag tatagaaact caaaataaat acaatttacc tcacaataga 120 tggcaaatag tttggagaaa cgtcttaata tttgcatatc ttcattatgc agctttttac 180 ggcttatatt acatgctcac tttagctcaa tggaaaagta tcatttgggg atatgctgtt 240 atcctatttg caagtattgg agtaaccgga ggagcacata ggttatgggc ccatcgttcg 300 tataaagcaa aactcccatt acgaatttat ttagcttttt ggcagactgt tgctttacaa 360 aatcacatct atgaatgggt gcgagatcac cgagtgcacc acaaatttac agacacagat 420 gctgatcctc ataattctaa tcaaggattt tttttctcac atatgggttg gctgatgctc 480 aaaaaacaca aagatgtatt tattaaaggc aaaactattg atctgagtga tgtagcagct 540 gatccagttg tccagtttca aaaaaaatat tatttaatct tggctccgat tctaacgttt 600 gtttttcctg caattgttcc ttggtacttc tggaacgaaa atccaatagt gtgctattat 660 tctttagcaa ttttgaggta cattttaaat cttcatgggg cttggttggt aaatagcgca 720 gctcatatct ggggctacaa accattcgat aagaacataa atgctacaga caatataagc 780 gtcgctatta tcgctttcgg tgaaggatgg cacaattacc accacgtttt tccttgggat 840 tacaaagctg cagaattagg taactacagg atgaatttta ctacggcttt tcttgatctg 900 atggcaagaa ttggacaggc ttatgatttg aaaacagtgt ccgttgaaat gatcaacaag 960 agaaggaaaa gaactggtga tggtaccggt gtagttgatc ctttggtgga aaataaagaa 1020 gaccatcgcc atgaagacac tgtttgggga tggggtgaca aagatatgaa ccaagatgaa 1080 atgaatttgg ttgaaattta taatccaagt agcaaagaac cgtaa 1125 <210> 13 <211> 1077 <212> DNA <213> Tribolium castaneum <400> 13 atgtcggccc agaccattac cacgacggag accacacaaa atgcccagaa accgcagcag 60 taccattgga ggatggtctg gaggaacatc atcctgtaca ttatcatgca cctcaccggc 120 ttctatggac tgtacctggc catgttctac gcccagtgga aaacagtctt ttacagttgg 180 ttccttctgg tcatagccct tcaaggagtg acagctggta gtcaccgcct ctgggcccac 240 aaggcctaca aggcgcgact ccccctccga atgcttcttt gtattttcca aaccctgtcc 300 ctccagaacc acatctacga ctgggccacg taccaccgcg tccaccacaa gttcgtcgat 360 accaacgccg acccacacaa ctcgcgccgc ggcttcttct tctcccatat gggctggttg 420 ttcatcgagc cccacaaaga cgtggaggat aaatacaagt cgatcgactt cagcgacttg 480 catgccgatt ccgtggtcat gatccagaaa aagtactacc acacgttctt tgcgccagtc 540 attgggttct acctcccggc ggcgatccca tggtacttct ggggcgagaa cttctggacc 600 gcgtttttcg ttgcgaccat gctgcggtac tgcgcctgta ccaacattac gttccttgtg 660 aacagttggg cccatattta tgggtcccgc ccatacgaca agaacattta tcccaccgaa 720 agtgcaacga ttgcggtttt gaccggtggg gagggttggc acaactacca tcacaccttc 780 ccgtgggatt ataagaccgg ggagtttggg aagtaccgga gtaaccttac cacgggcttt 840 ttggacttta tggcggccat aggctgggcc tatgacctca agaccgtgtc ggaagagatg 900 ataatgaaga gggtgctgcg cacgggtgat ggtactcgga agtttgataa gatcgataag 960 atactcaatg tggacgatga ccaccaccat gaagacatgc tctgggggtg gggggatagt 1020 gatatggcca aagaggaaat gaactacgtc aaaattcaca acaggaagga ggattaa 1077 <210> 14 <211> 1008 <212> DNA <213> Tribolium castaneum <400> 14 atgggagcgc tcaaacaaac cgaggaggaa aaaactctac taccacaaga catcggaacc 60 gattacacct tcaagcggaa aatcgtctgg ttcaatgcta ttggattctt catcttgcac 120 ctcttggccc tttatggcgg ctaccggctg ctgcattgcc acatcctgac gccgcttttc 180 gccctagcac tgatgttcgt ctctggcgaa ggcatcaccc tcggggccca ccgcctgtac 240 tcccacaagg ccttcaaagc gtctttcgtc gtgcgattag ctgtgataat tttgcacacc 300 atcgccggtc agaattgtct ctacatctgg gttcgcgacc accgccagca ccacaaatac 360 agcgacaccg acgccgaccc ccacaactcc aacaggggct tcttcttctc gcacatcggc 420 tggctgatga gcaggaagca ccctgctgtc atcgccaagg gcaagaccat cgacatgagc 480 gacctggaga acgactcgct cgtgatgcta cagaaagaac attacaagtt tctgtacatc 540 attttcgcca tcgggatccc aatcgcaatc ccgatttacg gctggaacga gtctttcacc 600 aactcgctct ttatcagcta ctttggaaga tacattcttc agttacacgc cacttggctg 660 atcaacagcg ctacgcactt gtacgggacc aagccctacg acaagttcat gaatccggtg 720 gagaattatt ttatttcgat gattgccctt ggcgaaggct ggcataacta ccaccacgcc 780 tttccctcag attatcgggc ggcggagtat ggcgttagat actcgataac gacttttctg 840 atagacgctc ttgccttttt tggcctgctt tatgacttga aagaggccaa ctcggagcaa 900 gtcaaaatcc gggcggtcaa aaagggggat ggcagccacc cagtcttcgg gaaacagaag 960 gagatggaag ttaactttag cgataggcag gttacggcaa atggttaa 1008 <210> 15 <211> 1170 <212> DNA <213> Tribolium castaneum <400> 15 atggctccta atttgctagg aaattcaacg ttatttctcg ctgaaacaaa ttcagccgaa 60 ccaatacaga ttattagtaa accaggactg caagatgtac taccgcaagt aaagccacaa 120 atttccagca gatcttctgt gtcccaatat agatggcaga ttgtatggag aaacgttttg 180 atatttatat acttgcacat tgctggtatt tatggattat attatgctat tgctcaagcg 240 caatggaaaa ctcttctctg gggatattta gttattctag catcaggaat tggcgtaaca 300 gcaggagcgc acagactgtg ggcccatcgc acatacaaag ctaaacttcc attacgaatt 360 tacttagctt tttgtcaaac tgttgcttta caaaatgaca tctacgaatg ggtgcgagac 420 catcgagttc atcacaaatt cacagataca gacgctgatc ctcacaactc taatcgagga 480 ttctttttct cacacatggg atggttattg gttaaaaaac acaaggatgt tttcgtcaag 540 ggcaaaactg tggatatgag tgatgtggaa gccgatccgg tggtacggtt tcaaagaaaa 600 tactacataa ttctaactcc aattttaaca tttgtttttc ctgctatcgt tccttggtac 660 ttctggaacg aaactcccac tgtttgcttc tatagtgtcg ccatctttag atatattctc 720 acacttcatg ggacttggct ggtaaatagt gcagctcata tttggggcta tagaccctat 780 gacaaaaaca taaatgccac agaaaacaaa agcgtttcaa ttctcgcttt cggtgaagga 840 tggcacaact atcatcatgt cttcccttgg gattacaaag ccgcagaatt aggaaactac 900 aggatgaatt ttactacggc ttttctggat ttgatgtcaa aaattggaca ggcttatgat 960 ttgaaaaccg tgtcagttga tatgatcaat aagagaagaa agagaactgg agatggtact 1020 Phe Phe Phe Ala His Val Gly Trp Leu Met Met 130 135

Ser Asp Leu Phe Glu Asp 155 160

His Pro Glu

ggattggttg acgaggaatt gctagaaaat gaagataaac atcaccacca tcatgatgac 108( agcatctggg gatggggtga taaagatatg aaacaagatg acatggatat ggtacaagtg 114( cataatccaa gtagagagaa atttgattaa 117(

<210> 16

<211> 310

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 16

Met Ala Pro Asn Ser Thr Val Thr Thr Thr Leu Thr Ala Ser Glu Leu 1 5 10 15

Ser Pro Arg Glu Ser Lys lie Leu Pro Glu Val Thr Tyr Arg Thr Leu 25 30

Trp Gly Asn Phe Lys Thr Pro Leu Lie Trp Pro Asn lie lie Gly lie 40 45

lie Ser Val His Val lie Thr lie lie Gly Phe Val Thr Phe Pro Tyr 50 55 60

Phe Gln His Lys Ser Thr Phe Ala Trp Cys Asn Val Thr Gly Trp Ala 65 70 75 80

Gly Gly Phe Gly Val Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Lys 85 90 95

Ser Tyr Lys Asn Arg Leu Arg Glu Trp Val Arg Asp His Arg Val His 100 105 110

His Lys Phe Ser Glu Ser Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Asn Arg Gly 115 120 125

Ser Val Val Val Phe Phe Glu Lys Phe Phe Trp Pro Met Lys Leu Phe 165 170 175 Gly Thr

Asn Tyr Lys Val Asn Ala Thr 270

Ala Ala Glu Leu

Leu Thr

<210> 17

<211> 320

<212> PRT

<213> Tribolium castaneura

<400> 17

Met Ser Thr Leu Glu 1 5

Thr Gln Val Gln lie Val Trp Arg Asn Val lie 15

Leu Phe lie Tyr Leu His Val Ala Ala lie Tyr Gly Leu Tyr Phe Thr 25 30

Thr Leu Leu Leu Asp Leu Phe Ala Lys lie Gly Trp Ala Tyr Asp Leu 275 280 285

Lys Ser Pro Ser Lys Gln Leu lie Gln Gln Val lie Glu Asn His Gly 290 295 300

Trp Cys Phe lie Phe Pro Thr Met lie Pro Tyr Phe Cys Trp Asn Glu 180 185 190

Thr Phe Tyr Trp Cys Val Met Ser Cys lie Ala Arg Tyr Val Cys Gly 195 200 205

Leu Asn Phe Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Met Phe Gly Asn 210 215 220

Lys Pro Tyr Asp Arg Lys lie Gln Pro Val Glu Asn Leu Met Val Ser 225 230 235 240

lie Leu Ala Met Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro 245 250 255

Asp 305

Arg Arg Asp 310

Gly 265 Ser Thr Ala Phe lie Asp Phe Met Ala Lys lie Gly 265 270

Trp Gly Asn

lie Thr Asn Gly Glu Arg Phe His Asn Tyr 235 240

Tyr Leu lie

160

Leu Glu Glu Asp Gln 145

His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ser Tyr 245 250 255

Leu Ala Pro Phe Phe Ala Phe Leu Leu Pro Ala Trp Val Pro Trp Tyr 165 170 175

Phe Trp Gly Glu Asp Leu His Val Ser Trp Cys Val Ala Ser Met Leu 180 185 190

Arg Tyr Ala Leu Ser Leu His Gly Thr Trp Leu Val Asn.Ser Ala Ala 195 -200 205

His Met Trp Gly Thr Arg Pro Tyr Asp Arg Asn lie Lys Ala Thr Glu 210 215 220

50

55

60

His Arg Ser Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg lie Leu Leu Cys lie 65 70 75 80

Tyr Gln Thr His Cys Leu Gln Asn His lie Tyr Glu Trp Val Arg Asp 85 90 95

His Arg Ala His His Lys Phe Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn 100 105 HO

Ser Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Leu Leu Val Arg 115 120 125

Lys His Pro Gln Val Lys lie Lys Gly Lys Leu 工Ie Asp Leu Ser Asp 130 135 140

r O y 3 T 2

Lys Val Val

Thr 225

Trp Ala Tyr Asp Leu Lys lie lie Pro Pro Glu Leu Val Glu Lys Arg 275 280 285 Ala Lys Arg Thr Gly Glu Cys Thr His Lys Val Trp Gly Trp Gly Asp

290

295 300

Lys Asp lie Asp Lys Glu Glu lie Glu lie Val Glu Arg Asn Arg Gly

305

<210> <211> <212> <213>

310 315 320

18

318

PRT

Tribolium castaneum

<400> 18

Met Ser Ser Glu Leu Ala Pro Leu Asn lie Arg Pro Val Trp Leu Lys

5

15

lie Val Tyr Phe Ala Tyr Leu His Tyr Gly Thr lie Leu Gly Thr Tyr

20

30

Tyr Leu Leu Thr Ala Ala Gln Trp Lys Thr lie Leu Trp Thr Tyr Leu

35

40 45

Leu Leu Leu Ser Ala Thr His Gly lie Ala Val Gly Ala His Arg Leu

50

55 60

Trp Ala His Arg Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg Leu Leu Leu

65

70 75 80

Ala Phe Asp Gln Thr Leu Thr Phe Gln Lys Asp lie Tyr Asp Trp Val

85

90 95

Arg Asp His Arg lie His His Lys Tyr Ser Asp Thr Glu Tyr Asp Pro

100

105 110

His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His lie Gly Trp Leu Met

115

120 125

lie Lys Lys Ser Asp Lys Val lie Ala Lys Gly Lys Glu Leu Asp Leu

130

135 140

Ser Asp Leu Glu Gln Asp Pro Val Val Trp Tyr Gln Arg Lys Tyr Tyr 145 150 155 160 Leu

<210> 19

<211> 321

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 19

Met Glu Arg Glu 1

lie Ala Trp Lys 5

Asp Glu Asp Met Asp Lys 305 310

Glu Asp Val Cys

Lys Ala Ala Glu Leu Gly 255

Lvs Asn

Ser Ala Pro Leu Asp Met Val Lys 285

lie Gly Trp Ala 275

Trp Asn Thr Ala Phe lie Asp Phe Met Ala Lys 265 270

Asn Tyr His

Lys Val Ser Trp Tyr Leu Cys Ser 185 190

Lys Arg Gly Glu 290

Arg Thr Gly Asp Gly Thr Lys Leu Trp Gly Trp Gly 295 300

lie Phe Arg Leu Cys Val Thr Leu His Gly Thr Cys Leu Val Asn Ser 195 200 205

Ala Ala His lie Trp Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Lys Asn lie Lys Pro 210 215 220

Val Glu Thr Ser Trp Val Ala His lie Ser His Gly Glu Gly Trp His 225 230 235 240

Trp Tyr Met Ala

Pro Phe Leu Ala Phe lie 165 170

Phe Pro Ala Met Val Pro 175

Lys Val Phe Phe Phe Val Ty 15

1

A

S 5 y 1 L 3

Trp Tyr Phe Trp Ser Glu Gln Phe 180

His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu lie Leu Thr Glu Ala Ser 25 30 Leu

Trp Asp Tyr Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ser Tyr Tyr Gly Asn 245 250

His His Ala

Asn Gly Glu Gly Phe 230

Leu Val Asn Ser Ala Ala His lie Tyr Gly Asn 200 205

Phe Val Val Ser Trp Tyr Val Cys Ser Met 180 185

Gly Thr Gly Ala Gly Val His Arg Leu Trp Ala His Arg Ala Tyr Lys

50 55

60

Ala Thr Val Pro Leu Arg Leu Leu Leu Thr Phe Tyr Gln Thr Leu Thr 65 70 75 80

Phe Gln Lys Asp lie Tyr Asp Trp Val Arg Asp His Arg Val His His

85 90

95

Lys Tyr Ser Asp Thr Glu Pro Asp Pro His Asn Ala Ser Asn Gly Phe

100 105

110

Phe Tyr Ser His Met Gly Trp Leu Met Leu Lys Lys Thr Gln Cys Thr

115 120

125

lie Asp Lys Gly Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asp Pro 130 135 140

lie Val Met Phe Gln Arg Lys Tyr Tyr Trp Tyr Leu Ala Pro Val lie 145 150 155 160

Ala Leu Gly Met Pro Ala Phe Val Pro Trp Tyr Phe Trp Gly Glu Arg

165 170

175

Arg Pro Tyr Asp Lys Asn lie Leu Pro Thr Gln Asn Leu 210 215 220

Leu Val Ser

S y

C

r h T

y 5 1 9 G 1

His

P

240

Phe

Ser

P 5 r 5 T 2

r 5 y 3 T 2

η

S

A

H

lie Thr

r 5 y 2 T 2

Thr Ala Phe lie Asp Phe Met Ala Arg lie Gly Trp Ala Tyr Asp Leu 260 265 . 270 Lys Ser Val Pro Leu Ala Met Val Glu Lys Arg Val 275 280

Phe Val Leu Thr Thr Thr Asn Trp Pro Thr Leu lie Tyr 40 45

Glu lie Thr His Thr Arg Ala Ser Gln Thr 315 320

Arg Thr Gly

Gly Phe lie Phe Gly Ala Leu Thr Gly Gln Gly lie Lys Leu Gly Ala 50 55 60

His Arg Leu Trp Ala His Arg Cys Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg 65 70 75 80

lie Phe Leu Cys Phe Leu Gln Thr Val Thr Leu Gln Asn Pro Leu Tyr 85 90 95

Glu Trp Val Arg Asp His Gln Val His His Lys Tyr Thr Asp Thr Asn 100 105 110

Ala Asp Pro Leu Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Met Gly 115 120 1.25

<210> 20

<211> 302

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum .

<400> 20

Met Phe Leu Arg Thr lie Thr Ser Lys Phe Tyr Ser Asp Gln lie Val 1.5 10 15

Trp Arg Asn Val Phe Leu Leu Leu lie Leu His lie lie Ser Leu Gln 25 30

Asp Gly Thr His Asn Val Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Leu His Pro 290 295 300

S 5 y 8 L 2

Gly Trp Tyr 35

Asp Asp Ala Lys Met Val 305 310

Gly

Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Asn Val lie Ala Lys Gly Lys Thr Met Leu Arg Lys Arg Lys Met Arg Thr Gly Asp 290 295

130

135

140

Leu Asp Leu Ser Asp Leu Glu Glu Asp Pro Val Val Met 145 150 155

<210> 21

<211> 356

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 21

Met Thr Glu 1

Gly Ser Asp Glu Cys Ser Lys Gly Ala Cys Ser Thr Ala 10 15

Ala Lys Glu Thr Ser Arg Arg Leu Asn Ala Leu Thr Lys Thr Glu lie

20

25

30

Lys Tyr Tyr Lys lie lie Ala Pro Val Leu Thr Leu Ala lie Pro.Ala 165 170 . 175

Leu lie Pro Trp Tyr Phe Phe Gly Glu Asp Leu Tyr Leu Ser Trp Val 180 185 190

Thr Thr Cys Val Leu Pro Tyr Phe lie Thr Leu His Ser Thr Trp Ala 195 200 205

Val Asn Ser Val Ala His lie Trp Gly Thr Lys Pro Tyr Asn Lys Asn 210 215 220

lie Leu Pro Thr Glu Asn lie Ala Val Ala lie Val Ala Tyr Gly Glu 225 230 235 240

Gly Trp His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Ala Ala 245 250 255

Glu Leu Gly Asn Tyr Arg Pro Asn Leu Ser Thr Ala Phe lie Asp Phe 260 265 270

Met Ala Lys lie Ala Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Ser Pro Glu 275 280 285 Leu Ser Gly Phe Gly lie Thr Ala Gly Ala His 90 95

Asn Ser Val Ala His Met Trp 245

Arg Leu Trp

Ser Hxs Arg Ala 100

Phe Leu

Leu Leu Leu lie Leu Phe Thr lie Thr Gly Gln Arg His Val Tyr Val 115 120 125

Trp Ala Leu Asp His Arg Val His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala 130 135 140

Asp Pro His Asn Ala Lys Arg Gly Phe Leu Phe Ser His Val Gly Trp 145 150 155 160

Leu Val Leu Thr Pro His Pro Asp Val Val Glu Lys Arg Lys Ala Val 165 170 175

Asp Met Ser Asp Leu Glu Ala Asp Pro Leu lie Met Trp His Lys Lys 180 185 190

Leu Tyr Pro Pro Leu Phe Phe Leu Phe Val lie Phe Leu Pro Val Phe 195 200 205

Thr Pro Val Tyr Phe Trp Asn Glu Thr lie Trp Asn Ser Phe Trp Val 210 215 220

Asn Phe Asn Ala Arg Phe Cys lie Thr Leu Asn lie Ala Phe Phe Val 225 230 235 240

Pro Glu Asn Lys Leu Lys Lys Glu Glu Phe Arg Pro Arg lie Arg Trp 40 45

Pro Asp Leu Thr Val Gln Val Phe lie His Val Gly Cys Leu Tyr Gly 50 55 60

Leu Tyr Leu Cys Leu Val Ser Ala Arg Leu Tyr Thr Thr Leu Phe Ala •65 70 75 80

y 5 T 8

e 1 I

Th Leu Trp Ala His Arg Ser Phe 90 95

Leu Ala Thr Ser lie Phe Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Leu Gly Gly 70 75 80

Trp Arg Asn lie lie Leu Phe Ala Tyr 40 45

Gly Leu Tyr Leu Met Phe Thr Ser Ala 60

Asn

Leu

Lys Ser Gly Asp Gly Ser His lie Trp Gly Tyr 330 335

Ala Arg

Gly Asp Ala Asp lie Glu Lys Glu Asp Leu Glu Glu Leu Asn Lys Met 340 345 350

Glu Asp Phe Asn

355

<210> 22 <211> 353 <212> PRT

<213> Tribolium castaneum <400> 22

Met Pro Pro Tyr Val Ser His Val Thr Gly Val Leu Asp Glu Asn Asp 10 15

Glu Glu Val Ser Thr Lys Asn lie Leu Pro Glu Val Thr Lys Pro Glu 25 30

Ser Pro Val Glu Asn Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Leu Gly Glu Gly

260 265

270

Trp His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Thr Gly.Glu

275

280

285

Leu Gly Asn Ser Tyr Asn Pro Ser Thr Thr Phe lie Asp Phe Phe Ala

290

295 300

Lys lie Gly Trp Ala Tyr Asp Leu'Lys Phe Ala Ser Asn Ser Met lie

305

310 315

320

S

y 5 L 6 Lys Lys Arg Val Leu Arg Thr Gly 315 320

Pro Leu Arg Leu Leu Leu Ala Phe 105

Cys Asn Thr Leu 110

Ala Phe Glu Asp Ser Val lie Asp Trp Ser Arg Asp His Arg Val His 115 120 125

His Lys Phe Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro Tyr Asn Ala Lys Arg Gly 130 135 140

Phe Phe Phe Ser His lie Gly Trp Leu Leu Cys Arg Lys His Pro Gln 145 150 155 160

Val Lys Glu Lys Gly Lys Gln lie Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Gln Asp 165 170 175

Pro lie Leu Arg Tyr Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Val Met Pro Val 180 185 190

lie Cys Phe Val Leu Pro Thr Ala Ala Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu 195 200 205

Ser Phe Lys Asn Ala Phe Phe Val Asn Leu Phe Arg Tyr Cys Phe Thr 210 215 220

Leu Asn Ser Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Trp Gly Ser 225 230 235 240

Lys Pro Tyr Asp Lys Phe lie Asn Pro Ala Glu Asn Phe Ala Val Ser 245 250 255

Val Leu Ala Leu Gly Glu Gly Trp His Asn Phe His His Thr Phe Pro 260 265 270

Trp Asp Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Gly Lys Tyr Ser Val Asn Phe Ser 275 280 285

Ser Ala Phe lie Asp Phe Phe Ala Lys lie Gly Trp Ala Tyr Asp Leu 290 295 300

Lys Thr Val Ser Glu Asp Leu Val 305 310 Leu Gln Leu Val Trp Arg Asn lie lie Leu Phe Ala Tyr 40 45

Glu Asp Tyr Glu Gly Ala lie lie Lys His Arg Lys 340 345

Asn

Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly lie Trp lie Met Phe Thr Ser Ala

50

55 60

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Phe Gly lie Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Ser Tyr

85

90 95

Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu lie Leu Thr Phe Cys Asn Thr Leu

100

105 110

Ala Phe Glu Asp Ser Val lie Asp Trp Ser Arg Asp His Arg Val His

115

120 125

His Lys Phe Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Lys Arg Gly

130

135 140

<210> 23 <211> 350 <212> PRT

<213> Tribolium castaneum <400> 23

Met Thr Pro Asn Ala Ser lie Pro Thr Gly Val Leu His Glu Asn Asp 10 15

Glu Glu Val Ser Asn Ala Thr Leu Pro Pro Glu Val Asn Lys Pro Asp 25 30

Asp Gly Ser His His Val Trp Gly Trp Gly Asp Met Asp Gln Ala Leu 325 330 335

Asp Arg Lys 35

Phe Phe Phe

Ser His

Val Gly Trp Leu Leu Cys Arg Lys His Pro Gln Ser Ser Glu Met lie Lys Lys 310

Arg Val Thr Arg Thr Gly 315 320

Phe lie Asn Pro

Ala Glu Asn Phe Val Val Ser 250 255

Lys Pro

Thr Phe Lys 210

Asn Ala Phe Leu Val Asn Leu 215

Gln lie Asp Leu 170

Ser Asp Leu Tyr Ala Asp 175

Asp Gly Thr His Glu lie Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Gln Ser Gln 325 330 335

Glu Asp Tyr Gln Asp Ala lie lie Thr His Arg Lys Ser Ala 310 345 350

<210> 24

<211> 277

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 24

Val Leu Ala Leu Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro

260 265 270

Trp Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Leu Gly Lys Tyr Ser Val Asn Phe Ser

275 280 285

Thr Ala Phe lie Asp Phe Phe Ala Lys lie Gly Trp Ala Tyr Asp Leu

290 295 300

Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser 225 230

Ala Ala His Met Trp Gly Asp 235 240

Pro lie Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Thr lie Val Met Pro Leu 180 185 190

Val Ser Phe Val Met Pro Thr Val Val Pro Met Tyr Leu Trp Gly Glu 195 200 205

145

150

155

160

Thr Val

S 5 y O L 3

Tyr Asp Arg 245 His Tyr Met Ser Pro Trp Asp

195

Met Ser Asp Leu Glu Gln Asp Lys lie Val Met 100 105

Leu Leu Glu Glu lie Asp 95

Asn Leu Lys

Leu Trp Ala His Asn 20

Tyr Trp Phe Leu Phe Val lie Val Thr Leu Leu Leu Pro lie Asn Ala 115 120 125

Pro Val Glu Tyr Trp Asp Glu Thr lie Leu Asn Ser Phe Phe lie Leu 130 135 140

Gly Trp Leu Arg Leu Gly lie Ser Tyr His Leu Thr Leu Leu lie His 145 150 155 160

Ser Ala lie Asn Val Phe Asp Leu Lys Gln Met Asp Arg Asn Ser Tyr 165 170 175

Asp Ser Asn Ala Val Phe Phe lie Asn Lys Ser Tyr Trp lie Ser Tyr 180 185 190

Leu Met Leu Cys Gln Thr Leu Ala Gly Gln Thr Ser lie Tyr Asn Trp 40 45

Val Arg Leu His Arg Leu His His Lys Tyr Phe Gln Thr Glu Met Asp 50 55 60

Pro Phe Asn Pro Gln Lys Gly Phe lie Tyr Ser His Phe lie Ala Asn

65 70 75 80

Met Leu lie Leu Leu Ser Thr lie Gly Val Thr Ala Gly Ala His Arg 10 15

Thr Thr Ser Leu Lys lie Phe 30

Gln Al

25

Ty

Se

Gly Ser Asp Cys Thr Ser Lys Phe lie Arg Val Cys Ala Ala Leu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Asp Leu Lys Thr Val Asp Ser Glu Met lie Arg Glu Ala

225

230

235 240

Leu Thr Leu Cys Val Asp Glu Lys Lys Pro lie Glu Glu Cys Leu Thr

245

250 255

Arg Leu Gly Lys Lys Ser His Asp Lys Leu Leu Lys His Tyr Leu Thr

260

Pro Ser Lya Phe His 275

<210> 25

<211> 290

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

265 270

<400> 25

Met Phe Gln 1

Thr Pro lie Val Trp Pro Asn Val lie Leu Phe lie Leu 10 15

Tyr His Ala lie Ala Leu Gln Gly Trp Tyr Tyr Phe lie Thr Phe Gln 25 30

Thr Asn Leu Arg Thr lie Phe Trp Ala Phe Leu lie Leu Val Leu Ala

35

40 45

Gly Gln Gly lie Thr Ser Gly Val His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser

50

55 60

Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg lie Phe Leu Cys Leu Cys Gln Thr 65 70 75 80

lie Ser Phe Gln Asn Ser lie Tyr Glu Trp Ala Arg Asp His Arg Ala 85 90 95

His His Lys Phe Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn lie Lys Arg 100 105 HO

Gln Val Lys 130

Met

Lys

Gly Gln Leu lie Asp Leu Ser Asp Leu Glu Asn 135 1^0 Lys Met

Leu Lys Thr Ser Ala 20

Phe Pro Arg Thr 25

Ser Phe Cys Val Cys Met Leu 185

Glu Asn Phe

Ser Leu His Phe Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Trp Gly 195 200 205

Phe Lys Pro Tyr Asp Arg Phe lie Lys Pro Ser Glu Asn Gln lie Val 210 215 220

Ala Lys Leu Thr Met Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe 225 230 235 240

Pro Trp Asp Tyr Lys Ala Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Asn Gly Asn Leu 245 250 255

Ser Thr Ala Phe lie Asp Leu Met Ala Lys lie Gly Trp Ala Tyr Asp 260 265 270

Leu Lys Thr Val Pro Leu Asp Val lie Arg Lys Arg Val Leu Arg Thr 275 280 285

Gly Gln 290

<210> 26

<211> 329

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 26

Met Arg Gln lie Gln Val Arg Phe Glu Ser Gln lie Gly Leu Leu Tyr 10 15

Asp Pro Val Val Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr His Val Leu Ala Pro 145 150 155 160

Leu Cys Cys Phe Val Val Pro Thr Met Val Pro Trp Tyr Phe Trp Lys 165 170 175 Leu Glu lie Val Trp Lys Asn Val Phe Ser Phe lie Leu Tyr His Tyr 40 45

Leu Ala Phe His Gly Leu Phe Tyr Leu Val Thr Gly His Thr His Trp 50 55 60

Ala Thr Phe Ala Phe Asn Leu Phe Leu Ala Gln Leu Ser Asn Leu Gly 65 70 75 80

Thr lie Ser Gly Ala His Arg Leu Trp Thr His Arg Ser Tyr Gln Ala 85 90 95

Gln Leu Pro Leu Lys Leu Phe Leu Met Phe Cys Asn Asn lie Ser Asn 100 105 HO

Gln Asn Ser lie Tyr Asp Trp Val Arg Asp His Arg Val His His Lys 115 120 125

Phe Ser Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn lie Lys Arg Gly Phe Phe 130 135 140

Phe Ala His Met Gly Trp Leu Met Val Arg Lys His Pro Glu Val Thr 145 150 155 160

lie Lys Gly Gln Thr Leu Asp Phe Ser Asp lie Asp Ser Asp Lys Leu 165 170 175

lie Gln Phe Gln Arg Lys Tyr Phe Lys Phe Leu Ala Phe Phe Cys Ser 180 185 190

lie Phe Leu Pro Val Val Val Pro Trp Tyr Tyr Trp Gly Glu Asn Trp 195 200 205

Tyr Val Ser Leu Cys lie Thr Phe Val Arg Tyr Val Gly Thr Leu His 210 215 220

Gly Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Val Tyr Gly Thr Arg Pro 225 230 235 240

Tyr Asp Ser Asp lie Lys Pro Thr Glu Asn Pro lie Val Ala Tyr lie 245 250 255

Thr Met Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro Trp Asp Thr Thr Asn Lys

<210> 27 <211> 374 <212> PRT

<213> Tribolium castaneum <400> 27

Met Ala Pro Asn Ser Leu Ser Lys Ser Glu Tyr Leu Gly Glu Pro Val 10 15

Gln lie lie Ser Lys Pro Asn Val Glu Tyr Ser lie Glu Thr Gln Asn 25 30

Lys Tyr Asn Leu Pro His Asn Arg Trp Gln lie Val Trp Arg Asn Val 40 45

Leu lie Phe Ala Tyr Leu His Tyr Ala Ala Phe Tyr Gly Leu Tyr Tyr 50 55 60

Met Leu Thr Leu Ala Gln Trp Lys Ser lie lie Trp Gly Tyr Ala Val 65 70 75 80

lie Leu Phe Ala Ser lie Gly Val Thr Gly Gly Ala His Arg Leu Trp 85 90 95

Ala His Arg Ser Tyr Lys Ala Lys Leu Pro Leu Arg lie Tyr Leu Ala

100

105 HO

260

265

270

Tyr Arg Ala Ser Glu Phe Asp Ser Phe Asn Gly Asn Val Asn Thr Val 275 280 285

Phe lie Asn Phe Met Ala Lys Val Gly Leu Ala His Gly Leu Lys Thr 290 295 300

Ala Ser Leu Ser Leu lie Gln Arg Lys Lys Leu Lys Ser- Thr Asn Ser 305 310 315 320

Lys Gln Leu Gln Lys 325

Phe Trp Gln Thr 115

Val Ala Leu Gln Asn 120

His lie Tyr Glu Trp Val Arg 125 Gly Gln Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Val Glu Met lie Asn 305 310 315

Asn Phe Thr Thr Ala Phe Leu Asp Leu Met Ala Arg 工Ie 295 300

Arg Arg Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Gly Val Val Asp Pro Leu Val 325 330 335

lie Leu Ala Pro lie Leu Thr Phe Val Phe Pro Ala lie Val Pro Trp 195 200 205

Tyr Phe Trp Asn Glu Asn Pro lie Val Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala lie

210 215 220

Leu Arg Tyr lie Leu Asn Leu His Gly Ala Trp Leu Val Asn Ser Ala 225 230 235 240

Ala His lie Trp Gly Tyr Lys Pro Phe Asp Lys Asn lie Asn Ala Thr 245 250 255

Asp Asn lie Ser Val Ala lie lie Ala Phe Gly Glu Gly Trp His Asn 260 265 270

Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Ala Ala Glu Leu Gly Asn 275 280 285

Asp His Arg Val His His Lys Phe Thr Asp Thr Asp Ala Asp Pro His 130 135 140

Asn Ser Asn Gln Gly Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Leu Met Leu 145 150 155 160

Lys Lys His Lys Asp Val Phe lie Lys Gly Lys Thr lie Asp Leu Ser 165 170 175

S O y 2 L 3

Glu Asn Lys Glu Asp His Arg His Glu Asp Thr Val Trp Gly Trp Gly 340 345 350 Met Asn Gln Asp Glu Met Asn Leu Val Glu lie Tyr Asn 360 365

Pro Ser Ser Lys Glu Pro 370

<210> 28 <211> 358 <212> PRT

<213> Tribolium castaneura <400> 28

lie

Met Ser 1

Ala Gln Thr lie Thr Thr Thr Glu Thr Thr Gln Asn Ala Gln 10 15

Lys Pro Gln Gln Tyr His Trp Arg Met Val Trp Arg Asn lie lie Leu

20

30

Tyr lie lie Met His Leu Thr Gly Phe Tyr Gly Leu Tyr Leu Ala Met

35

40 45

Phe Tyr Ala Gln Trp Lys Thr Val Phe Tyr Ser Trp Phe Leu Leu Val

50

55 60

lie Ala Leu Gln Gly Val Thr Ala Gly Ser His Arg Leu Trp Ala His 65 70 75 80

Lys Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Met Leu Leu Cys lie Phe

85

90 95

Gln Thr Leu Ser Leu Gln Asn His lie Tyr Asp Trp Ala Thr Tyr His

100

105 HO

Arg Val His His Lys Phe Val Asp Thr Asn Ala Asp Pro His Asn Ser

115

120 125

Arg Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Leu Phe lie Glu Pro

130

135 140

His Lys Asp Val Glu Asp Lys Tyr Lys Ser lie Asp Phe Ser Asp Leu 145 150 155 160

Lys Asp 355

ASp His Asn

Glu Asp

Val Leu Arg Thr Gly Asp Gly Thr Arg Lys Phe Asp Lys 305 310 315

Gly Trp His Asn Tyr 255

Ser Ala Thr lie Ala Val 245

<210> 29

<211> 335

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 29

lie Leu Asn Val Asp Asp Asp His His His Glu Asp Met Leu Trp Gly 325 330 335

Trp Gly Asp Ser Asp Met Ala Lys Glu Glu Met Asn Tyr Val Lys lie 340 345 350

His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Gly Glu Phe Gly Lys Tyr 260 265 270

Arg ser Asn Leu Thr Thr Gly Phe Leu Asp Phe Met Ala Ala lie Gly 275 280 285

Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Glu Glu Met lie Met Lys Arg 290 295 300

Phe Ala Pro Val lie Gly Phe Tyr 180

Phe Trp Gly Glu Asn Phe Trp Thr 195 200

Arg Tyr Cys Ala Cys Thr Asn lie 210 215

His lie Tyr Gly Ser Arg 225 230

Leu Pro Ala Ala lie Pro Trp Tyr 185 190

Ala Phe Phe Val Ala Thr Met Leu 205

Thr Phe Leu Val Asn Ser Trp Ala . 220

Asn lie Tyr Pro Thr Glu 235 240

Pro Tyr Asp Lys

Lys

g 5 r 5 A 3

lie Asp Lys 320

Leu Thr Gly Gly Glu 250 Pro lie Ala lie Pro lie 190

Lys His Pro Ala Val lie Ala Lys Gly Lys Thr lie Asp Met Ser 150 155 160

His Lvs

Met Phe Val Ser Gly Glu Gly lie Thr Leu Gly Ala His Arg Leu 65 70 75

Tyr Gly Trp Asn Glu Ser Phe Thr Asn Ser Leu Phe lie Ser Tyr Phe 195 200 205

Asp Leu Glu Asn Asp Ser Leu Val Met Leu Gln Lys Glu His Tyr Lys 165 170 175

Asn Ser Asn Arg Gly Phe Phe Phe Ser His lie Gly Trp Leu Met Ser 130 135 MO

Ser His Lys Ala Phe Lys Ala Ser Phe Val Val Arg Leu Ala Val lie

85

90

95

lie Leu His Thr lie Ala Gly Gln Asn Cys Leu Tyr lie Trp Val Arg 100 105 110

Met Gly Ala Leu Lys Gln Thr Glu Glu Glu Lys Thr Leu Leu Pro Gln 1 5 10 15

Asp lie Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Arg Lys lie Val Trp Phe Asn 25 30

Ala lie Gly Phe Phe lie Leu His Leu Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr 40 45

Arg Leu Leu His Cys His lie Leu Thr Pro Leu Phe Ala Leu Ala Leu 50 55 60

g 5 r 4 A 1

Asp His Arg Gln His 115

r

y O T 8

Gly Arg Tyr lie Leu Gln Leu His Ala Thr Trp Leu lie Asn Ser Ala 210 215 220 Ala Val Lys 305

Lys Gly Asp Gly Ser His Pro Val Phe Gly Lys 310 315

Glu Met Glu Val Asn Phe Ser Asp Arg Gln Val Thr Ala Asn Gly 325 330 335

<210> 30

<211> 389

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum

<400> 30

Met Ala Pro Asn Leu Leu Gly Asn Ser Thr Leu Phe Leu Ala Glu Thr

n s 10 15

Asn Ser Ala Glu Pro lie Gln lie lie Ser Lys Pro Gly Leu Gln Asp 25 30

Val Leu Pro Gln Val Lys Pro Gln lie Ser Ser Arg Ser Ser Val Ser

40 45

35

Gin Tyr Arg Trp Gln lie Val Trp Arg Asn Val Leu lie Phe lie Tyr 50 55 60

Leu His 65

lie Ala Gly lie Tyr Gly Leu Tyr Tyr Ala lie Ala Gln Ala

70

75

80

Gln Trp Lys Thr Leu Leu Trp Gly Tyr Leu Val lie Leu Ala Ser Gly

85

90

225 230 235 240

Glu Asn Tyr Phe lie Ser Met lie Ala Leu Gly Glu Gly Trp His Asn 245 250 255

Tyr His His Ala Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Ala Ala Glu Tyr Gly Val 260 265 270

Arg Tyr Ser lie Thr Thr Phe Leu lie Asp Ala Leu Ala Phe Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Tyr Asp Leu Lys Glu Ala Asn Ser Glu Gln Val Lys lie Arg 290 295 300

S O y 2 L 3

Gln Thr Thr Ala Phe Leu 305

Pro

Tyr Arg Pro

Ser

Gly Asn Tyr Arg Met Asn Phe 300

Ser Val

Asn lie Asn Ala Thr Glu Asn 265

Thr Leu His Gly Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His 245 250

Leu Thr Phe Val Phe Pro Ala lie Val Pro Trp Tyr Phe Trp Asn Glu 210 215 220

Thr Pro Thr Val Cys Phe Tyr Ser Val Ala lie Phe Arg Tyr lie Leu 225 230 235 240

lie Leu Thr Pro lie 205

Phe Phe Phe Ser

His Met Gly Trp Leu Leu 165 170

Val

Gln Thr Val

Lys Ala Lys Leu 115

Pro Leu Arg lie Tyr Leu 120

lie Gly Val Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His 100 105

Ser lie Leu Ala 275

Phe Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His 230 285

Val Phe

Val Phe Val Lys 180

Gly Lys Thr Val Asp Met 185

Ser Asp Val Glu Ala Asp 190

Ala Leu Gln Asn Asp lie Tyr Glu Trp Val Arg Asp His Arg Val Has 130 135 140

His Lys Phe Thr Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ser Asn Arg Gly 145 150 155 160

e M

U

e L

P O

S 1

A 3

S O

Y 7 L 2

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lie

Lys Lys His Lys Asp 175

S 5 y 2 C 1

e h

P

Ala <210> 31

<211> 42

<212> PRT

<213> Tribolium castaneum .

<400> 31

His Asn Tyr His His Ala Tyr Pro Trp Asp Tyr Lys Ala Ala Glu lie 1 5 10 15

Gly Met Pro Leu Asn Ser Thr Ala Ser Leu lie Arg Leu Cys Ala Ser 25 30

Leu Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val "O

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 32

aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

Leu Lys Thr Val

Ser Val Asp Met lie Asn Lys Arg Arg 325 330

Gly Asp Gly Thr Gly Leu Val Asp Glu Glu Leu Leu Glu Asn Glu Asp .340 345 350

Lys His His His His His Asp Asp Ser lie Trp Gly Trp Gly Asp Lys 355 360 365

Asp Met Lys Gln Asp Asp Met Asp Met Val Gln Val His Asn Pro Ser 370 375 380

Lys Arg Thr 335

Asp

Arg Glu Lys Ph- 385 <223> Oligonucleotide

<220>

<221> -d(T)

<222> (28)..(28)

<220>

<221> misc—feature

<222> (29)7.(58)

<223> v=A, G or C

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)7.(59)

<223> η = A, G, C or T

<400> 33

attctagagg ccgaggcggc cgacatgtvv vvvvvvvvvv vvvvvvvvvv vvvvvvvvn

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 34 23

aagcagtggt atcaacgcag agt

<210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 35

attatgagcg gatcggcttc caagtc

<210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 36

cgaaacaatt tggaattcgt tttggg <210> 37 <211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 37

ggatccatgg cccccaacag caca

<210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide

<400> 38

gaattcttaa tctctgcgtg tgcg

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 39

ggatccatgt caacgcttga aaca

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 40

gaattcttat cctcgatttc gttc

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 41 ggatccatgt ctagcgagct agcg <210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 42

gaattcttaa tttttcgcct taca

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 43

ggatccatgg aacgtgaaat cgcgtgg

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 44

gaattcttat cctgtttgtg aagc

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 45

ggatccatgt ttttacgtac aata

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> Oligonucleotide <400> 46

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<210> 47

<211> 27

<212> DNA ■

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide <400> ■ 47

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<210> 48

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide <400> 48

gcggccgctc agttaaaatc ctccatttt

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 49

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<210> 50

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<212> DNA

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<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 50

gcatgcttaa ttaaaatcgt caga

<210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Oligonucleotide

<400> 51

ggatccatga caccaaatgc ttca

24

<210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 52 gaattcctac gcactcttcc tatg <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 53 ggtaccatgc taatcttact ttcc <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 54 ctcgagctaa tgaaattttg aagg <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide

24

24

24

<400> 55

ggatccatgt ttcaaacacc catcgtctgg

30 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 56

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<210> 58

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<212> DNA

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<223> Oligonucleotide <400> 58

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<210> 59

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<212> DNA

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<223> Oligonucleotide

<400> 59

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<210> 60

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<212> DNA

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<223> Oligonucleotide

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<210> 61

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<212> DNA

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<220>

<223> Oligonucleotide <400> 61

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<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial .

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 62

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<210> <211> <212> <213> 63 24 DNA Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 63 aagcttatgg gagcgctcaa acaa 24

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide <400> 64

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<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> Oligonucleotide <400> 65

gaattcatgg ctcctaattt gctagga

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 66

ctcgagttaa tcaaatttct ctctact

<210> 67

<211> 1050

<212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris

27

<400> 67

atgccaccca acgcccacga cagtaccggg gttatgtttg aggatgatag cgaagtatcg cctcagcaga tcgaagatgt tctcaaatta tccaagaacc gagatcttcc tttggtttgg agagatgtga tcaagtttgt ggttcttcac gtgatcggat tctacggctt ctatcttatg ttcacatccg ctagcatctg gacgtctgtc ttagtgttcg tgaattatca tcttggaatc ttgggaatca ccgccggcgc gcacaggttg tgggcccaca aatcgtacaa ggcgaggtgg cccctaaagc tcttcctggc ttacatcgag accctggcct tccagtttga catcatcttc tgggccaagt accatcgcgt gcaccacaag tacagtgaaa ccgacgccga tcctcacaac gccaagcgcg gtttcttctt ctctcacatg ggttggacca tgtgcgaaaa gaaccctgaa tttgagacca gatgcaatga ggtcgatctc tctgacttat acgccgatcc catcgtgcgc taccaagaaa aatactacta ccaactcttg gtcctcatct tcttcgtaat tcccacttgc atgcccatgt atctctggaa cgaatccttt gaaaacgcct tctgcatcaa tctaacccgc taccttatca gtcttcactg cacctggcta gtaaactctg ccgctcactt ctacggaaac aagccatacg acaggtcttt gtatcccgcc gaaaacatgc tggtaactgt cttggtcaac ggtgagggat ggcacaacta ccaccacacc ttcccatggg actacaaggc gtccgagttg ggtctctggg ccaccaacac gactgcaggt ttcatcgaca tcatggccaa gatgggcctt gcttacgatc tcaagtctgt gtctcccgac atggtcaagc gacgcgtcaa gaggaccggt gatggctccc acaacatctg gggatggggc gacaaggatc tgactgaaga ggagaggcaa

27

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 tgcgccgtca ttactcacaa acaaaagtga 1050

<210> 68 <211> 1050 <212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris <400> 68

atggcaccaa acagcaacga tgctaccgga gttttgcagg aaaccgacga cgacgtatcg 60

tctaatcaag ttttacagca aattacaaaa tcggagaagt caaaattgat aattgtttgg 120 tctaatgtaa tgtattttgt aatactacac gtgggagcgt tgtacggtct gtggttgtta ttaacttcgg ctcaaatatg gacatgtctt tgggtttttg cgatgtacga gtttggtgaa atttgtatca cagcaggagt tcacagattg tggtcacatc gctcgtacaa agcaaagtgg ccgttaaggc tgtttcatac aatgggtcaa actctagctt ttcaggatgc agtggttgat tgggccagag atcacagggt tcatcataag tacagcgaaa cggacgcaga tcctcataac gccaaacgtg gttttttctt ttctcacatg ggatggctta tgtgcagaaa aagtaaacaa gtgaaagaaa aaggaaaaga gccagacatc tctgatttat acgcggatcc tattttacgt taccaaaaaa agtattacat gctatttatg ccgctgatgt gtttcgcgtt tcctacggtc gtaccacttt atttttggaa tgaatcgctt aaaactgcat tctttgttaa catatttaga tacatattta gtttgcatgc tacctggttg gtaaactcag ctgctcatct atatggcgaa aagccgtaca acaagcatat aaatcctgct gaaaacttgg ccgtttctct catagtaaac ggagaaagat ggcacaatta tcaccacaca tttccgtggg attataaagc gggcgaattt ggaagatacg gaacaaactt gactacagtt ttcataaacg cgatggctaa aattggtctg gcatacgatc ttaaattcgt tccagaagat gtggtaaaaa gacgcgtaca taaaaccgga gacggcagtc acgctgtttg gggttgggga gacaaagatc aaacagtaga agaaattagt aaaactattg tagcctataa tcagtcttag

<210> 69

<211> 375

<212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris

180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1050

<400> 69

ttcttcttcg ctcatgtagg ttggttactt tgccggaagc atccagacgt tcgcaccaaa ggaaaaggaa tcgatctgtc agatttatac gccgacccta ttctcagata ccaaaagaaa

60 120 tactatcatt atttgatgat tccactttgt tttattttac caactatggt tcccatgtac 180

tattggaacg aaacttttaa aaacgcattc tgcgtaaatc tccttcgata cacttttacg 240

cttaacgcaa tttggttgat caactcgatc gctcatttgt acggtcacaa accgtacgat 300

agaaatatca atccggccga gagcttgagt gtatcggtta tatctctggg agagggctac 360

cacaactacc accaa 375

<210> 70 <211> 460 <212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris <400> 70

ttcttcttct tactcacatg taggtatggc tcatgtgcaa aaagcatccg ctagtaatca 60

gcaagggaaa aggaatagac atgtcggaca tcaatgccga ctatatggtc atgctgcaaa 120

agagattcta caagactttt tatatgatat ttgccatcgg cgttccggtg ttcgtgccag 180

tctatttttg gaacgaaagc ctctggaatt cgttcttcac ggcctacatg gctcgcacct 240

ttattaccct aaatttgact tggatggtta acagctgggc tcactttttc ggaacgagac

ctttcgacac acgactgaaa cccgtagaaa gtgtcctggt ttcttctctc ggacttggag

agggctgcca caactaccaa tcgaattccc gcggccgctc atggcgtgcc gggagcatgc 4 20

gacgtttggt cccatttttt ccatatagtg aatcatataa 460

<210> 71 <211> 378 <212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris <400> 71

ttcttcttct ctcaggtcgg gtggttgatg atgaagaaac atccggaggt gtacagacga

ggccaggagg tcgacatgag cgacgtcctg gcggatcccg tagtgcaatt tcatcaaaag 120

tacttcattc ctctgaagct aattcttgga ttcgtcattc cttcgatcat tccgcctctt 180

ctttggaatg aagattggat gtggtccatc ctgttggcgt gcgtcggacg ttacgtcttg 240

tctctcaact ttacatggtt ggtgaacagc gccgctcaca tctggggata tagaccatat 300

gacaagaaga taggaccggc cgaaaataaa tacgtgtctg tgttagcgat gggcgagggc 3 60

37 8

tagcacaact accaccaa

300 360

60

<210> 72 <211> 378 <212> DNA

<213> Chauliognathus Iugubris <400> 72

ttcttcttcg cgcacttcgg gtggctggtg ctgacgccgc accccgatgt cgtcaccaag 60

agggcggccg ttgacatgag cgacctagaa gaggacgcca tagttatgtg gcacaagaag 120

tactacccac tcctattcgc cctgctgtgc atcggtcttc ccgtgggaat acccgtatac 180

ttttggaacg aaacgctctg gaacgcattc tggacttgct tcaacacgcg cttctgcgcg 240

acgctaaaca tcgccttttg cgtcaacagt ctggcgcata tgtggggcca aaagccctac 300

gataggaaca tcagtccggt ggaaaatttg gccgtgtcca tggcagctct tggcgagggt 3 60

378

taccacaact accatcaa

<210> 73 <211> 349 <212> PRT

<213> Chauliognathus Iugubris <400> 73

Met Pro Pro Asn Ala His Asp Ser Thr Gly Val Met Phe Glu Asp Asp 10 15

Ser Glu Val Ser Pro Gln Gln Ile Glu Asp Val Leu Lys Leu Ser Lys 25 30

Asn Arg Asp Leu Pro Leu Val Trp Arg Asp Val Ile Lys Phe Val Val. 40 45

Leu His Val Ile Gly Phe Tyr Gly Phe Tyr Leu Met Phe Thr Ser Ala 50 55 60

Ser Ile Trp Thr Ser Val Leu Val Phe Val Asn Tyr His Leu Gly Ile 65 70 75 80

Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser Tyr 85. 90 95

Lys Ala Arg Trp Pro Leu Lys Leu Phe Leu Ala Tyr Ile Glu Thr Leu 100 105 HO

Ala Phe Gln Phe Asp Ile Ile Phe Trp Ala Lys Tyr His Arg Val His 115 120 125 His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Lys Arg Gly 130 ' 135 140

Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Thr Met Cys Glu Lys Asn Pro Glu 145 150 155 160

Phe Glu Thr Arg Cys Asn Glu Val Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Ala Asp 165 170 175

Pro Ile Val Arg Tyr Gln Glu Lys Tyr Tyr Tyr Gln Leu Leu Val Leu 180 185 ■ .190

Ile Phe Phe Val Ile Pro Thr Cys Met Pro Met Tyr Leu Trp Asn Glu

195 200 205

Ser Phe Glu Asn Ala Phe Cys Ile Asn Leu Thr Arg Tyr Leu Ile Ser 210 215 220

Leu His Cys Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Phe Tyr Gly Asn

235 240

225

230

Lvs Pro Tyr Asp Arg Ser Leu Tyr Pro Ala Glu Asn Met Leu Val Thr

250 255

245

Val Leu Val Asn Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro 260 265 270

Trp Asp Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Trp Ala Thr Asn Thr Thr 275 280 285

Ala Gly Phe Ile Asp Ile Met Ala Lys Met Gly Leu Ala Tyr Asp Leu

295 300

290

Lys Ser Val Ser Pro Asp Met Val Lys Arg Arg Val Lys Arg Thr Gly

305

310

315

Asp Gly Ser His Asn Ile Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Leu Thr Glu 325 330 33b

Glu Glu Arg Gln Cys Ala Val Ile Thr His Lys Gln Lys 340 345 <210> 74

<211> 349

<212> PRT

<213> Chauliognathus Iugubris

<400> 74

Met Ala Pro Asn Ser Asn Asp Ala Thr Gly Val Leu Gln Glu Thr Asp 1 5 10 * 15

Asp Asp Val Ser Ser Asn Gln Val Leu Gln Gln Ile Thr Lys Ser Glu 25 30

Lys Ser Lys Leu Ile Ile Val Trp Ser Asn Val Met Tyr Phe Val Ile 40 45

Leu His Val Gly Ala Leu Tyr Gly Leu Trp Leu Leu Leu Thr Ser Ala 50 55 50

Gln Ile Trp Thr Cys Leu Trp Val Phe Ala Met Tyr Glu Phe Gly Glu 65 70 75 80

Ile Cys Ile Thr Ala Gly Val His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr 85 90 95

Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu Phe His Thr Met Gly Gln Thr Leu 100 105 HO

Ala Phe Gln Asp Ala Val Val Asp Trp Ala Arg Asp His Arg Val His 115 120 125

His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Lys Arg Gly 130 135 140

Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Leu Met Cys Arg Lys Ser-Lys Gln 145 150 155 160

Val Lys Glu Lys Gly Lys Glu Pro Asp Ile Ser Asp Leu Tyr Ala Asp 165 170 175

Pro Ile Leu Arg Tyr Gln Lys Lys Tyr Tyr Met Leu Phe Met Pro Leu 180 185 190

Met Cys Phe Ala Phe Pro Thr Val Val Pro Leu Tyr Phe Trp Asn Glu 195 200 205 Ser Leu Lys Thr Ala Phe Phe Val Asn Ile Phe Arg Tyr Ile Phe Ser 210 215 220

Leu His Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Glu 225 230 235 240

Lys Pro Tyr Asn Lys His Ile Asn Pro Ala Glu Asn Leu Ala Val Ser 245 250 255

Leu Ile Val Asn Gly Glu Arg Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro 260 265 270

Trp Asp Tyr Lys Ala Gly Glu Phe Gly Arg Tyr Gly Thr Asn Leu Thr 275 280 285

Thr Val Phe Ile Asn Ala Met Ala Lys Ile Gly Leu Ala Tyr Asp Leu 290 295 300

Lys Phe Val Pro Glu Asp Val Val Lys Arg Arg Val His Lys Thr Gly 305 310 315 320

Asp Gly Ser His Ala Val Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Gln Thr Val 325 330 335

Glu Glu Ile Ser Lys Thr Ile Val Ala Tyr Asn Gln Ser 340 345

<210> 75 <211> 125 <212> PRT

<213> Chauliognathus lugubris <400> 75

Phe Phe Phe Ala His Val Gly Trp Leu Leu Cys Arg Lys His Pro Asp 10 15

Val Arg Thr Lys Gly Lys Gly Ile Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Ala Asp 25 30

Pro Ile Leu Arg Tyr Gln Lys Lys Tyr Tyr His Tyr Leu Met Ile Pro 40 45 Leu Cys Phe Ile Leu Pro Thr Met Val Pro Met Tyr Tyr Trp Asn Glu 50 55 60

Thr Phe Lys Asn Ala Phe Cys Val Asn Leu Leu Arg Tyr Thr Phe Thr 65 70 75 80

Leu Asn Ala Ile Trp Leu Ile Asn Ser Ile Ala His Leu Tyr Gly His 85 90 95

Lys Pro Tyr Asp Arg Asn Ile Asn Pro Ala Glu Ser Leu Ser Val Ser 100 105 110

Val Ile Ser Leu Gly Glu Gly Tyr His Asn Tyr His Gln 115 120 125

<210> 76 <211> 124 <212> PRT

<213> Chauliognathus lugubris <4 00> 76

Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Met Cys Lys Lys His Pro Leu 10 15

Val Ile Ser Lys Gly Lys Gly Ile Asp Met Ser Asp Ile Asn Ala Asp 25 30

Tyr Met Val Met Leu Gln Lys Arg Phe Tyr Lys Thr Phe Tyr Met Ile 40 45

Phe Ala Ile Gly Ile Pro Val Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Asn Glu

50 55 60

Ser Leu Trp Asn Ser Phe Phe Thr Ala Tyr Met Ala Arg Thr Phe Ile 65 70 75 80

Thr Leu Asn Leu Thr Trp Met Val Asn Ser Trp Ala His Phe Phe Gly 85 90 95

Thr Arg Pro Phe Asp Thr Arg Leu Lys Pro Val Glu Ser Val Leu Val 100 105 HO

Ser Ser Leu Gly Leu Gly Glu Gly Tyr His Asn Tyr 115 120 <210> 77

<211> 118

<212> PRT

<213> Chauliognathus Iugubris

<400> 77

Phe Phe Phe Ala His Val Gly Trp Leu Met Met Lys Lys His Pro Glu 1 5 10 15

Val Tyr Arg Arg Gly Gln Glu Val Asp Met Ser Asp Val Leu Ala Asp 25 30

Pro Val Val Gln Phe His Gln Lys Tyr Phe Ile Pro Leu Lys Leu Ile 40 45

Leu Gly Phe Val Ile Pro Ser Ile Ile Pro Pro Leu Leu Trp Asn Glu 50 55 60

Asp Trp Met Trp Ser Ile Leu Leu Ala Cys Val Gly Arg Tyr Val Leu 65 70 75 80

Ser Leu Asn Phe Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Trp Gly 85 90 95

Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Lys Ile Gly Pro Ala Glu Asn Lys Tyr Val 100 105 HO

Ser Val Leu Ala Met Gly 115

<210> 78

<211> 126

<212> PRT

<213> Chauliognathus Iugubris

<400> 78

Phe Phe Phe Ala His Phe Gly Trp Leu Val Leu Thr Pro His Pro Asp

1 5 10 15

Val Val Thr Lys Arg Ala Ala Val Asp Met Ser Asp Leu Glu Glu Asp 25 30

Ala Ile Val Met Trp His Lys Lys Tyr Tyr Pro Leu Leu Phe Ala Leu 40 45

Leu Cys Ile Gly Leu Pro Val Gly Ile Pro Val Tyr Phe Trp Asn Glu 50 55 60

Thr Leu Trp Asn Ala Phe Trp Thr Cys Phe Asn Thr Arg Phe Cys Ala 65 70 75 80

Thr Leu Asn Ile Ala Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Met Trp Gly 85 90 95

Gln Lys Pro Tyr Asp Arg Asn Ile Ser Pro Val Glu Asn Leu Ala Val 100 105 HO

Ser Met Ala Ala Leu Gly Glu Gly Tyr His Asn Tyr His Gln 115 120 125

<210> 79 <211> 1050 <212> DNA

<213> Chauliognathus nobiliatus <400> 79

atgccaccca acgcccacga cagcactggg gttatgtttg aggatgatgc cgaggtatcg

cctcagcaga tcgaagatgt cctcaaatta tcccataacc gagatcttcc tttggtatgg agagatgtga tcaagtttgt ggttcttcac gtgatcggtc tctacggctt ctatcttatg ttcacttccg ctagtatctg gacatcggtt ttagtgttcg tgaattacca tcttggtatc ttgggaatca ccgccggcgc gcacagattg tgggcccaca aatcgtacaa ggcgagatgg cccctaaaac tcttcctggc ttacatcgaa accctggcct tccagttcga catcatcttc tgggccaagt accatcgcgt gcatcacaaa tacagcgaaa ccgacgccga ccctcacaat gccaagcgcg gattcttctt ctctcacatg ggttggacca tgtgcgaaaa gaaccccgaa ttcgagacca gatgcaagga ggtcgatctt tccgacttgt acgccgatcc catcgtgcgc 540 taccaagaaa aatactacta ccaactcctg gtattcatct tcttcgtaat tcccacttgc atgcccatgt acctctggaa cgaatctttc gaaaacgcct tctgcatcaa tctaacccgc taccttatca gtcttcactg cacctggcta gtaaactccg ccgcccactt ctacggaaac aagccttacg ataggtcttt gtatcccgcc gaaaacatgc tggtaactgt cttggtcaac ggcgagggat ggcacaacta ccaccacacc ttcccatggg actacaaggc gtccgagctt

60 120 180 240 300 360 420 480

600 660 720 780 840 ggtctctggg csaccaacac caccgcaggt ttcatcgaca tcatggccaa gatgggtctt 900 gcgtacgatc tcaagtctgt atctcccgat atggtcaagc gacgtgtcaa gaggaccggt 960 gacggcaccc acaacgtctg gggatggggc gacaaggacc tgaccgaaga ggagaggcaa 1020 tgcgccgtca ttactcacaa acaaaagtga 1050

<210> 80

<211> 349

<212> PRT

<213> Chauliognathus nobiliatus

<220>

<221> misc_feature <222> (284)..(284)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 80

Met Pro Pro Asn Ala His Asp Ser Thr Gly Val Met Phe Glu Asp Asp 10 15

Ala Glu Val Ser Pro Gln Gln Ile Glu Asp Val Leu Lys Leu Ser His 25 30

Asn Arg Asp Leu Pro Leu Val Trp Arg Asp Val Ile Lys Phe Val Val 40 45

Leu His Val Ile Gly Leu Tyr Gly Phe Tyr Leu Met Phe Thr Ser Ala

50 55 60

Ser Ile Trp Thr Ser Val Leu Val Phe Val Asn Tyr His Leu Gly Ile 65 70 75 80

Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys Ser Tyr 85 90 95

Lys Ala Arg Trp Pro Leu Lys Leu Phe Leu Ala Tyr Ile Glu Thr Leu 100 105 HO

Ala Phe Gln Phe Asp Ile Ile Phe Trp Ala Lys Tyr His Arg Val His 115 120 125

His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Lys Arg Gly 130 135 140 Phe Phe Phe Ser His Met Gly Trp Thr Met Cys Glu Lys Asn Pro Glu 145 150 155 160

Phe Glu Thr Arg Cys Lys Glu Val Asp Leu Ser Asp Leu Tyr Ala Asp 165 170 175

Pro Ile Val Arg Tyr Gln Glu Lys Tyr Tyr Tyr Gln Leu Leu Val Phe 180 185 190

Ile Phe Phe Val Ile Pro Thr Cys Met Pro Met Tyr Leu Trp Asn Glu 195 200 205

Ser Phe Glu Asn Ala Phe Cys Ile Asn Leu Thr Arg Tyr Leu Ile Ser 210 215 220

Leu His Cys Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Phe Tyr Gly Asn 225 230 235 240

Lys Pro Tyr Asp Arg Ser Leu Tyr Pro Ala Glu Asn Met Leu Val Thr 245 250 255

Val Leu Val Asn Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Thr Phe Pro 260 265 270

Trp Asp Tyr Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Trp Xaa Thr Asn Thr Thr 275 280 285

Ala Gly Phe Ile Asp Ile Met Ala Lys Met Gly Leu Ala Tyr Asp Leu 290 295 300

Lys Ser Val Ser Pro Asp Met Val Lys Arg Arg Val Lys Arg Thr Gly 305 310 315 320

Asp Gly Thr His Asn Val Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Leu Thr Glu 325 330 335

Glu Glu Arg Gln Cys Ala Val Ile Thr His Lys Gln Lys 340 345

<210> 81

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> oiigomicleotideo

<400> 81

tttttttttt tttttttt

<210> 82

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oiigomicleotideo

<220>

<221> misc_feature

<222> (12).. (12)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21).. (21)

<223> η is a, c, g, or t

<4 00> 82

ttcttcttck cncaykthgg ntgg

<210> 83

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oiigomicleotideo

<220>

<221> misc_feature

<222> (18).. (18)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 83

tgrtggtagt tgtgvhancc ctc

<210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Oiigomicleotideo <220> <221> misc_feature

<222> (3) . . (3)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 84

gcncaymgny tntgggcnca

85 20 DNA

Artificial

OUsoiiucleolideo

<210> <211> <212> <213>

<220> <223>

<220>

<221> misc_feature

<222> (3).. (3)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> η

<222> (19) .. (19)

<223> η = inosine

<220>

<221> misc_feature

<222> (19) .. (19)

<223> η is a, c, g, or t

<40Q> 85

aanryrtgrt ggtagttgng

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Oligoinicleotideo

<400> 86

taatacgact cactataggg

<210> 87 <211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligomicleotideo

<400> 87

atttaggtga cactatag

<210> 88

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Oligomicleotideo

<220>

<221> misc_feature

<222> (12) .. (12)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 88

ttyttytwyk cncayatggg ntgg

<210> 89

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> oiigomieleotideo

<400> 89

cccagagata taaccgatac a

<210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Oligomicleotideo

<400> 90

ttatatacgc cgaccctatt c

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligomicleotideo

<400> 91

cctctccaag tccgagagaa g

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<22°> ,Oligomicleotideo

<400> 92

tggctcatgt gcaaaaagca t

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligoiiucleotideo

<400> 93

ttgtgccatc cctcaccgtt g

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> Oligomieleotideo

<400> 94

tggctaacat cgagaccctg <210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OiigomicleoHdeo <400> 95

gccatataga tgagcagctg a

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligomicleotídeo

<400> 96

atgggatggc attatgtgca g

<210> 97

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<22 3> Oligonucleotideo

<400> 97

aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg

98 31 DNA

Artificial

Oligomicleoti deo

η

(29) .. (29) η = d (T)30

misc_feature (29) .. (31) η is a, c, g, or t

<210> <211> <212> <213>

<220> <223>

<220> <221> <222> <223>

<220> <221> <222> <223>

<220> <221> η

<222> (30) .. (30)

<223> η = Α, G, C, or T

<220>

<221> η

<222> (31)..(31)

<223> η = Α, G, or C

<400> 98

attctagagg ccgaggcggc cgacatgdnn η

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Oligomicleotideo

<400> 99

aagcagtggt atcaacgcag agt

<210> 100

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Oligomicleolideo

<400> 100

ggtaccatgc cacccaacgc ccac

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Oligomicleotideo

<400> 101

gaattctcac ttttgtttgt gagt

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Olisomicleolicleo <400> 102

aagcttatgc taccggagtt ttgc

<210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotídeo <400> 103

ctccagctaa gactgattat aggc

<210> 104

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 104

Ala Gly Ala His Arg Leu Trp 1 5

<210> 105

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 105

Ser Glu Thr Asp Ala Asp 1 5

<210> 106

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 106

Phe Phe Phe Ser His Val Gly 1 5 <210> 107

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus seguence

<400> 107

Gln Lys Lys Tyr 1

<210> 108

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 108

Asn Ser Ala Ala His 1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 109

Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His 1 5

<210> 110

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 110

Pro Trp Asp Tyr 1 <210> 111 <211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Consensus sequence

<400> 111

Gly Trp Ala Tyr 1

<210> 112

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<4 00> 112

His Arg Leu Trp Thr His 1 5

<210> 113

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 113

His Arg Leu Trp Ser His 1 5

<210> 114

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 114

His Arg Leu Trp Ala His

1 5

<210> 115 <211> 6 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<4 00> 115

His Arg Leu Tyr Ser His 1 5

<210> 116

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 116

His Arg Val His His 1 5

<210> 117

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 117

His Arg Ala His His 1 5

<210> 118

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 118

His Gln Val His His 1 5

<210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<4 00> 119

His Arg Leu His His 1 5

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220> '

<223> Histidine box

<400> 120

His Arg Gln His His 1 5

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Histidine box

<400> 121

His Asn Tyr His His 1 5

<210> 122

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> Histidine box

<4 00> 122

Trp Ile Ser Tyr His 1 5

<210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Signature sequence

<400> 123

Gly Pro Ala Glu 1

<210> 124

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Signature sequence

<400> 124

Asn Pro Val Glu 1

<210 > 125

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Signature sequence

<400> 125

Tyr Pro Ala Glu 1 >

<210> 126

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Signature sequence

<400> 126

Ser Pro Val Glu

1

<210> 127

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Oligoiiucleoticleo

<400> 127

ttgttctgtg tgggtcayga ytgyggwca

<210> 128

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligoinicleotideo

<400> 128

gtgatgggcg acgtgacygt ykgtrat

<210> 129

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<22°> Oligonucleotideo

<220>

<221> misc_feature

<222> (12).. (12)

<223> η is a, c, g, or t

<220> .

<221> misc_feature

<222> (21).. (21)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 129

ttcttcttck cncaykthgg ntgg

<210> 130

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonueleotideo

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> η is a, c, g, or t <400> 130

tgrtggtagt tgtgvhancc ctc

<210> 131

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<22 3> Regiã0 conservada

<220>

<221> X

<222> (4) .. (4)

<223> X = S or A

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X = I or V

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa pocle ser qualquer aniinoacido ocorrido nahiralniante

<400> 131

Phe Phe Phe Xaa Ala His Ile Xaa Val Gly Trp 10

<210> 132

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220> , <223> Região conservada

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X=YoiiWOIIF'

<4 00> 132

Glu Gly Xaa His Asn Tyr His His

1 5

<210> 133 <211> 1074 <212> DNA <213> Acheta domesticus <400> 133

atggatctca acgaggaaag tgcgcccagc ggagtcctat tcgaagaaga tgtggctgag 60 caggaagcca agatggcgaa cggaggaccg aagaagggca agaaacttga agaaccctac 120 cggctcgaaa ttgtatggtt caatgtccta tggtttgtcc ttcttcatgc tggtgctttg 180 tacggtgtat atctcatctt tgcatctgcc aagatctaca caacattata tggcttcttg 240 ctgtgcgaat tgtcgctgct gagcatcacg gcgggcgtgc accgcctgtg ggctcatcgc 300 gcctacaagg ccaagtggcc cctgcgcctc accctcatgg tcctcaacct gctggcgtac 360 cagaactcca tctacgagtg ggcgcgcgac cacagggtgc accacaagtt cagcgagacc 420 aacgccgacc ccgtgaacgc caagcgcggc ttcttcttct cgcacgtggg ctggctgctg 480 tgccgcaagc acccggaggt ccgcgccaag ggcggccgca tcgacctcag cgacctggag 540 cgcgacccca tcgtcatgtt ccagaagagg cattattaca aattggtgcc attcgtttcc 600 tttgtgattc caaccctcat tcctatgtat ttctggggag agacgctatc taattcttgg 660 tatgtgtcga ctatgttccg ttattgcctc tctctcaact taacatggct ggtcaacagt 720 gcggctcaca tgtggggcaa caagccatac gacaagaaca tcaatcctgt tgaaaacctt 780 gctgtcgcca tcggaagctt gggtgaggga tggcataact tccaccacgt tttcccctgg 840 gactacaaga catcagaact cggcaactac agcctcaatt tcacaaacgc cttcatcgac 900 ctggctgtcc tactagggtt ggcatacgac ctcaagaccg tcccagtttc tatgatcaag 960 actcgcgtag ggcgcaccgg tgatggcagc cacgatgtgt ggggctgggg ggacaaagat 1020 cttccgaaag aactcgcaga tcaaactatg atcgaaaata ggaaaacaga atag 1074

<210> 134 <211> 357 <212> PRT

<213> Acheta domesticus <400> 134

Met Asp Leu Asn Glu Glu Ser Ala Pro Ser Gly Val Leu Phe Glu Glu 10 15

Asp Val Ala Glu Gln Glu Ala Lys Met Ala Asn Gly Gly Pro Lys Lys . 25 30

Gly Lys Lys Leu Glu Glu Pro Tyr Arg Leu Glu Ile Val Trp Phe Asn 40 45 Val Leu Trp Phe Val Leu Leu His Ala Gly Ala Leu Tyr Gly Val Tyr 50 55 60

Leu Ile Phe Ala Ser Ala Lys Ile Tyr Thr Thr Leu Tyr Gly Phe Leu 65 70 75 80

Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly Val His Arg Leu 85 90 '95

Trp Ala His Arg Ala Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Leu Thr Leu 100 105 HO

Met Val Leu Asn Leu Leu Ala Tyr Gln Asn Ser Ile Tyr Glu Trp Ala 115 120 125

Arg Asp His Arg Val His His Lys Phe Ser Glu Thr Asn Ala Asp Pro 130 135 140

Val Asn Ala Lys Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu 145 150 155 160

Cys Arg Lys His Pro Glu Val Arg Ala Lys Gly Gly Arg Ile Asp Leu 165 170 175

Ser Asp Leu Glu Arg Asp Pro Ile Val Met Phe Gln Lys Arg His Tyr 180 185 190

Tyr Lys Leu Val Pro Phe Val Ser Phe Val Ile Pro Thr Leu Ile Pro 195 200 205

Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn Ser Trp Tyr Val Ser Thr 210 215 220

Met Phe Arg Tyr Cys Leu Ser Leu Asn Leu Thr Trp Leu Val Asn Ser 225 230 235 240

Ala Ala His Met Trp Gly Asn Lys Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Asn Pro 245 250 255

Val Glu Asn Leu Ala Val Ala Ile Gly Ser Leu Gly Glu Gly Trp His 260 265 270 Asn Phe His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Leu Gly 275 280 285

Asn Tyr Ser Leu Asn Phe Thr Asn Ala Phe Ile Asp Leu Ala Val Leu 290 295 300

Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Pro Val Ser Met Ile Lys 305 310 315 320

Thr Arg Val Gly Arg Thr Gly Asp Gly Ser His Asp Val Trp Gly Trp 325 330 335

Gly Asp Lys Asp Leu Pro Lys Glu Leu Ala Asp Gln Thr Met Ile Glu 340 345 350

Asn Arg Lys Thr Glu 355

<210> 135

<211> 383

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 135

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Pro Val Pro Thr Ser Ser Lys Lys Ser 10 15

Glu Thr Asp Thr Thr Lys Arg Val Pro Cys Glu Lys Pro Pro Phe Ser 25 30

Val Gly Asp Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser 40 45

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Ser Asp Ile Ile Ile Ala Ser 50 55 ' 60

Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Asn Tyr Phe Ser Leu Leu Pro Gln Pro 65 70 75 80

Leu Ser Tyr Leu Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val 85 90 95'

Leu Thr Gly Ile Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 100

105

110

Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser 115 120 125

Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His 130 135 140

His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys 145 150 155 160

Gln Lys Ser Ala Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu 165 170 175

Gly Arg Ile Met Met Leu Thr Val Gln Phe Val Leu Gly Trp Pro Leu 180 185 190

Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Phe Ala Cys 195 200 205

His Phe Phe Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu Gln 210 215 220

Ile Tyr Leu Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Phe Gly Leu Tyr 225 230 235 240

Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Met Ala Ser Met Ile Cys Leu Tyr Gly 245 250 255

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Ala Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu 260 265 270

Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp 275 280 285

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu 290 295 300

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu 305 310 315 320

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr Asn Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile 325 330 335 Lys Pro Ile Leu Gly Asp Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Trp Tyr 340 345 350

Val Ala Met Tyr Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro Asp 355 360 365

Arg Glu Gly Asp Lys Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Asn Asn Lys Leu 370 ' . 375 ' 380.

Claims (74)

1. Célula eucariótica caracterizada pelo fato de compreender um ácido nucléico exógeno codificando um polipeptideo que é: (i) um polipeptideo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N0:16 a 30, 73 a 78, 80 e 134, (ii) um polipeptideo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a qualquer uma ou mais seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) , em que o polipeptideo tem uma ou mais atividades selecionadas da atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase e hidroxilase.

2. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptideo compreende aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 16 a 30, 73 a 78, 80 e 134.

3. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptideo pode ser isolado de um inseto da Ordem Coleoptera ou Ortoptera.

4. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o inseto é uma espécie de Tribolium, Chauliognathus ou Acheta.

5. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptideo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, -73, e/ou 134, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ü) , em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase Δ12 de acil-CoA.

6. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N° : 18 ou ID. de SEQ. N0: 19, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a uma seqüência determinada em ID. de SEQ. N° : 18 ou ID. de SEQ. N°: 19, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) , em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase Δ5 de acil-CoA.

7. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma ID. de SEQ. Ν°: 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) , em que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase Δ9 de acil-CoA.

8. Célula eucariótica caracterizada pelo fato de compreender um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase Δ12 de acil-CoA.

9. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a desnaturase Δ12 de acil-CoA compreende: (i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma ID. de SEQ. N° : 28, 73, e/ou 134, (ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 28, 73, e/ou 134, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) -

10. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de compreender um nível Δ9 Δ12 / το οΔ9,Δ12 aumentado de ácidos graxos de 16:2 ' e/ou ia: ζ relativo a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico exógeno.

11. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10, caracterizada pelo fato de • -, ι r Δ12 compreender um nível aumentado de ácidos graxos 16:2 e/ou 18 : 2Λ9,Δ12 que são esterif içados a CoA.

12. Célula eucariótica caracterizada pelo fato de compreender um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase Δ5 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de 18:1a9, 16:1Δ9, 20:0 e 20:2Δ11Δ14.

13. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a desnaturase Δ5 de acil-CoA compreende: (i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N° : 18 ou ID SEQ N°: 19, (ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N° : 19, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ü) ·

14. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16: 1Δ5 e/ou 18:1a5 relativo a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico exógeno.

15. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que compreende um nível aumentado de ácidos graxos de 16:1a5 e/ou 18:1a5 que são esterif içados a CoA.

16. Célula eucariótica caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucléico exógeno codificando uma desnaturase Δ9 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 14:0 do que em um substrato de ácido graxo esterifiçado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

17. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a desnaturase Δ9 de acil-CoA compreende: (i) aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 23 ou ID. de SEQ. N°: 74, (ii) aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ. N°: 23 ou ID. de SEQ. N°:74, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) ·

18. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que compreende um nível aumentado de 14:1Δ9 relativo a uma célula eucariótica correspondente faltando o ácido nucléico exógeno.

19. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que compreende um nível aumentado de 14:1Δ9 que é esterifiçado a CoA.

20. Célula eucariótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que é uma célula de planta, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula de levedura.

21. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que está em uma planta ou uma semente de planta.

22. Célula eucariótica, de acordo com a reivindicação -21, caracterizada pelo fato de que a planta ou semente de planta é uma planta de semente oleaginosa ou uma semente oleaginosa respectivamente.

23. Processo para identificar uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência relacionada mais proximamente à ID. de SEQ. N°: 28 do que ao ID. de SEQ. N°: 135, (ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo, (iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativo à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução da molécula de ácido nucléico, e (iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

24. Processo para identificar uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 28, 73, e/ou 134, (ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo, (iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução da molécula de ácido nucléico, e (iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a etapa (iv) compreende selecionar uma molécula de ácido nucléico codificando uma desnaturase Δ12 de acil-CoA.

26. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a composição de ácido graxo modificada compreende um nível aumentado de 16:2Δ9'Δ12 e/ou 18:2Δ9'Δ12.

27. Processo para identificar uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 18 e/ou 19, (ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo, (iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução do ácido nucléico, e (iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (iv) compreende a seleção de uma molécula de ácido nucléico uma desnaturase Δ5 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de um 18:1a9, 16:1δ9, 20:0 e 2 0 : 2δ11Λ14.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a composição de ácido graxo modificada compreende um nível aumentado de ácidos graxos 16:1a5 e/ou 18:1a5.

30. Processo para identificar uma molécula de ácido nucléico envolvida na modificação de ácido graxo caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obtenção de uma molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor, a molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 17, 22, 23, 27, 29, 74, 75 e/ou 76, (ii) introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula ou sistema de expressão livre de célula em que o promotor está ativo, (iii) determinação se a composição de ácido graxo está modificada relativa à célula ou ao sistema de expressão livre de célula antes da introdução do ácido nucléico, e (iv) opcionalmente, selecionar uma molécula de ácido nucléico que modificou a composição de ácido graxo.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a etapa (iv) compreende selecionar uma molécula de ácido nucléico codificando uma desnaturase Δ9 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 14:0 do que em um substrato de ácido graxo esterifiçado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a composição de ácido graxo Δ 9 modificada compreende um nível aumentado de 14:1 .

33. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo de inseto ou mutante do mesmo.

34. Polipeptídeo recombinante ou substancialmente purificado caracterizado pelo fato de que é uma desnaturase Δ12 de acil-CoA.

35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N° : 28, 73, e/ou 134, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N° : 28, -73, e/ou 134, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou

36. Polipeptxdeo recombinante ou substancialmente purificado caracterizado pelo fato de que é uma desnaturase Δ5 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 18:0 e/ou 16:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é qualquer um, dois, três ou todos de um 18:1a9, 16:1a9, 20:0 e 2 0 : 2a11a14.

37. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 18 ou ID. de SEQ. N0: 19, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 50% idêntica à ID. de SEQ. N°: 18 e/ou ID. de SEQ. N°: 19, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) ·

38. Polipeptídeo recombinante ou substancialmente purificado caracterizado pelo fato de que é uma desnaturase Δ9 de acil-CoA, em que a desnaturase está mais ativa em um substrato de 14:0 do que em um substrato de ácido graxo esterificado à CoA, em que o ácido graxo é 16:0 e/ou 18:0.

39. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em ID. de SEQ. N°: 17 ou ID. DE SEQ. N0:74, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a uma ou mais das seqüências como determinadas em ID. de SEQ. N°: 17 e/ou ID. de SEQ. N°: 74, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii) .

40. Polipeptídeo recombinante ou substancialmente purificado caracterizado pelo fato de que é: (i) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência como determinada em qualquer uma de ID. de SEQ. N°:16 a 30, 73 a 78, 80 e 134, (ii) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 5 0% idêntica a qualquer uma ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134, e/ou (iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ü) , em que o polipeptídeo tem uma ou mais atividades selecionadas de atividade de desnaturase, conjugase, epoxidase e/ou hidroxilase.

41. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende aminoácidos tendo uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a qualquer ou mais das seqüências determinadas em ID. de SEQ. N°: 16 a 30, 73 a 78, 80 e/ou 134.

42. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo pode ser isolado de um inseto da Ordem Coleoptera ou Ortoptera.

43. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40, 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem a atividade de desnaturase sob uma ligação carbono-carbono localizada em qualquer uma das posições Δ2 a Δ15 de um ácido graxo.

44. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é um ácido graxo C16 ou C18.

45. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que é uma proteína de fusão compreendendo ainda pelo menos uma outra seqüência de polipeptideo.

46. Polinucleotideo exógeno e/ou isolado caracterizado pelo fato de compreender: (i) uma seqüência de nucleotídeos selecionados de qualquer uma de ID. de SEQ. N°: 1 a 15, 67 a 72, 79 e 133, (ii) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 OU 45, (iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 50% idêntica a uma ou mais seqüências determinadas em ID. de SEQ. N0: 1 a 15, 67 a 72, 79 e/ou 133, e/ou (iv) uma seqüência que hibridiza qualquer um de (i) a (iii) sob condições rigorosas.

47. Vetor caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 46.

48. Vetor, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está ligado operavelmente a um promotor.

49. Célula caracterizada pelo fato de compreender o polipeptideo recombinante de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, o polinucleotídeo exõgeno da reivindicação 46 e/ou o vetor da reivindicação 47 ou 48.

50. Célula, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que é uma célula de planta, fúngica, de levedura, bacteriana ou animal.

51. Método de produção de polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, -41, 42, 43, 44 ou 45, o método caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma célula ou sistema de expressão de livre de célula o polinucleotídeo da reivindicação 46.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de compreender ainda o isolamento do polipeptídeo.

53. Organismo não humano transgênico caracterizado pelo fato de que compreende uma célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 49 OU 50.

54. Organismo, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que é uma planta transgênica.

55. Semente caracterizada pelo fato de que compreende a célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, -6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, -4 9 ou 5 0.

56. Óleo caracterizado pelo fato de que é produzido por, ou obtido, da célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 49 ou 50, o organismo não humano transgênico da reivindicação 53 ou 54, ou a semente da reivindicação 55.

57. Óleo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende ácidos graxos 16:0, 16:1a5, 18:0 e 18:1Δ5, em que a razão da quantidade total de 18:1a5 a 18:0 no óleo está entre 100:1 e 1:2, e em que o ácido graxo do óleo compreende menos do que 10% (peso/peso) de 20:1a5.

58. Óleo, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizado pelo fato de que pelo menos 43% do ácido graxo C18 do óleo é 18:1a5.

59. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56, 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo do óleo compreende pelo menos 3,0% (peso/peso) de 18:1a5 como uma porcentagem do ácido graxo total do óleo.

60. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58 ou 59, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende menos do que 10% (peso/peso) de 18. 3Δ9,Δ12,Δ15 (ALA) como uma porcentagem do ácido graxo total no óleo.

61. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que o óleo é obtido por extração de óleo de uma semente oleaginosa.

62. Óleo compreendendo ácidos graxos 16:0, 16:1a5, 18:0 e 18:1a5 caracterizado pelo fato de que que a razão da quantidade total de 18:1a5 a 18:0 no óleo está entre 100:1 e 1:2, e em que o ácido graxo do óleo compreende menos do que 10% (peso/peso) de 20:1a5.

63. Óleo compreendendo ácidos graxos caracterizado pelo fato de que pelo menos 43% do ácido graxo C18 do óleo é 18 : 1Δ5 .

64. Óleo compreendendo ácidos graxos caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 3,0% (peso/peso) de 18:1a5 como uma porcentagem de ácido graxo total do óleo.

65. Óleo, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que compreende menos do que 10% (peso/peso) de 18: 3Δ9'Δ12<Δ15 (ALA) como uma porcentagem do ácido graxo total no óleo.

66. Ácido graxo caracterizado pelo fato de que é produzido por, ou obtido, da célula de qualquer uma das reivindicações I7 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 49 ou 50, o organismo não humano transgênico da reivindicação 53 ou 54, ou a semente da reivindicação 55.

67. Método de produção do óleo contendo ácidos graxos insaturados, o método caracterizado pelo fato de que compreende a extração do óleo da célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 49 ou 50, o organismo não humano transgênico da reivindicação 53 ou 54, ou a semente da reivindicação 55.

68. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma célula de qualquer uma das reivindicações 1, -2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, -19, 20, 21, 49 ou 50, o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, um polinucleotídeo da reivindicação 46, um vetor da reivindicação 4 7 ou 48, um óleo de qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 ou um ácido graxo de acordo com a reivindicação 66.

69. Alimentos, cosméticos ou produtos químicos caracterizados pelo fato de que compreendem o óleo de qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 ou um ácido graxo da reivindicação 66.

70. Método de realização de uma reação de desnaturase, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um substrato de ácido graxo saturado, monoinsaturado ou poliinsaturado esterificado a CoA com o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 OU 45.

71. Anticorpo substancialmente purificado, ou fragmento do mesmo caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 4 5.

72. Método de tratamento ou prevenção de uma condição que se beneficiaria de um PUFA, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo de uma célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 49 ou 50, o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, um polinucleotídeo da reivindicação 46, um vetor da reivindicação 47 ou 48, um óleo de qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65, um ácido graxo da reivindicação 66 e/ou um alimento da reivindicação 69.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a condição é arritimia cardíaca , angioplastia, inflamação, asma, psoríase, osteoporose, pedras no rim, AIDS, esclerose múltipla, artrite reumatóide, doença de Crohn, esquizofrenia, câncer, síndrome fetal alcóolica, distúrbio de hiperatividade deficiente de atenção, fibrose cistica, fenilcetonúria, depressão unipolar, hostilidade agressiva, adrenoleucodistrofia, doença do coração coronária, hipertensão, diabetes, obesidade, doença de Alzheimer, doença pulmonar obstrutiva crônica, colite ulcerativa, restenose após angioplastia, eczema, pressão sangüínea elevada, agregação plaquetária, sangramento gastrointestinal, endometriose, síndrome pré-menstrual, encefalomielite miálgica, fadiga crônica após infecções virais ou uma doença ocular.

74. Uso caracterizado pelo fato de ser por uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, -5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, -21, 49 ou 50, o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, um polinucleotídeo da reivindicação 46, um vetor da reivindicação 4 7 ou da reivindicação 48, um óleo de qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, -63, 64 ou 65 ou um ácido graxo da reivindicação 66 e/ou um alimento da reivindicação 69 para a manufatura de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma condição que se beneficiaria de um PUFA.