JP2002523048A - 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素の遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコードする単離核酸フラグメントまたはそれと機能的に均等なサブフラグメントの製造および使用が記載されている。このような核酸フラグメントもしくはそれと機能的に均等なサブフラグメントまたはその補体および適当な調節配列を導入するキメラ遺伝子は脂質プロファイルの変化したトランスジェニック植物の創製に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、脂肪酸の生合成および、とくに共役二重結合の形成に関係する植物
脂肪酸改質酵素（plant fatty acid modifying enzyme）をコードする核酸フラ
グメントの製造および使用に関する。このような核酸フラグメントまたはその機
能的に均等なサブフラグメントおよび適当な調節配列が導入されたキメラ遺伝子
は脂質プロファイルが変化したトランスジェニック植物の創製に使用することが
できる。

【０００２】

【背景技術】

一般的な二重結合に加え化学的な改質を受けた脂肪酸が多くの油脂種子の貯蔵
脂質中に見いだされる（Harwood, I.J. 1980, In The Biochemistry of Plants,
T.S. Moore Jr. ed., CRC Press, New York, pp 91-116）。これらの改質の一
部は工業的適用において有用な生成物を産生するように脂肪酸を機能化する。こ
れは植物由来の脂質の食品としての、より一般的な利用と対立するものである。
このような例には、ヒドロキシル化脂肪酸リシノレン酸の潤滑剤としての使用、
パーム油からの短または中炭素鎖長脂肪酸の界面活性剤としての使用がある。場
合により、熱帯地方で産生される油脂種子の貯蔵脂質の脂肪酸組成は、外来起源
の遺伝子の付加により、大量のユニークな脂肪酸が産生されるように改質するこ
とができる（Ohlrogge, J.B. 1994, Plant Physiol. 104, 821-826）。

【０００３】 共役二重結合を含有する脂肪酸は限られた数の植物種の種子油脂の主要な成分
である。たとえば、α−パリナル酸（α−parinaric acid）（９−シス，１１−
トランス，１３−トランス，１５−シス−オクタデカテトラエン酸）およびβ−
パリナル酸（９−トランス，１１−トランス，１３−トランス，１５−シス−オ
クタデカテトラエン酸）は Impatiens（ツリフネソウ科）の種の種子油脂総脂肪
酸の２５％以上を構成している（Bagby, M.O., Smith, C.R. & Wolff, I.A. 196
6, Lipids 1, 263-267）。さらに、α−エレオステアリン酸（９−シス，１１−
トランス，１３−トランス−オクタトリエン酸）ならびにβ−エレオステアリン
酸（９−トランス，１１−トランス，１３−トランス−オクタトリエン酸）は M
omordica charantia（ツルレイシ）の種子油脂の総脂肪酸の＞５５％を構成する
（Chisolm, M.J. & Hopkins. C.Y. 1994, Can. J. Biochem. 42, 560-564; Liu,
L., Hammond, E.G. & Nikolau, B.J. 1997, Plant Physiol. 113, 1343-1349)
。

【０００４】 脂肪酸中における共役二重結合の存在は、エレオステアリン酸のアイソマーに
富んだ桐油のような乾性油の機能的な基盤を提供する。これは主として、とくに
メチレンで中断された二重結合を有するポリ不飽和脂肪酸に比較した場合に共役
二重結合を有する脂肪酸は高率の酸化を示すという事実に基づいている。桐油の
ような乾性油は、ペンキ、ニスおよびインクの成分として使用される。

【０００５】 共役脂肪酸はまた、動物の飼料添加物としても使用することができる。共役リ
ノール酸（ＣＬＡ，１８：２）は動物飼料の脂肪組成の改良に用いられてきた。

【０００６】 1998年12月22日に Cook らに発行された米国特許第5,581,572号には共役リノ
ール酸を用いて、動物の脂肪の締まりを増大させ、動物の肉の品質を改良する方
法が記載されている。

【０００７】 1996年9月10日に Cookらに発行された米国特許第5,554,646号には共役リノー
ル酸を用いて、動物の生体脂肪を低下させる方法が記載されている。

【０００８】 1999年7月6日に Cookらに発行された米国特許第5,519,451号には、動物の成長
または飼料変換効率を改良する方法において、栄養素の内核、および共役脂肪酸
または動物の成長能力もしくは飼料を体組織に効率的に変換する能力に悪影響を
及ぼす疾患への感染から動物を保護できる抗体を含む外層を有する動物飼料用粒
子を包含する方法が記載されている。

【０００９】 1995年6月27日に Cookらに発行された米国特許第5,428,072号には共役リノー
ル酸の使用を包含する動物の増体重および飼料効率を上昇させる方法が記載され
ている。

【００１０】 これらの効果が実現する機構は不明である。動物の屠体特性の改良のための共
役１８：３脂肪酸（共役リノレン酸もしくはＣlnＡ）の使用はこれまでに論じら
れたことはないと確信する。

【００１１】 共役二重結合を有する脂肪酸の生合成については十分理解されていない。数件
の報告には、共役二重結合は既存の二重結合の改変により形成されることが指示
されている（Crombie, L. & Holloway, S.J. 1985, J. Chem. Soc. Perkins Tra
ns. I. 1985, 2425-2434; Liu, L., Hammond, E.G. & Nikolau, B.J. 1997, Pla
nt Physiol．113, 1343-1349）。たとえば、エレオステアリン酸における１１お
よび１３炭素原子はリノール酸（１８：２△^9,12）の△¹²二重結合の改変により
生じることが示されている（Liu, L., Hammond, E.G. & Nikolau, B.J. 1997, P
lant Physiol. 113, 1343-1349）。しかしながら、脂肪酸における共役二重結合
形成に関与する正確な機構はまだ決定されていない。したがって、候補酵素のク
ラスは示唆されてはいるものの、それらの候補クラスからまたは共役二重結合を
有する脂肪酸の産生されることが知られている組織から遺伝子配列は単離されて
いない。

【００１２】

【発明の開示】

本発明は共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコードする単離
核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはその機能的に均等なサブフ
ラグメントは（ａ）配列番号：１、３、１９、２３または２９に掲げた任意のヌ
クレオチド配列に中等度の緊縮条件下にハイブリダイズするか、または（ｂ）配
列番号：１、３、１９、２３または２９に掲げた任意のヌクレオチド配列により
コードされるポリペプチドと少なくとも４５％は同一であるか、もしくは相同性
配列を検出するために設計された比較方法によって測定してその機能的に均等な
サブフラグメントである単離核酸フラグメントに関する。

【００１３】 第二の態様においては、本発明は共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改
質酵素をコードする単離核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはそ
の機能的に均等なサブフラグメントは配列番号：２、４、２０、２４または３０
に掲げたアミノ酸配列の任意の一つからなる蛋白質をコードする単離核酸フラグ
メントに関する。

【００１４】 第三の態様においては、本発明は適当な調節配列に操作性に連結したこのよう
な単離核酸フラグメントもしくはそれと機能的に均等なサブフラグメントまたは
それらの補体からなるキメラ遺伝子に関する。

【００１５】 第四の態様においては、本発明は、このようなキメラ遺伝子からなるトランス
フォームされた宿主細胞に関する。

【００１６】 第五の態様においては、本発明は共役二重結合を有する脂肪酸のレベルを変化
させる方法において、 (ａ) 宿主細胞を上述のようにキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
に増殖させ、ついで (ｃ) 二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされた宿
主細胞を選択することからなる方法に関する。

【００１７】 第六の態様においては、本発明は、植物の種子中に共役二重結合を有する脂肪
酸含有種子油脂を製造する方法において、 (ａ) 植物細胞をこのようなキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) 工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
を生育させ、 (ｃ) 工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を、共役二重結合を有する
脂肪酸のレベルの変化についてスクリーニングし、ついで (ｄ) 工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして、レベルが変化した、共役
二重結合を有する植物脂肪酸を含有する種子を得る方法に関する。

【００１８】 第七の態様においては、本発明は、共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸
改質酵素を製造する方法において、 (ａ) 微生物宿主細胞を請求されたキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
に増殖させ、ついで (ｃ) キメラ遺伝子によってコードされた蛋白質のレベルが変化したトランス
フォームされた宿主細胞を選択することからなる方法に関する。

【００１９】 第八の態様においては、本発明は、共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸
改質酵素をコードする単離核酸フラグメントに関する。

【００２０】 第九の態様においては、本発明は、共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸
改質酵素をコードする核酸フラグメントおよびその機能的に均等なサブフラグメ
ントを単離する方法において、 (ａ) 配列番号：２、４、２０、２４または３０と他の脂肪酸改質酵素ポリペ
プチド配列を比較し、 (ｂ) 工程（ａ）において得られた４個またはそれ以上のアミノ酸の保存的配
列を同定し、 (ｃ) 工程（ｂ）において同定された保存的配列に基づく縮重オリゴマーを設
計し、ついで (ｄ) 工程（ｓ）の縮重オリゴマーを用いて共役二重結合の形成に関係する植
物脂肪酸改質酵素またはその部分をコードする配列を配列依存性プロトコールに
より単離する方法に関する。

【００２１】 第十の態様においては、本発明は、本明細書で論じたキメラ遺伝子でトランス
フォームされた植物から得られる任意の種子のプロセッシングによって誘導され
る成分からなる動物飼料、ならびに桐油、ビターメロン、キンセンカ、ジャカラ
ンダ、キササゲおよびザクロからなる群より選択される天然原料から抽出された
油脂に由来する少なくとも１種の共役リノレン酸からなる動物飼料に関する。

【００２２】 第十一の態様においては、本発明は、動物の食餌をこのような動物飼料で補充
することによる動物の屠体の品質を改良する方法に関する。

【００２３】配列番号の簡単な説明 本発明の一部を形成する以下の詳細な説明ならびに図面および配列の記載から
、本発明はさらに完全に理解できるものと確信する。配列表には、Nucleic Acid
s Research 13: 3021-3030 (1985) および Biochemical Journal 219 (No.2): 3
45-373 (1984) に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ標準に定義されたヌクレオチド配列
特性の１文字コードおよびアミノ酸の３文字コードを含有し、またすべてのヌク
レオチドおよびアミノ酸配列データに用いられる記号およびフォーマットは 37
C.F.R. §1.821-1.825 およびＷＩＰＯ標準 St.25 に掲げられた特許出願におけ
るヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示について定めた規定に従った。

【００２４】 配列番号：１は、Impatiens balsamina（ホウセンカ）の種子からの共役二重
結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素をコードするクローンＩmpＨ8Ｆad2 中の
ｃＤＮＡ挿入体からなるヌクレオチド配列である。 配列番号：２は、クローンＩmpＨ8Ｆad2 中のｃＤＮＡ挿入体からなるヌクレ
オチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号：３は、Momordica charantia（ツルレイシ）の種子からの共役二重
結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素をコードするクローンＭomＦad2 中のｃＤ
ＮＡ挿入体からなるヌクレオチド配列である。 配列番号：４は、クローンＭomＦad2 中のｃＤＮＡ挿入体からなるヌクレオチ
ド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号：５は、図１（図１−１および１−２）に記載の大豆（Glycine max
）脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列である。

【００２５】 配列番号：６は、図１に記載のトウゴマ（Ricinus communis）脂肪酸ヒドロキ
シラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列である。 配列番号：７は、タバコ発現ベクターｐＭＬ63 中にクローニングするために
、Impatiens balsamina コード配列の増幅に使用するＮcoＩ−含有５′−末端「
センス」プライマーである。 配列番号：８は、タバコ発現ベクターｐＭＬ63 中にクローニングするために
、Impatiens balsamina コード配列の増幅に使用するＥcoＲＩ−含有３′−末端
「アンチセンス」プライマーである。 配列番号：９は、タバコ発現ベクターｐＭＬ63 中にクローニングするために
、Momordica charantia コード配列の増幅に使用するＮcoＩ−含有５′−末端「
センス」プライマーである。 配列番号：１０は、タバコ発現ベクターｐＭＬ63 中にクローニングするため
に、Momordica charantia コード配列の増幅に使用するＥcoＲＩ−含有３′−末
端「アンチセンス」プライマーである。

【００２６】 配列番号：１１は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素の Impatiens balsamina コード領域の増幅に用いられするＮcoＩ−含有５′
−末端「センス」プライマー、およびｐＫＳ67 へのそのクローニングである。 配列番号：１２は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素の Impatiens balsamina コード領域の増幅に用いられるＮcoＩ−含有３′−
末端「アンチセンス」プライマー、およびｐＫＳ67 へのそのクローニングであ
る。 配列番号：１３は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素の Momordica charantia コード領域の増幅に用いられるＮcoＩ−含有５′−
末端「センス」プライマー、およびｐＫＳ67 へのそのクローニングである。 配列番号：１４は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素の Momordica charantia コード領域の増幅に用いられるＮcoＩ−含有５′−
末端「センス」プライマー、およびｐＫＳ67 へのそのクローニングである。 配列番号：１５は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco（ワレモコウ）ｃＤＮＡの５′−末端を増
幅するために用いられるＢamＨＩ−含有「アンチセンス」プライマーである。

【００２７】 配列番号：１６は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡの３′−末端を増幅するために
用いられるＥcoＲＩ−含有「センス」プライマーである。 配列番号：１７は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡのコード領域を増幅するために
用いられるＢamＨＩ−含有５′−末端「センス」プライマーである。 配列番号：１８は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡのコード領域を増幅するために
用いられるＥcoＲＩ−含有３′−末端「アンチセンス」プライマーである。 配列番号：１９は、Chrysobalanus icaco の種子からの、共役二重結合の形成
に関係する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡ挿入体か
らなるヌクレオチド配列である。 配列番号：２０は、配列番号：１９からのクローン中のｃＤＮＡ挿入体からな
るヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。

【００２８】 配列番号：２１は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡのコード領域を増幅するために
用いられるＮotＩ−含有５′−末端「センス」プライマーである。 配列番号：２２は、種子からの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵
素をコードする Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡのコード領域を増幅するために
用いられるＮotＩ−含有３′−末端「アンチセンス」プライマーである。 配列番号：２３は、Licania michauxii の種子からの、共役二重結合の形成に
関係する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡ挿入体から
なるヌクレオチド配列である。 配列番号：２４は、配列番号：２３からのクローン中ｃＤＮＡ挿入体からなる
ヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号：２５はゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸
改質酵素をコードする Aleurites fordii（オオアブラギリ）のｃＤＮＡのコー
ド領域を増幅するために用いるＥcoＲＩ−含有５′−末端「センス」プライマー
である。

【００２９】 配列番号：２６は、ゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪
酸改質酵素をコードする Aleurites fordii のｃＤＮＡのコード領域を増幅する
ために用いるＥcoＲＩ−含有３′−末端「アンチセンス」プライマーである。 配列番号：２７は、Aleurites fordii のＰＣＲで増幅されたゲノムＤＮＡか
らの、共役二重結合の形成に関係するクラスＩ脂肪酸改質酵素をコードするｃＤ
ＮＡクローン中のｃＤＮＡ挿入体からなるヌクレオチド配列である。 配列番号：２８は、配列番号：２７からのクローン中のｃＤＮＡ挿入体からな
るヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号：２９は、Aleurites fordii のＰＣＲで増幅されたゲノムＤＮＡか
らの、共役二重結合の形成に関係するクラス II 脂肪酸改質酵素をコードするｃ
ＤＮＡクローン中のｃＤＮＡ挿入体からなるヌクレオチド配列である。 配列番号：３０は、配列番号：２９からのクローン中のｃＤＮＡ挿入体からな
るヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。

【００３０】 配列番号：３１はゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸
改質酵素をコードする Chrysobalanus icaco のｃＤＮＡの保存アミノ酸リピー
トＫＫＡＩＰＰＨＣＦおよびＷＲＥＡＫＥＣの間のコード領域を増幅するために
使用されるＸbaＩ−含有５′−末端「センス」プライマーである。 配列番号：３２はゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸
改質酵素をコードする Chrysobalanus icaco のｃＤＮＡの保存アミノ酸リピー
トＫＫＡＩＰＰＨＣＦおよびＷＲＥＡＫＥＣの間のコード領域を増幅するために
使用されるＢgl II−含有３′−末端「アンチセンス」プライマーである。 配列番号：３３は、ゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪
酸改質酵素をコードする Licania michauxii のｃＤＮＡのコード領域を増幅す
るために使用されるＮcoＩ−含有５′−末端「センス」プライマーである。 配列番号：３４は、ゲノムＤＮＡからの、共役二重結合の形成に関係する脂肪
酸改質酵素をコードする Licania michauxii のｃＤＮＡのコード領域を増幅す
るために使用されるＢgl II−含有３′−末端「アンチセンス」プライマーであ
る。

【００３１】 この開示に関連して、多くの技術用語が使用される。 本明細書で用いられる「単離核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖の、
任意に合成、非天然または変化させたヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたは
ＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー型の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１または２以上のセグメントから構成されて
もよい。ヌクレオチドは、それらの１文字記号によって次のように表される。す
なわち、アデニンは「Ａ」、シトシンは「Ｃ」、グアノシンは「Ｇ」、チミジン
は「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）は「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）は「Ｙ」
、ＧまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、任意
のヌクレオチドは「Ｎ」である。

【００３２】 「機能的に均等であるサブフラグメント」および「機能的に均等なサブフラグ
メント」の語は本明細書では同義に用いられる。これらの語は、フラグメントま
たはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子の
発現を変える能力またはある種の表現型を生成する能力を維持している単離核酸
フラグメントの部分またはサブ配列を意味する。たとえば、そのフラグメントま
たはサブフラグメントはトランスフォームされた植物に所望の表現型を生成させ
るキメラ遺伝子の設計に使用することができる。キメラ遺伝子は核酸フラグメン
トまたはそのサブフラグメントを植物プロモーター配列に関して適当な方向に連
結することにより、それが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、共抑制
またはアンチセンスに使用するために設計することができる。

【００３３】 本明細書で用いられる「実質的に類似」および「実質的に相当する」の語は、
１または２以上のヌクレオチド塩基で核酸フラグメントの遺伝子発現の仲介能力
またはある種の表現型の生成能力に影響しない変化を受けた核酸フラグメントを
意味する。これらの語はまた、１または２以上のヌクレオチドの欠失または挿入
のような本発明の核酸フラグメントの改質であって、最初の非改質フラグメント
に関して得られた核酸フラグメントの機能性は実質的に変化してない改質を意味
する。したがって、本技術分野の熟練者には明らかなように、本発明は特異的な
例示配列以上の配列を包含するものであることを理解すべきである。

【００３４】 さらに、本発明に包含される実質的に類似の核酸配列はまた、熟練技術者には
明らかなように、中等度の緊縮条件下（たとえば、０.５×ＳＳＣ，０.１％ＳＤ
Ｓ，６０℃）において、ここに例示された配列と、またはここに報告されたヌク
レオチド配列であり本発明のプロモーターと機能的に均等な任意の部分と、ハイ
ブリダイズする能力によって定義される。本発明に包含される実質的に類似の核
酸配列は、好ましくは、ここに記載された核酸フラグメントと４５％の同一性を
示す配列またはここに記載されたヌクレオチド配列の任意の部分と４５％の同一
性を示す配列である。さらに好ましくは、ここに記載された核酸配列と５０％の
同一性を示すか、またはここに記載されたヌクレオチド配列の任意の部分と５０
％の同一性を示す核酸フラグメントである。最も好ましくはここに記載された核
酸配列と６０％の同一性を示すかまたはここに記載されたヌクレオチド配列の任
意の部分と６０％の同一性を示す核酸フラグメントである。配列アラインメント
と類似性％の計算はそれらに限定されるものではないがＬＡＳＡＲＧＥＮＥ生物
情報コンピューター装置の Megalian プログラム（Dnastar Inc., Madison, WI)
を用いて実施した。配列の多重アラインメントは、Clustal のアラインメント法
（Higgins & Sharp, 1989, CABIOS. 5: 151-153）によりデフォルトパラメータ
ー（GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10）を用いて実施した。Clustal
法を用いたペア毎のアラインメントおよび蛋白質配列の同一性％の計算のための
デフォルトパラメーターは KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3, WINDOW＝5 および DIA
GONALS SAVED＝5とする。核酸では、これらのパラメーターは KTUPLE＝2, GAP P
ENALTY＝5, WINDOW＝4 および DIAGONALS SAVED＝4とする。

【００３５】 アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、本技術分野の熟練者に
よる配列の手作業での評価、またはＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F.ら, 1993, J.Mo
l. Biol. 215: 403-410）および Gapped ＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F.ら, 1997,
Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402，また、www. ncbi. nlm. nih. gov／BLAST
／参照）のようなアルゴリズムを用いるコンピューター自動配列比較および同定
のいずれかによる、そのポリペプチドもしくは遺伝子の同定候補を与えるのに十
分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列から構成され
る。

【００３６】 「遺伝子」は、コード配列に先立つ（５′−非コード配列）および以後の（３
′−非コード配列）調節配列を含めて、特定の蛋白質を発現する核酸フラグメン
トを意味する。「ネイティブな遺伝子」は天然にそれ自身の調節配列とともに見
いだされる遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見いだされる
ことはない調節配列およびコード配列からなるネイティブではない遺伝子である
任意の遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来す
る調節配列およびコード配列からなるか、または同じソースに由来する調節配列
およびコード配列からなるが、天然に見いだされるのとは異なる様式でアレンジ
されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置におけるネイテ
ィブな遺伝子を意味する。「異種」遺伝子は宿主細胞中に正常には見いだされな
いが、遺伝子トランスファーによって宿主生物中に導入された遺伝子を意味する
。異種遺伝子は、ネイティブでない生物中に挿入されたネイティブな遺伝子また
はキメラ遺伝子からなる。「導入遺伝子」は、トランスフォーメーション操作に
よってゲノム中に導入された遺伝子である。

【００３７】 「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。
「調節配列」はコード配列の上流（５′−非コード配列）、その配列内、または
下流（３′−非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を意味し、それらは転
写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性または会合コード配列の翻訳に影響す
る。調節配列には、それらに限定されるものではないがプロモーター、翻訳リー
ダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が包含される。

【００３８】 「プロモーター」はコード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ
配列を意味する。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流エレメントから
構成され、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い、したがって
「エンハンサー」はプロモーターの活性を刺激できるＤＮＡ配列であって、プロ
モーターの内生的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を
上昇させるために挿入された異種エレメントのＤＮＡ配列である。プロモーター
はそれらの全体がネイティブな遺伝子に由来するものであっても、天然に見いだ
される異種プロモーターに由来する異種エレメントから構成されても、また合成
ＤＮＡセグメントからなるものであってもよい。本技術分野の熟練者によれば、
異種プロモーターは異種組織もしくは細胞型において、分化の異なる段階でまた
は異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指図するものと理解されている。
大部分の細胞型で、大部分の時期に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、
一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。現在では、植物細胞で有用な様々
な型の新規プロモーターが絶えず発見され、多数の実例が Okamoto & Goldberg,
1989, Biochemistry of Plants 15: 1-82 に列挙されている。調節配列の正確な
境界は大部分の場合、完全には定義されていないので、ある変動を有するＤＮＡ
フラグメントが同一のプロモーター活性をもつことがさらに認められている。

【００３９】 「イントロン」は遺伝子中の介在配列であり、蛋白質配列の部分をコードする
ものではない。すなわちこのような配列はＲＮＡには転写されるが、ついで切断
されて、翻訳されない。この語はまた、切断されたＲＮＡ配列にも使用される。
「エキソン」は転写される遺伝子配列の部分であり、遺伝子から誘導される成熟
メッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、必ずしも最終の遺伝子産物をコード
する配列の部分ではない。

【００４０】 「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に存在
するＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全に
プロセッシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写体
のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響する。
翻訳リーダー配列の例は Turner, R. & Foster, G.D., 1995, Molecular Biotec
hnology 3: 225に記載されている。

【００４１】 「３′−非コード配列」はコード配列の下流に存在するＤＮＡ配列を意味し、
ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響
できる調節シグナルをコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグナル
は通常、ｍＲＮＡプレカーサーの３′末端へポリアデニル酸領域への付加に影響
することを特徴とする。異なる３′−非コード配列の使用は Ingelbrechtら, 19
89, Plant Cell 1: 671-680に例示されている。

【００４２】 「ＲＮＡ転写体」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産
物を意味する。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補性コピーである場合には
それは一次転写体と呼ばれるか、またはそれは一次転写体の転写後プロセッシン
グに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンをもたず、細胞により蛋白質に翻訳で
きるＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補性であり、逆転写
酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは一本鎖
でもよく、またＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖型
に変換することもできる。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを包含し、したがって細
胞内またはインビトロで蛋白質に翻訳できるＲＮＡ転写体を意味する。「アンチ
センスＲＮＡ」は標的一次転写体またはｍＲＮＡのすべてまたは部分に相補性で
あり標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡを意味する（米国特許第5,107,065号）
。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写体の任意の部分、すなわち５
′−非コード配列、３′−非コード配列、イントロンまたはコード配列と相補性
であってよい。「機能性ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、
または翻訳されないが細胞過程に影響する他のＲＮＡを意味する。「補体」およ
び「逆補体」の語は、ｍＲＮＡに関して本明細書においては同義に使用され、そ
のメッセージのアンチセンスＲＮＡを定義する意味である。

【００４３】 「操作性に連結」の語は、一方の機能が他方によって影響されるように、単一
核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を意味する。たとえばプロモーターは
それがコード配列の発現に影響できる場合（すなわちコード配列がプロモーター
の転写制御下にある場合）、コード配列と操作性に連結している。コード配列は
センスまたはアンチセンス方向で調節配列に機能性に連結することができる。

【００４４】 本明細書に使用される「発現」の語は機能性最終産物の産生を意味する。遺伝
子の発現または過剰発現には、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのプレカーサーまた
は成熟蛋白質への翻訳が包含される。「アンチセンス阻害」は標的蛋白質の発現
を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写体の産生を意味する。「過剰発現」の語は
正常なまたは非トランスジェニック生物での産生レベルを越えるトランスジェニ
ック生物における遺伝子産物の産生を意味する。「共抑制」は同一または実質的
に類似の異種もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ
の産生を意味する（米国特許第5,231,020号）。

【００４５】 「変化した発現」とは、トランスジェニック生物における遺伝子産物（単数ま
たは複数）の産生が、野生型生物からの匹敵する組織（生物型および分化型）に
おける活性から量または比率で有意に異なることを意味する。

【００４６】 「成熟」蛋白質とは、翻訳後プロセッシングを受けたポリペプチド、すなわち
一次翻訳産物中に存在するプレまたはプロペプチドが除去されたポリペプチドを
意味する。「プレカーサー」蛋白質とはｍＲＮＡの翻訳の一次産物すなわちプレ
またはプロペプチドがまだ存在する産物を意味する。プレおよびプロペプチドは
それらに限定されるものではないが、細胞内局在シグナルであってもよい。

【００４７】 「葉緑体トランジットペプチド」は、蛋白質と接合して翻訳されその蛋白質を
葉緑体、またはその蛋白質が作成された細胞内に存在する他のプラスチド型に向
けるアミノ酸配列である。「葉緑体トランジット配列」は、葉緑体トランジット
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。「シグナルペプチド」とは
は蛋白質と接合して翻訳され、その蛋白質を分泌系に向けるアミノ酸配列である
（Chrispeels, J.J., 1991, Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-
53）。蛋白質が液胞に向けられる場合は液胞ターゲティングシグナル（上述）を
さらに付加させ、小胞体に向けられる場合には小胞体維持シグナル（上述）が付
加される。蛋白質が核へ向けられる場合は存在するシグナルペプチドをすべて除
去し、代わりに核局在シグナルを包含させる（Raikhel, 1992, Plant Phys. 100
：1627-1632）。

【００４８】 「トランスフォーメーション」は核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへのト
ランスファーを意味し、遺伝的に安定な素因が生じる。トランスフォームされた
核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる
。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の好ましい細胞トランスフォーメー
ション方法には、粒子加速もしくは「遺伝子ガン」トランスフォーメーション技
術（Kleinら, 1987, Nature (London) 327: 70-73; 米国特許第4,945,050号）ま
たは導入遺伝子を含有する適当なＴi プラスミドを使用するアグロバクテリウム
−媒介法(Ishida, Y.ら, 1996, Nature Biotech. 14: 745-750）の使用がある。

【００４９】 本発明で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は本技術分
野において周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T., Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: C
old Spring Harbor, 1989（以下 Sambrook という）にさらに詳細に記載されて
いる。

【００５０】 「ＰＣＲ」もしくは「ポリメラーゼ連鎖反応」は一連の反復サイクルから構成
される（Perkin Elmer Cetus Instruments, CT）大量の特異的ＤＮＡセグメント
を合成するための技術である。通常二本鎖ＤＮＡを加熱して変性させ、標的セグ
メントの３′境界に相補性の２つのプライマーを低温でアニーリングし、ついで
中間温度で伸長させる。これらの３連続工程の１セットを１サイクルとする。

【００５１】 本明細書で用いられる「発現構築体」とは、本発明の任意の単離核酸フラグメ
ントからなり、本明細書で論じたように単独でまたは互いに組み合わせて用いら
れ、さらにベクターまたはそのサブフラグメントと接合して使用することもでき
る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、本技術分野の熟練者には周知
のように宿主植物のトランスフォーメーションに使用する方法に依存する。たと
えば、プラスミドベクターを使用できる。本発明の任意の単離核酸フラグメント
からなる宿主細胞を有効にトランスフォーム、選択および増殖させるためにベク
ター上に存在しなければならない遺伝子エレメントについては、熟練者には周知
である。また、異なる独立のトランスフォーメーション現象は、異なる発現レベ
ルおよび発現パターンで起こること（Jonesら, 1985, EMBO J 4: 2411-2418; De
Almeidaら, 1989, Mol. Gen. Genetics 218: 78-86）、したがって、所望の発現
レベルおよびパターンを示す系統を得るためには多くの現象をスクリーニングし
なければならないことは熟練者には周知の通りである。このようなスクリーニン
グはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウエスタ
ン分析または表現型分析によって行われる。「発現構築体」および「組換え発現
構築体」の語は本明細書においては同義に使用される。

【００５２】 「ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ」は、アシル鎖のカルボキシル末端に対し
て１２および１３番目の炭素原子の間においてオレイン酸への二重結合の挿入を
触媒する細胞質酵素を意味する。二重結合は、以下の非均等構造を仮定できるキ
ラル単位であるので、「シス」または「トランス」と呼ばれる。

【化１】

【００５３】 この酵素のオレイン酸基質は、糖脂質たとえばホスファチジルコリンに結合し
ている。「ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ」の語は、「ω⁶−デサチュラーゼ」
、「△¹²−オレイン酸デサチュラーゼ」、「△¹²−デサチュラーゼ」および「Ｆ
ad2」と同義に使用される。ω⁶と△¹²の位置は、ω−炭素はメチル末端から数え
られ、一方、△−炭素は脂肪酸鎖のカルボキシル末端から数えられるので、オレ
イン酸（Ｃ18）においては同じでる。本発明の酵素は脂肪酸の脱飽和に関与する
活性からなり、結果として共役二重結合の形成を生じる。「共役二重結合」の語
は式：−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−により指示される関係位置にある２つの二重
結合と定義される（Grant & Hackh's Chemical Dictionary, Fifth. Ed., R.Gra
nt & C.Grant eds., McGraw-Hill, New York）。π−軌道の電子は共役二重結合
間で共有されるが、非共役二重結合においては比較的独立している。これは共役
二重結合の酸素との大きな反応性を説明するものである。本明細書に記載する共
役二重結合の形成に関係する改質酵素は「ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ類似
」、「△¹²−オレイン酸デサチュラーゼ類似」、「ω⁶−オレイン酸デサチュラ
ーゼ様」または「△¹²−デサチュラーゼ様」とも呼ばれる。「類似」および「様
」の語はＦad2 酵素をコードする遺伝子対本発明の遺伝子の間の核酸配列のホモ
ロジーにおける保存および差異を反映している。

【００５４】 本発明は共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコードする単離
核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはその機能的に均等なサブフ
ラグメントは（ａ）配列番号：１、３、１９、２３または２９に掲げたヌクレオ
チド配列に中等度の緊縮条件下にハイブリダイズするか、または（ｂ）配列番号
：１、３、１９、２３または２９に掲げたヌクレオチド配列によりコードされる
ポリペプチドと少なくとも４５％は同一であるかもしくは相同性配列を検出する
ために設計された比較方法により測定してその機能的に均等なサブフラグメント
である単離核酸フラグメントに関する。

【００５５】 このような酵素は、Impatiens balsamina、 Momordica charantia および Chry
sobalanus icaco の生育中の種子で正常に発現され、それらは配列において植物
の膜結合脂肪酸デサチュラーゼに類似している。しかしながら、これらの脂肪酸
改質酵素は、それらの機能性において膜結合脂肪酸デサチュラーゼとは異なって
いる。とくにこれらの酵素は共役二重結合を有する脂肪酸の形成に関係し、さら
に特定すれば共役リノレン酸の形成に関与する。共役二重結合をもつ脂肪酸の例
には、それらに限定されるものではないが、エレオステアリン酸および／または
パリナル酸が包含される。エレオステアリン酸を含む天然に存在する植物油脂に
は、種子から抽出された油脂中に６９％ものα−エレオステアリン酸が含有され
る Aleurites fordii もしくは montana からの桐油、あるいは valarian 種（C
entranthus microsifolia）からの油脂が包含される。ジャカル酸（ジャカラン
ダの木から、Jacaranda mimosiphon および Jacaranda chelonia から、１８：
３△^{8cis,10trans,12cis}）、カレンド酸（キンセンカ、またはアフリカデージー
から、Calendula officinalis ならびに Osteospermum spinescens および Oste
ospermum hyoseroides から、１８：３△^{8trans,10trans,12cis}）、カタルプ酸
（アメリカノウゼンカズラ、Catapla ovata または speciosa または bigninioi
des から、１８：３△^{9trans,11trans,13cis}）およびプニース酸（ビターメロン
およびザクロ、Tricosanthes 種、Cucurbita、 Punica granatum、 Tricosanthes
cucumeroidesから、１８：３△^{9cis,11trans,13cis}）を挙げることができる。共
役二重結合をもつこれら脂肪酸および他の脂肪酸は“Lipid Handbook" 2nd. Edi
tion, Gunstone，F.D.ら編, Chapman & Hall, London, 1994; Crombie & Hollow
ay, J, Chem. Soc. Perkins Trans. 1985: 2425-2434; および Liuら, Plant Ph
ysiol. 1997, 113: 1343-1348に見いだすことができる。これらの共役脂肪酸は
またすべて組成が１８：３であることから、ＣlnＡ（共役リノレン酸）とも呼ば
れている。これは１８：２コンフィギュレーションをもつＣＬＡ（共役リノレン
酸）と対照的である。

【００５６】 「１８：３」の命名法は脂肪酸鎖における炭素の数（この場合、「１８」また
はステアリン酸の長さ）および不飽和二重結合の数（この場合、「３」はこの脂
肪酸をリノレン酸に特定する）を意味する。１８：２および１８：３はそれぞれ
リノール酸およびリノレン酸であるが、二重結合の位置は特定されない（すなわ
ち、それらは非共役または共役、シスまたはトランスのいずれでもよい）。

【００５７】 本明細書において用いられる「エレオステアリン酸」の語は、△^9,11,13−オ
クタデカトリエン酸（１８：３△^9,11,13）のシス−トランスアイソマーの混合
物を指す。この混合物は主としてα−エレオステアリン酸（１８：３△^{9cis,11t rans,13trans} ）からなるが、β−エレオステアリン酸（１８：３△^{9trans,11tra ns,13trans} ）を含めて他のアイソマーを含有していてもよい。本明細書において
用いられる「パリナル酸」の語は、△^9,11,13,15−オクタデカテトラエン酸（１
８：４△^9,11,13,15）のシス−トランスアイソマーの混合物を指す。この混合物
は主としてα−パリナル酸（１８：３△^{9cis,11trans,13trans,155cis}）からな
るが、他のアイソマー、たとえばβ−パリナル酸（１８：３△^{9trans,11trans,1 3trans,15trans} ）を含有していてもよい。本技術分野の熟練者には明らかなよう
に、エレオステアリン酸およびパリナル酸はガスクロマトグラフィ−マススペク
トル（ＧＣ−ＭＳ、図３参照）によって容易に分割することが可能でα型はβ型
（図３に^*印を付した）から識別することができる。ＧＣ−ＭＳ分析についての
さらに詳細は実施例４、５、７および８に見いだされる。

【００５８】 配列ホモロジーを検出する比較方法の例は、それらに限定されるものではない
がＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド、両鎖）、ＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド、６−フ
レーム翻訳）、ＢＬＡＳＴＰ（蛋白質）、ＴＢＬＡＳＴＮ（蛋白質、６−フレー
ムからの翻訳）、ＴＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド、６−フレーム翻訳）を含めた
ＢＬＡＳＴコンピューター法（Basic Local Alignment Search Tool; Altshulら
, 1993, J.Med. Biol. 215: 403-410; また www. ncbi. nlm. nih. gov／BLAST
／参照）を包含する（ＢＬＡＳＴに関する更なる情報は、blast＠ncbi. nlm. ni
h. gov／BLAST にある「help」もしくは「blast manuals」参照）を含む。ＬＡ
ＳＡＲＧＥＮＥ生物情報コンピューター装置の Megalian プログラム（Dnastar
Inc., Madison, WI, 同一性％の計算用）および多重配列アラインメントの Clus
tal 法（Higgins & Sharp, 1989, CABIOS. 5: 151-153）である。デフォルトパ
ラメーターはすべての比較およびすべての方法について使用した。ＮＣＢＩにお
けるＢＬＡＳＴの基本装置はそれらのウエッブ部位にそれらのアルゴリズムの詳
細な考察があり、Megalian プログラムは Clustal とデフォルトパラメーターを
共有する Clustal プログラムを使用する。すなわち核酸またはポリペプチドの
多重配列アラインメントには（GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PLENTY＝10）、核
酸のペア毎のアラインメントには（KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5, WINDOW＝4, DI
AGONALS SAVED＝4）、ポリペプチドのペア毎のアラインメントには（KTUPLE＝1,
GAP PENALTY＝3, WINDOW＝5, DIAGONALS SAVED＝5）とする。

【００５９】 驚くべきことにそして予期せずに、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質
酵素には厳密な基質特異性はないように思われる。たとえば、Impatiens、 Momor
dica、 Chrysolbalanus、 Licania または Aleurites から得られた酵素は、選択
の背景におけるこれら２種の基質の利用性に基づいてリノール酸（１８：２△^{9, 12} ）をエレオステアリン酸（１８：３△^9,11,13）におよびリノレン酸（１８：
３△^9,12,15）をパリナル酸（１８：４△^9,11,13,15）に変換できるものと考え
られる。すなわち、リノール酸およびリノレン酸の含量が異なる背景を選択する
ことにより、トランスジェニックな種子中に異なる比のエレオステアリン酸およ
びパリナル酸を産生させることができる。

【００６０】 したがって、本発明は、共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素を
コードする単離核酸フラグメントに関する。

【００６１】 本発明はまた、共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコードす
る単離核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはそれと機能的に均等
なサブフラグメントは配列番号：２、４、２０、２４または３０に掲げたアミノ
酸配列の任意の一つからなる蛋白質をコードする単離核酸フラグメントに関する
。

【００６２】 他の態様においては、本発明は共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質
酵素をコードする単離核酸フラグメントであって、上記フラグメントまたはその
機能的に均等なサブフラグメントは共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改
質酵素をコードする任意の単離核酸フラグメントまたはその機能的に均等なサブ
フラグメントにハイブリダイズし、上記フラグメントまたはサブフラグメントは
配列番号：２、４、２０、２４または３０に掲げたアミノ酸配列の任意の一つか
らなる蛋白質をコードし、さらに上記フラグメントまたはサブフラグメントは（
ａ）この単離核酸フラグメントまたはその機能的に均等なサブフラグメントに中
等度の緊縮条件下にハイブリダイズするかまたは（ｂ）前述の単離核酸フラグメ
ントもしくはその機能的に均等なサブフラグメントのいずれかによってコードさ
れるポリペプチドとの相同性配列を検出するために設計された比較方法によって
測定して少なくとも４５％の同一性を有する単離核酸フラグメントに関する。

【００６３】 また、適当な調節配列に連結した本発明の単離核酸フラグメントもしくはその
機能的に均等なサブフラグメントまたはその補体からなるキメラ遺伝子にも興味
がもたれる。この場合、キメラ遺伝子の発現はトランスフォームされた宿主細胞
中のレベルが変化した所望の酵素の産生を生じる。

【００６４】 本発明はまた、宿主細胞中における共役二重結合を形成する脂肪酸のレベルが
変化したこのような単離核酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラ
グメントまたはその補体の使用方法において、 （ａ）宿主細胞を本発明の任意のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 （ｂ）トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
に増殖させ、ついで （ｃ）共役二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされ
た宿主細胞を選択することからなる方法に関する。

【００６５】 さらに他の態様においては、本発明は、植物の種子中に共役二重結合を有する
脂肪酸を含有する種子油脂を製造する方法において、 （ａ）本発明の任意のキメラ遺伝子で植物細胞をトランスフォームし、 （ｂ）工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
を生育させ、 （ｃ）工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を共役二重結合を有する脂
肪酸のレベルの変化についてスクリーニングし、ついで （ｄ）工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして共役二重結合を有する植物
脂肪酸の含有レベルの変化した種子油脂を得る方法に関する。

【００６６】 さらに他の態様においては、本発明は、共役二重結合の形成に関係する植物脂
肪酸改質酵素を製造する方法において、 （ａ）微生物宿主細胞を本発明の任意のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 （ｂ）トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
に増殖させ、ついで （ｃ）キメラ細胞によってコードされる、レベルが変化した蛋白質を含有する
トランスフォームされた宿主細胞を選択することからなる方法に関する。

【００６７】 Impatiens balsamina、Momordica charantia、Chrysobalanus icaco、Licania
michauxii および Aleurites fordii の種子における共役二重結合の形成に関係
する脂肪酸改質酵素をコードする単離核酸フラグメントは、それぞれ配列番号：
１、３、１９、２３および２９中に提供され、相当する推定アミノ酸配列は配列
番号：２、４、２０、２４および３０に提供される。他の植物からの共役二重結
合の形成に関係する脂肪酸改質酵素は、ヌクレオチド配列が配列番号：１、３、
１９、２３および２９に掲げる任意のヌクレオチド配列に中等度の緊縮条件下に
ハイブリダイズするかまたは（ｂ）配列番号：１、３、１９、２３および２９に
掲げる任意のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも４
５％は同一であるかもしくは相同性配列を検出するために設計された比較方法に
より測定してその機能的に均等なサブフラグメントである場合に確認することが
できる。

【００６８】 本明細書に開示されたこれらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸配列は、モノ不飽和脂肪酸の１２および１３炭素原子の間に第二の二重結合を
挿入しオレイン酸からリノール酸を産生する、大豆からの脂肪酸デサチュラーゼ
と図１に対比する。

【００６９】 本発明の単離核酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメント
またはその補体は、宿主細胞をトランスフォームしてキメラ遺伝子を創製するた
めに使用することができる。トランスフォームできる宿主細胞の例には、原核お
よび真核細胞が包含される。たとえば細菌の大腸菌および酵母の Saccharomyces
cerevisiae のような微生物を挙げることができる。植物細胞の例には、それら
に限定されるものではないが、大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花
生、イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシから得
られる細胞が包含される。

【００７０】 すなわち、本発明のキメラ遺伝子は、Impatiens balsamina、Momordica chara
ntia、Chrysobalanus icaco、Lica michauxii および Aleurites fordii の種子
における共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素が、正常レベルより高い
レベルでまたは正常には見いだされない細胞型もしくは分化段階においても存在
するトランスジェニック植物の創製に使用することができる。またこのような植
物から得られる種子およびこれらの種子から得られる油脂に興味がもたれる。

【００７１】 共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素が、正常レベルより高いもしく
は低いレベルで存在するか、または正常には見いだされない細胞型もしくは分化
段階においても存在するトランスジェニック植物を作製することができる。これ
は、それらの細胞中で共役二重結合を有するこのような脂肪酸のレベルが変化し
たことによる効果を有する。ある種の適用においては、植物中のこのような酵素
をコードする遺伝子の発現を減少または消失させることが望ましい場合がある。
これを達成するためには、内因性酵素の共抑制のために設計されたキメラ遺伝子
を、共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素をコードする遺伝子または遺
伝子フラグメントを植物プロモーター配列に連結することによって構築すること
ができる。別法として、本発明の核酸フラグメントのすべてまたは部分に対して
アンチセンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子は、単離核酸フラ
グメントまたはその機能的に均等なサブフラグメントを植物プロモーター配列に
逆方向に連結することによりて構築することができる。共抑制またはアンチセン
スキメラ遺伝子のいずれかの共発現は相当する内因性遺伝子の発現が減少または
消失するトランスフォーメーションによって植物中に導入することができる。

【００７２】 植物細胞中に過剰発現した場合には、Impatiens balsamina、Momordica chara
ntia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役二重結合の形成に関係する脂
肪酸改質酵素は、それらの細胞中における共役二重結合を有する脂肪酸たとえば
エレオステアリン酸および／またはパリナル酸の生合成および蓄積を引き起こす
ために有用である。油脂種子穀類植物の種子の細胞中における二重結合を含有す
る脂肪酸の産生には、Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chry
sobalanus icaco の種子中の共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素の使
用がとくに有用である。

【００７３】 Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の
種子中の共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素の過剰発現は Impatiens
balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役
二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素のｃＤＮＡコード領域を、所望の分化
段階において所望の組織における遺伝子の発現を指図できるプロモーターに操作
性に連結するキメラ遺伝子をまず構築することによって達成することができる。
便宜上、キメラ遺伝子は同じ遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リー
ダー配列から構成してもよい。転写終結シグナルをコードする３′−非コード配
列も提供しなければならない。本発明のキメラ遺伝子はまた、遺伝子の発現を促
進するために１または２個以上のイントロンから構成される。

【００７４】 ついで、本発明のキメラ遺伝子からなるプラスミドベクターのようなベクター
を構築することができる。ベクターの選択は宿主植物のトランスフォームに使用
される方法に依存する。キメラ遺伝子を含有する細胞のトランスフォーム、選択
および増殖に成功するために、プラスミドベクター中に存在しなければならない
遺伝子エレメントは熟練者には周知である。熟練者はまた、異なる独立のトラン
スフォーメーション現象は異なるレベルおよびパターンの発現を生じることも認
識していて（Jonesら, 1985, EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeidaら, 1089, Mol
. Gen. Genetics 218: 78-86）、したがって、所望の発現レベルおよびパターン
を発揮する系統を得るために多重現象についてスクリーニングしなければならな
いことを知っている。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮ
Ａ発現のノーザン分析、蛋白質の発現のウエスタン分析、または表現型分析によ
り達成される。

【００７５】 ある種の適用においては、Impatiens balsamina、Momordica charantia およ
び Chrysobalanus icaco の種子中の共役二重結合の形成に関係する本発明の脂
肪酸改質酵素を、様々な細胞コンパートメントに向けるか、またはその細胞から
の分泌を促進することが有用な場合がある。したがって、本明細書に開示された
Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の種
子中の共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素をコードするコード配列を
適当な細胞内標的化配列、たとえばトランジット配列（Keegsta, K., 1989, Cel
l56: 247-253）、シグナル配列もしくは細胞小胞体局在をコードする配列（Chri
speels, J.J., 1991, Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Bol. 42: 21-53）、
または核局在シグナル（Raikhel, N., 1992, Plant Phys. 100: 1627-1632）の
添加および／または既存の標的配列のを除去により変更することによってさらに
補足することが有望である。上に引用した参考文献にこれらのそれぞれの実例が
あるが、一覧表は網羅的ではなく、有用な標的化シグナルが将来さらに発見され
るものと思われる。

【００７６】 本発明の核酸フラグメントまたはその機能的に均等なサブフラグメントは、ｃ
ＤＮＡおよび同一のまたは他の植物種からの相同な脂肪酸改質酵素をコードする
他の核酸フラグメントを単離するために使用することができる。配列依存性のプ
ロトコールを用いる相同なヌクレオチド配列の単離は本技術分野においては周知
である。配列依存性のプロトコールの例にはそれらに限定されるものではないが
、核酸ハイブリダイゼーション法、様々な核酸増幅技術の使用によって例示され
るようなＤＮＡおよびＲＮＡの増幅法（たとえばポリメラーゼ連鎖反応、ライガ
ーゼ連鎖反応）が包含される。本明細書において用いられる「保存的配列」の語
には厳密な保存およびアラインメントに用いられる配列の大部分の保存、たとえ
ばコンセンサス配列に関する保存の両者が包含される。

【００７７】 したがって、本発明のさらに他の態様においては、共役二重結合の形成に関係
する植物脂肪酸改質酵素をコードする核酸フラグメントまたはその機能的に均等
なサブフラグメントを単離する方法において、 （ａ）配列番号：２、４、２０、２４および３０と他の植物脂肪酸改質酵素ポ
リペプチド配列を比較し、 （ｂ）工程（ａ）において得られた４またはそれ以上のアミノ酸の保存的配列
を同定し、 （ｃ）工程（ｂ）において同定された保存的配列に基づいて縮重オリゴマーを
設計し、ついで （ｄ）工程（ｓ）の縮重オリゴマーを用いて共役二重結合の形成に関係する植
物脂肪酸改質酵素をコードする配列またはその部分を、配列依存性プロトコール
により単離する方法に関する。

【００７８】 たとえば、相同な脂肪酸改質酵素をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかと
してコードする核酸フラグメントは、本発明の核酸フラグメントまたはその機能
的に均等なサブフラグメントのすべてまたは部分を、本技術分野の熟練者に周知
の方法を使用して所望の植物からのライブラリーをスクリーニングするＤＮＡハ
イブリダイゼーションプローブとして直接単離することができる。本発明の核酸
配列に基づく特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、本技術分野で周知の方法
により設計し、合成することができる（Sambrook）。しかも、全配列を用いて熟
練者に周知の方法、たとえば、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランス
レーションもしくは末端−標識法または利用可能なインビトロ転写系を使用する
ＲＮＡプローブにより、直接ＤＮＡプローブを合成することができる。さらに、
特異的なプライマーは、本発明の配列の部分または完全長を増幅するために設計
し使用することができる。得られた増幅生成物は、増幅反応中に直接標識するか
または増幅反応後に標識し、適当な緊縮条件下に、完全長ｃＤＮＡまたはゲノム
フラグメントの単離にプローブとして使用することができる。

【００７９】 さらに、本発明の核酸フラグメントの２つの短いセグメントをポリメラーゼ連
鎖反応プロトコールで使用し、相同の遺伝子をコードするより長い核酸フラグメ
ントをＤＮＡまたはＲＮＡから増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は
また、クローン化核酸フラグメントのライブラリーに対して実施し、この場合、
一方のプライマーの配列は本発明の核酸フラグメントに由来し、他のプライマー
の配列は植物遺伝子をコードするｍＲＮＡプレカーサーの３′末端へのポリアデ
ニル酸領域の存在させるのが有利である。別法として、第二のプライマー配列は
クローニングベクターに由来する配列に基づくものであってもよい。たとえば、
熟練者はＲＡＣＥプロトコール（Frohmanら, 1988, PNAS USA 85: 8998）に従い
、転写における単一点および３′または５′末端の間の領域のコピーを増幅する
ためにＰＣＲを用いることによりｃＤＮＡを発生させることができる。３′およ
び５′方向を向いたプライマーを本発明の配列から設計することができる。市販
の３′ＲＡＣＥまたは５′ＲＡＣＥシステム(ＢＲＬ)を用いれば、特異的な３′
または５′ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Oharaら, 1989, PNA
S USA 86: 5673; Lohら, 1989, Science 243: 217）。３′ＲＡＣＥおよび ５′
ＲＡＣＥ操作によって発生させた生成物を合わせて、完全長ｃＤＮＡを発生させ
ることができる（Frohman，M.A. & Martin，G.R., 1989, Techniques 1: 165)。

【００８０】 したがって、共役二重結合の形成に関係する酵素をコードする他の核酸フラグ
メントは上述の任意の一般的な方法を用いて同定することができる。たとえば、
一般的なグループの脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）関連ｃＤＮＡは同定が可能
であり、共役二重結合の形成に関与する酵素をコードするそれらのｃＤＮＡの特
異的サブセットをトランスフォーメーションによって検出またはスクリーニング
することができる。脂肪酸デサチュラーゼ様酵素をコードする一群のｃＤＮＡ配
列は低緊縮ハイブリダイゼーション（たとえば２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ，６
０℃）を用い、任意の既知ＦＡＤ配列および／または配列番号：１、３、１９、
２３、２７、または２９に提供された配列のすべてまたは部分に相当するプロー
ブで同定することができる。別法として、ランダムに配列されたｃＤＮＡは、相
同の配列を検出するために設計されたコンピュータープログラム、それらに限定
されるものではないが、ＢＬＡＳＴまたは gapped ＢＬＡＳＴによって分析する
ことができる（標準デフォルトパラメーターを使用）。ＢＬＡＳＴ（Basic Loca
l Alignment Serarch Tool; Altschulら, 1993, J.Mol. Biol. 215: 403-410;
また www. ncbi. nlm. nih. gov／BLAST も参照）はＢＬＡＳＴ“nr" データベ
ース（すべての非冗長性 GeneBank CDS 翻訳、三次元構造 Brookhaven 蛋白質デ
ータバンクに由来の配列、Swiss-Prot 蛋白質配列データベースの最後の主要放
出、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースからなる）に含有される配列に対する
類似性を探索した。試験配列を、National Center for Biotechnology Informat
ion（ＮＣＢＩ）によって提供されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用い“nr" デ
ータベースに含まれる公に利用可能なすべてのＤＮＡ配列に対する類似性につい
て分析する。ＤＮＡ配列をすべてのリーディングフレームについて翻訳し、ＮＣ
ＢＩにより提供されたＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Gish & States, 1993, Natur
e Genetics 3: 266-272）を使用して“nr" データベースに含まれる公に利用可
能なすべての蛋白質配列に対する類似性を比較する。便宜上、Ｐ−値（確率）ま
たは「pＬog」（Ｐ−値の対数のマイナス）を２つの配列の間の類似性の指標と
して与える。試験配列および検索したデータベースに含まれる配列を比較し、２
つの配列が単に偶然に類似する確率をＢＬＡＳＴで計算し、「pＬog」値として
報告する。したがって、pＬog 値が大きいほど、ｃＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴ「ヒ
ット」が相同な蛋白質を表す可能性は大きい。ＦＡＤもしくは脂質デサチュラー
ゼとして定義される５より大きい pＬog 値、好ましくは１０より大きく、最も
好ましくは２０より大きいpＬog 値をもつ配列は候補である。共役二重結合の形
成に関係する酵素をコードするｃＤＮＡは、トランスフォーメーションスクリー
ニングを用いて候補プールから同定できる。個々のｃＤＮＡを発現ベクター中に
挿入し、本技術分野の熟練者には周知の方法を使用して酵母または植物宿主細胞
中にトランスフォームする（実施例３、４、５、７、９および１０参照）。酵母
または植物組織培養細胞は、多数のトランスフォーマントならびに適当な細胞生
物学および真核細胞生理学で処理する場合、取り扱いできるスピードおよび容易
さにより初期のスクリーニングに好ましい。

【００８１】 異種宿主細胞中とくに微生物宿主の細胞中で生成された Impatiens balsamina
、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役二重結合
の形成に関係する本発明の脂肪酸改質酵素は、本技術分野の熟練者に周知の方法
により Impatiens balsamina, Momordica charantia および Chrysobalanus ica
co の種子中の共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素に対する抗体の調
製に使用することができる。これらの抗体は、細胞中イン・サイチュ（in situ
）においてまたは細胞抽出液中インビトロにおいて Impatiens balsamina、Momo
rdica charantia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役二重結合の形成
に関係する本発明の脂肪酸改質酵素の検出に有用である。Impatiens balsamina
、Momordica charantiaおよび Chrysobalanus icaco の種子中の共役二重結合の
形成に関係する本発明脂肪酸改質酵素の製造のために好ましい異種宿主細胞は微
生物宿主である。異種蛋白質の高レベルの発現を指図する調節配列を含有する微
生物発現システムおよび発現ベクターは本技術分野の熟練者によく知られている
。これらの任意のものが、Impatiens balsamina、Momordica charantia および
Chrysobalanus icaco の種子中共役二重結合の形成に関係する本発明脂肪酸改質
酵素の製造のためのキメラ遺伝子の構築に使用できる。これらのキメラ遺伝子は
ついでトランスフォーメーションによって適当な微生物に導入され、Impatiens
balsamina、Momordicacharantia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役
二重結合の合成に関係するコードされた脂肪酸改質酵素の高レベルの発現を提供
する。リノレン酸からパリナル酸の製造のための Saccharomyces cerevisiae に
おける Impatiens balsamina 脂肪酸改質酵素の使用例は以下に実施例５におい
て考察する。Impatiensbalsamina、Momordi cacharantia および Chrysobalanus
icaco の種子中の共役二重結合の合成に関係する本発明の脂肪酸改質酵素の細
菌宿主における高レベルの発現のためのベクターの例は、以下に実施例９におい
て考察する。

【００８２】 さらに他の態様においては、共役脂肪酸、さらに特定すればリノレン酸は動物
の飼料添加物として使用できることも見いだされている。消費を伸ばす肉の品質
は、最終的に製品の市場需要に影響する多くの変数に依存する。たとえば、豚肉
の品質の改良は豚肉産業における主要な目標である。品質の変数には豚肉の色、
水分保持能力、サイズ、化学的組成および赤肉および脂肪組織の締まりが含まれ
る。豚食餌への共役リノール酸（１８：２△^9cis,11transまたは△^{10trans,12ci s} ）の添加によって豚肉の脂肪の締まりが影響されることは実験によって示され
ている（Eggert, J.M.ら, 1999, J.Anim. Sci. 77(Suppl): 53; Thiel, R.C.ら,
1998, Anim. Sci. 76(Suppl): 13; Wiegand, B.R.F.C. Parrrish Jr. & J.C. S
parks, 1999, J.Anim. Sci. 77 (Suppl): 19; 米国特許第5,554,646号; および
米国特許第5,851,572号）。一部の実験では、食餌のサプルメントとして共役リ
ノール酸（ＣＬＡ）を添加した場合、屠体の脂肪含量および飼料利用性効率が改
善されている。異なる共役脂肪酸の摂取が同じ効果をもつかどうかは知られてい
ない。本発明は飼料添加物として使用できるトランスジェニック種子において１
８：３脂肪酸から誘導される１８：３および１８：４脂肪酸の共役二重結合の生
成を記載する。

【００８３】 したがって、本発明は、明細書で論じた任意のキメラ遺伝子でトランスフォー
ムされた植物または植物細胞から得られる種子のプロセッシングにより誘導され
る成分からなる動物飼料、または桐油（tung）、ビターメロン（bittermelon）
、キンセンカ（pot marigold）、ジャカランダ（jacaranda）、キササゲ（catal
pa）およびザクロ（pomegranate）からなる群より選択される天然の原料から抽
出された油脂に由来する少なくとも１種の共役リノレン酸からなる動物飼料に関
する。上記成分または共役リノレン酸は、屠体の品質を改良する量を添加しなけ
ればならない。「屠体の品質を改良する量」は動物の屠体の品質を改良するのに
必要な量である。その成分はこのような種子から得られた脂肪酸の混合物とする
ことができる。この混合物は飼料添加物としての使用に適当な任意の形態とする
ことができる。たとえば、混合物は、それが鹸化されているか否かにかかわらず
、油脂の形態とすることができる。

【００８４】 上述の任意の種子から得られた油脂からなる動物飼料にも興味がある。本発明
はまた動物の食餌を上述のような動物飼料で補充することによる動物の屠体の品
質を改良する方法を包含する。

【００８５】

【実施例】

本発明を以下の実施例によりさらに定義する。実施例中、すべての部および百
分率は重量部および重量百分率であり、とくに他の記載のない限り温度は摂氏で
表示する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を指示するものであり、
本発明を例示するのみのものである。上述の考察およびこれらの実施例から、本
技術分野の熟練者は本発明の本質的な特徴を確認することが可能であり、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々な用途および条件に適合さ
せるため本発明に様々な変更および改質を行うことができるものと確信する。

【００８６】実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの組成：ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定 Impatiens balsamina、Momordica charantia、Chrysobalanus icaco、および
Lica michauxii の生育中の種子からｍＲＮＡを提供するｃＤＮＡライブラリー
を調製した。選択した種子は共役二重結合を有する脂肪酸を能動的に蓄積してい
た。ライブラリーは、Uni-ＺＡＰ（登録商標）ＸＲキットを、ファージベクター
中ではなく細菌ベクターｐBluescript ＳＫ（−）のＥcoＲＩおよびＸhoＩ部位
へｃＤＮＡをクローニングした以外は製造業者（Stratagene Cloning Systems,
LaJolla, CA）のプロトコールに従って調製した。ライブラリーを大腸菌ＤＨ10
Ｂ細胞（Life Technolodies, Gaithersberg, MD）中に維持した。ランダムに採
取した、組換えｐBluescript プラスミドを含む細菌コロニーからのｃＤＮＡ挿
入体を成長させ、プラスミドを精製した。ｃＤＮＡは挿入されたｃＤＮＡ配列に
隣接するベクター配列に特異的なプラスミプライマーを用いて配列決定した。挿
入体ＤＮＡを染料-プライマー配列決定反応で配列決定し、Perkin Elmer 137 型
蛍光シーケンサーを用いて、部分ｃＤＮＡを発生させた（発現配列タグもしくは
「ＥＳＴ」を発現；Adams, M.D.ら, 1991, Science 252: 1651 参照）。得られ
たＥＳＴを以下に記載するようにコンピューター法を用いて分析した。

【００８７】実施例２ ｃＤＮＡクローンの同定および特性解析 Impatiens balsamina および Momordica charantia の脂肪酸改質酵素をコー
ドするＥＳＴを、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Serarch Tool; Altschul
ら, 1993, J.Mol. Biol. 215: 403-410; www. ncbi. nlm. nih. gov／BLAST も
参照）“nr" データベース（すべての非冗長性 GeneBank コード配列［ＣＤＳ］
翻訳、三次元構造 Brookhaven 蛋白質データバンクに由来する配列、Swiss-Pro
t 蛋白質配列データベースの最後の主要放出、ＥＭＢＬならびにＤＤＢＪデータ
ベースからなる）に含有される配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ検索を実
施して同定した。実施例１で得られたｃＤＮＡ配列を National Center for Bio
technology Information（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリ
ズムを使用して“nr" データベースに包含される公に利用可能なすべてのＤＮＡ
配列との類似性を分析した。ＤＮＡ配列をすべてのリーディングフレームで翻訳
し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Gish & States, 1
993, Nature Genetics 3: 266-272）を使用して“nr" データベースに含まれる
公に利用可能なすべての蛋白質配列に対する類似性を比較した。便宜上、ＢＬＡ
ＳＴで計算して単に偶然に検索データベース中に含まれる配列に対するｃＤＮＡ
配列のマッチを観察するＰ−値（確率）をここでは「ｐＬog」値として報告する
。これは報告されたＰ−値の対数のマイナスを表す。したがって、ｐＬog 値が
大きいほどｃＤＮＡの配列およびＢＬＡＳＴ「ヒット」は相同の蛋白質を表す可
能性が大きいことになる。

【００８８】 Impatiens blasamina クローン ids. pk001. h8 に由来する配列情報を使用す
るＢＬＡＳＴＸの検索は、綿ω-⁶ 脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＭＢＬアクセス番
号Ｙ10112; ｐＬog＝49.25）とトマト「脂質デサチュラーゼ様蛋白質」（ＥＭＢ
Ｌアクセス番号Ｘ94944; ｐＬog＝48.68）について、ｃＤＮＡによりコードされ
る蛋白質の高い類似性が明らかにされた。クローン ids. pk001. h8 中の全ｃＤ
ＮＡ挿入体の配列をＢＬＡＳＩＰによって測定し再評価すると、ジャガイモの脂
肪酸デサチュラーゼ酵素の配列と比較した場合、かなり高いｐＬog 値（Ｘ92849
; ｐＬog＝152.0）を生じ、Arabidopsis（SwissProt アクセス番号Ｐ46313）な
らびに綿（ＥＭＢＬアクセス番号Ｙ10112）の両者のω-⁶ 脂肪酸デサチュラーゼ
に比較した場合は、１５０.００のｐＬog 値を生じた。配列番号：１はクローン
ids.pk001.h8 中における全 Impatiens blasamina ｃＤＮＡのヌクレオチドの
配列を示し、推定アミノ酸配列は配列番号：２に示す。配列アラインメントなら
びにＢＬＡＳＴ評点および確率指数は、本発明の核酸フラグメントがω-⁶ クラ
スの脂肪酸デサチュラーゼと構造的に関連のある Impatiens blasamina 蛋白質
をコードすることを指示する。この蛋白質のクローンは ImpｐＨ8Ｆad2 と命名
された。

【００８９】 Momordica charantia クローン fds. pk0009. h10 に由来する配列情報を用い
る類似のＢＬＡＳＴＸ検索は、大豆から（ＥＭＢＬアクセス番号＝43920；ｐＬo
g＝13.92）、および Arabidopsis から（ＥＭＢＬアクセス番号Ｌ26296；ｐＬog
＝9.96）のｃＤＮＡω-⁶ 脂肪酸デサチュラーゼによってコードされる蛋白質の
類似性を明らかにした。クローン fds. pk0009. h10 中における全ｃＤＮＡ挿入
体の配列をＢＬＡＳＴ ２.０４で測定し再評価すると、ジャガイモ脂肪酸デサチ
ュラーゼ酵素の配列と比較した場合、かなり高いｐＬog 値（Ｘ92847; ｐＬog＝
152.0）を生じ、落花生（アクセス番号ＡＦ030319）および綿（ＥＭＢＬアクセ
ス番号Ｙ10112）のω-⁶ 脂肪酸デサチュラーゼと比較した場合にはそれぞれ１５
１.０および１４７.０のｐＬog 値を生じた。配列番号：３はクローン fds. pk0
009. h10 中の全 Momordica charantia ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、そ
の推定アミノ酸配列は配列番号：４に示す。配列アラインメントおよびＢＬＡＳ
Ｔ評点ならびに確率は本発明核酸フラグメントがω-⁶ クラスの脂肪酸デサチュ
ラーゼと構造的に関連する Momordica charantia 蛋白質をコードすることを指
示する。この蛋白質のクローンは MomＦad2 と命名された。

【００９０】実施例３ タバコ細胞中におけるキメラ遺伝子の発現 Impatiens balsamina および Momordica charantia の種子中における共役二
重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡを、ｐＭＬ63 と
命名された植物発現ベクター中に導入した。ベクターｐＭＬ63 はＣＡＭＶ35Ｓ
プロモーターおよび３′ＮＯＳ配列に操作性に連結した uidＡ遺伝子（ＧＵＳ酵
素をコードする）を含有する。ｐＭＨ63 は、最小限の３′ＮＯＳターミネータ
ーフラグメントを産生するようにｐＭＨ40 から改質される。ｐＭＨ40 は、1998
年4月23日に公開されたＷＯ98／16650 に記載されている。この開示は参照によ
り本明細書に組み入れられる。本技術分野の熟練者は通暁している標準技術を用
いて、ｐＭＨ40 中に含まれる 770 塩基ペアのターミネーター配列を Depicker
ら（1982, J.Appl. Genet. 1: 561-574）によって報告された配列のヌクレオチ
ド１２７７〜１５５６からなる新しい３′ＮＯＳターミネーター配列で置換した
。Impatiens balsamina および Momordica charantia の種子中における共役二
重結合合成に関係する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡからなり、そのｃＤ
ＮＡフラグメントに対して５′に位置するカリフラワーモザイクウイルス 35Ｓ
プロモーターおよびそのｃＤＮＡフラグメント対して３′に位置するノパリンシ
ンターゼ（ＮＯＳ）からのターミネーション配列に関しセンス方向のキメラ遺伝
子を構築した。Impatiens ポリペプチドのｃＤＮＡはベクターｐＭＬ63 のＮco
ＩおよびＥcoＲＩ部位に導入した。Momordica ｃＤＮＡはベクターｐＭＬ63 の
ＮcoＩおよびＳmaＩ部位に導入した。Impatiens ｃＤＮＡに隣接するＮcoＩおよ
びＥcoＲＩ部位はこれらの制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマー（
センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき、それぞれ配列番号：７お
よび配列番号：８）を用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって発生させた。ＰＣＲ
増幅は、Pfu ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。Momordica ｃＤＮＡの５′末
端に隣接するＮcoＩ部位は同じ方法でＰＣＲ増幅により発生させた（配列番号：
９および配列番号：１０）。ＰＣＲ発生 Momordica ｃＤＮＡはベクターｐＭＬ6
3 のＳmaＩ部位へのクローニングを可能にするようにブラント末端化した。得ら
れたカリフラワーモザイクウイルス 35Ｓプロモーターと、Impatiens balsamina
および Momordica charantia の種子中の共役二重結合合成に関係する脂肪酸改
質酵素をコードするｃＤＮＡおよびＮＯＳターミネーション配列との融合体をＸ
baＩでの消化によってｐＭＬ63 から放出させた。得られたＸbaＩフラグメント
は二元ベクターｐＺＳ199 の相当する部位にライゲートした。ベクターｐＺＳ19
9 は以下のエレメント：（１）トランスフォームされた植物細胞の選択マーカー
としてキメラ遺伝子ノパリンシンターゼ／ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（Brevanら, 1984, Nature 304：184-186）、（２）Ｔi プラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡの左ならびに右境界（Brevanら, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720）
、（３）ＥcoＲＩ、 ＫpnＩ、 ＢamＨＩ、 ＸbaＩ、およびＳalＩのユニークな制限
エンドヌクレアーゼ部位を有する大腸菌 lacＺ−補足セグメント（Vieria & Mes
sing, 1982, Gene 19: 259-267）、（４） Pseudomonas プラスミドｐＶＳ1（It
oら, 1984, Plasmid 11: 206-220）ならびに（５）トランスフォームされた A.t
umefaciens の選択可能マーカーとしてのＴn５からの細菌ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子（Bergら, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 362
8-3632）を含有する。植物選択可能マーカー中のノパリンシンターゼプロモータ
ーは、標準制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーション戦略によって、35
Ｓプロモーター（Odellら, 1985, Nature 313：810-813）によって置換された。

【００９１】 Impatiens balsamina または Momordica charantia のｃＤＮＡとベクターｐ
ＺＳ199 中のカリフラワーモザイクウイルス 35ＳプロモーターならびにＮＯＳ
ターミネーション配列の遺伝子融合体は、Agrobacterium tumefaciens 株ＬＢＡ
4404 中に導入された。タバコ（Nicotiana tabacum L.cv Xanthi）は葉ディス
クの感染によって、Impatiens もしくは Momordica の遺伝子構築体を係留する
A.tumefaciens によりトランスフォームした（Horsch, B.B., Fry, J.E., Hoffm
an, N.E., Eicholtz, D., Rogers, S.G. & Fraley, R.T., 1985, Science 227:
1229-1231; Rogers, S.G., Horsch, R.B. & Fraley, R.T., 1986, Methods Enzy
nol. 118: 627-648）。安定にトランスフォームされたタバコをカナマイシン含
有培地上で生育する細胞の能力によって選択した。トランスフォームされたタバ
コカルスサンプルの脂肪酸組成はカルスから誘導された脂肪酸メチルエステルの
ガスクロマトグラフィー分析によってエレオステアリン酸およびパリナル酸の産
生について調べた。

【００９２】実施例４ トランスジェニック植物組織におけるエレオステアリン酸およびパリナル酸の分
析 実施例６に記載する遺伝子構築体でトランスフォームされたタバコからのカル
スサンプル中の脂肪酸を１％ナトリウムメトキシドを含むメタノール中で直接エ
ステル交換した。脂肪酸メチルエステルをヘプタンに抽出し、ヘプタン抽出液の
一部を Hitzら（Plant Physiol 105: 635-641, 1994）に記載されたようにガス
液体クロマトグラフィーにより分析した。Impatiens ｃＤＮＡまたは Momordica
ｃＤＮＡ脂肪酸を含有する遺伝子構築体でトランスフォームされたタバコのカル
スサンプル中には、Impatiens balsamina および Momordica charantia 種子油
脂の抽出液からのα−エレオステアリン酸およびα−パリナル酸の保持時間と同
等な保持時間を示す脂肪酸が検出された。Impatiens および Momordica ｃＤＮ
Ａを欠き、発現ベクターのみでトランスフォームされたタバコカルスの抽出液に
はいずれの脂肪酸も検出されなかった。さらに、Impatiens ｃＤＮＡまたは Mom
ordica ｃＤＮＡを含有する遺伝子構築体でトランスフォームされたタバコのカ
ルスサンプルから脂肪酸メチルエステルを調製し、ＧＳ−ＭＳ（ガスクロマトグ
ラフィー／マススペクトル）によって分析し、産生された新規脂肪酸の同一性を
確認した。脂肪酸メチルエステルは、Hewlett Packard 6890 型ガスクロマトグ
ラフに Hewlett Packard 5973 型マス選択検出器（ＭＳＤ）を接続して用いＧＳ
−ＭＳによって分析した。サンプルは３０-ｍ×０.２５-mm（内径）ＩＮＮＯＷa
x カラム（Hewlett Packard）により分離した。オーブンの温度は１８５℃（３.
５分保持）から２１５℃（５分保持）に２℃／分の速度ついで２３０℃に５℃／
分の速度にプログラムした。ＭＳＤのイオン化電圧は７０eVとした。いずれかの
ｃＤＮＡを発現するカルスからの脂肪酸メチルエステルには、エレオステアリン
酸およびパリナル酸の両者が検出された。これらの脂肪酸のメチルエステルのマ
ススペクトルは、とくにメチレン中断（すなわち非共役）二重結合を含有するα
−リノレン酸のようなポリ不飽和脂肪酸と比較した場合、豊富な分子イオンによ
って識別される。トランスジェニックタバコカルスからのエレオステアリン酸お
よびパリナル酸メチルエステルのマススペクトル中に検出される顕著な分子イオ
ンは、それぞれ、２９２ｍ／ｚおよび２９０ｍ／ｚを示す。さらにタバコカルス
サンプル中のエレオステアリン酸およびパリナル酸メチルエステルのマススペク
トルは Momordica および Impatiens 種子の抽出液中における相当する脂肪酸メ
チルエステルのマススペクトルと同一であった。Impatiens ｃＤＮＡを発現する
トランスジェニックタバコカルスは、エレオステアリン酸およびパリナル酸を総
脂肪酸に対してそれぞれ３.４％および１.７％量まで蓄積した。Momordica ｃＤ
ＮＡを発現するトランスジェニックタバコカルスはエレオステアリン酸およびパ
リナル酸をそれぞれ１.７％および１.１％量まで蓄積した。

【００９３】実施例５ Saccharomyces cerevisiae 中 Impatiens balsamina のクローン ImpＨ8Ｆad2
の発現 Impatiens balsamina クローン ImpＨ8Ｆad2 を、制限酵素ＥcoＲＩならびに
ＸhoＩで部分消化した。全ｃＤＮＡ挿入体を含有する１.５kbのＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。ｃＤＮＡ挿入体は製造業者の
説明書に従い、ＧＥＬアーゼ（登録商標，Epicentre Technologies）で消化して
アガロースゲルから得て、エタノール沈殿させ、乾燥し、２０μl の水に再懸濁
した。精製ｃＤＮＡを Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を使用して
、Saccharomyces cerevisiae 発現ベクターｐＹＥＳ2（Invitrogen）のＥcoＲＩ
およびＸhoＩ部位にライゲートした。得られたプラスミドｐＹes2／ImpＨ8Ｆad2
を酢酸リチウム仲介トランスフォーメーションによって Saccharomyces cerevi
siae ＩＮＶＳc1（Invitrogen）細胞に導入した（Sherman F, Fink GR, & Hicks
JB, Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Cold Spring
HarborLab. Press, Plainview, NY, 1987）。トランスフォームされた細胞をウ
ラシルの不存在下に増殖するそれらの能力によって選択した。ついでトランスフ
ォームされた細胞の個々のコロニーをそれぞれ最終濃度５％（v／v）および０.
５％（w／v）にグリセロールおよびグルコースを補充したウラシルを欠く増殖培
地［アミノ酸を含有しない０.１７％（w／v）酵母窒素塩基（Difco）、０.５％
（w／v）硫酸アンモニウムおよび０.１８％ＳＣ−ＵＲＡ（Bio101）］中３０℃
で２日間増殖させた。細胞をついで、代わりにガラクトースを最終濃度２％（w
／v）に補充した上述の増殖培地中で２回洗浄した。洗浄した細胞を Tergitol
ＮＰ-40（Sigma）を濃度０.２％（w／v）で含むガラクトース含有増殖培地中に
、ついでＯＤ ６００〜０.２に希釈した。これらの細胞のアリコートを外来性脂
肪酸なしでまたはリノール酸（１８：２△^9cis,12cis）もしくはα−リノレン酸
（１８：３△^{9cis,12cis,15cis}）を最終濃度２mMで添加して増殖させた。１６℃
において４日間増殖させたのち、S. cerevisiae 細胞を収穫し共役二重結合を含
有する脂肪酸の蓄積を実施例４に記載のようにして調べた。リノール酸含有培地
中で増殖させた細胞中にα−エレオステアリン酸が総脂肪酸の０.６％（w／w）
までの量検出された。しかしながら、これらの培養液の抽出物中にはα−パリナ
ル酸は検出されなかった。これに反し、α−リノレン酸を含有する培地中で増殖
させた培養液の抽出物中には、α−パリナル酸が総脂肪酸の０.９％（w／w）ま
での量蓄積したが、α−エレオステアリン酸は検出されなかった。これらのデー
タは、リノール酸がα−エレオステアリン酸の生合成の基質であり、α−リノレ
ン酸は、共役二重結合の形成に関係する Impatiens balsamina 脂肪酸改質酵素
の活性を介するパリナル酸合成の基質であることを示唆している。

【００９４】 これらを考え合わせると、前の実施例に記載したタバコトランスフォーメーシ
ョンおよび酵母発現の結果は、配列番号：１および配列番号：３によってコード
される酵素産物を、正常時には共役二重結合含有脂肪酸を産生または蓄積しない
培養植物または酵母にトランスジェニックに導入した場合、共役二重結合を含有
する脂肪酸の産生を触媒できることが証明される。

【００９５】実施例６ ImpＨ8Ｆad2 および MomＨ8Ｆad2 からの蛋白質の、ω-6 デサチュラーゼクラス
の酵素のメンバーとの配列の比較 ｃＤＮＡクローン ImpＨ8Ｆad2 および MomＨ8Ｆad2 からの推定アミノ酸配列
を（ｉ）大豆からの既知脂肪酸デサチュラーゼ（国際特許公開ＷＯ94／11516）
および（ii）トウゴマからの脂肪酸ヒドロキシラーゼ（van de Loo, F.J.ら, 19
95, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15): 6743-6747）をコードする推定アミノ
酸配列と、Lasargene（登録商標）ソフトウエアパッケージ（Dnastar Inc., Mad
ison, WI）からの多重配列比較プログラム Megalian（v 3.1.7）、およびアライ
ンメントの Clustal 法（デフォルトプログラムパラメーター）を用いて比較し
た。アラインした配列を図１に示す。Impatiens balsamina および Momordica c
harantia からの蛋白質配列を含む４つのすべての配列は、このクラスにおける
酵素の活性部位に要求される２つの鉄クラスター（Shanklin, J.ら, 1994, Bioc
hemistry 33: 12787-12793）の明らかな結合部位の部分である８つのきわめて高
度に保存されたヒスチジン残基によって類似している。これらの保存された残基
は、図１に箱で囲んだエレメントとして確認される。Impatiens balsamina ｃＤ
ＮＡクローン ImpＨ8Ｆad2 によってコードされるアミノ酸配列は大豆の配列と
５７.０％が同一、トウゴマの配列と５５.２％が同一である。Momordica charan
tia ｃＤＮＡクローン MomＨ8Ｆad2 によってコードされるアミノ酸配列は大豆
の配列と５３.５％同一であり、トウゴマの配列と５３.３％同一である。全体的
に、Impatiens balsamina および Momordica charantia の蛋白質によって共有
される配列類似性は５２.６％である。

【００９６】 すなわち、蛋白質の保存領域における比較的少ない数のアミノ酸残基の変化で
、このクラスの酵素の活性を二重結合を導入する活性（すなわちデサチュラーゼ
）から、ヒドロキシ基を導入する活性（すなわちヒドロキシラーゼ）にまたはポ
リ不飽和脂肪酸を多重共役二重結合を含有する脂肪酸に変換する活性に変化させ
るのに十分である。

【００９７】実施例７ 大豆胚および種子における共役二重結合を有する脂肪酸の産生 Impatiens balsamina および Momordica charantia の種子における共役二重
結合の合成に関与する脂肪酸改質酵素は、適当なキメラ遺伝子の構築ついでそれ
らの遺伝子の宿主植物への安定な導入により、正常に貯蔵脂質を産生する双子葉
植物の細胞内に発現させることができる。この方法の例として、二重結合の合成
に関係する Impatiens および Momordica の脂肪酸改質酵素を、種子特異的なプ
ロモーターを用いてトランスジェニック大豆胚に発現させた。

【００９８】 ある種の細菌および植物細胞中でハイグロマイシンＢの発現を可能にするキメ
ラ遺伝子を含有するプラスミドｐＺＢＬ100 は、以下の遺伝子エレメント：ａ）
Ｔ7 プロモーター＋Shine-Delgarno／ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ（ＨＰＴ）／Ｔ7 ターミネーター配列、ｂ）カリフラワーモザイクウイルス
（ＣaＭＶ）からの 35Ｓプロモーター／ハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ（ＨＰＴ）／ノパリンシンターゼ（Agrobacterium tumefaciens Ｔ-ＤＮ
ＡからのＮＯＳ３′）およびｃ）ｐＳＰ72 プラスミドベクター（Premega）から
構築し、β−ラクタマーゼコード領域（アンピシリン抵抗性遺伝子）を除去した
。

【００９９】 ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、Klebsiella 誘導プ
ラスミドｐＪＲ225（Gritz, L. & Davies, J. 1983, Gene 25: 179-188）を含有
する大腸菌株Ｗ677（Gritz, L. & Davies, J. 1983, Gene 25: 179-188）からＰ
ＣＲによって増幅した。ｐＳＰ72 ベクター（Promega）に出発し、エレメントを
標準クローニング法（Maniatis）を用いて単一プラスミド中にアッセンブルした
。

【０１００】 したがって、プラスミドｐＺＢＬ100 は、ある種の大腸菌株たとえばλＤＥ3
（これは lacＵＶ5 の制御下にＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する）に対し
て溶原性である NovaBlue（ＤＥ3）（Novagen）中にＨＰＴ酵素の発現のための
Ｔ7 プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ7 ターミネーターカセットを含有する。プラスミ
ドｐＺＢＬ100 はまた、植物、たとえば大豆において、ＨＰＴ酵素の構成的発現
のための 35Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳカセットを含有する。これらの２つの発現シス
テムは、ハイグロマイシンの存在下における増殖に対する選択を可能にし、細菌
および植物システムの両者においてこのプラスミドを含有する細胞を同定する手
段として使用される。

【０１０１】 プラスミドｐＺＢＬ100 はまた他のキメラ遺伝子のこのベクターへのクローニ
ングに適当な３つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。

【０１０２】 Impatiens balsamina および Momordica charantia の種子における共役二重
結合の合成に関与する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡの発現のためのプラ
スミドは大豆のβ−コングリシニンプロモーター（Beachyら, 1985, EMBO J. 4:
3047-3053）の制御下に構築することができる。このベクターの構築は、いずれ
も以前に記載されているプラスミドｐＣＷ109 およびｐＭＬ18 の使用によって
容易になった（国際特許公開ＷＯ94／11516）。

【０１０３】 ｐＣＷ109 におけるβ−コングリシニンプロモーターとファセオリン３′末端
の間のクローン領域に、ＮcoＩおよびＸbaＩ消化、ついでヤエリナ（mung bean
）エキソヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡ末端の除去によってユニークなＮotＩ
部位を導入した。ＮotＩリンカー（New England Biochemical）を線状化プラス
ミドにライゲートし、プラスミドｐＡＷ35 を産生させた。ｐＭＬ18 における単
一のＮotＩ部位をＮotＩ消化により破壊し、単一鎖末端をｄＮＴＰおよびクレノ
ウフラグメントで充填し、ついで線状化プラスミドの再ライゲーションを実施し
た。改質ｐＮＬ18 を次にＨind IIIで消化し、ウシ腸ホスファターゼで処理した
。

【０１０４】 ｐＡＷ35 中β−コングリシニン：ＮotＩ：ファセオリン発現カセットをＨind
III 消化により除去し、１.８kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動によっ
て単離した。単離されたフラグメントを上述の改質、線状化ｐＭＬ18 構築体に
ライゲートした。所望の方向性でのクローンをＮotＩおよびＸbaＩで消化により
同定し、β−コングリシニン転写単位の方向が選択マーカー転写単位と同じであ
ることを指示する１.０８kbのフラグメントを放出させた。得られたプラスミド
はｐＢＳ19 と命名した。

【０１０５】 Ｈind III はｐＺＢＬ100 中で利用可能なユニークなクローニング部位の一つ
である。最終的発現カセットをアッセンブルするため、ｐＢＳ19 およびｐＺＢ
Ｌ 100 をいずれもＨind III で消化した。ｐＢＳ19 からのβ−コングリシニン
含有フラグメントをゲル電気泳動で単離し、予めウシアルカリホスファターゼに
よって処理した消化ｐＺＢＬ100 中にライゲートした。得られたプラスミドはｐ
ＫＳ67 と命名した。

【０１０６】 共役二重結合の形成に関係する Impatiens および Momordica 酵素のｃＤＮＡ
をＰＣＲによって増幅し、プラスミドｐＫＳ67 の相当する制限部位へのクロー
ン化を可能にする隣接ＮotＩ部位を発生させた。Impatiens ｃＤＮＡの増幅のた
めに用いた５′および３′オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ配列番号：
１１および配列番号：１２に与える。５′プライマーは配列番号：１における塩
基１９〜３９から構成され、５′末端に５′−AAG GAA AAA AGC GGC CGC−３′
からなる余分の塩基が付加され、ＮotＩ部位と、得られたＰＣＲ産物の制限酵素
活性を上昇させる１０個の付加的５′隣接塩基をコードする。３′プライマーは
配列番号：１における塩基１１５０〜１１７０の逆補体から構成され、５′末端
に５′−AAGGAAAAAAGCGGCCGC−３′からなる余分の塩基が付加され、ＮotＩ部位
と、制限消化を強化する１０個の付加的塩基を与える。Momordica ｃＤＮＡの増
幅のために用いた５′および３′オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ配列
番号：１３および配列番号：１４に提供される。５′プライマーは配列番号：３
における塩基７４〜９４から構成され、余分な塩基５′−AAG GAA AAA AGC GGC
CGC−３′がＮotＩ部位と得られたＰＣＲ産物の制限酵素活性を上昇させる１０
個の付加的５′隣接塩基をコードする。３′プライマーは配列番号：３における
塩基１２５３〜１２７３の逆補体から構成され、余分の塩基５′−AAGGAAAAAAGC
GGCCGC−３′が付加され、ＮotＩ部位と制限消化を強化する１０個の付加的塩基
を与える。

【０１０７】 ＰＣＲ反応は、Pfu ポリメラーゼ（Stratagene）および鋳型として配列番号：
１および３にそれぞれ示した Impatiens および Momordica のｃＤＮＡ配列を含
むプラスミドを用いて実施した。増殖反応からの産物は Wizard ＰＣＲ ＤＮＡ
精製システム（Promega）を用いて精製し、中間ベクターｐＧＥＭ-t（Promega）
にクローン化した。このベクターへのライゲーションを容易にするために、精製
ＰＣＲ産物を、２００μMのｄＡＴＰ、２.５単位の Amplitaq ＤＮＡポリメラー
ゼ（Perkin-Elmer）および１.５mMのＭgＣl₂ と最終容量 １００μl、７２℃で
２０分間インキュベートして各鎖の３′末端に単一のアデニン塩基を付加した。
増殖した Impatiens および Momordica のｃＤＮＡを含むライゲーション産物を
ＮotＩで消化し、放出された挿入体をアガロースゲル電気泳動によって精製した
。共役二重結合の合成に関係する Impatiens および Momordica 脂肪酸改質酵素
のコード配列を含有する単離されたＮotＩフラグメントを、ベクターｐＫＳ67
のＮotＩ部位にライゲートした。得られたプラスミドは、共役二重結合の合成に
関係するImpatiens または Momordica いずれかの脂肪酸改質酵素のコード配列
に隣接する５′β−コングリシニンプロモーターおよび３′ファセオリンターミ
ネーション配列から構成されるキメラ遺伝子を含有した。

【０１０８】 Impatiens balsamina または Momordica charantia ｃＤＮＡの、ベクターｐ
ＫＳ67 中のコングリシニンプロモーターおよび３′ファセオリンターミネーシ
ョン配列との遺伝子融合体は、トランスフォーメーションの粒子ボンバードメン
ト法を用いて、大豆の胚に導入した。体細胞胚を誘導するために、大豆変種Ａ28
72 またはＪＡＣＫ-910 の未成熟種子の滅菌した表面から３〜５mmの長さの切片
にした子葉を適当な寒天培地上６〜１０週間２６℃、明または暗期で培養した。
二次胚を生成した体細胞胚をついで切開し適当な液体培地中に置いた。初期、球
状胚として増殖した体細胞胚のクラスターを繰り返し選択したのち懸濁液を以下
に記載するように維持した。

【０１０９】 大豆胚の懸濁培養液を３５mlの液体培地中ロータリーシェイカー上１５０rpm
、２６℃、蛍光灯下に１６：８時間昼／夜のスケジュールに維持した。培養体は
約３５mgの組織を３５mlの液体培地中に接種して２週間おきに継代培養した。

【０１１０】 大豆胚の懸濁培養液をついで、共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素
の Impatiens または Momordica ｃＤＮＡを含有するベクターｐＫＳ67 により
、粒子ガンボンバードメント法でトランスフォームした（Kleinら, 1987, Natur
e (London) 327: 70; 米国特許第4,945,050号）。これらのトランスフォーメー
ションは DuPont の Biolistic（登録商標）PDS1000／HE 装置（ヘリウム改良型
）を使用して行った。

【０１１１】 １mmの金粒子の６０mg／ml懸濁液５０mlに５mlのＤＮＡ（１mg／ml）、２０ml
のスペルミジン（０.１Ｍ）および５０mlのＣaＣl₂（２.５Ｍ）をこの順序で加
えた。粒子プレパレーションをついで３分間激しく撹拌し、ミクロフュージ中で
１０秒間遠心分離し、上清を除いた。ＤＮＡ−被覆粒子をついで４００mlの７０
％エタノールで１回洗浄し、４０mlの無水エタノール中に再懸濁した。ＤＮＡ／
粒子懸濁液を各１秒間３回超音波処理した。ＤＮＡ−被覆金粒子５mlをついで各
マクロキャリヤーディスクに負荷した。

【０１１２】 ２週齢の懸濁培養液約３００〜４００mgを６０×１５-mmの空のペトリ皿に取
り、残った液体を組織からピペットで除去した。各トランスフォーメーション実
験について約５〜１０プレートの組織をボンバーした。膜破壊圧は１１００psi
にセットし、チャンバーは２８インチ水銀の真空にした。擁壁スクリーンから約
３.５インチ離して組織を配置し、３回ボンバーした。ボンバードメントの後、
組織を半分に分割し、液体中に戻し、上述のように培養した。

【０１１３】 ボンバードメント後５〜７日に液体培地を新鮮な培地と交換し、ボンバードメ
ント１１〜１２日後に５０mg／mlのハイグロマイシンを含有する培地に交換した
。この選択培地は１週間ごとに更新した。ボンバードメントから７〜８週後、緑
色のトランスフォームされた組織がトランスフォームされなかった壊死胚クラス
ターから成長しているのが観察された。単離緑色組織を除去し、個別のフラスコ
に接種し、新しい、クローン的に増殖する、トランスフォームされた胚懸濁培養
液を発生させた。新しい各系統を独立のトランスフォーメーション現象として処
理した。これらの懸濁液をついで継代培養し、非成熟胚のクラスターとして維持
した。

【０１１４】 このようにして選択され維持されたトランスジェニック大豆胚を、実施例４に
記載の方法を用いてエレオステアリン酸およびパリナル酸含量を分析した（表１
）。共役二重結合の合成に関係する Impatiens または Momordica 脂肪酸改質酵
素のいずれかを発現する個々の胚をメタノール中１％（w／v）ナトリウムメトキ
シド中にホモジナイズした。このエステル交換工程で得られた脂肪酸メチルエス
テルを実施例４に記載したようにＧＣおよびＧＣ−ＭＳの両者により分析した。
トランスジェニック大豆抽出液中のエレオステアリン酸およびパリナル酸メチル
エステルの保持時間およびマススペクトルを、Impatiens balsamina または Mom
ordicacharantia の種子から調製された脂肪酸メチルエステルの場合と比較して
同定した。共役二重結合の合成に関係する Impatiens 脂肪酸改質酵素を発現す
る大豆胚の総脂肪酸には、３％ものα−エレオステアリン酸および２％ものα−
パリナル酸を含むことが見いだされた（図２および表１）。さらに、共役二重結
合の合成に関係する Momordica 脂肪酸改質酵素を発現する大豆胚の総脂肪酸に
は、１６.５％ものエレオステアリン酸および１.５％ものα−パリナル酸を含む
ことが見いだされた（図３および表１）。Momordica 酵素を発現する大豆胚にお
いては、エレオステアリン酸は主としてα−エレオステアリン酸として検出され
、エレオステアリン酸の他のシス−トランス異性体少なくとも２種が少量検出さ
れた。

【０１１５】

【表１】

【０１１６】 共役二重結合の合成に関係する Momordica 脂肪酸改質酵素が穀物植物の種子
内で機能する能力を調べるため、この酵素を発現するトランスジェニック大豆胚
を植物中に再生させた。これらの植物から分離される種子の脂肪酸組成を実施例
４に記載のように、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳによって調べた。図４および表２に示
したように、Momordica 酵素を発現する種子は総脂肪酸の１３％以上にも及ぶα
−エレオステアリン酸を蓄積し、また総脂肪酸の約０.５％までのα−パリナル
酸が蓄積された。α−エレオステアリン酸の蓄積とともに、トランスジェニック
種子中のオレイン酸（１８：１）含量も著しく上昇し、これは野生型種子におけ
る約１８重量％から総脂肪酸のほぼ５０重量％への上昇であった。さらにリノレ
ン酸（１８：３）含量は野生型種子におけるほぼ９重量％からトランスジェニッ
ク種子の総脂肪酸の約１重量％へ減少した。これらの結果は、共役二重結合の合
成に関係する脂肪酸改質酵素のトランスジェニック発現による、穀類種の種子中
のα−エレオステアリン酸およびα−パリナル酸の産生能力を証明するものであ
る。

【０１１７】

【表２】

【０１１８】実施例８ Chrysobalanus icaco の種子からの共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵
素のｃＤＮＡの同定 実施例４、５、７記載の Impatiens balsamina および Momordica charantia
からの結果は、ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼと同族の酵素がα−エレオステ
アリン酸およびα−パリナル酸に見いだされる共役二重結合の合成に関与してい
ることを証明した。この知識に基づいて、Impatiens balsamina および Momordi
cacharantia に無関係な植物から共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素
をコードするｃＤＮＡをさらに同定することを試みた。この関連では、Chrysoba
lanus icaco［Chrysobalanus（ワレモコウ）科のメンバー］の種子が大量のα−
エレオステアリン酸およびα−パリナル酸ならびにこれらの脂肪酸の４−ケト誘
導体を蓄積する（Badami, R.C. & Batil, K.B. 1981, Prog. Lipid Res. 19: 11
9-153）。Chrysobalanus icaco から共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質
酵素を同定する最初の工程として、ｃＤＮＡの第一鎖をこの植物の生育中の種子
から単離した総ＲＮＡ １０μgから、SuperScript II 逆転写酵素（Gibco BRL）
を用い製造業者のプロトコールに従って合成した。この反応のプライマーとして
はオリゴ−ｄＴを使用した。得られた第一鎖ＤＮＡを、ω⁶−オレイン酸デサチ
ュラーゼおよび関連ポリペプチドのコード配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として
用いた。これらの反応のオリゴヌクレオチドプライマーはω⁶−オレイン酸デサ
チュラーゼ中の部分的に保存されたアミノ酸配列に基づくものであった。縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーの設計に使用した保存されたアミノ酸配列は、ＫＫ
ＡＩＰＰＨＣＦおよびＷＲＥＡＫＥＣであった。ＰＣＲ反応に用いた相当するオ
リゴヌクレオチドは、５′ta tct aga gct cAA IAA RGC NAT HCC NCC NCA YTG Y
TT３′（センス、配列番号：３１）および５′taa gat ctg tat acR CAY TCY TT
N GCY TCN CKC３′（アンチセンス、配列番号：３２）であった（注：クローニ
ングのための制限部位および制限消化を促進する付加的配列は小文字で示した）
。Ｔaq ポリメラーゼ（GibcoBRL）を用いたＰＣＲ増幅サイクルを、縮重オリゴ
ヌクレオチドならびに第一鎖ｃＤＮＡ合成反応のアリコートによって５０回実施
した。ついで、ＰＣＲ産物をｐＰＣＲ-Script ＡＭＰ（Stratagene）に製造業者
のプロトコールに従ってサブクローニングし、大腸菌ＤＨ10Ｂ細胞（Gibco BRL
）にトランスフォームした。ついで得られたコロニー６個のプラスミドのｃＤＮ
Ａ挿入体からヌクレオチド配列を得た。これらの配列から Chrysobalanus icaco
ｃＤＮＡライブラリー中のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼまたは関連ポリペプ
チドのｃＤＮＡは２つの別個のクラスの存在が明らかになった。これらの２つの
クラスは、クラス１およびクラス２と命名された。クラス２ｃＤＮＡによってコ
ードされる部分ポリペプチドは、クラス１ ｃＤＮＡによってコードされる部分
ポリペプチドよりも既知のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼから相違していた。
さらに、クラス２ポリペプチドは既知のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼに対し
て最初のヒスチジンボックスにグルタミン酸のアスパラギン酸への置換を含んで
いた（図１参照）。このアミノ酸置換はまた、共役二重結合の合成に関係する M
omordica 脂肪酸改質酵素にも存在した（Momordica 酵素におけるアミノ酸メン
バー 115、図１参照）。この情報はクラス２ｃＤＮＡが Chrysobalanus icaco
における共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素の部分をコードすること
を示唆した。

【０１１９】 Chrysobalanus icaco 酵素の活性を測定するためには、その全ポリペプチドを
コードするｃＤＮＡの単離が要求された。第一工程として Chrysobalanus icaco
の生育中の種子から単離されたポリＡ⁺ ＲＮＡから実施例１記載の方法を用いて
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ついでライブラリーを係留する大腸菌ＤＨ10
Ｂ細胞のアリコートから、Qiagen プラスミドミニキットを用い製造業者のプロ
トコールに従いプラスミドを単離した。単離されたプラスミドを Chrysobalanus
icaco クラス２ポリペプチドのオープンリーディングフレームの全５′および３
′末端を増幅する目的でついでＰＣＲ反応の鋳型として用いた。クラス２ｃＤＮ
Ａの部分配列に基づいて（上述のように）２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を、ライブラリークローニングベクターｐBluscript（−）に特異的なプライマ
ーと組み合わせて用いた場合、オープンリーディングフレームの５′および３′
末端の増幅が可能になるように設計した。一方のＰＣＲ反応においては、Ｔ3 プ
ライマー（５′AATTAACCCTCACTAAAGGG ３′）をクラス２−特異的プライマー（
５′ttt gga tcc GTG GAC GTA ATG CGT ATC AG ３′，配列番号：１５）と組み
合わせてオープンリーディングフレームの完全５′末端の増幅に使用した。第二
の反応では、Ｔ7 プライマー（５′GTAATACGACTCACTATAGGGC ３′）を、オープ
ンリーディングフレームの完全３′末端の増幅のためにクラス２−特異的プライ
マー（５′ttt ggg ttc GCC ACC ACG CCT TTA GTG AC ３′，配列番号：１６）
と組み合わせて使用した。両反応とも、Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡライブラ
リーからのプラスミド約２００mgを最終反応容量１００μl中に鋳型として使用
し、４０サイクルの増幅をＴaq ポリメラーゼ（Gibco BRL）を用いて実施した。
各反応からの主要な産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＰＣＲ-Script
ＡＭＰ（Stratagene）にキットとともに供給された説明書に従ってサブクローニ
ングした。２つの反応のサブクローニングされた産物から、ついでヌクレオチド
配列情報を得た。これらの配列ならびに他のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼお
よび関連ポリペプチドの配列との比較から、Chrysobalanus icaco クラス２ポリ
ペプチドのオープンリーディングフレームの完全５′および３′配列が、２つの
ＰＣＲ反応の産物中に含まれていることが確認された。

【０１２０】 これらの配列を用いて、オープンリーディングフレームの５′および３′末端
に隣接し、したがって Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプチドの完全長コ
ード配列の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーが設計された。Chry
sobalanus icaco クラス２ポリペプチドのオープンリーディングフレームの増幅
に用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、５′ttt gga tcc GAA ATG GGA
GCA GGT GGC C ３′（センス，配列番号：１７）および５′ttt gag ctc GCA CT
C AAA ACTTGT CGA AC ３′（アンチセンス，配列番号：１８）であった。Pfu ポ
リメラーゼおよび鋳型としての Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡライブラリーか
らのプラスミド約２００ngを用い１００μlの反応液中ＰＣＲの３０サイクルの
増幅を行った。この反応からの産物をｐＰＣＲ-Script ＡＭＰにサブクローニン
グし、両鎖を配列決定した。この配列は配列番号：１９に示す。ＢamＨＩおよび
ＳacＩで制限消化したのち、ＰＣＲ産物をｐＰＣＲ-Script ＡＭＰから、植物発
現ベクターｐＢＩ121（Clontech）の相当する部位に除去した。ベクターｐＢＩ1
21 は、カリフラワーモザイクウイルス 35Ｓプロモーターによって仲介される導
入遺伝子の構成的発現に使用される。ｐＢＩ121 中における完全長 Chrysobalan
us icaco クラス２ ｃＤＮＡを次に実施例３に記載の方法を用いて Agrobacteri
um tumefaciens 仲介トランスフォーメーション法でタバコ（Nicotiana tabacum
cv. Xanthi）に導入した。得られたカルスをカナマイシン含有培地上で選択し
た。このカルスを実施例３および４に記載のようにガスクロマトグラフィーおよ
びガスクロマトグラフィー／マススペクトルで分析したところ、α−エレオステ
アリン酸およびα−パリナル酸の存在が明らかにされた。α−エレオステアリン
酸およびα−パリナル酸の量はそれぞれ、カルスサンプルの総脂肪酸の４.７重
量％および０.４重量％ほどであった。ベクター対照サンプルでは、いずれの脂
肪酸も検出されなかった。この結果は、配列番号：２０に示し、配列番号：１９
に示すｃＤＮＡによりコードされる Chrysobalanus icaco ポリペプチドが共役
二重結合の合成に関係する脂肪酸の改質酵素であることを指示する。Chrysobala
nus icaco 酵素の同定は Momordica charantia および Impatiens balsamina か
ら得られた結果を拡張するものである。

【０１２１】 その機能的性質をさらに特徴づけるため、Chrysobalanus icaco クラス２ポリ
ペプチドを大豆体細胞胚で発現させた。配列番号：１９からの情報を用い、オー
プンリーディングフレームの５′および３′に隣接し、Chrysobalanus icaco ク
ラス２ポリペプチドの完全長コード配列の増幅を可能にするようにオリゴヌクレ
オチドプライマーを設計した。オリゴヌクレオチドプライマーにはｃＤＮＡの植
物発現ベクターへのクローニングを可能にする隣接制限部位も包含させた。Chry
sobalanus icaco クラス２ポリペプチドのオープンリーディングフレームの増幅
に用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、５′tat gcg gcc gcG AAA TGG
GAG CAG GTG GCC C ３′（センス，配列番号：２１）および５′tat gcg gcc gc
G CAC TCAAAA CTT GTC GAA C ３′（アンチセンス，配列番号：２２）であった
。Pfu ポリメラーゼおよび鋳型としての Chrysobalanus icaco ｃＤＮＡライブ
ラリーからのプラスミド約２００ngを用いて１００μlの反応液中ＰＣＲ増幅３
０サイクルを行った。この反応からの産物をｐＰＣＲ-Script ＡＭＰ（Stratage
ne）に製造業者のプロトコールに従ってサブクローニングした。ＮotＩによって
制限酵素消化後、Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプチドのオープンリーデ
フィングフレームをコードするｃＤＮＡ挿入体を、実施例７に記載した大豆発現
ベクターｐＫＳ67 にライゲートした。Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプ
チドのオープンリーディングフレームに融合した大豆β−コングリシニンプロモ
ーターから構成されるキメラ遺伝子を含有する得られた構築体は、実施例７に記
載したように、大豆体細胞胚に安定にトランスフォームされた。トランスフォー
メーションから得られたハイグロマイシン抵抗性胚を、実施例４に記載したよう
にＧＣおよびＧＣ−ＭＳを用いて、共役二重結合を含む脂肪酸の存在について調
べた。図５および表３に示すように、Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプチ
ドを発現する体細胞胚中に総脂肪酸の２１重量％までのα−エレオステアリン酸
およびトランスジェニック胚の総脂肪酸の約１重量％に達するα−パリナル酸が
検出された。いずれの酸も野生型大豆胚には検出されなかった。

【０１２２】

【表３】

【０１２３】実施例９ 単子葉植物細胞におけるキメラ遺伝子の発現 大部分の草本種子における油脂貯蔵組織は、胚およびその担当組織、胚盤から
ある程度アリューロン層にまで及ぶ。プロモーター配列たとえば保存蛋白質グロ
ブリン１（Belanger, S.C. & Kirz, A.L., 1989, Plant Physiol. 91: 636-643
）およびグロブリン２（Walace, N.H. & Kirz, A.L., 1991, Plant Physiol. 95
: 973-975）の発現を制御するプロモーター配列はこれらの組織におけるキメラ
遺伝子の発現に適当である。

【０１２４】 そのｃＤＮＡフラグメントに対し５′に位置するトーモロコシのグロブリン２
プロモーターならびにそのｃＤＮＡフラグメントに対し３′に位置するグロブリ
ン２の３′末端とセンス方向にある Impatiens blasamina、 Momordica charanti
a および Chrysobalanus icaco の種子中における共役二重結合の合成に関係す
る脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡからなるキメラ遺伝子を構築することが
できる。この遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適当なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって発
生させることができる。正しく設計された発現ベクターに挿入した場合、ＤＮＡ
フラグメントの適正な方向を提供するために、オリゴヌクレオチドにクローニン
グ部位を導入することができる。

【０１２５】 このような発現ベクターは、その宿主中にプラスミドの複製の起源を付与する
遺伝子配列エレメント、そのプラスミドをもつ宿主細胞に独立栄養性または抗生
物質耐性のような選択性を付与できる遺伝子、ならびに宿主植物細胞中での所望
の遺伝子の発現のためのプロモーター配列を包含しなければならない。さらに、
設計の特徴には、それらのエレメントにより制御される遺伝子の慣用的な導入を
可能にする植物遺伝子プロモーターエレメントの各エレメント間にユニークな制
限エンドヌクレアーゼ認識部位を包含させる。適当な宿主となることができる植
物には、それらに限定されるものではないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、お
よびヤシが包含される。

【０１２６】 上述のように構築されたキメラ遺伝子はついで、以下の操作によってトウモロ
コシの細胞に導入することができる。すなわち、未成熟のトウモロコシの胚を近
交系トウモロコシ系統Ｈ99 およびＬＨ132 の交配に由来する生育中の穀果から
切り取ることができる。受粉１０または１１日後胚が１.０〜１.５mm長に達した
ときに胚を単離する。ついで胚を軸方向を下に向けて置いてアガロース固形Ｎ6
培地（Chuら, 1975, Sci. Sin. Peking 18: 659-668）に接触させる。胚を暗所
で２７℃に保持する。体細胞前胚質および胚柄上に生じた前胚質を有する未分化
細胞塊からなるもろい胚形成カルスが、これらの未分化胚の胚盤から増殖する。
一次外植体から単離される胚形成カルスはＮ6 培地上で培養することが可能で、
この培地上で２〜３週毎に継代培養することができる。

【０１２７】 選択マーカーを提供するためにトランスフォーメーション実験にはプラスミド
ｐ35Ｓ／Ａc（Peter Ecke 博士，Hoechst Ag, Frankfurt, Germany から入手）
を使用できる。このプラスミドはホスフィノスリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（ＰＡＴ）をコードする Pat 遺伝子（欧州特許 0 242 236 参照）に含有され
る。酵素ＰＡＴはホスフィノスリシンのような除草性グルタミンシンセターゼ阻
害剤に対する抵抗性を付与する。ｐ35Ｓ／Ａc 中の pat 遺伝子はカリフラワー
モザイクウイルスからの 35Ｓプロモーター（Odellら, 1985, Nature 313: 810-
812）および Agrobacterium tumefaciens のＴi プラスミドのＴ−ＤＮＡからの
ノパリンシンターゼ遺伝子の３′領域の制御下にある。

【０１２８】 粒子ボンバードメント法（Kleinら, 1987, Nature 327: 70-73）をカルス培養
細胞に遺伝子を導入するために使用できる。この方法によれば、金粒子（直径１
μm）を以下の方法を用いてＤＮＡにより被覆する。プラスミドＤＮＡ １０μg
を金粒子の懸濁液（６０mg／ml）５０μlに添加する。塩化カルシウム（２.５Ｍ
溶液５０μl）およびスペルミジン遊離塩基（１.０Ｍ溶液２０μl）を粒子に加
える。これらの溶液の添加時には懸濁液を激しく撹拌する。１０分後、試験管を
短時間遠心分離し（１５,０００rpmで５秒間)、上清を除去する。粒子を２００
μlの無水エタノールに再懸濁し、再び遠心分離し、上清を除去する。エタノー
ル洗浄を再び実施して、粒子を最終容量３０μlのエタノールに再懸濁する。Ｄ
ＮＡ被覆金粒子のアリコート（５μl）を Kapton（登録商標）フライイングディ
スク（Bio-Rad Labs）の中心に置く。ついで粒子をヘリウム圧１０００psi、ギ
ャップ距離０.５cmおよびフライイング距離１.０cmを用い、Biolistic（登録商
標）PDS-1000／He（Bio-Rad Instruments, Hercules, CA）でトウモロコシ組織
に加速する。

【０１２９】 ボンバードメントのためには、胚形成組織をアガロース固形Ｎ6 メジウム上方
のフィルターペーパー上に置く。組織を薄いローン状に配置し、直径約５cmの円
形領域を覆う。組織を含有するペトリ皿を停止スクリーンから約８cm離してPDS-
1000／He のチャンバー内に置く。ついでチャンバー内の空気を抜いて２８イン
チＨg の真空にする。衝撃管内のヘリウム圧が１０００psiに達したとき破裂す
る破壊膜を用いて、マクロキャリヤーをヘリウム衝撃波で加速する。

【０１３０】 ボンバードメントの７日後に、組織を、グルフォシネート（２mg／Ｌ）を含有
しカゼインまたはプロリンを欠くＮ6 培地に移す。この培地上で、組織をゆっく
り成長させる。さらに２週後、組織をグルフォシネートを含む新鮮なＮ6 培地に
移す。６週後、グルフォシネート補充培地を含むプレートの一部に直径約１cmの
領域で能動的に増殖するカルスを同定することができる。これらのカルスは、選
択培地上で継代培養しても増殖を続ける。

【０１３１】 植物は、組織のクラスターを０.２mg／Ｌの２,４−Ｄ補充Ｎ6 培地に始めて移
すことにより、トランスジェニックカルスから再生することができる。２週後、
組織を再生培地に移す（Frommら, 1990, Bio／Technology 8: 833-839）。

【０１３２】実施例１０ 双子葉植物細胞中におけるキメラ遺伝子の発現 Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の
種子における共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素は、正常に貯蔵脂質
を産生する双子葉植物細胞中において、適当なキメラ遺伝子の構築ついでそれら
の遺伝子の宿主植物への安定な導入によって発現させることができる。この方法
の例には、Impatiens balsamina および Momordica charantia ならびに Chryso
balanus icaco の種子中における共役二重結合の合成に関係する脂肪酸改質酵素
の大豆における種子特異的発現がある。使用できる他の植物には、それらに限定
されるものではないが、種子油脂種アブラナ種、落花生、ヒマワリ、ベニバナ、
綿、アマ、およびココヤシが包含される。

【０１３３】 ある種の細菌および植物細胞中でハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼの発現を可能にするプラスミドｐＫＳ18ＨＨキメラ遺伝子は次の遺伝子エレメ
ント：ａ）Ｔ7 プロモーター＋Shine-Delgarno／ハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼ（ＨＰＴ）／Ｔ7 ターミネーター配列、ｂ）カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣaＭＶ）からの 35Ｓプロモーター／ハイグロマイシンＢホスホト
ランスフェラーゼ（ＨＰＴ）／ノパリンシンターゼ（Agrobacterium tumefacien
sＴ-ＤＮＡからのＮＯＳ３′）およびｃ）β−ラクタマーゼコード領域（アンピ
シリン抵抗性遺伝子）を除去したｐＳＰ72 プラスミドベクター（Premega）から
構築することができる。

【０１３４】 ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、Klebsiella 誘導プ
ラスミドｐＪＲ225 を含有する大腸菌株Ｗ677 からＰＣＲによって増幅すること
が可能である。ｐＳＰ72 ベクターに出発して、エレメントを標準クローニング
法（Maniatis）を用いて単一プラスミド中にアッセンブルする。

【０１３５】 したがって、プラスミドｐＫＳ18ＨＨは、大腸菌株たとえばλＤＥ3（これは
lacＵＶ5 の制御下にＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する）に対し溶原性で
ある NovaBlue（ＤＥ3）（Novagen から）のようなある種の大腸菌株中にＨＰＴ
酵素の発現のためのＴ7 プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ7 ターミネーターカセットを
含有する。プラスミドｐＫＳ18ＨＨはまた、植物、たとえば大豆において、ＨＰ
Ｔ酵素の構成的発現のための 35Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳカセットを含有する。これ
らの２つの発現システムは、ハイグロマイシンの存在下における増殖に対する選
択を可能にし、細菌および植物システムの両者において、このプラスミドを含有
する細胞を同定する手段として使用される。

【０１３６】 プラスミドｐＫＳ18ＨＨもまたこのベクターへの他のキメラ遺伝子のクローニ
ングに適当な３つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。

【０１３７】 Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の
種子中共役二重結合の合成に関与する脂肪酸改質酵素をコードするｃＤＮＡの発
現のためのプラスミドは大豆β−コングリシニンプロモーター（Beachyら, 1985
, EMBO J. 4: 3047-3053）、またはそれらに限定されるものではないが、種子貯
蔵蛋白質の種子中における高レベルの発現を可能にする任意の双子葉植物プロモ
ーターの制御下に作成することができる。種子貯蔵蛋白質は厳密に調節されて、
種子中、高度に臓器特異的におよび段階特異的様式でほとんど排他的に発現され
る（Higginsら, Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221, 1984; Goldbergら, C
ell 56: 149-160, 1989; Thompsonら, BioEaasys 10: 108-113, 1989）。しかも
異なる種子貯蔵蛋白質が種子生育の異なる段階で発現される。このベクターの構
築はプラスミドｐＣＷ109 およびｐＭＬ18 の使用によって容易になる。これら
は、いずれも既に記載されている（国際特許公開ＷＯ94／11516 参照）。

【０１３８】 ｐＣＷ109 におけるβ−コングリシニンプロモーターとファセオリン３′末端
の間のクローニング領域に、ＮcoＩおよびＸbaＩ消化ついでヤエリナ（mung bea
n）エキソヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡ末端の除去によって、ユニークなＮo
tＩ部位を導入する。ＮotＩリンカー（New England Biochemical カタログ No.
NEB1125）を線状化プラスミドにライゲートし、プラスミドｐＡＷ35 を産生させ
る。ｐＭＬ18 における単一のＮotＩ部位をＮotＩ消化により破壊し、単一鎖末
端をｄＮＴＰおよびクレノウフラグメントで充填し、ついで線状化プラスミドの
再ライゲーションを実施する。改質ｐＮＬ18 をついでＨind III で消化し、ウ
シ腸ホスファターゼで処理する。

【０１３９】 ｐＡＷ35 中β−コングリシニン：ＮotＩ：ファセオリン発現カセットをＨind
III 消化により除去し、１.７９kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動によ
って単離する。単離されたフラグメントを上述の改質、線状化ｐＭＬ18 構築体
にライゲートする。所望の方向性でのクローンをＮotＩおよびＸbaＩでの消化に
より同定し、β−コングリシニン転写単位の方向が選択マーカーの転写単位と同
じであることを指示する１.０８kbのフラグメントを放出させる。得られたプラ
スミドはｐＢＳ19 と命名する。

【０１４０】 Ｈind III はｐＫＳ18ＨＨ中で利用可能なユニークなクローニング部位の一つ
である。最終的発現カセットをアッセンブルするため、ｐＢＳ19 およびｐＫＳ1
8 ＨＨをいずれもＨind III で消化する。ｐＢＳ19 からのβ−コングリシニン
含有フラグメントをゲル電気泳動で単離し、予めウシアルカリホスファターゼに
よって処理した消化ｐＫＳ18ＨＨ中にライゲートする。得られたプラスミドはｐ
ＲＢ20 と命名する。

【０１４１】 Impatiens、Momordica および Chrysobalanus のポリペプチドのクローンから
増幅したＰＣＲ産物（上記実施例３に記載）を制限酵素で消化し、ＰＣＲプライ
マー中に設計された部位を切断する。プラスミドｐＲＢ20 もＰＣＲフラグメン
トの導入のための慣用のクローニング部位と適合性であるように設計する。線状
化ｐＲＢ20 のホスファターゼ処理後、ＰＣＲ産物をｐＲＢ20 中にライゲートし
、ライゲーション混合物を大腸菌株ＤＨ10Ｂのトランスフォームに使用する。コ
ロニーを液体培地中で選択し増殖させてプラスミドＤＮＡを調製する。プラスミ
ドＤＮＡをβ−コングリシニンプロモーターに関してコード配列の正しい方向を
診断できる酵素で消化すると、大豆へのトランスフォーメーションまたは任意の
適当な双子葉植物宿主へのトランスフォーメーションに用いられるクローンが同
定される。

【０１４２】 大豆胚をついで、上述の Impatiens、Momordica、Chrysobalanus のポリペプ
チドをコードする配列からなる発現ベクターでトランスフォームする。トランス
フォームされた植物の以後の培養および選択は実施例７に略述したのと本質的に
同様である。 この実施例に記載の方法を用いて、検出可能なレベルの共役ポリ不飽和脂肪酸
を有するトランスフォームされた双子葉植物の胚が同定され、増殖される。

【０１４３】実施例１１ 微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現 Impatiens balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の
種子中の共役二重結合の合成に関与する本発明の脂肪酸改質酵素をコードするｃ
ＤＮＡはＴ7 大腸菌発現ベクターｐＥＴ24ｄ（Novagen）中に挿入することがで
きる。たとえば、ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは適当に消化して Impatiens
balsamina、Momordica charantia および Chrysobalanus icaco の種子中の共役
二重結合の合成に関与する脂肪酸改質酵素をコードする核酸フラグメントを放出
させる。このフラグメントはついで、１％ NuSieve ＧＴＧ（登録商標）低融点
アガロースゲル（ＦＭＣ）上で精製することができる。緩衝液およびアガロース
ゲルにはＤＮＡフラグメントを可視化するために１０μg／mlのエチジウムブロ
ミドを含有させる。このフラグメントをついでＧＥＬアーゼ（登録商標, Epicen
tre Technologies）により製造業者の指示書に従って消化してアガロースゲルか
ら精製し、エタノール沈殿させ、乾燥し、２０μlの水に再懸濁する。適当なオ
リゴヌクレオチドアダプターをＴ4 ＤＮＡライガーゼ（New England Biolabs, B
everly, MA）を用いてこのフラグメントにライゲートする。ライゲートされたア
ダプターを含有するフラグメントは上述の低融点アガロースを用いて過剰のアダ
プターから精製することができる。ベクターｐＥＴ24ｄを消化し、アルカリホス
ファターゼ（ＮＥＢ）で脱リン酸化し、上述のように、フェノール／クロロホル
ムで脱蛋白する。調製されたベクターｐＥＴ24ｄおよびフラグメントをついで１
６℃で１５時間ライゲートし、次にＤＨ5 エレクトロコンピーテント細胞（Gibc
o BRL）にトランスフォームすることができる。トランスフォーマントを、２×
ＹＴメジウムおよび５０μg／mlのカナマイシンを含むアガールプレート上で選
択することができる。遺伝子を含むトランスフォーマントをついでｐＥＴ24ｄ
Ｔ7 プロモーターに関して正しい方向性について制限酵素分析によりスクリーニ
ングする。

【０１４４】 Ｔ7 プロモーターに関して正しい方向性のクローンは、ＢＬ12（ＤＥ3）コン
ピーテント細胞（Novagen）にトランスフォームし、５０μg／mlのカナマイシン
を含む２×ＹＴアガールプレート上で選択することができる。このトランスフォ
ーメーションから生じたコロニーの構築体を５０μg／mlのカナマイシンを含む
２×ＹＴ培地中３０℃で一夜増殖させることができる。培養液をついで新鮮な培
地で２倍に希釈し、１時間再増殖させ、イソプロピル−チオガラクトピラノシド
を最終濃度１mMに加えて誘導する。３時間後についで細胞を遠心分離によって収
穫し、０.１mM ＤＤＴおよび０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリドを含
有する５０μlの５０mMの Tris−ＨＣl、pH８.０に再懸濁する。１mmのガラスビ
ーズ少量を加え、混合物をマイクロソニケーターで各回約５秒間、３回超音波処
理する。混合物を遠心分離し、上清の蛋白質濃度を測定する。培養液の可溶性分
画からの蛋白質１μgをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離
することができる。ゲルから、期待される分子量で移動する蛋白質バンドが観察
できる。

【０１４５】実施例１２ Licania michauxii の発育中の種子から相違するω⁶−オレイン酸デサチュラー
ゼの同定 Licania michauxii は実施例８に記載した Chrysobalanus icaco 同様、Chrys
obalanaceae 科のメンバーであり、その種子油脂中に大量のα−エレオステアリ
ン酸およびα−パリナル酸を蓄積する（Badami, R.C. & Batil, K.B., 1981, Pr
og. Lipid Res. 19: 119-153）。実施例８において明らかにされたように、Lica
nia michauxii の種子におけるα−エレオステアリン酸およびα−パリナル酸の
共役二重結合は異なる型のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼの活性から生じるこ
とが期待される。Licania michauxii からのこの酵素のｃＤＮＡを同定するため
に、ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼおよび関連酵素に見いだされる保存アミノ
酸配列から設計された縮重センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い
て、ＰＣＲ増幅を実施した。これらの反応の鋳型は、発育中の Licania michaux
ii の種子から単離されたＲＮＡから合成された第一鎖ＤＮＡとした。使用した
方法およびオリゴヌクレオチドは実施例８の記載の場合と同様とした。Licania
michauxii から得られたＰＣＲ産物の配列は、２つの別個のクラスのω⁶−オレ
イン酸デサチュラーゼ型ポリペプチドの部分をコードすることが見いだされた。
一方のクラスは、実施例８に記載の Chrysobalanus icaco からのクラス２ポリ
ペプチドの相当する部分と９８％のアミノ酸の同一性を共有した。この密接な関
係から考えて、Chrysobalanus icaco クラス２ ｃＤＮＡの完全オープンリーデ
ィングフレームに隣接する配列から設計されるセンスおよびアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、Licania michauxii の相当する完全長ｃＤＮＡの増幅のために
使用した。これらのＰＣＲ増幅反応の鋳型は、Licania michauxii の生育中の種
子から実施例１に記載の方法を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーとした。セ
ンスオリゴヌクレオチドの配列は、５′tttccatggAGCAGGTGGCCAAAAG３′(配列番
号：３３）であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、５′tttagatctG
CACTCAAAACTTGTCGAAC３′(配列番号：３４）であった。ＰＣＲ反応は pfu ポリ
メラーゼ（Stratagene）を使用して実施した。得られた産物をベクターｐＰＣＲ
-Script ＡＭＰ ＳＫ（＋）(Stratagene）に製造業者のプロトコールを用いてサ
ブクローニングした。ヌクレオチド配列はついで、サブクローニングしたＰＣＲ
産物の両鎖から得られた。この配列は、配列番号：２３に示し、推定ポリペプチ
ドのアミノ酸配列は配列番号：２４に示す。Licania michauxii ｃＤＮＡライブ
ラリーから増幅された完全長のｃＤＮＡ配列は、実施例８に記載の縮重オリゴヌ
クレオチドを用いてＰＣＲ反応から得られた部分配列を包含することが見いださ
れた。

【０１４６】 配列番号：２４ に示した Licania michauxii ポリペプチドのアミノ酸配列は
、実施例８に記載の Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプチドの配列と９７
％の同一性を有する。Chrysobalanus icaco クラス２ポリペプチドの発現は実施
例８に記載したようにトランスジェニック大豆体細胞胚およびタバコカルスにお
いて共役二重結合を有する脂肪酸の形成を指図することが示された。Chrysobala
nus icaco クラス２ポリペプチドとの密接な関係を考慮すると、Licania michau
xii ポリペプチドも共役二重結合を有する脂肪酸の合成を触媒することが期待さ
れる。これを、実施例９、１０および１１に記載のようにトランスジェニック植
物または微生物細胞における Licania michauxii ｃＤＮＡ（配列番号：２３）
の発現、およびついで実施例４に記載のようにトランスジェニック植物または微
生物細胞における脂肪酸組成の分析によって試験することができる。

【０１４７】実施例１３ アブラギリ（Aleurites fordii）からのω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ−関連
配列の同定 エレオステアリン酸はアブラギリ（Aleurites fordii）の種子油脂の＞６５％
を構成する（Badami, R.C. & Batil, K.B., 1981, Prog. Lipid Res. 19: 119-1
53）。したがって、この種は、共役二重結合の形成に関係するω⁶−オレイン酸
デサチュラーゼ−関連酵素をコードするｃＤＮＡもしくは遺伝子の付加的なソー
スを提供するものである。実施例８に記載のように、これらの酵素のコード配列
は、ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼおよび関連酵素における保存アミノ酸配列
から設計される縮重オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ増幅を用いて同定すること
ができる。ＰＣＲ増幅の鋳型は共役二重結合を有する脂肪酸の蓄積する組織から
調製される第一鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーとすることができる（実
施例８に記載のように）。さらにω⁶−オレイン酸デサチュラーゼの遺伝子はそ
れらのオープンリーディングフレーム内にイントロンを含まない（Okuley, J.ら
, 1994, PlantCell 6: 147-158）。したがって、アブラギリのような種から単離
されたゲノムＤＮＡは共役二重結合の形成に関係するω⁶−オレイン酸デサチュ
ラーゼ−関連酵素のコード配列を増幅する鋳型として使用することができる。こ
の証明として、ゲノムＤＮＡをアブラギリの葉から Shureら, 1993, Cell 35: 2
25-233 によって記載されたの方法を用いて単離した。得られたＤＮＡを、ω⁶−
オレイン酸デサチュラーゼおよび関連酵素における保存アミノ酸配列から設計さ
れた縮重オリゴヌクレオチドプライマーとともにＰＣＲ反応の鋳型として用いた
。センスオリゴヌクレオチドはアミノ酸配列ＫＡＩＰＰＨＣＦに相当する５′tt
gaattcAARGCNATHCCNCCNCAYTGYTT３′(配列番号：２５）、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドはアミノ酸配列ＥＷＤＷ(Ｌ／Ｆ)ＲＧに相当する５′ttgaatTCCNCKNA
RCCARTCCCAYTC３′(配列番号：２６）とした（注：小文字の塩基ペアはＰＣＲ増
幅産物のクローニングを容易にする制限消化のために付加し、隣接ＥcoＲＩ認識
配列には下線を付す）。アブラギリゲノムＤＮＡ １５０ngを含有する１００μl
の反応容量中Ｔaq ポリメラーゼを用いて、４０サイクルのＰＣＲ増幅を実施し
た。使用したアニーリング温度は４５℃とした。約７５５bpの得られた産物をｐ
ＧＥＭ−Ｔ（Promega）に製造業者のプロトコールに従ってサブクローニングし
、大腸菌ＤＨ10Ｂ細胞（Gibco-BRL）にトランスフォームした。ついで得られた
コロニーの１１のプラスミドからのｃＤＮＡ挿入体についてヌクレオチド配列を
得た。ホモロジーの比較ではこれらの配列が、ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ
型酵素の２５５アミノ酸部分をコードすることを指示した。さらに、これらの配
列はクラス１（配列番号：２７）および２（配列番号：２９，図１参照）と命名
された２つの異なるクラスの遺伝子に相当する。クラス１および２遺伝子産物は
７５％のアミノ酸配列の同一性を共有する（図１）。もちろんクラス２遺伝子産
物は、既知のω⁶−オレイン酸デサチュラーゼに関してより異なっている。たと
えばクラス１および２ ＰＣＲ産物によりコードされる２５５アミノ酸配列は、
大豆ω⁶−オレイン酸デサチュラーゼの相当する部分とそれぞれ７６％および７
２％の同一性を有する（図１）。さらに、クラス２における第一のヒスチジンボ
ックスのすぐ隣の残基はグリシンである（図１に星印により指示）。この位置の
グリシンは、分岐した機能性を有するω⁶−オレイン酸デサチュラーゼ−関連酵
素、たとえばトウゴマオレイン酸ヒドロキシラーゼ（van de Loo, F.J.ら, 1995
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6743-6747）およびフタマタンポポ（Crepis
palaestina）のエポキシダーゼ（Lee, M.ら, 1998, Science 280: 6743-6747）
にのみ観察される。その一次構造の特徴および既知のω⁶−オレイン酸デサチュ
ラーゼとのそのより遠い関係を考慮すれば、クラス２遺伝子によってコードされ
るポリペプチドはアブラギリからの共役二重結合形成に関連する酵素であると考
えられる。共役二重結合形成に関与する酵素の同定に有用と考えられるさらに２
つの他のアミノ酸変化がある。上述の第一のヒスチジンボックス中における最初
のヒスチジンのすぐ次のアミノ酸は保存されたアスパラギン酸である。Chrysoba
lanus、Momordica および Licania の配列はこの位置がグルタミン酸で置換され
、これは他の報告されたＦad2 遺伝子には認められない。アブラギリおよび Imp
atiens 酵素にはこの置換はないが、両者ともこの位置の２アミノ酸上流にグリ
シン置換を有する。有用と考えられる他のアミノ酸の相違は Momordica 配列の
位置 312 にある。Momordica、Chrysobalanus および Licania はすべてこの位
置にプロリン置換を含有する。他の報告されたＦad2 酵素にはこの置換はない。

【０１４８】 アブラギリの遺伝子の残りの部分は２つの方法のいずれかによって得られる。
第一の方法では、アブラギリの種子または生育中の実生から単離されたｍＲＮＡ
より実施例１に略述したようにして作成される。ライブラリークローンをランダ
ムに配列決定し、実施例２に略述したようにして分析する。別法では、クローン
のＰＣＲ増幅を、アンチセンスプライマーは遺伝子のアミノ末端部分を増幅する
ように、センスプライマーはカルボキシ末端部分を増幅するよう、配列番号：２
９に示す配列から選択されるプライマーを用いて実施する。反応中に１対のプラ
イマーが挿入されたｃＤＮＡのそれぞれ上流および下流に存在するプラスミドベ
クター配列を作成する。アブラギリの配列を得る第二の方法は、アブラギリのゲ
ノムＤＮＡに対して「逆ＰＣＲ」の使用を包含するものである。略述すれば、ア
ブラギリのゲノムＤＮＡを、配列番号：２９に示す配列にハイブリダイズする小
（２〜３kb）フラグメントを与える制限酵素を用いて分画化する。消化されたゲ
ノムＤＮＡを希釈し、分子内ライゲーションが優先するように設計された反応で
ライゲートする。ＰＣＲプライマーには、配列番号：２９中に見いだされる配列
とは相違する配列を使用する。この反応で得られたＰＣＲフラグメントは配列番
号：２９に隣接するゲノム配列を有し、脂肪酸中共役二重結合の形成に関与する
完全なアブラギリ遺伝子のＰＣＲ増幅を可能にするプライマーの構築に使用する
ことができる。

【０１４９】実施例１４ 共役１８：３脂肪酸は動物の飼料に添加すると屠体の品質を改良できること ブタの成長、屠体の性質、ならびに脂肪の締まりに対するエレオステアリン酸
（１８：３）摂取の効果を評価するために実験を行った。高速度の１日肉質成長
および背脂肪低下の能力のある２４匹のブタ（バロウ種去勢雄、ＰＬＣからの遺
伝的改良種）を同腹仔、体重によってランダムに割り付け、３つの飼料群に分け
た。群１には正常トウモロコシ飼料、群２にはＣＬＡを補充した正常トウモロコ
シ飼料、群３には共役リノレン酸すなわちＣlnＡ（１８：３共役脂肪酸）補充し
た正常トウモロコシ飼料を与えた。ブタは個別の畜舎に入れ、耳のイレズミによ
って確認した。バロウの初期平均体重は１２５ポンドであった。ブタは通常飼料
で飼育したのち、１５０lbに達してからそれぞれの試験飼料を摂取させた。

【０１５０】 飼料は２フェーズすなわちフェーズ１（１５０〜２００lb）およびフェーズ２
（２００〜２５０lb）で摂取させた。処置飼料の成分および栄養組成はそれぞれ
表４および５に示す。飼料は等カロリーに処方された。

【０１５１】

【表４】

【０１５２】

【表５】

【０１５３】 飼料の調製に用いるミキサーは混合前に３００lbのトウモロコシを流して洗浄
し、各混合物の間に交差汚染が起こるのを防止する。共役リノール酸（ＣＬＡ）
は Conlinco, Inc.（Detroit Lakes, MN）から“Clareen"（登録商標）として購
入した。共役リノレン酸（ＣlnＡ）は６５％のα−エレオステアリン酸を含む桐
油（Industrial Oil Products, Woodbury）の市販のソースから購入した。最終
脂肪酸濃度０.５％のを達成するために、０.８３lb ＣＬＡプレパレーション／
１００lb飼料および０.７３lb ＣlnＡプレパレーション／１００lb飼料を添加し
た。共役二重結合の酸化を最小限にするために、飼料は１４日分を作成して使用
まで冷蔵庫に保存した。飼料は、給餌器に毎日最少量を添加した。抗生物質バシ
トラマイシンメチレンジサリチレート（ＢＭＤ，Alpharma, Inc., Fort Lee, NJ
）をすべての飼料に加えた（５０ｇ／ton）。アミノ酸および脂肪酸の分析のた
めに飼料サンプルを収集した。

【０１５４】 フェーズ１（１５０〜２００lb）およびフェーズ２（２００〜２５０lb）の平
均体重増を測定するため、生体重を記録した。飼料効率を測定するため、飼料重
量データも収集した。１日に２〜３回、給餌器および給水器への接近、畜舎の温
度ならびに異常な健康状態を確認するために動物を観察した。試験中ブタは移動
させなかった。死亡した動物があれば、死因を決定するために剖検した。死亡動
物の体重は飼料効率を補正するために使用した。

【０１５５】 ブタが体重２５０ポンドに達した時点で屠殺し、処理し、標準的屠体測定値を
収集した。共役脂肪酸を制限するため、ＣＬＡおよびＣlnＡを摂取していたブタ
には屠殺前４日間は正常食を与えた。各試験群の８匹のブタからの腹部について
圧縮前後のベリーの厚さを測定して脂肪の締まりを評価した。脂肪の圧縮は新鮮
なベリー上に１時間５０lbの重りを置くことにより行った。脂肪の圧縮は初期の
ベリー厚は圧縮時のベリー厚を差引いて定量化した。ベリー厚はマイクロメータ
ーを使用して測定した。ベリー厚の評価の結果は表６に示す。データはＳＡＳ（
Statistical Analysis System）のＧＬＭ（一般線型モデル）操作を用いて、無
作為完全乱塊配置として分析した。表には圧縮および非圧縮ブタ肉ベリーの厚さ
の間の差として表す。数が小さいほどブタ肉のベリーの圧縮は低下する（すなわ
ち、締まりは大きい）ことを指示する。ブタ肉のベリーは５０％脂肪より大きい
ので、ベリーの圧縮試験は、ブタ肉の脂肪の相対的な締まりの指標である。ＮＣ
飼料にＣＬＡまたはＣlnＡのいずれかを添加するとブタで脂肪の締まりの増大を
生じた。飼料へのＣＬＡの添加により生じるブタ肉の脂肪の締まりの改良は他の
研究者の報告結果（Eggert, J.M.ら, 1999, J.Anim. Sci. 77(Suppl): 53; Thie
l, R.C.ら, 1998, J.Anim. Sci. 76(Suppl): 13; Wiegand, B.R.F.C. Parrrish
Jr. & J.C. Sparks, 1999, J.Anim. Sci. 77(Suppl): 19; 米国特許第5,554,646
; および米国特許第5,851,572）と一致する。飼料中へのＣlnＡの添加によって
生じる脂肪の締まりの改良はこれまでに報告されていない。この実験の結果に基
づいて、共役リノール酸（ＣＬＡ）または共役リノレン酸（ＣlnＡ）のブタ飼料
への添加は脂肪の締まりを改良する。

【０１５６】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１−１】 Impatiens balsamina (ImpH8Fad2、配列番号：２）、Memordicacharantia (Mo
mFad2、配列番号：４）、Chrysobalanus icaco (ChrFad2、 配列番号：２０）、
Licania michauxii (LinFad2、配列番号：２４）及び Aleuritesfordii Class I
（AleCl、配列番号：２８）及び Aleurites fordii Class II（AleC2、配列番号
：３０）の種子からの共役二重結合形成に関係する本発明の脂肪酸改質酵素のア
ミノ酸配列の比較を示す。桐油クラスＩ遺伝子は共役二重結合形成に関係する酵
素をコードしているとは考えられない。これらの酵素のアミノ酸配列を大豆ω-⁶ オレエートデサチュラーゼ（大豆ω-⁶) 及びトウゴマ脂肪酸ヒドロキシダーゼ（
Hydroxidase) と比較する。実施例１３に述べるアラニンに対するグリシンの置
換位置をａ^*で強調する。

【図１−２】 Impatiens balsamina (ImpH8Fad2、配列番号：２）、Memordicacharantia (Mo
mFad2、配列番号：４）、Chrysobalanus icaco (ChrFad2、 配列番号：２０）、
Licania michauxii (LinFad2、配列番号：２４）及び Aleuritesfordii Class I
（AleCl、配列番号：２８）及び Aleurites fordii Class II（AleC2、配列番号
：３０）の種子からの共役二重結合形成に関係する本発明の脂肪酸改質酵素のア
ミノ酸配列の比較を示す、図１−１の続きである。

【図２】 共役二重結合形成に関係する Impatiens 脂肪酸改質酵素を発現しているトラ
ンスジェニック大豆胚の脂肪酸プロフィールを示す。野生型大豆胚（Ａ）、Impa
tiens ポリペプチドを発現しているトランスジェニック大豆胚（Ｂ）、及び Imp
atiens balsamina の種子（Ｃ）から調製した脂肪酸メチルエステルのガスクロ
マトグラムを示す。野生型脂肪酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
リノール酸、及びリノレイン酸：それぞれ、１６：０、１８：０、１８：１、１
８：２及び１８：３をラベルする。α−エレオステアリン酸及びα−パリナル酸
に相当するピークも認められる。

【図３】 共役二重結合形成に関係する Momordica 脂肪酸改質酵素を発現しているトラ
ンスジェニック大豆胚の脂肪酸プロフィールを示す。野生型大豆胚（Ａ）、Momo
rdica ポリペプチドを発現しているトランスジェニック大豆胚（Ｂ）及び Momor
dicacharantia の種子（Ｃ）から調製した脂肪酸メチルエステルのガスクロマト
グラムを示す。星印（^*）はメチルα−エレオステアリン酸のシス−トランス異
性体を指示している。

【図４】 共役二重結合形成に関係する Momordica 脂肪酸改質酵素を発現しているトラ
ンスジェニック大豆胚の脂肪酸プロフィールを示す。野生型大豆種子（Ａ）及び
Momordica ポリペプチドを発現しているトランスジェニック大豆種子（Ｂ）か
ら調製した脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラムを示す。星印（^*）はメ
チルα−エレオステアリン酸のシス−トランス異性体を指示している。

【図５】 共役二重結合形成に関係する Chrysobalanus icaco 脂肪酸改質酵素を発現し
ているトランスジェニック大豆胚の脂肪酸プロフィールを示す。野生型大豆種子
（Ａ）及び Chrysobalanus ポリペプチドを発現しているトランスジェニック大
豆種子（Ｂ）から調製した脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラムを示す。
星印（^*）はメチルα−エレオステアリン酸のシス−トランス異性体を指示して
いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/00 １０１ 9/00 Ｃ１２Ｐ 7/64 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/64 5/00 Ａ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ (72)発明者 トマス・ジェイ・カールソン アメリカ合衆国デラウェア州19810．アー デンタウン．オーチャードロード2316 (72)発明者 ウィリアム・ディーン・ヒッツ アメリカ合衆国デラウェア州19807．ウィ ルミントン．ヒルサイドロード404 (72)発明者 ケヴィン・ジー・リップ アメリカ合衆国デラウェア州19806．ウィ ルミントン．ウェスト・エイティーンスス トリート2310 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD07 CD09 CD10 CD13 CD14 CD17 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 EA04 GA11 GA17 HA12 4B050 CC02 DD02 FF14 LL03 4B064 AD88 CA11 CA19 CC24 DA10 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC14 BA02 BA25 CA13 CA27 CA41 CA53

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコード
   する単離核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはそれと機能的に均
   等なサブフラグメントは（ａ）配列番号：１、３、１９、２３または２９のヌク
   レオチド配列のいずれかに中等度の緊縮条件下にハイブリダイズするか、または
   （ｂ）配列番号：１、３、１９、２３または２９のヌクレオチド配列のいずれか
   によりコードされるポリペプチドと少なくとも４５％は同一であるかもしくは相
   同性配列を検出するために設計された比較方法により測定してその機能的に均等
   なサブフラグメントである単離核酸フラグメント。
2. 【請求項２】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコード
   する単離核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはそれと機能的に均
   等なサブフラグメントは配列番号：２、４、２０、２４または３０のアミノ酸配
   列の任意の一つからなる蛋白質をコードする単離核酸フラグメント。
3. 【請求項３】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコード
   する単離核酸フラグメントにおいて、上記フラグメントまたはそれと機能的に均
   等なサブフラグメントは（ａ）請求項２記載の単離核酸フラグメントに中等度の
   緊縮条件下にハイブリダイズするか、または（ｂ）請求項２記載の任意の単離核
   酸フラグメントによってコードされるポリペプチドと少なくとも４５％は同一で
   あるかもしくは相同性配列を検出するために設計された比較方法によって測定し
   たその機能的に均等なサブフラグメントである単離核酸フラグメント。
4. 【請求項４】 上記フラグメントは Impatiens balsamina、Momordica char
   antia、Chrysobalanus icania、Licania michauxii および Aleurites fordii
   から単離される請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸フラグメント。
5. 【請求項５】 植物脂肪酸改質酵素は、エレオステアリン酸およびパリナル
   酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸の形成に関係する請求項１
   〜３のいずれかに記載の単離核酸フラグメント。
6. 【請求項６】 植物脂肪酸改質酵素は、エレオステアリン酸およびパリナル
   酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸の形成に関係する請求項４
   記載の単離核酸フラグメント。
7. 【請求項７】 植物は大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花生、
   イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシからなる群
   より選択される請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸フラグメント。
8. 【請求項８】 植物は大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花生、
   イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシからなる群
   より選択される請求項４記載の単離核酸フラグメント。
9. 【請求項９】 植物は大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花生、
   イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシからなる群
   より選択される請求項５記載の単離核酸フラグメント。
10. 【請求項１０】 植物は大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花生
    、イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシからなる
    群より選択される請求項６記載の単離核酸フラグメント。
11. 【請求項１１】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項１〜３のいずれ
    かに記載の単離核酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメント
    またはその補体からなるキメラ遺伝子。
12. 【請求項１２】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項４記載の単離核
    酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメントまたはその補体か
    らなるキメラ遺伝子。
13. 【請求項１３】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項５記載の単離核
    酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメントまたはその補体か
    らなるキメラ遺伝子。
14. 【請求項１４】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項６記載の単離核
    酸フラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメントまたはその補体か
    らなるキメラ遺伝子。
15. 【請求項１５】 請求項１１記載のキメラ遺伝子からなるトランスフォーム
    された宿主細胞。
16. 【請求項１６】 請求項１２記載のキメラ遺伝子からなるトランスフォーム
    された宿主細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１３記載のキメラ遺伝子からなるトランスフォーム
    された宿主細胞。
18. 【請求項１８】 請求項１４記載のキメラ遺伝子からなるトランスフォーム
    された宿主細胞。
19. 【請求項１９】 上記細胞は植物細胞および微生物からなる群より選択され
    る請求項１５記載の宿主細胞。
20. 【請求項２０】 上記細胞は植物細胞および微生物からなる群より選択され
    る請求項１６記載の宿主細胞。
21. 【請求項２１】 上記細胞は植物細胞および微生物からなる群より選択され
    る請求項１７記載の宿主細胞。
22. 【請求項２２】 上記細胞は植物細胞および微生物からなる群より選択され
    る請求項１８記載の宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項１１記載のキメラ遺伝子でトランスフォームされた
    植物細胞から得られる種子。
24. 【請求項２４】 請求項１２記載のキメラ遺伝子でトランスフォームされた
    植物細胞から得られる種子。
25. 【請求項２５】 請求項１３記載のキメラ遺伝子でトランスフォームされた
    植物細胞から得られる種子。
26. 【請求項２６】 請求項１４記載のキメラ遺伝子でトランスフォームされた
    植物細胞から得られる種子。
27. 【請求項２７】 請求項２３記載の種子からの油脂。
28. 【請求項２８】 請求項２４記載の種子からの油脂。
29. 【請求項２９】 請求項２５記載の種子からの油脂。
30. 【請求項３０】 請求項２６記載の種子からの油脂。
31. 【請求項３１】 宿主細胞中における共役二重結合を有する脂肪酸のレベル
    を変化させる方法において、 (ａ) 宿主細胞を請求項１１記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) 共役二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされ
    た宿主細胞を選択することからなる方法。
32. 【請求項３２】 宿主細胞中における共役二重結合を有する脂肪酸のレベル
    を変化させる方法において、 (ａ) 宿主細胞を請求項１２記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) 共役二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされ
    た宿主細胞を選択することからなる方法。
33. 【請求項３３】 宿主細胞中における共役二重結合を有する脂肪酸のレベル
    を変化させる方法において、 (ａ) 宿主細胞を請求項１３記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) 共役二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされ
    た宿主細胞を選択することからなる方法。
34. 【請求項３４】 宿主細胞中における共役二重結合を有する脂肪酸のレベル
    を変化させる方法において、 (ａ) 宿主細胞を請求項１４記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) 共役二重結合を有する脂肪酸のレベルが変化したトランスフォームされ
    た宿主細胞を選択することからなる方法。
35. 【請求項３５】 宿主細胞は植物細胞および微生物からなる群より選択され
    る請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
36. 【請求項３６】 エレオステアリン酸および／またはパリナル脂肪酸のレベ
    ルが変化する請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
37. 【請求項３７】 植物の種子中に共役二重結合を有する脂肪酸を含有する種
    子油脂を製造する方法において、 (ａ) 請求項１１記載のキメラ遺伝子で植物細胞をトランスフォームし、 (ｂ) 工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
    を生育させ、 (ｃ) 工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を共役二重結合を有する脂
    肪酸の変化したレベルについてスクリーニングし、ついで (ｄ) 工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして、レベルの変化した共役二
    重結合を有する脂肪酸を含有する種子油脂を得る方法。
38. 【請求項３８】 植物の種子中に共役二重結合を有する脂肪酸を含有する種
    子油脂を製造する方法において、 (ａ) 請求項１２記載のキメラ遺伝子で植物細胞をトランスフォームし、 (ｂ) 工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
    を生育させ、 (ｃ) 工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を共役二重結合を有する脂
    肪酸の変化したレベルについてスクリーニングし、ついで (ｄ) 工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして、レベルの変化した共役二
    重結合を有する脂肪酸を含有する種子油脂を得る方法。
39. 【請求項３９】 植物の種子中に共役二重結合を有する脂肪酸を含有する種
    子油脂を製造する方法において、 (ａ) 請求項１３記載のキメラ遺伝子で植物細胞をトランスフォームし、 (ｂ) 工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
    を生育させ、 (ｃ) 工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を共役二重結合を有する脂
    肪酸の変化したレベルについてスクリーニングし、ついで (ｄ) 工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして、レベルの変化した共役二
    重結合を有する脂肪酸を含有する種子油脂を得る方法。
40. 【請求項４０】 植物の種子中に共役二重結合を有する脂肪酸を含有する種
    子油脂を製造する方法において、 (ａ) 請求項１４記載のキメラ遺伝子で植物細胞をトランスフォームし、 (ｂ) 工程（ａ）のトランスフォームされた植物細胞から稔性のある成熟植物
    を生育させ、 (ｃ) 工程（ｂ）の稔性のある植物からの子孫種子を共役二重結合を有する脂
    肪酸の変化したレベルについてスクリーニングし、ついで (ｄ) 工程（ｃ）の子孫種子をプロセッシングして、レベルの変化した共役二
    重結合を有する脂肪酸を含有する種子油脂を得る方法。
41. 【請求項４１】 植物は大豆、脂肪種子アブラナ種、トウモロコシ、落花生
    、イネ、コムギ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、アマ、ヤシおよびココヤシからなる
    群より選択される請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。
42. 【請求項４２】 種子油脂はレベルの変化したエレオステアリン酸および／
    またはパリナル脂肪酸を含有する請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。
43. 【請求項４３】 共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素を製造する
    方法において、 (ａ) 微生物宿主細胞を請求項１１記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし
    、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) キメラ細胞によってコードされた蛋白質のレベルが変化したトランスフ
    ォームされた宿主細胞を選択することからなる方法。
44. 【請求項４４】 共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素を製造する
    方法において、 (ａ) 微生物宿主細胞を請求項１２記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし
    、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) キメラ細胞によってコードされた蛋白質のレベルが変化したトランスフ
    ォームされた宿主細胞を選択することからなる方法。
45. 【請求項４５】 共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素を製造する
    方法において、 (ａ) 微生物宿主細胞を請求項１３記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし
    、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) キメラ細胞によってコードされた蛋白質のレベルが変化したトランスフ
    ォームされた宿主細胞を選択することからなる方法。
46. 【請求項４６】 共役二重結合の形成に関係する脂肪酸改質酵素を製造する
    方法において、 (ａ) 微生物宿主細胞を請求項１４記載のキメラ遺伝子でトランスフォームし
    、 (ｂ) トランスフォームされた宿主細胞をキメラ遺伝子の発現に適当な条件下
    に増殖させ、ついで (ｃ) キメラ細胞によってコードされた蛋白質のレベルが変化したトランスフ
    ォームされた宿主細胞を選択することからなる方法。
47. 【請求項４７】 脂肪酸改質酵素は、エレオステアリン酸およびパリナル酸
    からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸の形成に関係する請求項４３
    〜４６のいずれかに記載の方法。
48. 【請求項４８】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコー
    ドする単離核酸フラグメント。
49. 【請求項４９】 植物脂肪酸改質酵素は、エレオステアリン酸およびパリナ
    ル酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸の形成に関係する請求項
    ４８記載の単離核酸フラグメント。
50. 【請求項５０】 上記フラグメントは配列番号：１、３、１９、２３または
    ２９ のヌクレオチド配列に実質的に類似する請求項４８記載の単離核酸フラグ
    メント。
51. 【請求項５１】 コンピュータープログラムはＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド
    、両鎖）、ＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド、６フレーム翻訳）、ＢＬＡＳＴＰ（蛋
    白質）、ＴＢＬＡＳＴＮ（蛋白質、６フレーム翻訳）ならびにＴＢＬＡＳＴＸ（
    ヌクレオチド、６フレーム翻訳）を包含するＢＬＡＳＴコンピューター法（Basi
    c Local Alignment Search Tool)；Megalign プログラムのＬＡＳＡＲＧＥＮＥ
    生物情報法（ＤＮＡＳＴＡＲ）、または多重配列アラインメントの Clustal 法
    からなる群より選択される請求項１または３記載の単離核酸フラグメント。
52. 【請求項５２】 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコー
    ドする核酸フラグメントまたはその機能的に均等なフラグメントを単離する方法
    において、 (ａ) 配列番号：２、４、２０、２４および３０ならびに他の植物脂肪酸改質
    酵素ポリペプチド配列を比較し、 (ｂ) 工程（ａ）で得られた４またはそれ以上のアミノ酸の保存的配列を同定
    し、 (ｃ) 工程（ｂ）で同定された保存的配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し
    、ついで (ｄ) 工程（ｓ）の縮重オリゴマーを用い、配列依存性プロトコールによって
    共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素をコードする配列またはその
    部分を単離する方法。
53. 【請求項５３】 請求項２３〜２６のいずれかに記載の種子のプロセッシン
    グから誘導される成分からなる動物用飼料。
54. 【請求項５４】 請求項２３〜２６のいずれかに記載の任意の種子からなる
    動物用飼料。
55. 【請求項５５】 請求項２７〜３０のいずれかに記載の任意の油脂からなる
    動物用飼料。
56. 【請求項５６】 請求項５３記載の飼料を動物の食餌に補充することにより
    動物の屠体の品質を改良する方法。
57. 【請求項５７】 請求項５４記載の飼料を動物の食餌に補充することにより
    動物の屠体の品質を改良する方法。
58. 【請求項５８】 請求項５５記載の飼料を動物の食餌に補充することにより
    動物の屠体の品質を改良する方法。
59. 【請求項５９】 アブラギリ、ビターメロン、キンセンカ、ジャカランダ、
    キササゲおよびザクロからなる群より選択される天然の原料から抽出された油脂
    に由来する少なくとも１種の共役リノレン酸を含有する動物飼料。
60. 【請求項６０】 上記共役リノレン酸は屠体の品質を改良する量で存在させ
    る請求項５９記載の動物飼料。
61. 【請求項６１】 請求項５９または６０記載の飼料を動物の食餌に補充する
    ことによる動物の屠体の品質を改良する方法。
62. 【請求項６２】 請求項１〜３または４８のいずれかに記載の単離核酸フラ
    グメントの補体。