CN108101954B - 用动态轴向压缩柱分离纯化冷水七中三萜皂苷单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法。将冷水七水提取；大孔树脂除杂富集；中压C18柱初步纯化皂苷活性部位；用C18填料填装动态轴向压缩柱，用流动相持续冲洗动态轴向压缩柱直到色谱仪基线平稳；将稀释好的经中压C18柱初步纯化的冷水七皂苷类活性成分样品溶液过滤后，注入平衡后的动态轴向压缩柱，等度洗脱，洗脱液为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝30‑50％：5‑20％：30‑65％(V/V/V)，用紫外检测器检测样品分离情况；根据保留时间和色谱峰高度鉴定，确定每种冷水七三萜皂苷单体的起止收集时间，将收集到的每种皂苷单体溶液分别减压浓缩，除去溶剂。该方法工艺简单，可同时分离提纯制备多种高纯三萜皂苷化合物，植物原料利用率高。

Description

用动态轴向压缩柱分离纯化冷水七中三萜皂苷单体的方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及用动态轴向压缩柱制备冷水七皂苷单体的方法。

背景技术

冷水七(Impatiens pritzllii Hook.f.var.hupehensis Hook.f.)为凤仙花科凤仙花属植物湖北凤仙花，其根茎是鄂西土家族常用民族药，具有祛风除湿，散瘀消肿之功效。民间将其用于治疗类风湿性疾患，疗效甚佳。

冷水七的主要成分为三萜皂苷类、脂肪族类、甾醇类、含氮化合物类、糖类等。三萜皂苷类化合物是冷水七的主要有效成分。冷水七主要的药理作用有：1.镇痛作用。周雪峰等考察了从冷水七中分离得到的8个单体化合物对醋酸诱发小鼠扭体次数的影响，有2个冷水七三萜皂苷的高剂量有明显镇痛作用。2.抗炎作用。研究结果表明，土家族药冷水七对胶原蛋白II诱导的小鼠关节炎模型也有明显的效果，其甲醇提取物和正丁醇部位可降低小鼠关节炎模型血清中IgG，INF-γ，IL-18水平和升高IL-10水平。在IL-18抑制活性筛选中，考察了从冷水七中得到的10个单体化合物对LPS诱导人PBMCs产生的IL-18的抑制作用，其中5个化合物包括2个冷水七三萜皂苷有明显的IL-18抑制活性。3.抗菌作用。文德鉴等对将冷水七的提取液进行体外抗菌作用研究，结果表明土家族药冷水七醇提物对常见细菌无明显抑制活性，对白假丝酵母菌表现出一定的体外抗菌活性。4.对免疫系统作用。在淋巴细胞增殖实验中，考察了冷水七中分离得到的13个单体化合物对ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖的影响，分别各有2种冷水七三萜皂苷对T、B淋巴细胞增殖有抑制作用。5.抑制小肠运动作用。6.改善微循环作用。

三萜皂苷类化合物是冷水七的主要有效成分。现阶段关于从冷水七中提取三萜皂苷的研究较少，几乎没有从冷水七中同时分离出多种三萜皂苷单体的报道。目前工业上制备三萜皂苷的方法得到的三萜皂苷纯度较低，需经过多步分离纯化方可得到高纯度的三萜皂苷，且制备工艺复杂，分离步骤繁琐，溶剂消耗量大。

研究一种能够从冷水七中分离制备出多种高纯三萜皂苷单体的制备工艺，可以有效的利用植物资源，为天然药物的开发提供物质基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法。该方法工艺简单，可同时分离提纯制备多种高纯三萜皂苷化合物，植物原料利用率高。一种用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其步骤如下：

(1)将冷水七根茎干燥，粉碎，纯水加热提取，提取完毕后，收集提取液，将提取液调pH为7-11，合并提取液，沉降，沉降完毕后，取上清液进行粗滤，得干净的上清液；

(2)大孔树脂除杂富集：将干净的上清液进入装有D101树脂的树脂柱内进行吸附，吸附完毕后用水洗柱，洗至pH试纸显中性，然后10％～35％的乙醇洗脱去杂，再用75％～85％的乙醇进行解析，将解析液真空减压回收乙醇，得冷水七总皂苷流浸膏；

(3)中压C18柱初步纯化皂苷活性部位：将冷水七总皂苷流浸膏用甲醇溶液溶解，超声后过滤，将滤液稀释得到样品溶液，采用反相C18填料进行柱层析分离提纯，然后经浓度为20％～30％的甲醇洗脱除去杂质后，再用浓度为30％～60％的甲醇洗脱，压力0.3-0.5Mpa，收集洗脱液，合并，浓缩，即得含有冷水七皂苷类活性成分(抑制淋巴细胞活性)的组合物；

(4)动态轴向压缩柱分离纯化皂苷单体：用C18填料填装动态轴向压缩柱，用流动相持续冲洗动态轴向压缩柱直到色谱仪基线平稳；将稀释好的经中压C18柱初步纯化的冷水七皂苷类活性成分样品溶液过滤后，注入平衡后的动态轴向压缩柱，压力3-5Mpa，等度洗脱，洗脱液为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝30-50％：5-20％：30-65％(V/V/V)，用紫外检测器检测样品分离情况；根据保留时间和色谱峰高度鉴定，确定每种冷水七三萜皂苷单体的起止收集时间，其中，t_R＝11-19min，收集冷水七皂苷D(Impatiprinoside D)、t_R＝21-30min，收集冷水七皂苷G(Impatienoside G)、t_R＝32-40min，收集冷水七皂苷E(ImpatiprinosideE)、t_R＝50-60min，收集东风菜皂苷A₂(scaberoside A₂)四种单体，将收集到的每种皂苷单体溶液分别减压浓缩，除去溶剂。

按上述方案，所述步骤(1)的纯水提取时间2-4小时，提取温度80～95℃，

按上述方案，所述步骤(1)的提取次数为3次以上，沉降时间为20-30小时。

按上述方案，所述步骤(2)中洗脱除杂用乙醇用量体积为树脂体积的3-10倍，解析用乙醇用量为再用树脂体积的2-8倍，洗脱和解析流速为50-150L/h。

按上述方案，所述步骤(2)中用配制的流动相30％～100％的甲醇将滤液稀释成浓度为0.5～1.0g/ml的样品溶液。

按上述方案，所述的步骤(3)中：C18填料的粒径为20-60μm。

按上述方案，所述步骤(4)中填料的装填方法为：将C18填料加入匀浆试剂甲醇，设定DAC色谱柱系统压力10Mpa，室温下超声并搅拌得匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排除流动相后压实色谱柱填料，完成装填。

按上述方案，所述的步骤(4)中C18填料的粒径为10-20μm；C18填料和甲醇匀浆试剂甲醇的质量体积比为2800mg：1000ml。

按上述方案，所述的步骤(4)中紫外检测器的波长为205nm或210nm。

按上述方案，所述的步骤(4)中稀释好的样品溶液的浓度为10-50mg/ml。

按上述方案，所述步骤(4)的洗脱流速为50-150ml/min。

按上述方案，所述步骤(4)中的流动相持续冲洗动态轴向压缩柱时间为15-20分钟。

本发明的有益效果：

本发明提供的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法先利用皂苷水溶性好的性质进行水提取，然后采用大孔树脂纯化，去掉极性大的杂质，包括多糖，蛋白质等水溶性杂质，保留水溶性皂苷类成分，之后配合中压C18柱初步分离和动态轴向压缩柱色谱分离，可从冷水七中分离纯化Impatiprinoside D(3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-刺囊酸-28-O-β-D-呋喃芹菜糖-(1→3)-[O-β-D-吡喃木糖(1→4)-]-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-L-吡喃阿拉伯糖苷)、Impatienoside G(3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-刺囊酸-28-O-β-D-吡喃木糖(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-L-吡喃阿拉伯糖苷)、Impatiprinoside E(3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-刺囊酸-28-O-β-D-呋喃芹菜糖-(1→3)-[O-β-D-吡喃木糖(1→4)-]-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)、scaberoside A₂(3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-刺囊酸-28-O-β-D-吡喃木糖(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)(化学结构式见图1)四种皂苷单体，即包括冷水七皂苷D(Impatiprinoside D)、冷水七皂苷G(Impatienoside G)、冷水七皂苷E(Impatiprinoside E)、scaberoside A₂，通过高效液相色谱法检测，其纯度均在95％以上。

本发明的方法操作简单，紫外检测器在线监测，效率高，产品质量容易控制；等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，制备效率高，且所用有机试剂均可以回收再用，是一种高效、环保、适用性强的工业制备冷水七皂苷单体的分离纯化方法。

附图说明

图1为四种冷水七三萜皂苷的化学结构图。

图2为经中压C18分离收集60％-85％甲醇洗脱部分HPLC分析图谱。

图3为动态轴向压缩柱(DAC)制备分离四种冷水七皂苷的图谱。

图4为DAC纯化分离后皂苷1(Impatiprinoside D)的HPLC分析图谱。

图5为DAC纯化分离后皂苷2(Impatienoside G)的HPLC分析图谱。

图6为DAC纯化分离后皂苷3(Impatiprinoside E)的HPLC分析图谱。

图7为DAC纯化分离后皂苷4(scaberoside A2)的HPLC分析图谱。

图8皂苷1(Impatiprinoside D)的13C-NMR图谱。

图9皂苷2(Impatienoside G)的13C-NMR图谱。

图10皂苷3(Impatiprinoside E)的13C-NMR图谱。

图11皂苷4(scaberoside A2)的13C-NMR图谱。

具体实施方式

实施例1

将冷水七根茎干燥，粉碎，投入多功能提取罐内，加纯水提取三次，每次时间3小时，温度80～95℃，提取完毕后，将提取液调pH为8，合并三次提取液，沉降24小时。沉降完毕后，取上清液进行粗滤，将干净的上清液泵入高位槽内，进入装有D101树脂的树脂柱内进行吸附，吸附完毕后用水洗柱，洗至PH试纸显中性。然后4倍树脂体积的30％乙醇洗脱去杂，再用4倍树脂体积78％乙醇进行解析，流速100L/h。将解析液真空减压回收乙醇，得冷水七总皂苷流浸膏。

将冷水七总皂苷流浸膏用甲醇溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用配制的流动相30％甲醇稀释成浓度为0.5g/ml的样品；将冷水七总皂苷粗品采用反相C18填料(20-60μm)进行柱层析分离提纯，压力0.3Mpa，经浓度为25％甲醇洗脱除去杂质后，再用浓度为40％甲醇洗脱，收集洗脱液，合并，浓缩，即得含有冷水七皂苷类活性成分(抑制淋巴细胞活性)的组合物。见图2。

将1000g粒径为10-20μm的C18填料，加入2800mL匀浆试剂，设定DAC色谱柱系统压力，室温下超声30min，超声并搅拌20min后，将匀浆液送入直径为80mm的动态轴向压缩柱，排除流动相后压实色谱柱填料，压力10Mpa，完成DAC柱的填装；用流动相持续冲洗动态轴向压缩柱15-20分钟，直到色谱仪基线平稳；用甲醇溶解经中压C18柱初步纯化的冷水七皂苷类活性成分样品，配成浓度为30mg/ml溶液，用0.45μm有机滤膜过滤后，注入平衡后的动态轴向压缩柱，进样量为300mg，设定紫外检测器的波长为205nm，压力4Mpa，等度洗脱，洗脱液为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝42：10：48(V/V)，输液泵的流速为140ml/min，用紫外检测器检测样品分离情况；根据保留时间和色谱峰高度鉴定，确定每种冷水七三萜皂苷单体的起止收集时间，其中，t_R＝11-19min,收集Impatiprinoside D、t_R＝21-30min,收集Impatienoside G、t_R＝32-40min,收集Impatiprinoside E、t_R＝50-60min,收集scaberoside A₂四种单体(制备图谱见图3)。经收集到的每种皂苷单体溶解分别减压浓缩，除去溶剂，配制成一定浓度的溶液，用高效液相色谱法检测纯度，纯度分别可以达到95.2％，96.5％，96.8％，95.7％。分别见图4，5，6，7。其化学结构经¹H-NMR，¹³C-NMR以及2D-NMR，MS和参考文献等方法来进行确定。四个皂苷的¹³C-NMR图谱分别见图8，9，10，11。四个皂苷的¹H-NMR，¹³C-NMR数据分别见表1，2，3，4。其中：表1皂苷1-4苷元13C-NMR数据(δ)(150MHz,pyridine-d5)；表2皂苷1-4糖基13C-NMR数据(δ)(150MHz,pyridine-d5)；表3皂苷1-4糖基1H-NMR数据(δ)(600MHz,pyridine-d5)；表4皂苷1-4苷元1H-NMR数据(δ)(600MHz,pyridine-d5)。

表1.皂苷1–4苷元¹³C-NMR数据(δ)(150MHz,pyridine-d₅).

表2.皂苷1-4糖基¹³C-NMR数据(δ)(150MHz,pyridine-d₅).

表3.皂苷1-4糖基的¹H-NMR数据(δ),(600MHz，pyridine-d₅).

表4皂苷1-4苷元¹H-NMR数据(δ)(600MHz,pyridine-d5).

实施例2

将冷水七根茎干燥，粉碎，投入多功能提取罐内，加纯水提取三次，每次时间4小时，温度80～95℃，提取完毕后，将提取液调pH 9，合并三次提取液，沉降24小时。沉降完毕后，取上清液进行粗滤，将干净的上清液泵入高位槽内，进入装有D101树脂的树脂柱内进行吸附，吸附完毕后用水洗柱，洗至PH试纸显中性。然后4倍树脂体积的30％乙醇洗脱去杂，再用4倍树脂体积80％乙醇进行解析，流速100L/h。将解析液真空减压回收乙醇，得冷水七总皂苷流浸膏。

将冷水七总皂苷流浸膏用甲醇溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液用配制的流动相30％甲醇稀释成浓度为0.5g/ml的样品；将冷水七总皂苷粗品采用反相C18填料(20-60μm)进行柱层析分离提纯，压力0.4Mpa，经浓度为20％甲醇洗脱除去杂质后，再用浓度为55％甲醇洗脱，收集洗脱液，合并，浓缩，即得含有冷水七皂苷类活性成分(抑制淋巴细胞活性)的组合物。见图2。

将1000g粒径为10-20μm的C18填料，加入2800mL匀浆试剂，设定DAC色谱柱系统压力，室温下超声30min，超声并搅拌20min后，将匀浆液送入直径为80mm的动态轴向压缩柱，排除流动相后压实色谱柱填料，完成DAC柱的填装；用流动相持续冲洗动态轴向压缩柱15-20分钟，直到色谱仪基线平稳；将稀释好的经中压C18柱初步纯化的冷水七皂苷类活性成分样品溶液，浓度为40mg/ml，用0.45μm有机滤膜过滤后，注入平衡后的动态轴向压缩柱，进样量为300mg，设定紫外检测器的波长为205nm，压力4Mpa，等度洗脱，洗脱液为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝45：11：44(V/V)，输液泵的流速为140ml/min，用紫外检测器检测样品分离情况；根据保留时间和色谱峰高度鉴定，确定每种冷水七三萜皂苷单体的起止收集时间，其中，t_R＝11-19min,收集Impatiprinoside D、t_R＝21-30min,收集Impatienoside G、t_R＝32-40min,收集Impatiprinoside E、t_R＝50-60min,收集scaberoside A₂四种单体；(制备图谱见图3)。经收集到的每种皂苷单体溶解分别减压浓缩，除去溶剂，配制成一定浓度的溶液，用高效液相色谱法检测纯度，纯度分别可以达到95.6％，96.8％，97.0％，96.2％。其化学结构经¹H-NMR，¹³C-NMR以及2D-NMR，MS和参考文献等方法来进行确定。

Claims (10)

1.一种用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)将冷水七根茎干燥，粉碎，纯水加热提取，提取完毕后，收集提取液，将提取液调pH为7-11，合并提取液，沉降，沉降完毕后，取上清液进行粗滤，得干净的上清液；

(2)大孔树脂除杂富集：将干净的上清液进入装有D101树脂的树脂柱内进行吸附，吸附完毕后用水洗柱，洗至pH试纸显中性，然后10％～35％的乙醇洗脱去杂，再用75％～85％的乙醇进行解析，将解析液真空减压回收乙醇，得冷水七总皂苷流浸膏；

(3)中压C18柱初步纯化皂苷活性部位：将冷水七总皂苷流浸膏用甲醇溶液溶解，超声后过滤，将滤液稀释得到样品溶液，采用反相C18填料进行柱层析分离提纯，然后经浓度为20％～30％的甲醇洗脱除去杂质后，再用浓度为30％～60％的甲醇洗脱，压力0.3-0.5MPa，收集洗脱液，合并，浓缩，即得含有冷水七皂苷类活性成分的组合物；

(4)动态轴向压缩柱分离纯化皂苷单体：用C18填料填装动态轴向压缩柱，用流动相持续冲洗动态轴向压缩柱直到色谱仪基线平稳；将稀释好的经中压C18柱初步纯化的冷水七皂苷类活性成分样品溶液过滤后，注入平衡后的动态轴向压缩柱，压力3-5MP a，等度洗脱，洗脱液为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝30-50％：5-20％：30-65％(V/V/V)，用紫外检测器检测样品分离情况；根据保留时间和色谱峰高度鉴定，确定每种冷水七三萜皂苷单体的起止收集时间，其中，t_R＝11-19min，收集冷水七皂苷D(Impatiprinoside D)、t_R＝21-30min，收集冷水七皂苷G(Impatienoside G)、t_R＝32-40min，收集冷水七皂苷E(Impatiprinoside E)、t_R＝50-60min，收集东风菜皂苷A₂(scaberoside A₂)四种单体，将收集到的每种皂苷单体溶液分别减压浓缩，除去溶剂；

所述冷水七皂苷D(Impatiprinoside D)，冷水七皂苷G(Impatienoside G)，冷水七皂苷E(Impatiprinoside E)，东风菜皂苷A₂(scaberoside A₂)单体的结构式分别如下：

2.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述步骤(1)的纯水提取时间2-4小时，提取温度80～95℃。

3.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述步骤(1)的提取次数为3次以上，沉降时间为20-30小时。

4.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述步骤(2)中洗脱除杂用乙醇用量体积为树脂体积的3-10倍，解析用乙醇用量为树脂体积的2-8倍，洗脱和解析流速为50-150L/h。

5.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中用配制的流动相30％～100％的甲醇将滤液稀释成浓度为0.5～1.0g/ml的样品溶液。

6.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中：C18填料的粒径为20-60μm。

7.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：步骤(4)中填料的装填方法为：将C18填料加入匀浆试剂甲醇，设定DAC色谱柱系统压力10MP a，室温下超声并搅拌得匀浆液，将匀浆液送入动态轴向压缩柱，排除流动相后压实色谱柱填料，完成装填。

8.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中C18填料的粒径为10-20μm。

9.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中紫外检测器的波长为205nm或210nm。

10.根据权利要求1所述的用动态轴向压缩柱制备冷水七三萜皂苷单体的方法，其特征在于：所述步骤(4)的洗脱流速为50-150ml/min；所述步骤(4)中的流动相持续冲洗动态轴向压缩柱时间为15-20分钟。

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