CN101274953B - 从植物中提制科罗索酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从植物中提制科罗索酸(corosolic acid)的方法，包括水溶性物质的水煮除杂、总三萜酸的碱性有机溶剂提取和科罗索酸的大孔吸附树脂富集纯化步骤：以含有科罗索酸的植物为原料，纯水煮沸去除水溶性物质；滤渣采用碱性的30～60％乙醇或甲醇水溶液提取总三萜酸、在pH 4.5～7.5条件下沉淀分离制得总三萜酸粗品；总三萜酸粗品经85～100％乙醇或甲醇充分溶解并去除不溶物，滤液经大孔吸附树脂的吸附与洗脱，调整科罗索酸洗脱液中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，在此条件下沉淀分离制得科罗索酸。本发明制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产、生产成本低，具有较大推广性。

Description

从植物中提制科罗索酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从植物中提取药用活性成分的绿色化学生产方法，更具体涉及一种从植物中提制科罗索酸的可工业化生产的方法。

背景技术

科罗索酸(Corosolic acid)属于五环三萜酸类化合物，为熊果酸(Ursolic acid)的衍生物。与熊果酸相比，科罗索酸在2位碳上多了一个α羟基，通常又称2α-羟基熊果酸。

由于科罗索酸结构复杂，人工合成困难，国内外均自中草药或植物中提取。科罗索酸纯品为白色结晶性粉末，熔点242～244℃，无臭，无味，可溶于热乙醇等极性有机溶剂，微溶于氯仿、乙醚等脂溶性溶剂，不溶于石油醚和水中。

            科罗索酸(Corosolic acid)的化学结构示意图

国内已有多个学者对植物中三萜酸及其科罗索酸进行了分离纯化，但国外尚未见报道。枇杷叶富含科罗索酸、熊果酸等三萜酸类物质，性微寒，味苦辛，止咳平喘，清肺和胃，降气化痰，收载于历版中国药典。枇杷叶三萜酸类物质具有消炎平喘、增强免疫、降糖、抗癌等临床药理作用，是治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想药物，且毒副作用小。

中国专利申请200710009556.7，陈剑锋等报道了从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，其做法是：采用80～100％亲水性有机溶剂水溶液，于50～80℃提取总三萜酸，在碱性条件下，趁热过滤除杂和活性炭脱色，枇杷叶提取液采用大孔吸附树脂富集纯化科罗索酸，但该方法生产步骤繁琐、活性炭脱色过程科罗索酸损失率较大，枇杷叶提取液的粘度和水溶性杂质含量很高，严重限制了大孔吸附树脂对科罗索酸的吸附量和选择性，导致科罗索酸总收率较小、生产总成本剧高不下、制备的科罗索酸纯度偏低。

陈龙胜等仅考察了溶剂萃取条件对科罗索酸提取率的影响(陈龙胜等，林产化学与工业，2006，26(3)，110)，但科罗索酸的分离纯化工艺尚未成熟。

大叶紫薇提取物具有降糖、降脂、抗肿瘤等功能，其降血糖的主要药效成分为科罗索酸。纵伟等采用2次制备薄层层析分离法，从大叶紫薇叶中提取了corosolic acid，并且采用HPLC法对大叶紫薇叶中corosolicacid含量进行了测定(纵伟等，热带作物学报，2006，27(2)，103)。中国专利ZL 200410064929.7，孙宏斌等报道了科罗索酸的化学合成制备方法。

中药溪黄草为民间习用草药，用于治疗湿热泻痢、跌打瘀肿、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎等疾病。其主要成分有溪黄草甲素(rabdoserrin A)，溪黄草乙素(rabdoserrin B)，2α-羟基熊果酸，熊果酸等。吴剑峰等采用HPLC法测定GAP基地不同施肥区域和不同采收期溪黄草药材中2α-羟基熊果酸的含量变化，(吴剑峰等，药学进展，2004，28(7)，318；吴剑峰等，中草药，2004，35(1)，81)。

发明内容

本发明的目的是提供一种从植物中提制科罗索酸的方法。该方法不仅制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产，而且制备的科罗索酸纯度高、生产成本低，适合工业化大规模生产。

本发明的植物中提制科罗索酸的方法：以含有科罗索酸的植物为原料，采用5～10倍植物干重的纯水或自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入5～10倍植物干重的30～60％乙醇或甲醇水溶液，加入溶液重量的0.5～1.0％的NaOH或KOH调节溶液pH值，于30～48℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至4.5～7.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品；于50～75℃条件下，用不低于3倍重量的85～100％乙醇或甲醇水溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到0.5～2.5g/L、乙醇或甲醇终浓度为30～40％、NaOH或KOH终浓度为0.2～0.5％后，滤液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于3倍树脂重量的纯水或自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂重量的40～50％乙醇或甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不少于3倍树脂重量的60～70％乙醇或甲醇水溶液，在中性条件下以0.5～1.5倍树脂重量/小时的流速洗脱科罗索酸，调整洗脱液体系中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、固液分离沉淀物即为科罗索酸。

本发明的显著优点是：

一、与已有的文献相比，本发明根据科罗索酸的水不溶性特点，巧妙地采用了水煮除杂的方式，可预先除去大部分的蛋白质、多糖、酚类物质和无机盐等水溶性杂质，却不影响科罗索酸的回收率，这有助于降低后续总三萜酸的碱性有机溶剂提取液的粘度和水溶性杂质含量，可大幅度提高大孔吸附树脂对科罗索酸的饱和吸附量和选择性，制备的科罗索酸纯度更高、生产成本更低。

二、与已有的文献相比较，本发明创新性地利用了科罗索酸等三萜酸在强碱性条件下可溶于30～60％乙醇或甲醇水溶液、而在pH值≤7.5条件下却不溶于30～60％乙醇或甲醇水溶液的特点，不采用工艺繁琐和收率较低的层析分离技术和活性炭脱色技术，而直接采用酸性条件下沉淀分离方式去除杂质，获得高纯度的总三萜酸粗品，具有较大的推广意义。

三、与已有的文献的采用80～100％亲水性有机溶剂水溶液于50～80℃条件下提取时枇杷叶提取液的粘度和水溶性杂质含量很高相比，本发明独创性地应用了低温时30～60％乙醇或甲醇水溶液对蛋白质、多糖、精油、无机盐等杂质的溶解度较小，可以大幅度降低枇杷叶提取液的粘度和水溶性杂质含量，以及30～60％乙醇或甲醇水溶液在强碱性条件下对枇杷叶中科罗索酸的溶解度可高达2.0g/L，远远大于已有文献的采用80～100％亲水性有机溶剂水溶液的0.5g/L溶解度水平的特点，采用碱性的30～60％乙醇或甲醇水溶液从植物中提取科罗索酸，更利于后续进一步的分离纯化获得高纯度科罗索酸、生产成本更低，具有较大的推广性。

四、本发明充分利用大孔吸附树脂对科罗索酸的吸附力与对蛋白质、多糖、酚类物质、无机盐等杂质的吸附力的不同，以及在强碱性的30～60％乙醇或甲醇水溶液中科罗索酸成分与蛋白质、多糖、无机盐等杂质的溶解度差异，真正达到科罗索酸与杂质的高效分离。

五、本发明组合采用水溶性物质的水煮除杂、总三萜酸的碱性有机溶剂提取和科罗索酸的大孔吸附树脂富集纯化等一系列分离纯化集成技术，从植物中制备高纯度科罗索酸，具有理论新颖、技术合理、操作安全、工艺简便、经济可行、环境友好等优点。

具体实施方式

含有科罗索酸的植物为原料，采用5～10倍植物干重的纯水或自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入5～10倍植物干重的30～60％乙醇或甲醇水溶液，加入溶液重量的0.5～1.0％的NaOH或KOH调节溶液pH值，于30～48℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至4.5～7.5静置陈化，固液分离沉淀物即为总三萜酸粗品；于50～75℃条件下，用不低于3倍重量的85～100％乙醇或甲醇水溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到0.5～2.5g/L、乙醇或甲醇终浓度为30～40％、NaOH或KOH终浓度为0.2～0.5％后，滤液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于3倍树脂重量的纯水或自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂重量的40～50％乙醇或甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不少于3倍树脂重量的60～70％乙醇或甲醇水溶液，在中性条件下以0.5～1.5倍树脂重量/小时的流速洗脱科罗索酸，调整洗脱液体系中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、固液分离沉淀物即为科罗索酸。

上述总三萜酸是熊果酸类化合物或齐墩果酸类化合物中的一种或几种化合物。

上述含有科罗索酸的植物是枇杷叶、大叶紫薇叶、溪黄草、番石榴叶的一种或几种。

上述浸膏可用于进一步制备具有化痰、止咳、平喘、消炎、抗病毒或降血糖作用的口服药剂。

本发明理化参数测定方法如下：

总三萜酸、科罗索酸、熊果酸、山楂酸和齐墩果酸的含量采用高效液相色谱仪测定。测定条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-Pak C₁₈色谱柱(Φ3.9×150mm，5μm)，流动相为甲醇-1％醋酸水溶液(88∶12)(V/V)，流速1.0mL/min，柱温34℃，进样量20μL，检测波长分别为220nm。熊果酸和齐墩果酸标准品(纯度99％，中国药品生物制品检定所)，科罗索酸和山楂酸标准品(纯度95％，美国Sigma公司)。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

将鲜枇杷叶水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过20～30目筛得粉末，将4.9kg枇杷叶粉末放入提取罐中，采用10倍枇杷叶干重的纯水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入10倍枇杷叶干重的30％乙醇水溶液，加入溶液重量的1.0％的NaOH调节溶液pH值，于48℃条件下提取3小时，过滤，滤液调节pH值至7.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品，其中科罗索酸的提取率可达96.3％；于65℃条件下，用3倍重量的95％乙醇溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到2.0g/L、乙醇终浓度为35％、NaOH终浓度为0.3％后，滤液经HZ818大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用4倍树脂体积量的纯水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和3倍树脂体积量的50％乙醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用4倍树脂体积量的70％乙醇水溶液、在中性条件下以1倍树脂体积量/小时的流速洗脱科罗索酸；用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中乙醇浓度达42％和pH值为6.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，固液分离沉淀物即为科罗索酸。

实施例2

将5.3kg大叶紫薇叶粉末放入提取罐中，加入5倍大叶紫薇叶干重的自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入10倍大叶紫薇叶干重的60％甲醇水溶液，加入溶液重量的0.5％的KOH调节溶液pH值，于30℃条件下提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至4.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品，其中科罗索酸的提取率可达91.9％；于50℃条件下，用6倍重量的100％甲醇充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到2.5g/L、甲醇终浓度为40％、KOH终浓度为0.2％后，滤液经HZ801大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用3倍树脂体积量的自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和4倍树脂体积量的45％甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用3倍树脂体积量的60％甲醇水溶液，在中性条件下以0.5倍树脂体积量/小时的流速洗脱科罗索酸；用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中甲醇浓度达38％和pH值为5.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、

过滤，固液分离沉淀物即为科罗索酸。

实施例3

将6.1kg溪黄草粉末放入提取罐中，加入8倍溪黄草干重的自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入5倍溪黄草干重的35％甲醇水溶液，加入溶液重量的0.8％的NaOH调节溶液pH值，于50℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至6.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品，其中科罗索酸的提取率可达95.1％；于50℃条件下，用8倍重量的90％甲醇充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到1.6g/L、甲醇终浓度为38％、KOH终浓度为0.3％后，滤液经HZ806大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用3倍树脂体积量的自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和2倍树脂体积量的40％甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用5倍树脂体积量的65％甲醇水溶液，在中性条件下以1.5倍树脂体积量/小时的流速洗脱科罗索酸；用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中甲醇浓度达50％和pH值为6.5，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，固液分离沉淀物即为科罗索酸。

实施例4

将6.5kg番石榴叶粉末放入提取罐中，加入6倍番石榴叶干重的自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入8倍番石榴叶干重的40％乙醇水溶液，加入溶液重量的0.5％的NaOH调节溶液pH值，于45℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至5.5静置陈化，固液分离沉淀物即为总三萜酸粗品，其中科罗索酸的提取率可达93.2％；于75℃条件下，用5倍重量的85％乙醇溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到0.5g/L、乙醇终浓度为38％、NaOH终浓度为0.5％后，滤液经D101大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用5倍树脂体积量的纯水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和6倍树脂体积量的48％乙醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用6倍树脂体积量的68％乙醇水溶液、在中性条件下以0.8倍树脂体积量/小时的流速洗脱科罗索酸；用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中乙醇浓度达45％和pH值为7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，固液分离沉淀物即为科罗索酸。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

Claims (4)

1.一种从植物中提制科罗索酸的方法，其特征在于：以含有科罗索酸的植物为原料，采用5～10倍植物干重的纯水或自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入5～10倍植物干重的30～60％乙醇或甲醇水溶液，加入溶液重量的0.5～1.0％的NaOH或KOH调节溶液pH值，于30～48℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至4.5～7.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品；于50～75℃条件下，用不低于3倍重量的85～100％乙醇或甲醇水溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到0.5～2.5g/L、乙醇或甲醇终浓度为30～40％、NaOH或KOH终浓度为0.2～0.5％后，滤液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于3倍树脂重量的纯水或自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂重量的40～50％乙醇或甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不少于3倍树脂重量的60～70％乙醇或甲醇水溶液，在中性条件下以0.5～1.5倍树脂重量/小时的流速洗脱科罗索酸，调整洗脱液体系中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、固液分离沉淀物即为科罗索酸。

2.根据权利要求1所述的从植物中提制科罗索酸的方法，其特征在于：所述总三萜酸是熊果酸类化合物或齐墩果酸类化合物中的一种或几种化合物。

3.根据权利要求1所述的从植物中提制科罗索酸的方法，其特征在于：所述浸膏可用于进一步制备具有化痰、止咳、平喘、消炎、抗病毒或降血糖作用的口服药剂。

4.根据权利要求1所述的从植物中提制科罗索酸的方法，其特征在于：所述的含有科罗索酸的植物为枇杷叶、大叶紫薇叶、溪黄草、番石榴叶中的一种或几种。