CN102911185B - 一种从银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯a、b、c及白果内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯A、B、C及白果内酯的方法，该方法包括提取、柱层析、萃取、重结晶等步骤，其中，所述的柱层析步骤是用经提取步骤制得的提取液，以每1ml提取液加1～3ml聚酰胺材料的比例过聚酰胺吸附柱，再以纯化水洗涤，收集上样流出液和水洗液；减压浓缩后进行分步结晶，得到粗晶后再进行重结晶，分别得到纯度高于90%的银杏内酯A、B、C及白果内酯单体化合物。本方法步骤简单、操作方便、成本低廉、污染较少，可用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于中药制备技术领域，具体涉及一种从银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯A、B、C及白果内酯的方法。
背景技术
银杏是我国特有物种，资源拥有量占世界总量的70%，在我国已有六百多年的药用历史，同时它也是西方国家研究最多的天然植物之一，其中银杏叶提取物以其在心脑血管等老年性疾病方面的治疗与保健作用成为国际市场上最受追捧的植物药制剂。
内酯类化合物是银杏叶提取物中的主要活性成分，包括银杏内酯和白果内酯。其中银杏内酯类成分具有特异性的抗血小板活化因子（PAF）作用，被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂，对心血管系统具有保护作用，是银杏叶提取物治疗冠心病、预防心肌缺血再灌注损伤以及抗心律失常的重要活性成分。白果内酯对神经系统具有较强的保护作用，可剂量依赖地保护神经元损伤、抑制神经细胞凋亡、促进神经细胞生长，同时能够增加脑血流量，改善脑代谢，对缺血性脑水肿及老年性痴呆症具有较好的治疗作用。
但银杏内酯类化合物结构复杂，目前很难用化学合成的方法制备，且成本高昂。而各内酯类成分的极性差异小，分离纯化到纯度较高的单体化合物比较困难。目前国内的银杏内酯类成分的富集纯化方法主要有醇提-有机溶剂萃取-柱色谱分离或者采用CO2超临界流体萃取法、中压制备柱或液相制备等，大多设备要求较高或工艺步骤复杂、成本高、污染大，很难实现工业化生产。如公开号为1634925 A的专利申请公开了一种银杏内酯单体的分离纯化方法，该法以银杏总内酯为原料，采用了柱色谱-重结晶-超临界CO2精制纯化的组合工艺。公开号为CN101392000A的专利申请公开了一种银杏内酯单体的分离纯化方法，该法以银杏叶提取物为原料，通过多步有机溶剂萃取后经高效液相制备所得。公开号为101747338 A的专利申请公开了一种银杏内酯类化合物制备方法，该法以银杏叶或银杏叶提取物为原料，通过水提及有机溶剂萃取后上硅胶柱，分别收集各内酯流份，再进行重结晶。公开号为CN102416027A的专利申请公开了利用高效液相色谱法纯化银杏内酯的方法，该法流动相选自体积比为55:40:5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，流速为26ml/min，上样量为120mg，制备出纯度大于98%的四种内酯。公开号为102526025A的专利公开了以苯乙烯型非极性大孔吸附树脂分离银杏内酯A、B、C的方法。公开号CN101134758公开了一种制备银杏内酯单体的方法，该方法以银杏叶为原料，通过醇提、乙酸乙酯萃取，萃取物过选择性极性无孔吸附树脂，制得银杏总内酯，总内酯再过硅胶柱后分别收集各内酯流份并重结晶获得各内酯单体。公开号为CN102552340A的专利公开了一种制备银杏内酯单体的方法，该方法以银杏叶提取物为原料，通过上聚酰胺柱、洗脱液静置沉淀、有机溶剂提取沉淀后重结晶得到内酯混合物，混合物再通过上中压制备柱得到各内酯单体。
银杏内酯高纯度单体化合物的富集纯化，将有利于此类药物新剂型的研究与开发以及制剂的质量控制，同时针对不同病因给药，有利于提高疗效、降低毒副作用。但到目前为止，还没有特别适合工业化生产的工艺简单、操作方便、成本低廉的银杏内酯类化合物单体的制备工艺。
发明内容
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种从银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯A、B、C及白果内酯的方法，该方法包括以下步骤：
a）取银杏叶提取物加入热水后搅拌或超声溶解、过滤，残渣再用热水溶解3～5次，过滤，合并滤液；
b）调整滤液的相对密度；
c）以每1ml样品溶液加1～3ml聚酰胺材料的比例，将制得的滤液通过聚酰胺柱吸附，上样完毕后，用2～3倍柱体积纯化水洗脱，收集上样流出液和水洗液；
d）将上样流出液和水洗液合并，减压浓缩，冷藏静置，分步结晶，得到银杏内酯粗品；
e）步骤d）分步结晶后的母液，减压浓缩至原体积的1/60～1/40，用中等极性有机溶剂萃取2～3次，有机相合并后减压浓缩，浓缩液挥干溶剂，残渣用含水乙醇结晶，得到白果内酯粗品；优选的，步骤d）分步结晶后的母液，减压浓缩至原体积的1/60～1/50。
f）上述银杏内酯和白果内酯粗品用含水乙醇重结晶1～3次，可以分别得到银杏内酯A、B、C及白果内酯单体化合物。
上述的方法，其在于步骤a）中所述热水的温度优选为55～70℃。
上述的方法，其在于步骤b）中所述滤液的相对密度调整为1.01～1.03。
上述的方法，其在于步骤c）中所述的聚酰胺材料为14～60目，优选30～60目。
上述的方法，其在于步骤d）中所述分步结晶的次数为3次，第一次将上样流出液和水洗液合并后，减压浓缩至原体积的1/15～1/10；第二次将抽滤后的结晶母液浓缩至原体积的1/25～1/20；第三次将抽滤后的结晶母液浓缩至原体积的1/40～1/30。上述分步结晶过程中：第一次结晶所得的银杏内酯粗品主要为银杏内酯A、B混合物；第二次结晶所得的银杏内酯粗品主要为银杏内酯A、B混合物，以银杏内酯A为主；第三次结晶所得的银杏内酯粗品主要为银杏内酯A、B、C混合物，以银杏内酯C为主。
上述的方法，其在于步骤d）中每次结晶的时间为8～24h，优选12～18h。
上述的方法，其在于步骤e）中所述的中等极性有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯，优选乙酸乙酯。所述的结晶时间为12～48h。
上述的方法，其在于步骤e）和f）中所述的含水乙醇，乙醇体积百分比为40%～85%，优选50%～70%。
上述的方法，其在于所制备的银杏内酯A、B、C及白果内酯的纯度高于90%，可作为药品、保健品的原料。
上述技术方案的具体详细过程为：
1、取银杏叶提取物，加热水溶解，过滤，滤渣继续用热水溶解3～5次，滤过，合并，滤液调整相对密度至1.01～1.03；
2、将制得的滤液，以每1ml滤液加1～3ml聚酰胺材料的比例，通过聚酰胺柱吸附，上样完毕后，用2～3倍柱体积纯化水洗脱，收集上样流出液和水洗液；
3、合并上样流出液及水洗液，减压浓缩至原体积的1/15～1/10，浓缩液冷藏静置8～24h；抽滤晶体（晶体主要为银杏内酯A、B混合物）后，结晶母液浓缩至原体积的1/25～1/20，继续冷藏静置8～24h；抽滤晶体（晶体主要为银杏内酯A、B混合物，以银杏内酯A为主）后，结晶母液浓缩至原体积的1/40～1/30，继续冷藏静置8～24h，抽滤晶体（晶体主要为银杏内酯A、B、C混合物，以银杏内酯C为主）。
4、经三次结晶后的母液浓缩至原体积的1/60～1/40，用中等极性有机溶剂萃取2～3次，合并有机相，减压浓缩，挥干溶剂，残渣用含水乙醇结晶，得到白果内酯粗品。
上述萃取有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯，优选乙酸乙酯；含水乙醇的乙醇体积百分比为40%～85%，优选50%～70%。
5、所得晶体分别用含水乙醇重结晶1～3次，得到纯度高于90%的银杏内酯A、B、C及白果内酯单体。
上述含水乙醇的乙醇体积百分比为40%～85%，优选50%～70%。
本发明所述冷藏的冷藏温度为2～8℃。
本发明所述的原体积为上样流出液和水洗液合并的体积。
与现有技术比较本发明的有益效果：
相对于现有技术路线和工艺，本发明只需一次过柱后再重结晶，该法步骤简单、生产成本低、污染较少，能实现工业化生产，所得到的内酯类成分纯度均高于90%，可作为药品和保健品的原料。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作详细说明，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和应用的技术手段，但本发明不限于所述实施例。
银杏叶提取物采购于江苏邳州，按照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部 附录VI D）及中国药典2010年版一部“银杏叶提取物”项中“含量测定”法测定。其中银杏内酯A含量2.32%，银杏内酯B含量0.95%，银杏内酯C含量1.40%，白果内酯含量3.32%，符合规定。
实施例1：
取干燥银杏叶提取物1kg，以65℃热水搅拌溶解，滤过，滤渣再以热水溶解3次，滤过，合并滤液。滤液加纯化水稀释至15L，相对密度1.01，备用。取预先处理好的30～60目聚酰胺材料，湿法装柱，柱体积为30L。上样液过聚酰胺柱，上样结束后，以60L纯化水洗脱，收集上样流出液和水洗液，共75L，合并，减压浓缩至6L。浓缩液冷藏静置18h，抽滤得到粗晶I，重量为16.9g，其中银杏内酯A含量为33.3%，银杏内酯B含量为36.2%；过滤后母液浓缩至3.5L，继续冷藏静置14h，抽滤得到粗晶II，重量为20.3g，其中银杏内酯A含量为48.2%，银杏内酯B含量为7.2%；过滤后母液再浓缩至2.4L，继续冷藏静置10h，抽滤得到粗晶III，重量为19.6g，其中银杏内酯A含量为12.1%，银杏内酯B含量为3.6%，银杏内酯C含量为42.3%；过滤后母液浓缩至1.4L，以等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩后挥干溶剂，所得萃取物以60%乙醇溶解后静置24h，抽滤得到粗晶IV，重量为40.3g，其中白果内酯含量为69.8%，。粗晶I以70%乙醇重结晶2次，得到银杏内酯B 4.9g，含量为92.4%；粗晶II以60%乙醇重结晶2次，得到银杏内酯A 8.3g，含量为97.1%；粗晶III以55%乙醇重结晶3次，得到银杏内酯C 6.8g，含量为93.8%；粗晶IV以60%乙醇重结晶1次，得到白果内酯 25.1g，含量为98.3%。
上述的含量测定方法按照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）及中国药典2010年版一部“银杏叶提取物”项中“含量测定”法测定。
实施例2：
取干燥银杏叶提取物2kg，以70℃热水超声溶解，滤过，滤渣再以热水溶解5次，滤过，合并滤液。滤液加纯化水稀释至25L，相对密度1.02，备用。取预先处理好的30～60目聚酰胺材料，湿法装柱，柱体积为60L。上样液过聚酰胺柱，上样结束后，以150L纯化水洗脱，收集上样流出液和水洗液，共175L，合并，减压浓缩至约12.5L。浓缩液冷藏静置24h，抽滤得到粗晶I，重量为35.1g，其中银杏内酯A含量为31.4%，银杏内酯B含量为35.9%；过滤后母液浓缩至约7L，继续冷藏静置12h，抽滤得到粗晶II，重量为39.2g，其中银杏内酯A含量为50.3%，银杏内酯B含量为6.9%；过滤后母液浓缩至约4.5L，继续冷藏静置18h，抽滤得到粗晶III，重量为41.0g，其中银杏内酯A含量为11.9%，银杏内酯B含量为1.9%，银杏内酯C含量为46.2%；过滤后母液浓缩至约3L，以同等体积乙酸甲酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩后挥干溶剂，所得萃取物以55%乙醇溶解后静置20h，抽滤得到粗晶IV，重量为78.3g，其中白果内酯含量为65.3%。粗晶I以70%乙醇重结晶3次，得到银杏内酯B9.9g，含量为93.2%；粗晶II以60%乙醇重结晶2次，得到银杏内酯A18.1g，含量为96.0%；粗晶III以55%乙醇重结晶3次，得到银杏内酯C17.3g，含量为94.1%；粗晶IV以70%乙醇重结晶1次，得到白果内酯46.5g，含量为98.8%。
上述的含量测定方法按照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）及中国药典2010年版一部“银杏叶提取物”项中“含量测定”法测定。
Claims (9)
1.一种从银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯A、B、C及白果内酯的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)取银杏叶提取物加入热水后搅拌或超声溶解、过滤，残渣再用热水溶解3～5次，过滤，合并滤液；
b)调整滤液的相对密度；
c)以每1ml样品溶液加1～3ml聚酰胺材料的比例，将制得的滤液通过聚酰胺柱吸附，上样完毕后，用2～3倍柱体积纯化水洗脱，收集上样流出液和水洗液；
d)将上样流出液和水洗液合并，减压浓缩，冷藏静置，分步结晶，得到银杏内酯粗品；
e)步骤d)分步结晶后的母液，减压浓缩至原体积的1/60～1/40，用中等极性有机溶剂萃取2～3次，有机相合并后减压浓缩，浓缩液挥干溶剂，残渣用含水乙醇结晶，得到白果内酯粗品；
f)上述银杏内酯和白果内酯粗品用含水乙醇重结晶1～3次，可以分别得到银杏内酯A、B、C及白果内酯单体化合物；
步骤d)中所述的分步结晶次数为3次，第一次将上样流出液和水洗液合并后，减压浓缩至原体积的1/15～1/10；第二次将抽滤后的结晶母液浓缩至原体积的1/25～1/20；第三次将抽滤后的结晶母液浓缩至原体积的1/40～1/30；3次分步结晶得到的银杏内酯粗品依次分别为粗晶I、粗晶II、粗晶III；
步骤e)中所述含水乙醇的乙醇体积百分比为60％，结晶后所得到的白果内酯粗品为粗晶IV；
步骤f)中所述的含水乙醇为粗晶I、粗晶II、粗晶III、粗晶IV的重结晶溶剂，乙醇体积百分比分别为70％、60％、55％、60％，通过重结晶处理，可分别得到银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C及白果内酯单体化合物；
步骤a)中所述的热水温度为55～70℃；
步骤e)中所述的中等极性有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述滤液的相对密度调整为1.01～1.03。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的聚酰胺材料为14～60目。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的聚酰胺材料为30～60目。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中每次的结晶时间为8～24h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于每次的结晶时间为12～18h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中等极性有机溶剂为乙酸乙酯。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)中所述的结晶时间为12～48h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所制备的银杏内酯A、B、C及白果内酯的纯度高于90％，可作为药品、保健品的原料。
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