CN101143887B - 从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从枇杷叶中分离制备科罗索酸(corosolic acid)的方法，包括枇杷叶总三萜酸的分离制备、科罗索酸的树脂富集纯化和科罗索酸的结晶纯化等。该制备方法的特征在于：以枇杷叶为原料，采用亲水性有机溶剂水溶液提取枇杷叶总三萜酸，在碱性条件下，趁热过滤除杂和活性炭脱色，提取液采用大孔吸附树脂富集纯化科罗索酸，科罗索酸粗品进一步采用亲水性有机溶剂结晶和重结晶，制得高纯度科罗索酸晶体。经测定，白色科罗索酸晶体的纯度≥98％。本发明制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产、制备的科罗索酸纯度高、生产成本低，具有现代中药的的“三高”、“三小”和“三便”等优点，具有较大推广性。

Description

从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从植物中提取药用活性成分的绿色化工生产方法，更具体涉及从枇杷叶中分离制备具有降血糖和抗癌功能的可工业化应用的科罗索酸(corosolic acid)的方法。

背景技术

科罗索酸(Corosolic acid)属于五环三萜酸类化合物，为熊果酸(Ursolic acid)的衍生物。与熊果酸相比，科罗索酸2位碳上多了一个α羟基，通常又称2α-羟基熊果酸。二者的化学结构示意图分别如下：

科罗索酸(Corosolic acid)的化学结构示意图

熊果酸(Ursolic acid)的化学结构示意图

近年研究结果发现，大叶紫薇提取物具有降糖、降脂、抗肿瘤和抗氧化等功能，其降血糖的主要药效成分为科罗索酸，但在大叶紫薇植物中科罗索酸的含量仅0.01％，在大叶紫薇提取物中科罗索酸的含量也仅为1％左右，目前市售的保健品Glucosol所含科罗索酸的含量即为1％，由于科罗索酸在大叶紫薇植物中的低含量将在一定程度上限制其在医疗保健领域的广泛应用，中国专利ZL 200410064929.7，孙宏斌等报道了科罗索酸的化学合成制备方法。美国专利US 6485760和US 6716459分别报道了采用大叶紫薇提取物降血糖的方法和配方。

近现代药理药效学研究表明，科罗索酸可通过兴奋葡萄糖的转运通道，促进细胞对葡萄糖的吸收和利用，具有降血糖的功效(Murakami等，Chem.Pharm.Bull.1993，41，2129；Miura等，Bio.Pharm.Bull.2004，27，1103)。科罗索酸对葡萄糖转运的兴奋作用类似于胰岛素，因此，科罗索酸也被称为“植物胰岛素”。除了降血糖和减肥功能外，科罗索酸还具有抗炎、抗癌和抑制脱氧核糖核酸聚合酶活性等作用。作为防治肥胖症和II型糖尿病新药，科罗索酸在美国FDA已进入III临床药效学研究。

中国是世界上最主要的枇杷生产国，枇杷栽培面积和产量约占全球的2/3以上，福建莆田是中国枇杷的主产区(为福建省枇杷叶GAP药材基地)，现有枇杷种植面积16万亩，可年产枇杷叶5万多吨。

枇杷叶系蔷薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]的叶子，为药食同源的传统中药材，有止咳平喘、清肺和胃、降气化痰的功效，收载于历版中国药典。枇杷叶富含科罗索酸(0.4～1.25)、熊果酸(1.0～2.0％)和齐墩果酸(Oleanolic acid)等三萜酸类物质，枇杷叶中的熊果酸和科罗索酸含量在迄今发现的所有植物中位居前茅，综合利用中国丰富的枇杷叶资源制备熊果酸和科罗索酸具有十分重要的社会效益和经济价值。

国内已有多个研究者对枇杷叶中三萜酸及其熊果酸进行了分离纯化，但国外尚未见报道。中国专利申请200710008809.9，陈剑锋等报道了从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，中国公开专利CN1943647A，陈剑锋等报道了一种枇杷叶三萜酸提取物的制备方法。但枇杷叶中科罗索酸的分离纯化尚未成熟，仅陈龙胜等考察了溶剂萃取条件对科罗索酸提取率的影响(陈龙胜等，林产化学与工业，2006，26(3)，110)。

由于科罗索酸、熊果酸和齐墩果酸等三萜酸类物质的结构复杂，人工合成困难，国内外均自中草药或植物中提取。科罗索酸纯品为白色结晶性粉末，熔点242～244℃，无臭，无味，可溶于甲醇、乙醇等极性有机溶剂，微溶于氯仿、乙醚等脂溶性溶剂，不溶于石油醚和水中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，包括枇杷叶总三萜酸的分离制备、科罗索酸的树脂富集纯化和科罗索酸的结晶纯化等步骤。该制备方法采用亲水性有机溶剂提取、碱性除杂、活性炭脱色、大孔吸附树脂富集纯化，亲水性有机溶剂结晶和重结晶处理等一系列分离纯化集成技术，从枇杷叶中制备高纯度科罗索酸晶体，不仅制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产，而且制备的科罗索酸纯度高、生产成本低。

本发明的从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法包括枇杷叶总三萜酸的分离制备、科罗索酸的树脂富集纯化和科罗索酸的结晶纯化步骤，其特征在于：采用亲水性有机溶剂水溶液提取枇杷叶总三萜酸，在碱性条件下，趁热过滤除杂和活性炭脱色，提取液经减压回收部分溶剂、调整pH值、调整有机溶剂浓度和总三萜酸浓度后，采用大孔吸附树脂富集纯化科罗索酸，冷却结晶、冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。

本发明的显著优点是：

一：本发明采用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂作为亲水性有机溶剂从枇杷叶中提取科罗索酸，优点1：甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂的溶解性能好，对枇杷叶细胞的穿透能力强，更容易渗透到枇杷叶内部组织结构中，大大提高了枇杷叶中科罗索酸的溶出速率和提取效率；优点2：热的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂对枇杷叶中科罗索酸的溶解度很大，而对蛋白质、多糖、精油、无机盐等杂质的溶解度较小，更利于后续进一步的分离纯化获得高纯度科罗索酸。

二：本发明充分利用大孔吸附树脂对科罗索酸的吸附力与对蛋白质、多糖、无机盐等杂质的吸附力的不同，以及在亲水性有机溶剂水溶液中，科罗索酸为主要成分的枇杷叶总三萜酸与蛋白质、无机盐等杂质的溶解度差异，真正达到枇杷叶总三萜酸、尤其是科罗索酸与杂质的高效分离。

三：与已有的文献相比较，本发明充分利用科罗索酸可溶于甲醇和乙醇等极性有机溶剂、微溶于氯仿和乙醚等脂溶性溶剂、不溶于石油醚和水的特点，不采用硅胶柱层析技术，而直接采用亲水性有机溶剂萃取、结晶和重结晶处理等方式去除杂质，获得高纯度科罗索酸，具有较大的推广性。

四：本发明组合采用采用亲水性有机溶剂提取、碱性除杂、活性炭脱色、大孔吸附树脂富集纯化，亲水性有机溶剂结晶和重结晶处理等一系列分离纯化集成技术，从枇杷叶中制备高纯度科罗索酸晶体，具有理论新颖、技术合理、操作安全、工艺简便、经济可行、环境友好等优点。

具体实施方式

枇杷叶总三萜酸的分离制备方法是：以枇杷叶为原料，采用5～15倍枇杷叶干重(W/W)的80～100％亲水性有机溶剂水溶液，在pH值4～11条件下，于50～80℃提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤；滤液在pH值＞7的条件下静置陈化、过滤去除不溶物；滤液于50～80℃趁热进行活性炭脱色，过滤；滤液经减压回收部分溶剂后，调整pH值至8～12、亲水性有机溶剂浓度达20～50％和总三萜酸浓度为0.5～10.0g/L，其中科罗索酸浓度达0.2～5.0g/L。

科罗索酸的树脂富集纯化方法是：所述步骤中的枇杷叶总三萜酸溶液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于1倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂量(V/V)的25～55％亲水性有机溶剂水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不低于3倍量(W/W)的40～60％亲水性有机溶剂水溶液，在pH值8～12条件下，以1～3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入科罗索酸溶解度调节剂，控制洗脱液体系中亲水性有机溶剂终浓度≤50％和pH值≤7，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。

科罗索酸的结晶纯化方法是：50～80℃条件下，科罗索酸粗品用不低于3倍量(W/W)的亲水性有机溶剂充分萃取科罗索酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、室温条件下水洗，得科罗索酸结晶。

其中，科罗索酸结晶还可以进一步在室温条件下，用亲水性有机溶剂重结晶，分别用水和弱极性有机溶剂洗晶除杂，得高纯度科罗索酸晶体。

所用的科罗索酸溶解度调节剂为酸性的亲水性有机溶剂。

所用的亲水性溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。

所用的大孔吸附树脂骨架的化学组成可以是聚苯乙烯、聚丙烯酸或酚醛中的一种或几种。

所用的弱极性有机溶剂可以是石油醚、乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇中的一种或几种混合溶剂。

上述总三萜酸是熊果酸类化合物或齐墩果酸类化合物中的一种或几种化合物。

本发明所制备的枇杷叶总三萜酸中科罗索酸的纯度≥18％；科罗索酸粗品的纯度≥76％；科罗索酸结晶的纯度≥91％；最终制得的高纯度科罗索酸晶体的纯度≥98％。

本发明所制备的科罗索酸经熔点和光谱数据确证，与文献值一致(鞠建华等，中国药学杂志，2003，38，752；孙宏斌等，中国专利ZL200410064929.7)。

本发明理化参数测定方法如下：

枇杷叶总三萜酸、科罗索酸、熊果酸、山楂酸和齐墩果酸的含量采用高效液相色谱仪测定。测定条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-PakC₁₈色谱柱(Φ3.9×150mm，5μm)，流动相为甲醇-1％醋酸水溶液(88∶12)(V/V)，流速1.0mL/min，柱温34℃，进样量20μL，检测波长分别为220nm。熊果酸和齐墩果酸标准品(纯度99％，中国药品生物制品检定所)，科罗索酸和山楂酸标准品(纯度95％，美国Sigma公司)。

经测定，实验所用福建省莆田市出产的枇杷叶(含水量3.9％)中科罗索酸含量为4.6～12.5g/kg。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

以福建莆田产枇杷叶为原料，将鲜枇杷叶水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过20～30目筛得枇杷叶粉末，将5.2kg枇杷叶粉末放入提取罐中，采用15倍枇杷叶干重(W/W)的95％食用酒精，在pH值4条件下，于65℃提取3次，每次2小时，合并提取液，过滤；滤液用氢氧化钠调整pH值至9.0，于65℃静置陈化3小时，过滤去除不溶物后添加1kg活性炭于65℃脱色1小时，过滤。滤液用稀盐酸水溶液调整pH值至8.0、乙醇浓度达50％和总三萜酸浓度为0.5g/L，其中科罗索酸浓度达0.2g/L。

接着，滤液经HZ801大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用3倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和4倍树脂量(V/V)的25％乙醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用6倍量(W/W)的pH值为8.0的60％乙醇水溶液，以1倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分乙醇溶剂后，用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中乙醇浓度达32％(W/W)和pH值为3.6，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。经测定，科罗索酸粗品的纯度78.6％。

最后，于80℃条件下，科罗索酸粗品用6倍量(W/W)的95％乙醇水溶液充分萃取科罗索酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、31℃室温条件下水洗，得科罗索酸结晶；经测定，科罗索酸结晶的纯度达91.5％。科罗索酸结晶进一步在31℃条件下，用5倍量(W/W)的甲醇-乙醇(5∶3)重结晶，分别用6倍量(W/W)的水和石油醚洗晶除杂，得高纯度科罗索酸晶体。经测定，高纯度科罗索酸晶体纯度98.3％，枇杷叶中科罗索酸总回收率51.6％。

实施例2

先将4.6kg枇杷叶粉末放入提取罐中，采用10倍枇杷叶干重(W/W)的80％甲醇水溶液，在pH值11.0条件下，于50℃提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤；滤液于50℃静置陈化1小时、过滤去除不溶物后添加0.9kg活性炭于50℃脱色0.5小时，过滤。滤液在-0.05～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收部分甲醇溶剂后，用稀硫酸水溶液调整枇杷叶总三萜酸溶液的pH值至11.0、甲醇浓度达20％和总三萜酸浓度为4.0g/L，其中科罗索酸浓度达1.5g/L。

接着，滤液经D101大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用6倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和3倍树脂量(V/V)的38％甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用8倍量(W/W)的pH值为12.0的40％甲醇水溶液，以2倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分甲醇溶剂后，用含有稀硫酸的甲醇水溶液调整洗脱液体系中甲醇浓度达48％(W/W)和pH值为6.5，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。经测定，科罗索酸粗品的纯度79.2％。

最后，于50℃条件下，科罗索酸粗品用8倍量(W/W)的无水甲醇充分萃取科罗索酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、25℃条件下水洗，得科罗索酸结晶；经测定，科罗索酸结晶的纯度91.6％。科罗索酸结晶进一步在25℃条件下，用2倍量(W/W)的甲醇-丙酮(1∶1)重结晶2次，分别用2倍量(W/W)的水和乙酸乙酯洗晶除杂4次，得高纯度科罗索酸晶体。经测定，高纯度科罗索酸晶体纯度98.6％，枇杷叶中科罗索酸总回收率52.3％。

实施例3

先将6.3kg枇杷叶粉末放入提取罐中，采用5倍枇杷叶干重(W/W)的无水乙醇，在pH值7条件下，于80℃回流提取2小时，过滤；滤液用氢氧化钠调整pH值至12.0，于70℃静置陈化2小时、过滤去除不溶物后添加1.2kg活性炭于70℃脱色1.5小时，过滤；滤液在-0.05～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收部分乙醇溶剂后，用含有稀盐酸的乙醇水溶液调整pH值至12.0、乙醇浓度达40％和总三萜酸浓度为10.0g/L，其中科罗索酸浓度达5.0g/L。

接着，滤液经HZ816大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用1倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和2倍树脂量(V/V)的55％乙醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用9倍量(W/W)的pH值为11.0的50％乙醇水溶液，以3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分乙醇溶剂后，用浓盐酸调整洗脱液体系中乙醇浓度达50％(W/W)和pH值为7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。经测定，科罗索酸粗品的纯度76.9％。

最后，于70℃条件下，科罗索酸粗品用5倍量(W/W)的无水乙醇萃取科罗索酸2次，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、20℃条件下水洗，得科罗索酸结晶；经测定，科罗索酸结晶的纯度91.2％。科罗索酸结晶进一步在20℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇重结晶，用2倍量(W/W)的水饱和乙酸乙酯洗晶除杂3次，得高纯度科罗索酸晶体。经测定，高纯度科罗索酸晶体纯度98.2％，枇杷叶中科罗索酸总回收率52.1％。

实施例4

先将20～30目已脱脂处理的枇杷叶粉末4.5kg放入提取罐中，用15倍枇杷叶粉末干重(W/W)的85％乙醇水溶液，在pH值6.5条件下，于80℃条件下回流提取2小时，过滤；滤液用氢氧化钠调整pH值至10.5，75℃静置陈化2小时、过滤去除不溶物后添加0.9kg活性炭于75℃脱色1小时，过滤；滤液在-0.05～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收部分乙醇溶剂后，用含有稀盐酸的乙醇水溶液调整pH值至9.0、乙醇浓度达45％和总三萜酸浓度为6.5g/L，其中科罗索酸浓度达3.8g/L。

接着，滤液经HZ802大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用2倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和6倍树脂量(V/V)的35％乙醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用5倍量(W/W)的pH值为10.5的48％乙醇水溶液，以1倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；用稀盐酸水溶液调整洗脱液体系中乙醇浓度达45％(W/W)和pH值为6.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品。经测定，科罗索酸粗品的纯度80.2％。

最后，于75℃条件下，科罗索酸粗品用3倍量(W/W)的无水乙醇充分萃取科罗索酸3次，过滤，合并滤液，缓慢冷却滤液至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，15℃条件下水洗，得科罗索酸结晶；经测定，科罗索酸结晶的纯度93.1％。科罗索酸结晶进一步在15℃条件下，用3倍量(W/W)的甲醇重结晶3次，分别用2倍量(W/W)的水饱和乙醚洗晶除杂5次，得高纯度科罗索酸晶体。经测定，高纯度科罗索酸晶体纯度98.9％，枇杷叶中科罗索酸总回收率52.8％。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

Claims (3)

1.一种从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，包括枇杷叶总三萜酸的分离制备、科罗索酸的树脂富集纯化和科罗索酸的结晶纯化步骤，其特征在于：采用亲水性有机溶剂水溶液提取枇杷叶总三萜酸，在碱性条件下，趁热过滤除杂和活性炭脱色，提取液经减压回收部分溶剂、调整pH值、调整有机溶剂浓度和总三萜酸浓度后，采用大孔吸附树脂富集纯化科罗索酸，冷却结晶、冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品；制备的具体步骤包括：以枇杷叶为原料，采用5～15倍枇杷叶干重(W/W)的80～100％亲水性有机溶剂水溶液，在pH值4～11条件下，于50～80℃提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤；滤液在pH值＞7的条件下静置陈化、过滤去除不溶物；滤液于50～80℃趁热进行活性炭脱色，过滤；滤液经减压回收部分溶剂后，调整pH值至8～12、亲水性有机溶剂浓度达20～50％和总三萜酸浓度为0.5～10.0g/L，其中科罗索酸浓度达0.2～5.0g/L；所述的科罗索酸的树脂富集纯化方法是：所述步骤中的枇杷叶总三萜酸溶液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于1倍树脂量(V/V)的纯水洗去未被吸附的枇杷叶总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂量(V/V)的25～55％亲水性有机溶剂水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不低于3倍量(W/W)的40～60％亲水性有机溶剂水溶液，在pH值8～12条件下，以1～3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱科罗索酸；洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入科罗索酸溶解度调节剂，控制洗脱液体系中亲水性有机溶剂终浓度≤50％和pH值≤7，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得科罗索酸粗品；所述亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂；所述大孔吸附树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯、聚丙烯酸和酚醛中的一种或几种；所述科罗索酸溶解度调节剂为稀盐酸水溶液、稀硫酸甲醇水溶液或浓盐酸中的一种。

2.根据权利要求1所述的从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，其特征在于：所述的科罗索酸的结晶纯化方法是：50～80℃条件下，科罗索酸粗品用不低于3倍量(W/W)的亲水性有机溶剂充分萃取科罗索酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出科罗索酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、室温条件下水洗，得科罗索酸结晶；所述亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。

3.根据权利要求2所述的从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，其特征在于：所述步骤中的科罗索酸结晶进一步在室温条件下，用亲水性有机溶剂重结晶，分别用水和弱极性有机溶剂洗晶除杂，得高纯度科罗索酸晶体；所述亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂；所述的弱极性有机溶剂是石油醚、乙酸乙酯、乙醚、氯仿和正丁醇中的一种或几种混合溶剂。