CN103204894A - 新科罗索酸衍生物、其制备方法及其在制备糖尿病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物化学及医药技术领域，公开了通过新月旋孢腔菌Cochliobolus lunatus转化科罗索酸分离得到的化学结构通式为式(1)所示的两种新化合物1和2的结构及其提取分离方法和对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学及医药技术领域，包括从新月旋孢腔菌转化科罗索酸后得到的新科罗索酸衍生物的提取分离方法，结构鉴定及其对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。
背景技术
科罗索酸是一种乌苏烷型五环三萜类化合物，存在于大叶紫薇、枇杷和山楂等植物中。近年来研究发现，科罗索酸具有降血糖、减肥、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和抗心血管疾病等作用，尤其是有较好的降血糖活性，具有类似胰岛素的生理作用，被称为“植物胰岛素”，受到人们广泛关注。α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制小肠内α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，从而有效防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，从而可达到防治糖尿病及其并发症发生的目的。
发明内容
本发明的目的在于通过新月旋孢腔菌对科罗索酸进行结构修饰得到新化合物，并研究新化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
本发明是通过以下技术方案完成的，具体内容包括：微生物转化科罗索酸，2种转化产物的提取分离，结构鉴定和α-葡萄糖苷酶活性的测定。
(1)微生物转化科罗索酸
本发明采用微生物新月旋孢腔菌Cochliobolus lunatus R.R.Nelson&Haasis CGMCC3.4381对底物科罗索酸在适宜条件下进行转化。本发明所述的新月旋孢腔菌Cochlioboluslunatus R.R.Nelson&Haasis CGMCC 3.4381可以从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得。
(2)转化产物提取分离
本发明采用乙酸乙酯对微生物发酵液进行萃取得到菌液提取物，采用乙酸乙酯提取菌丝中的产物，二者合并后进行硅胶柱分离，采用不同比例的石油醚-四氢呋喃进行梯度洗脱，将洗脱液分别减压浓缩、干燥，分别得到2种新化合物的提取物。将2种提取物进行反复硅胶柱层析，并用Sephadex LH-20或者HPLC制备纯化，最终得到2个新化合物。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的内容并不局限于例举的实施例。
实施例1.
新化合物1和2的提取与分离
本发明采用乙酸乙酯对微生物发酵液进行萃取得到菌液粗提物，采用乙酸乙酯超声提取 菌丝中的产物，二者合并后进行硅胶柱分离，采用不同比例的石油醚-四氢呋喃进行洗脱，将洗脱液分别减压浓缩、干燥，得到新化合物1和2的提取物。提取物经过Sephadex LH-20凝胶柱无水乙醇洗脱和高效液相色谱制备(甲醇∶水＝65∶35等度洗脱)分离得到新化合物1和2。
实施例2
新化合物1结构鉴定
新化合物1为白色粉末，由HR-ESI-MS([M-H]-：487.3451)可知，化学式为C30H48O5
1H-NMR(Pyridine-d5，500MHz)谱中，显示该化合物有7个甲基氢信号，为三萜化合物角甲基特征信号分别为：δ0.99(3H，s，25-CH3)、δ1.06(3H，s，26-CH3)、δ1.09(6H，o，24-CH3)、δ1.09(3H，o，29-CH3)、δ1.23(3H，s，27-CH3)、δ1.29(3H，s，23-CH3)、δ1.41(3H，d，30-CH3)；低场处有一氢信号δ5.51(brs)，推测为双键上的氢。从13C-NMR(Pyridine-d5，500MHz)谱中可知该化合物有30个碳原子信号，其中3个碳原子为连氧碳原子信号，对比科罗索酸的谱图特征，推断为羟基碳信号。化合物含有一组双键碳信号δ126.6和δ139.7；有一个羧基碳原子信号δ179.7，综上信息可以判断该化合物为乌苏烷型五环三萜类化合物。结合HSQC谱和HMBC谱对化合物1中碳、氢原子的化学位移进行了归属(表1)。
HMBC谱图显示H-29(δ1.09)与C-18(δ53.9)，C-19(δ39.3)远程相关，H-30(δ1.41)与C-20(δ47.4)，C-21(δ71.1)有远程相关；H-22(δ1.77)，H-19(δ1.70)与C-21(δ71.1)相关。在HMBC中，1.29和1.09两个-CH3氢都和40.4的季碳相关，表明两个-CH3分别为4位季碳上的23、24位-CH3。羧基碳δ179.68和δ2.20、δ2.77两个氢相关，推断为碳16、18位的氢。季碳峰δ139.7是烯键季碳特征信号，为C-13；δ126.6是烯键叔碳特征信号，为C-12。次甲基峰δ84.4是3位叔碳信号。13C-NMR谱中C-21(δ71.1)，为连氧碳原子信号；HSQC谱中可知H-21(δ3.86)推断为羟基氢信号，在HMBC谱中，δ71.1与H-22(δ1.77)，H-19(δ1.70)远程相关，说明C-21连有羟基，H-21和H-22的耦合常数为11.0Hz，确定该羟基为β构型。综合以上信息确定化合物1在科罗索酸的结构上发生了21位羟基化。该化合物未见文献报道，为新化合物，命名为2α，3β，21β-三羟基-12-烯-28-乌苏酸。
表1化合物1的1H-NMR、13C-NMR及HMBC数据(Pyridine-d5，500MHz，δ，ppm)
实施例3
新化合物2结构鉴定
新化合物2为白色粉末，HR-ESI-MS([M-H]-：485.3290)，化学式为C30H46O5
1H-NMR(Pyridine-d5，500MHz)谱中，显示该化合物有7个甲基氢信号，为三萜化合物角甲基特征信号，分别为：δ 0.99(3H，s，24-CH3)、δ 1.02(3H，s，26-CH3)、δ 1.07(3H，d，29-CH3)、δ 1.09(3H，s，25-CH3)、δ 1.13(3H，s，27-CH3)、δ 1.17(3H，d，30-CH3)、δ 1.29(3H，s，23-CH3)；低场处有一氢信号5.56(brs)，推测可能是双键上的氢。从13C-NMR(Pyridine-d5，500MHz)谱中可知该化合物中有30个碳原子信号，其中3个碳原子为连氧碳原子信号，对比科罗索酸的谱图特征，推断为连羟基碳信号。化合物含有一组双键氢信号δ 127.2和δ 138.9；有一个羧基碳原子信号δ 178.0，综上信息可以判断该化合物为乌苏烷型五环三萜类化合物。结合HSQC谱对化合物2中碳、氢原子的化学位移进行归属，根据HMBC谱可以化合物2的碳、氢作进 一步归属(表2)。
对比化合物2和化合物1的1H-NMR和13C-NMR可以发现，化合物2中母核上21位的羟基(δ 71.1)信号变成了羰基(δ 210.4)信号，同时C-20和C-22分别向低场位移9.3 ppm和13.4ppm，其它信号未发生改变，以上表明化合物2是化合物1中的21位羟基化成羰基的产物。
该化合物未见文献报道，为新化合物，命名为2α，3β-二羟基-21-羰基-12-烯-28-乌苏酸。
表2化合物2的1H-NMR、13C-NMR及HMBC数据( Pyridine-d5，500MHz，δ，ppm)
实施例4
新化合物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用
本研究者采用4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物测定新化合物1和2对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。分别在96孔板中每孔中加入pH6.8的磷酸钾缓冲液112μL，加入20μL的0.2U/mL α-葡萄糖苷酶和抑制剂8μL，在37℃恒温孵育15min后加入20μL浓度为2.5mmol/L的PNPG，37℃恒温反应15min再加入0.2mol/L的Na2CO3水溶液80L，于405nm波长下测吸光度A值，计算IC50。
表3实验分组及所加试剂
实验分为空白组、不加抑制剂的阴性组、阿卡波糖阳性组和待测样品组。在96孔板中，依次加入如表3所示的各种试剂，于37℃温育15min，再加入20L 2.5mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，于37℃温育15min，加入80μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液，于405nm波长下测吸光度值，每个浓度设4个复孔。计算抑制率和IC50。
表4新化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的IC50值
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
Claims (5)
1.一种五环三萜类化合物，其特征在于该化合物具有化学结构通式所示的化学结构：
其中：R1＝β-OH，R2＝H(K或Na)为化合物1；
R1＝＝O，R2＝H(K或Na)为化合物2；
化合物1的化学结构为：2α，3β，21β-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(钾或钠)
化合物2的化学结构为：2α，3β-二羟基-21-羰基-12-烯-28-乌苏酸(钾或钠)
其结构分别为：
2.根据权利要求1所述的科罗索酸衍生物的制备方法是微生物转化法。
3.根据权利要求2所述的新的科罗索酸衍生物的制备方法为：以科罗索酸为底物，利用微生物酶对底物进行生物转化，用乙酸乙酯对微生物发酵液进行萃取得到菌液提取物，采用不同比例的石油醚-四氢呋喃进行梯度洗脱，将洗脱液分别减压浓缩、干燥，分别得到2种新化合物的提取物。将2种提取物进行反复硅胶柱层析，并用Sephadex LH-20或者HPLC制备纯化，最终得到2个新化合物。
4.根据权利要求2所述的科罗索酸衍生物的制备所使用的微生物是新月旋孢腔菌或可以在科罗索酸相应位置上进行结构修饰的微生物。
5.根据权利要求1所述的科罗索酸衍生物在治疗糖尿病药物中的用途。
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