CN100448886C - 原人参三醇衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类原人参三醇衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的是具有式II、式III或式IV结构的原人参三醇衍生物。本发明利用微生物转化技术，对原人参三醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

原人参三醇衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化合物及其制备方法与应用，特别是涉及原人参三醇衍生物及其制备方法，以及该衍生物的医药用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，研究和开发抗肿瘤药物一直是医药领域的重要研究内容。迄今为止，临床上常用的主流抗肿瘤药物大多来源于天然药物，或以天然药物为先导化合物经结构改造后得到的产物。如植物来源的长春新碱，鬼臼毒素改造的依托泊甙，以及风靡世界的紫杉醇等，这表明天然产物仍然是抗肿瘤药物的一个重要来源。

人参是著名的中药，在传统中医药体系中占据了重要的地位。由于其疗效确切，活性多样，一直是研究的热点。近年来，针对人参中主要活性成分人参皂苷进行的研究发现，该类化合物具有良好的抗肿瘤作用，无论是体外细胞试验，还是流行病学调查，结果均表明此类化合物具有抗肿瘤和降低肿瘤风险的活性。值得注意的是，体外试验结果表明，原人参三醇作用优于人参皂苷。但是，原人参三醇属于四环三萜类化合物，缺乏活泼基团，反应位点较少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供一类原人参三醇衍生物及其制备方法。

本发明所提供的原人参三醇衍生物，其结构式为式I，

(式I)

其中，R₁为-OH或H；R₂为-CH₃或-CH₂OH；R₃为-CH₃或-CH₂OH。

更具体地，本发明的原人参三醇衍生物为结构式为式II、式III或式IV的化合物。

(式III)                                          (式IV)

本发明原人参三醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物，向培养基中加入原人参三醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为银汉霉(Cunninghamella)，曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucor)，木霉(Trichoderma)，共头霉(Syncephalastrum)，或根霉(Rhizopus)属；2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3)将所述转化物残渣以硅胶柱纯化，所述硅胶柱纯化采用氯仿-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

微生物优选为毛霉(Mucor)或根霉(Rhizopus)属。

其中，步骤1)培养基中原人参三醇的浓度为2-2000μg/mL；步骤3)进行硅胶柱纯化时，氯仿-乙酸乙酯系统的梯度为4∶1至1∶10。

本发明的另一目的是提供本发明原人参三醇衍生物的用途。

本发明发明人通过实验证实，本发明的原人参三醇衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

这些抗肿瘤药物的活性成分可以是选自结构式为式II、式III和式IV的化合物中的一种或几种。

在以原人参三醇衍生物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明利用微生物转化技术，对原人参三醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

图1为转化反应的色谱图

具体实施方式

实施例1、结构式为式II、式III和式IV的化合物的制备

本发明采用微生物转化方法，以原人参三醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括银汉霉(Cunninghamella)，曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucor)，木霉(Trichoderma)，共头霉(Syncephalastrum)，或根霉(Rhizopus)属的微生物；其中转化能力较强的是毛霉(Mucor)和根霉(Rhizopus)属的菌株。这些菌株均可以购于中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)和中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心(CICC)，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。真菌培养选用马铃薯培养基，细菌培养选用LB培养基。

马铃薯培养基的配制(PDA培养基)：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80℃保温1h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3％琼脂。

细菌培养基的制备(LB培养基)：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，以水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5％琼脂。

以刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450为例，制备结构式为式II、式III和式IV的化合物过程如下：

1、发酵、转化以及发酵液的萃取

将刺囊毛霉(Mucor spinosus)AS 3.3450接入4个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、25℃下振荡培养24h后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取5mL的种子液，加入16个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg原人参三醇(0.2mL，100mg/mL MeOH溶液)，共用320mg底物。相同条件下继续转化5天，将发酵液滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩蒸干，得到转化物残渣约4g。

2、转化物的硅胶柱纯化

将所得残渣溶于少量甲醇，与4g柱色谱硅胶(200-300目)混合拌样，自然干燥，加至装有70g硅胶(200-300目)的色谱柱中，用氯仿-乙酸乙酯系统梯度洗脱(4∶1-1∶10)，收集洗脱组分，采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，氯仿-乙酸乙酯(5∶5)展开，10％硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色)将所得到的相似洗脱组分合并。

3、反相高效液相色谱纯化

将合并组分用反相高效液相色谱分析、纯化。具体分析条件为：色谱柱YMC ODS-A5μm，4.6mm I.D×250mm(日本YMC公司)，洗脱系统为乙腈-水梯度洗脱，具体配比为：30分钟内乙腈-水由(30∶70，V/V)变为(100∶0，V/V)，并维持100％的乙腈10min；41分钟再次变为乙腈-水(30∶70，V/V)并维持10min。流速为0.7ml/min。检测波长为203nm，参比波长为360nm，柱温25℃，进样量10μL。转化反应的色谱如图1所示。

制备条件为半制备色谱柱YMC ODS-A 5μm，10mm I.D×250mm(日本YMC公司)，乙腈-水(40∶60v/v)，流速1.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式II、式III和式IV的化合物等3个转化产物。

式II化合物，12-羰基-15α-羟基-20(S)-原人参三醇[12-oxo-15α-hydroxyl-20(S)-protopanaxatriol]，为白色无定形粉末：

[α]²⁰ _D+29.9(c 0.748，MeOH)；

IR v max(KBr)：3412，2932，1701，1455，1384，1275，1179，1035，985，597cm^-1；

HR-FT-ICRMS(m/z)491.3724[M+1]⁺(calculated for C₃₀H₅₁O₅[M+1]⁺，491.3731)。

式III化合物，12-羰基-26-羟基-20(S)-原人参三醇[12-oxo-26-hydroxyl-20(S)-protopanaxatriol]，为白色无定形粉末：

[α]²⁰ _D+50.9(c 0.334，MeOH)；

IR v max(KBr)：3408，2932，1697，1463，1389，1082，1035，989，928，657，600cm^-1；

HR-FT-ICRMS(m/z)491.3731(calculated for C₃₀H₅₁O₅ [M+1]⁺，491.3740)。

式IV化合物，12-羰基-27-羟基-20(S)-原人参三醇[12-oxo-27-hydroxyl-20(S)-protopanaxatriol]，白色无定形粉末：

[α]₂₀ ^D+2.13(c 0.141，MeOH)；

IR v max(KBr)：3405，2931，2866，1698，1606，1456，1384，1034，600cm^-1；

HR-FT-ICRMS(m/z)491.3731[M+1]⁺(calculated for C₃₀H₅₁O₅ [M+1]⁺，491.3740)。

式II化合物的¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表1所示。

式III化合物和式IV化合物的¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表2所示。

表1.式II化合物的氢谱与碳谱数据(C₅D₅N)

表2.式III化合物和式IV化合物的氢谱与碳谱数据(C₅D₅N)

以上结果表明，所得化合物结构正确。

利用前述其他属的微生物，具体如黑曲霉Aspergillus niger AS 3.1858、华根霉Rhizopus chinensis CICC 3043、短刺小克银汉霉Cuninghamella blakesleana AS3.970，均可以采用与上相同的过程来制备化合物II、III、IV和V。

实施例2、本发明化合物的抗肿瘤活性

1、实验材料

仪器与试剂：酶标仪为TECAN多孔分光光度计(U.S.A)；CO₂气体培养箱为BB5060型紫外清洁型CO₂培养箱(Heraeus Co.)；高速冷冻离心机为TGL-16G高速冷冻离心机(上海科学仪器厂)。所用化学试剂均为分析纯(北京化学试剂厂)；细胞培养基分别购自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO，USA)和Hyclone公司(Logan，Utah，USA)

测试用肿瘤细胞株：HL-60，人白血病细胞(human leukemia cells)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。

测试样品：原人参三醇(PT)及实施例1所合成得到的化合物II-IV，纯度在90％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2、实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC₅₀值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM1640培养液配成2×10⁴的细胞悬液，接种于96孔培养板中，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，再继续培养72h。按MTT法于酶标仪上570nm测定吸收值。每个浓度设三个平行孔。

3、实验结果

根据MTT法测试结果，计算原人参三醇(PT)及本发明化合物II-IV对肿瘤细胞的IC₅₀值，结果如表3所示。结果表明，本发明化合物II-IV具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

表3.测试样品体外细胞毒活性筛选结果

Claims (7)

1、具有式II、式III或式IV结构的原人参三醇衍生物，

2、权利要求1所述原人参三醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物，向培养基中加入原人参三醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为银汉霉，曲霉，毛霉，木霉，共头霉，或根霉属的菌株；2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3)将所述转化物残渣以硅胶柱纯化，所述硅胶柱纯化采用氯仿-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述微生物为毛霉或根霉属的菌株。

4、根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述培养基中原人参三醇的浓度为2-2000μg/mL。

5、根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述氯仿-乙酸乙酯系统的梯度为4∶1至1∶10。

6、以权利要求1所述原人参三醇衍生物为活性成分的抗肿瘤药物。

7、权利要求1所述原人参三醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

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