CN115252624B - 一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法与应用。本发明利用微生物转化技术，对白桦脂酮酸成功地进行了结构修饰，获得了16个具有母核结构修饰的新型白桦脂酮酸衍生物，这些化合物具有显著的心肌细胞保护作用，可有效保护缺氧/复氧对H9c2心肌细胞的损伤，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。此外，这些化合物还具有良好的抗神经炎症活性和抗肿瘤活性，可以作为抗神经炎症药物和抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
白桦脂酮酸(betulonic acid)，又名路路通酸、桦木酮酸，属于羽扇豆烷型五环三萜，广泛分布于药用植物中，例如白桦Betula platyphylla Suk.树皮，枫香树Liquidambarformosana Hance干燥成熟果序(中药路路通)等。白桦脂酮酸在植物内的含量普遍较低，因此通常情况下选用白桦树皮中含量更丰富的白桦醇(betulin)或白桦脂酸(betulinicaicd)，经过化学半合成或生物转化的方式得到白桦脂酮酸。
白桦脂酮酸作为白桦酸的氧化产物，是药物化学研究的重要中间体。白桦脂酮酸本身拥有十分广泛的生物活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保肝护肝等作用。但是，该化合物极性较小，易溶于有机溶剂，而不溶于水，导致生物利用度低。通常使用化学修饰的方法，以白桦脂酮酸为底物进行结构改造，以期能得到具有更强溶解性和生物活性的衍生物。有研究发现，白桦脂酮酸经过有机化学的结构修饰后产物的抗肿瘤活性和抗HIV活性得以增强。
现有技术中，由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺乏化学反应活性基团。利用有机化学方法对白桦脂酮酸进行结构修饰的位点主要为白桦脂酮酸现有的两个化学反应活性基团——3位的羰基和28位的羧基(International Journal of MolecularSciences 2021,22:3676)。白桦脂酮酸母核上的大多数C-H键为非化学反应活性位点，采用常规化学反应方法难以对母核结构进行修饰，从而获得母核上具有羟基、羰基等化学活性基团修饰的衍生物。因此，严重限制了白桦脂酮酸化学结构修饰的反应位点与衍生物的多样性。
微生物转化是利用微生物细胞体内的酶对底物进行结构修饰，使其转化成为其他化合物的过程。发酵真菌、放线菌等微生物在生长过程中产生的细胞内或细胞外特殊的酶不仅可以催化自身物质，对于外来化合物也能催化特定的化学反应，例如水解、氧化、还原、裂解、骨架重排等，因而成为了复杂天然产物结构修饰与改造的有力工具。本课题组长期从事天然活性成分的微生物转化研究，尤其是天然活性三萜的微生物转化研究。利用多种微生物对天然来源的常见三萜(包括达玛烷型、环阿尔廷烷型、乌苏烷型、齐墩果烷型三萜和羽扇豆烷型等)进行转化研究，发现微生物酶体系能选择性催化三萜母核上的多个非化学反应活性位点，从而获得母核上具有羟基、羰基等化学活性基团的衍生物(Phytochemistry2021,182:112608；Natural Product Research 2021,35(16):2685-2690；Phytochemistry2019，166:112076；Planta Medica 2019,85(1):56-61)。微生物转化产物一方面可以获得更强生物活性的衍生物直接用于药物研发，另一方面经微生物转化后母核上新引进的化学活性基团增加了进行化学修饰与改造的位点，解决了三萜类化合物有机化学制备衍生物反应位点少的难题。而与有机化学的方法相比，微生物转化是不能从理论上或者发酵方法本身预测或确定哪个微生物具有转化的能力，也不能预测或确定转化产物的结构，只有制备得到化合物后经结构鉴定才能确认。已有研究表明，即使是结构相似的先导化合物，经过微生物酶体系选择性催化所获得的衍生物结构差异会非常显著，例如白桦醇和白桦脂酸，两个先导化合物的结构差异只在于28位的羟基和羧基，但是它们经微生物转化后所获得的衍生物却有显著的差异(Phytochemistry 2019，166:112076；Phytochemistry 2021,182:112608)。即使是相同的先导化合物，不同的微生物酶催化后所获得的衍生物结构也会有显著差异，而这也是微生物转化的多样性特色，例如同样是先导化合物原人参二醇的微生物转化，选择不同的菌株进行催化，所获得的衍生物也会是有显著差异(BiotechnologyLetters 2013,35:439-443；Fitoterapia 2013,84:6-10)。因而，微生物转化法作为一种化合物结构修饰的方法，其产物结构具有多样性和不确定性的特征，只有制备获得并经结构确证才能最终确定。因此，微生物转化法并不能像有机化学那样先设计好化合物，然后再去反向合成。同时，药物分子作为完整的化合物结构，即使仅仅是羰基、羟基和甲基的区别，表现出来的药理活性也会有显著差异。而在没有获得相应化合物并进行药理性测试之前，并不能准确预测其效果。自然界中微生物的种类繁多，挑选合适的微生物菌株是采用微生物转化法对白桦脂酮酸进行结构修饰与改造的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法与应用，该白桦脂酮酸衍生物可用于作为医药中间体，也可以应用于制备治疗心血管疾病的药物、抗肿瘤药物及抗神经炎症药物。
本发明提供的白桦脂酮酸衍生物为结构式为式Ⅰ-式XVI的化合物：
结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ、式Ⅹ、式Ⅺ、式Ⅻ、式XIII、式XIV、式XV和式XVI的化合物为本发明首次公开的白桦脂酮酸新衍生物。
本发明还提供了上述白桦脂酮酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入白桦脂酮酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为根霉，犁头霉，毛霉或共头霉属的菌株；
2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；
3)转化粗提物经反相硅胶柱色谱，以甲醇：水作为流动相进行梯度洗脱，收集流份后经HPLC分析合并得5个组分。
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到白桦脂酮酸衍生物。
优选的，步骤1)中，进行转化培养前，培养基中白桦脂酮酸的浓度为2-5000μg/mL。
优选的，步骤2)中，所述萃取的萃取溶剂为乙酸乙酯。
优选的，步骤3)中，优选梯度洗脱条件为甲醇：水20:80-40:60-60:40-80:20-100:0。
本发明还提供了上述白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，所述心血管疾病包括心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病或慢性心力衰竭。
本发明还提供了上述白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌。
本发明还提供了一种如下任一结构式所示的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗神经炎症药物中的应用，
与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，对白桦脂酮酸的母核结构成功地进行了结构修饰，获得了一类新的白桦脂酮酸衍生物，通过体外心肌细胞损伤保护试验和心肌细胞缺血再灌注试验证实，这些化合物具有较好的心肌细胞保护活性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分，也可以作为治疗宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌等药物的活性成分，还可以作为抗神经炎症药物的活性成分，具有广泛的用途。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的白桦脂酮酸衍生物及其制备方法进行详细描述。
实施例1：结构式为式Ⅰ-式XVI的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以白桦脂酮酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。根霉(Rhizopus)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以少根根霉Rhizopus arrhizus CGMCC 3.868为例，制备结构式为式Ⅰ-式XVI的化合物的过程如下：
1)发酵、转化以及萃取
将少根根霉Rhizopus arrhizus CGMCC 3.868接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg白桦脂酮酸(0.2mL，100mg/mL DMSO溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.78g。
2)反相柱色谱分离
转化粗提物经反相硅胶柱色谱ODS-C18(100g，60×3cm，50μM)进行分离。甲醇：水梯度洗脱(20:80，40:60，60:40，80:20，100:0)。收集流份，经HPLC分析后合并，得合并组分A-E。
3)反相高效液相色谱纯化
合并组分A-E分别用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMCODSA-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(35:65，42:58，55:45，58:42，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ-式XVI的16个转化产物，其质谱和波谱数据如下所示。
化合物Ⅰ：7β-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-7β-acetoxy-lup-20(29)-en-28-oicacid)；熔点286–288℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3562,3029,2921,1741,1707,1693,1376,1214,1061cm-1；高分辨质谱m/z 511.3426[M–H]-(calcd.for C32H47O5,511.3423)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅱ：11α,15α-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-11α,15α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点324–325℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3457,3035,2943,1745,1712,1382,1241,1076cm-1；高分辨质谱m/z 485.3264[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅲ：7β,11β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,11β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点318–320℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3524,3041,2938,1742,1705,1365,1231,1086cm-1；高分辨质谱m/z 485.3266[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅳ：7β-羟基-30-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-30-acetoxy-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点304–305℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3481,3036,2952,1738,1715,1698,1388,1235,1057cm-1；高分辨质谱m/z527.3372[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅴ：15α-羟基-30-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-30-acetoxy-15α-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点297–299℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3506,3041,2953,1748,1711,1695,1368,1227,1050cm-1；高分辨质谱m/z 527.3370[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅵ：30-过氧羟基白桦脂酮酸(3-oxo-30-hydroperoxyl-lup-28-oicacid)；熔点296–298℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3577,3039,2963,1735,1701,1371,1243,1075cm-1；高分辨质谱m/z485.3264[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅶ：7β,23-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,23-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点322–324℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3497,3044,2962,1753,1712,1384,1207,1055cm-1；高分辨质谱m/z 509.3239[M+Na]+(calcd.for C30H46O5Na,509.3243)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅷ：7β,15α,23-三羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,15α,23-trihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点343–345℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3559,3035,2955,1751,1714,1379,1235,1033cm-1；高分辨质谱m/z501.3215[M–H]-(calcd.for C30H45O6,501.3216)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅸ：7β-羟基-23-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-23-acetoxy-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点311–312℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3543,3032,2941,1742,1715,1697,1376,1214,1028cm-1；高分辨质谱m/z 527.3373[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅹ：15α-羟基-23-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-23-acetoxy-15α-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点305–306℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3537,3046,2938,1750,1712,1698,1384,1228,1031cm-1；高分辨质谱m/z 527.3376[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅺ：2-羰基-3β,7β-二羟基白桦脂酮酸(2-oxo-3β,7β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点332–334℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3455,3046,2936,1724,1706,1388,1215,1024cm-1；高分辨质谱m/z485.3263[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅻ：2α,7β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-2α,7β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点315–317℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3527,3046,2981,1746,1701,1382,1237,1022cm-1；高分辨质谱m/z 485.3262[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物XIII：7β,22β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,22β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点324–325℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3471,3053,2973,1757,1711,1379,1213,1027cm-1；高分辨质谱m/z 485.3261[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XIV：20(S)-7β-羟基-29-乙酰氧基白桦脂酮酸(20(S)-3-oxo-7β-hydroxy-29-acetoxy-lup-28-oic acid)；熔点302–304℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3538,2963,1745,1713,1702,1369,1223,1033cm-1；高分辨质谱m/z 529.3531[M–H]-(calcd.for C32H49O6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XV：20(S)-7β-羟基-29-乙酰氧基白桦脂酮酸(20(R)-3-oxo-7β-hydroxy-29-acetoxy-lup-28-oic acid)；熔点311–313℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3533,2977,1744,1716,1701,1361,1227,1039cm-1；高分辨质谱m/z 529.3533[M–H]-(calcd.for C32H49O6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XVI：7β-羟基白桦脂酮酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3-oxo-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid-β-D-glucopyranosyl ester)；熔点386–388℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3575,3047,2967,1741,1709,1355,1237,1035cm-1；高分辨质谱m/z 631.3847[M–H]-(calcd.for C36H55O9,631.3846)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
表1.化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表2.化合物Ⅴ、化合物Ⅵ、化合物Ⅶ和化合物Ⅷ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表3.化合物Ⅸ、化合物Ⅹ、化合物Ⅺ和化合物Ⅻ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表4.化合物XIII、化合物XIV、化合物XV和化合物XVI的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2：化合物Ⅰ-XVI对由过氧化氢损伤的心肌细胞保护活性
(1)实验材料
CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(OlympusIX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、DMEM高糖培养基(Gibcol BRL)，胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、30％的过氧化氢(H2O2)(天津市瑞金特化学品有限公司)、H9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。
(2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对H2O2损伤的H9c2细胞活性的影响：用胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞悬液的细胞密度至5×104个/mL，于96孔培养板中每孔加入200μL，置于5％CO2，37℃恒温CO2培养箱中培养12h。待细胞贴壁后分组处理：对照组、模型组(H2O2600μmol/L损伤6h)、模型+受试化合物(10、20、40μM)组。每孔终体积均为200μL，每个浓度设3个平行。药物处理24h后，于各孔内加入MTT溶液10μL(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率：细胞存活率＝加药组OD值/对照组OD值。
(3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算白桦脂酮酸衍生物Ⅰ-XVI对H2O2损伤的H9c2细胞存活率的结果如表5所示。
表5.测试化合物对H2O2损伤的H9c2细胞存活率的影响
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(与对照组相比较，#P＜0.05；与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01)
与对照组比较，H2O2处理组的细胞存活率显著降低，说明细胞造模成功。与H2O2处理组比较，白桦脂酮酸衍生物Ⅰ-XVI均能显著提高细胞的生存率，表明白桦脂酮酸衍生物Ⅰ-XVI具有显著的心肌细胞保护作用，且在一定的剂量范围内呈现良好的剂量依赖关系，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。
实施例3：本发明化合物Ⅰ-XVI对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用
1)实验材料
CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(OlympusIX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、DMEM高糖培养基(Gibcol BRL)，胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、H9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。
测试样品：白桦脂酮酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–XVI，纯度在95％以上，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
取对数生长期的H9c2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的DMEM培养液，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，约24h后更换新无糖、无血清鲜培养液，并加入化合物，放入无氧工作站内缺氧损伤1h，取出后加入糖和血清再培养24h，24h后用MTT染色法检测各孔细胞成活率。
3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算白桦脂酮酸衍生物Ⅰ-XVI对缺血再灌注损伤的H9c2细胞存活率的影响结果如表6所示。
表6.测试样品对缺血再灌注损伤的H9c2细胞存活率的影响
(与对照组相比较，#P＜0.05；与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01)
结果表明，与模型组比较不同浓度的化合物Ⅰ–XVI处理后均可明显升高心肌细胞存活率，表明本发明的化合物Ⅰ–XVI可有效保护缺氧/复氧对H9c2心肌细胞的损伤，且具有一定的剂量依赖性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。
实施例4：本发明化合物Ⅰ-XVI的抗神经炎症活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，神经小胶质细胞BV-2、RnaseA、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试样品：白桦脂酮酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅳ，纯度在95％以上；同时，选取L-单甲基精氨酸(L-NMMA)为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对神经小胶质细胞BV-2细胞活力的影响：取对数生长期的BV-2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的DMEM培养液，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定490nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。
采用Griess法测定各受试化合物对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响：调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔1mL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养12h后，取上清液，按试剂盒说明书操作，测定培养液中NO的水平。数据采用SPSS Statistics 25软件进行分析处理，计算各受试样品抑制NO释放的半数抑制浓度(IC50)。
3)实验结果
根据MTT法和Griess法测试结果，计算白桦脂酮酸及本发明化合物Ⅰ–XVI对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响，结果如表7所示。
表7.测试样品抑制LPS诱导的BV-2细胞NO释放的结果
化合物 IC50(μM) 细胞活力(％)
L-NMMAa 21.37±1.27 109.54±6.75
白桦脂酮酸 60.70±2.19 101.63±4.79
化合物Ⅰ 10.26±3.06 101.84±6.24
化合物Ⅱ 109.73±5.85 103.22±6.11
化合物Ⅲ 105.15±5.43 88.41±6.19
化合物Ⅳ 5.38±1.56 109.08±5.95
化合物Ⅴ 76.63±6.29 100.55±6.27
化合物Ⅵ 24.82±2.78 101.49±5.55
化合物Ⅶ 15.62±2.01 110.36±6.04
化合物Ⅷ 58.30±6.79 104.66±5.16
化合物Ⅸ 1.55±0.78 102.91±4.27
化合物Ⅹ 42.39±5.75 101.86±6.91
化合物Ⅺ 102.36±5.27 97.35±5.87
化合物Ⅻ 64.85±5.09 106.27±5.46
化合物XIII 37.21±4.13 101.32±6.02
化合物XIV 61.24±5.01 99.51±5.68
化合物XV 66.31±5.80 98.76±6.97
化合物XVI 4.69±2.71 100.97±6.82
结果表明，本发明的化合物Ⅰ–XVI对BV-2均未见明显的细胞抑制作用，同时可显著降低由LPS诱导的BV-2细胞炎症因子NO的释放水平，具有良好的抗神经炎症活性，可以作为抗神经炎症药物的活性成分。
实施例5：本发明化合物Ⅰ-化合物XVI的抗肿瘤活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试用肿瘤细胞株：Hela细胞(人宫颈癌细胞)、K562细胞(人白血病细胞)、K562/ADR细胞(人白血病耐药细胞)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)、Du-145(人前列腺癌细胞)、HePG2细胞(人肝癌细胞)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)、CT26细胞(结肠癌细胞)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
测试样品：熊果酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅳ，纯度在95％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM I 1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定570nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS 11.5软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(IC50)。
3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算白桦脂酮酸及本发明化合物Ⅰ–XVI对上述细胞的IC50值，结果如表8所示。
表8.测试样品体外细胞毒活性筛选结果
结果表明，本发明的化合物Ⅰ–XVI具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种白桦脂酮酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在培养基中发酵培养微生物，然后加入白桦脂酮酸进行转化培养，后除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为少根根霉Rhizopus arrhizus CGMCC 3.868；
2)将步骤1)得到的发酵液经萃取，得到转化粗提物；所述萃取的萃取溶剂为乙酸乙酯；
3)将步骤2)得到的转化粗提物经过反相硅胶ODS-C18柱层析，采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将步骤3)得到的组分用反相高效液相色谱进一步纯化，获得所述白桦脂酮酸衍生物；
所述白桦脂酮酸衍生物的结构式选自如下任一结构式：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，进行转化培养前，培养基中白桦脂酮酸的浓度为2-5000μg/mL。
3.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，所述心血管疾病包括心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病或慢性心力衰竭；
所述白桦脂酮酸衍生物选自以下任一结构式的化合物：
4.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌；
所述白桦脂酮酸衍生物选自以下任一结构式的化合物：
5.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗神经炎症药物中的应用，
所述白桦脂酮酸衍生物选自如下任一结构式：
所述抗神经炎症药物是通过抑制炎症因子NO的释放从而改善神经炎症。
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