CN116693593A - 一种熊果酮酸衍生物、微生物转化制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了一种熊果酮酸衍生物、微生物转化制备方法及应用。本发明利用微生物转化技术，以熊果酮酸为底物，区域选择性的在熊果酮酸母核C‑21位引入羰基或羟基。所引入的羟基基团还具有立体的选择性，均为β‑羟基。此外，还能在28位和13β位引入内酯，从而获得了结构新颖的熊果酮酸衍生物式Ⅰ—式Ⅳ。通过体外抗肿瘤细胞试验证实，化合物式Ⅰ—式Ⅳ具有显著的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，涉及一种一种熊果酮酸衍生物、微生物转化制备方法及应用，具体涉及一种C-21位具有羰基或羟基取代的新型熊果酮酸衍生物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
熊果酮酸是一种乌苏烷型五环三萜类化合物，广泛分布于药用植物中。熊果酮酸也可以提取自山楂、海棠果实和枣树成熟果实等常见的食品中，其中枣是传统中药配方PHY906的主要成分，用于癌症患者的辅助治疗。有研究发现，大西洋黄连木和龙脑香科树木的树脂、中华鳖、胡椒和小叶榕的根等植物中都含有熊果酮酸。这种在药用植物中广泛存在的熊果酮酸表明，熊果酮酸本身对癌症和传染性原生动物等疾病具有治疗潜力。
在化学结构上，熊果酮酸是熊果酸C-3位羰基化的产物，是化学法合成熊果酸衍生物的重要中间产物。研究结果表明C-3位羰基化和A环裂解的衍生物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗原虫、抗氧化、抗糖尿病和抗病毒等多种生物活性。由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核本身只存在C-3位羟基和C-28位羧基两个常见的化学反应活性基团。同时，已有的研究表明，C-3位的羰基是熊果酸衍生物抗肿瘤活性的活性基团，进一步限制了利用有机化学合成的方法制备具有抗肿瘤活性熊果酸衍生物的多样性。
微生物转化主要利用微生物体系产生的活性酶作为催化剂，对有机化合物底物的特定结构位点进行改造，以获得更具应用价值的新化合物。相较于传统化学合成方法，微生物转化方法减少了异构、消旋、重排、分解等复杂的反应过程，转化效率更高、化学选择性良好、区域和立体选择性良好、反应条件更温和、副产物少、后续处理更简单、更绿色环保。利用微生物转化所获得的转化产物一方面可以获得具有更强生物活性的衍生物直接用于药物研发。另一方面，经微生物转化后母核上新引入的化学活性基团增加了进行化学修饰与改造的位点，从而解决了三萜类化合物有机化学制备衍生物反应位点少的难题。然而，相对于化学合成法，微生物转化的方法具有很大的随机性，转化的结果不能像化学合成法那样可以预期，也不能进行有目的的设计。同时，即使是相似的底物经相同的菌株或不同的菌株催化转化后所获得的产物亦会有非常显著的差异。而同一个底物经不同的菌株转化后所能获得的转化产物也可能会有十分显著的差异。因此，利用微生物转化的方法进行化合物的结构修饰时选择合适的菌株是至关重要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种C-21位具有羰基或羟基取代的熊果酮酸衍生物或其药学上可成的盐及其微生物转化制备方法，该熊果酮酸衍生物可用于制备抗肿瘤的药物。
本发明提供了一种C-21位具有羰基或羟基取代的熊果酮酸衍生物，熊果酮酸衍生物为3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯和3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯，结构分别如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ所示：
结构式为式Ⅰ—式Ⅳ的化合物均为本发明首次公开的新型熊果酮酸衍生物。
本发明还提供了一种熊果酮酸衍生物的微生物转化制备方法，包括以下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入熊果酮酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为米曲霉Aspergillus oryzaeCGMCC 3.407；
2)将所述发酵液经萃取，得到转化物；
3)将所述转化物经过反相硅胶柱色谱纯化，所述反相硅胶柱纯化采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯和3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯。
上述微生物转化制备方法的合成路线如下式所示：
本发明还提供了上述的熊果酮酸衍生物或上述的制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
本发明还提供了上述的熊果酮酸衍生物或上述的制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备用于杀伤白血病耐药细胞的药物中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的活性成分活性成分为熊果酮酸衍生物或其药学上可接受的盐；所述熊果酮酸衍生物为3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯和3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯中的一种或几种；所述肿瘤包括宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
与现有技术相比，本发明利用微生物酶的催化作用，区域选择性的在熊果酮酸母核21位引入羰基或羟基。所引入的羟基基团还具有立体的选择性，均为β-羟基。此外，还能在28位和13β位引入内酯，从而获得了结构新颖的熊果酮酸衍生物式Ⅰ—式Ⅳ，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，化合物式Ⅰ-式Ⅳ具有显著的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的新型熊果酮酸衍生物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用进行详细描述。
实施例1：结构式为式Ⅰ—式Ⅳ的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以熊果酮酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤制备本发明化合物。曲霉属(Aspergillus)的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以米曲霉Aspergillus oryzae CGMCC 3.407为例，制备结构式为式Ⅰ—式Ⅳ的化合物的过程如下：
1)发酵、转化以及萃取
将米曲霉Aspergillus oryzae CGMCC 3.407接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养12小时后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养24小时后，每个摇瓶中加入20mg熊果酮酸(0.2mL，100mg/mL乙醇溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化3天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.85g。
2)ODS-C18柱色谱分离
转化粗提物经ODS-C18柱色谱进行分离。甲醇：水梯度洗脱(10:90，30:70，60:40，80:20，100:0)。收集流份，经HPLC分析后合并，得合并组分Fr.1-Fr.5。
3)反相高效液相色谱纯化
组分Fr.2用反相高效液相色谱进行纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODSA-5μm，12.0×250mm，甲醇-水(55:45，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的转化产物。组分Fr.3经反相高效液相色谱进行纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODSA-5μm，12.0×250mm，甲醇-水(65:35，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅳ的转化产物。化合物式Ⅰ—式Ⅳ的质谱和波谱学数据如下所示。
化合物Ⅰ：3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸；旋光度(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax 3562,2981,1725,1710,1705，1381,1252,1045cm-1；高分辨质谱[M-H]-m/z为467.3174(cal.467.3161，C30H43O4)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅱ：3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸；旋光度(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax 3673,3582,2958,1728,1712,1705,1392,1254,1084cm-1；高分辨质谱[M-H]-m/z为483.3126(cal.483.3110，C30H43O5)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅲ：3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯；旋光度(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax 3596,3043,2967,1725,1711,1699,1348,1293,1097cm-1；高分辨质谱[M-H2O+H]+m/z为451.3216(cal.451.3212，C30H43O3)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅳ：3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯；旋光度(c＝0.1,MeOH)；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax 3667,3511,2969,1727,1715,1325,1258,1066cm-1；高分辨质谱[M+Cl]-m/z为519.3247(cal.519.2877，C30H44O5Cl)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
表1.化合物式Ⅰ—式Ⅳ的核磁氢谱和碳谱数据
以上结果表明，所得化合物式Ⅰ—式Ⅶ结构正确。
实施例2：化合物式Ⅰ—式Ⅳ的抗肿瘤活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPM I 1640培养基(GibcolBRL)，RnaseA、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试用肿瘤细胞株：Hela细胞(人宫颈癌细胞)、K562细胞(人白血病细胞)、K562/ADR细胞(人白血病耐药细胞)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)、Du-145(人前列腺癌细胞)、HePG2细胞(人肝癌细胞)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)、CT26细胞(结肠癌细胞)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
测试样品：熊果酮酸及实施例1所合成得到的化合物式Ⅰ—式Ⅳ，纯度在95％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM I 1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定570nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS 11.5软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(IC50)。
3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算测试样品对上述细胞的IC50值，结果如表2所示。
表2.测试样品体外细胞毒活性筛选结果
结果表明，本发明式Ⅰ—式Ⅳ所示化合物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。同时，本发明式Ⅰ—式Ⅳ所示化合物可以有效杀伤人白血病耐药细胞。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种熊果酮酸衍生物，其特征在于，所述熊果酮酸衍生物为3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸，所述熊果酮酸衍生物具有式Ⅰ结构：
2.一种熊果酮酸衍生物，其特征在于，所述熊果酸衍生物为3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸，所述熊果酮酸衍生物具有式Ⅱ结构：
3.一种熊果酮酸衍生物，其特征在于，所述熊果酮酸衍生物为3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯，所述熊果酮酸衍生物具有式Ⅲ结构：
4.一种熊果酮酸衍生物，其特征在于，所述熊果酮酸衍生物为3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯，所述熊果酸衍生物具有式Ⅳ结构：
5.一种熊果酮酸衍生物的微生物转化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入熊果酮酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为米曲霉Aspergillus oryzaeCGMCC 3.407；
2)将所述发酵液经萃取，得到转化物；
3)将所述转化物经过反相硅胶柱色谱纯化，所述反相硅胶柱纯化采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到熊果酮酸，所述熊果酮酸包括3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯和3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯。
6.权利要求1-4任一项所述的熊果酮酸衍生物或权利要求5所述的制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
7.权利要求1-4任一项所述的熊果酮酸衍生物或权利要求5所述的制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备用于杀伤白血病耐药细胞的药物中的应用。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的活性成分活性成分为熊果酮酸衍生物或其药学上可接受的盐；所述熊果酮酸衍生物为3,21-二羰基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3,21-二羰基-7β-羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸、3-羰基-21β-羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯和3-羰基-7β,21β-二羟基-11(12)-双键-乌苏烷-28,13β-内酯中的一种或几种；所述肿瘤包括宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种。
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