CN102766184A

CN102766184A - 原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102766184A
Application number: CN2012102700432A
Authority: CN
Inventors: 陈广通; 杨雪; 凌勇; 翟旭光
Original assignee: Nantong University
Current assignee: San Yi Technology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN102766184B

Abstract

本发明公开了一类原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的原人参二醇过氧化衍生物，其结构式为式Ⅰ

Figure 2012102700432100004DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE002

、式Ⅱ

和式Ⅲ

Description

原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域,具体涉及原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法以及该衍生物的医药用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,研究和开发抗肿瘤药物一直是医药领域的重要研究内容。天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉，在新药开发过程中，一方面具有良好活性的天然产物可以直接被用于临床；另一方面，以天然活性成分为先导化合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒药物，是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。目前，临床上常用的主流抗肿瘤药物大多来源于天然药物，或以天然药物为先导化合物经结构改造后得到的产物。如植物来源的长春新碱，鬼臼毒素改造的依托泊苷，以及风靡世界的紫杉醇等，这表明天然产物仍然是抗肿瘤药物的一个重要来源。

人参是著名的中药，在传统中医药体系中占据了重要的地位。由于其疗效确切，活性多样，一直是研究的热点。近年来，针对人参中主要活性成分人参皂苷进行的研究发现，该类化合物具有良好的抗肿瘤作用，无论是体外细胞试验，还是流行病学调查，结果均表明此类化合物具有抗肿瘤和降低肿瘤风险的活性。现代的药理研究表明，作为苷元的原人参二醇的抑瘤作用比相应的皂苷更强。但是，原人参二醇属于四环三萜类化合物，缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。

　在过去的30多年中，微生物转化技术在有机化学合成领域中取得了很大的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物合成过程中的某些重要反应，已经能够用微生物技术得以替代。微生物转化的本质是某种微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应，因而微生物转化可以认为是有机化学反应中的一个特殊的分支。申请号为CN200510053616.6，公开号为CN1830995的中国专利文献公开了一类原人参二醇衍生物及其制备方法与应用，利用微生物转化技术，对原人参二醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

发明内容

本发明的目的是提供一类原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法与应用。

本发明所提供的原人参二醇过氧化衍生物：23,24-双键-25-过氧羟基-20(S)-原人参二醇（式Ⅰ）、25,26-双键-24(R)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇（式Ⅱ）和25,26-双键-24(S)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇（式Ⅲ），其结构式如下：

本发明还提供了上述原人参二醇过氧化衍生物的制备方法，包括如下步骤：1）发酵培养微生物，向培养基中加入原人参二醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为犁头霉（Absidia），小克银汉霉（Cunninghamella），毛霉（Mucor），链格孢（Alternaria），枝顶孢（Acremonium）、红酵母（Rhodotorula），共头霉（Syncephalastrum）、曲霉（Aspergillus）或根霉（Rhizopus）属的菌株；2）将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3）将所述转化物残渣以硅胶柱纯化，采用氯仿-乙酸乙酯两相系统梯度洗脱，收集合并组分；4）将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

其中，微生物优选为犁头霉（Absidia）、枝顶孢（Acremonium）、根霉（Rhizopus）、曲霉（Aspergillus）或毛霉（Mucor）属菌株，更优选伞枝犁头霉Absidia corymbiferaAS 3.3387、刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450、总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205、少根根霉Rhzopus arrhizus AS 3.3457、顶头孢Acremonium strictum AS 3.2059或黑曲霉Aspergillus flavus Link AS 3.3950。

上述方法步骤1）中培养基中原人参二醇的浓度为2-2000μg/mL。

上述方法步骤2）中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。

本发明的另一目的是提供本发明原人参二醇过氧化衍生物式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ的化合物的用途。

本发明通过实验证实，本发明的原人参二醇过氧化衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

这些抗肿瘤药物的活性成分可以是选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ的化合物中的一种或几种。

在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。

通常，过氧化物多采用传统的化学方法合成，由于带有过氧基团，合成困难，步骤繁杂。本发明利用微生物转化技术，对原人参二醇成功地进行了结构修饰，获得了一类新的原人参二醇过氧化衍生物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。本发明不但开拓出一类新的原人参二醇衍生物，对过氧化物的微生物转化合成领域也具有开创性的指导意义。

附图说明

图1为反相高效液相色谱分离纯化制备本发明式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的化合物的色谱图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1、本发明式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的原人参二醇过氧化衍生物的制备

本发明采用微生物转化方法，以原人参二醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括：犁头霉（Absidia），小克银汉霉（Cunninghamella），毛霉（Mucor），链格孢（Alternaria），枝顶孢（Acremonium）、红酵母（Rhodotorula），共头霉（Syncephalastrum）、曲霉（Aspergillus）或根霉（Rhizopus）属的微生物，其中转化能力较强的是犁头霉（Absidia）、枝顶孢（Acremonium）、根霉（Rhizopus）、曲霉（Aspergillus）或毛霉（Mucor）属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心（CICC），于固体斜面培养基上置4 ℃冰箱内保存。真菌培养基选用马铃薯培养基，细菌培养基选用LB培养基。

马铃薯培养基的配制（PDA培养基）：取200 g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80 ℃保温1 h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20 g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000 mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3%琼脂。

细菌培养基的制备（LB培养基）：每1000 mL液体培养基加入5.0 g酵母提取物，10.0 g蛋白胨，10.0 g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5%琼脂。

以刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450为例，制备结构式为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ的原人参二醇过氧化衍生物的过程如下：

1）发酵、转化以及萃取

将刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450接入2个250 mL三角瓶（装有100 mL马铃薯培养基）中，作为种子液。于摇床上160 rpm、26 ℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1 mL的种子液，加入到20个1000 mL摇瓶（装有400 mL马铃薯培养基）中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20 mg原人参二醇（0.2 mL， 100mg/mL无水乙醇溶液），共用400 mg底物。相同条件下继续转化5天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣约1.5 g。

2）硅胶柱纯化

将所得残渣溶于少量甲醇，与2.0 g柱色谱硅胶（200–300目）混合拌样，自然干燥，加至装有60 g硅胶（200–300目）的色谱柱顶，用氯仿–乙酸乙酯系统梯度洗脱（6:1-1:8），收集洗脱组分，采用TLC分析方法（硅胶G薄层板，氯仿–乙酸乙酯（5:1）展开，10%硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色），收集合并R_f值为0.3的组分。

3）反相高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱分析、纯化。分析条件为：色谱柱YMC ODS-A 5 μm，4.6mm I.D×250 mm（日本YMC公司），洗脱系统为乙腈–水梯度洗脱，具体配比为：30分钟内乙腈–水由（30:70，V/V）变为（100:0，V/V），并维持100%的乙腈10 min；40分钟再次变为乙腈–水（30:70，V/V）并维持10 min。流速为1.0 mL/min。检测波长为203 nm，柱温25 ^oC，进样量20μL。

制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS-A 5 μm，10.0 I.D×250 mm（日本YMC公司），乙腈-水（60:40，V/V），流速3.0 mL/min，检测波长203 nm。得到结构式为式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的原人参二醇过氧化衍生物，色谱图如图1所示。

式Ⅰ的原人参二醇过氧化衍生物：23,24-双键-25-过氧羟基-20(S)-原人参二醇[23,24-en-25-hydroperoxy- 20(S)-protopanaxadiol]，

，白色无定形粉末。HR-ESI-MS (m/z) 515.3725 [M+Na]⁺ (calculated for C₃₀H₅₂O₅Na [M+Na]⁺, 515.3712)。

其¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表1所示。

式Ⅱ的原人参二醇过氧化衍生物：25,26-双键-24(R)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇[25,26-en-24(R)-hydroperoxy-20(S)-protopanaxadiol]，，白色无定形粉末。HR-ESI-MS (m/z) 515.3718 [M+Na]⁺ (calculated for C₃₀H₅₂O₅Na [M+Na]⁺, 515.3712)。

其¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表1所示。

式Ⅲ的的原人参二醇过氧化衍生物：25,26-双键-24(S)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇[25,26-en-24(S)-hydroperoxy-20(S)-protopanaxadiol]，，白色无定形粉末。HR-ESI-MS (m/z) 515.3722 [M+Na]⁺ (calculated for C₃₀H₅₂O₅Na [M+Na]⁺, 515.3712)。

其¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表1所示。

表1. 式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的原人参二醇过氧化物的氢谱和碳谱数据（C₅D₅N）

（续上表）

以上结果表明，所得化合物结构正确。

利用其他属的微生物，具体如伞枝犁头霉Absidia corymbifera AS 3.3387、总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205、少根根霉Rhzopus arrhizus AS 3.3457、顶头孢Acremonium strictum AS 3.2059、黑曲霉Aspergillus flavus Link AS 3.3950，均可以采用与上相同的过程来制备式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ的原人参二醇过氧化物。

实施例2 式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的原人参二醇过氧化衍生物的抗肿瘤活性

1）实验材料

仪器与试剂：CO₂培养箱 (Jouan IGO150)；酶标仪 (Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 (碧云天生物技术研究所)、RPM I 1640 培养基 (Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜 (DMSO)、胰蛋白酶 (上海生物工程有限公司)。

测试用肿瘤细胞株：HL-60，人白血病细胞 (human leukemia cells)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。

测试样品：原人参二醇 (PPD)及实施例1所合成得到的原人参二醇过氧化衍生物Ⅰ–Ⅲ，纯度在90%以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2）实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC₅₀值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM I 1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0..1-100 μM，继续培养72 h。按MTT法于酶标仪，测定570 nm的吸光度(A ) 值，计算抑制率[ 抑制率= (1-实验组A值/对照组A值) ×100% ]。实验重复3次。应用SPSS 11. 5 软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用72 h的半数抑制浓度(IC₅₀)。

3）实验结果

根据MTT法测试结果，计算原人参二醇(PPD)及本发明原人参二醇过氧化衍生物Ⅰ–Ⅲ对HL-60细胞的IC₅₀值，结果如表2所示。

表2. 测试样品体外细胞毒活性筛选结果

化合物	化合物对HL-60细胞的IC₅₀(μg/mL)
		顺铂	0.07
PPD	12.8
		化合物Ⅰ	6.32
化合物Ⅱ	5.61
		化合物Ⅲ	5.37

结果表明，本发明原人参二醇过氧化衍生物Ⅰ–Ⅲ具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

Claims

1.一种原人参二醇过氧化衍生物：23,24-双键-25-过氧羟基-20(S)-原人参二醇，具有式Ⅰ结构：。

2.一种原人参二醇过氧化衍生物：25,26-双键-24(R)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇，具有式Ⅱ结构：

Figure 2012102700432100001DEST_PATH_IMAGE002

。

3.一种原人参二醇过氧化衍生物：25,26-双键-24(S)-过氧羟基-20(S)-原人参二醇，具有式Ⅲ结构：

Figure 2012102700432100001DEST_PATH_IMAGE003

。

4.如权利要求1-3所述原人参二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：

1）发酵培养微生物，向培养基中加入原人参二醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为犁头霉，小克银汉霉，毛霉，链格孢，枝顶孢、红酵母，共头霉、曲霉或根霉属的菌株；

2）将步骤（1）得到的发酵液经萃取，得到转化物；

3）将步骤（2）得到的转化物经过硅胶柱纯化，采用二氯甲烷-无水乙醇两相系统梯度洗脱，收集合并组分；

4）将步骤（3）得到的组分用反相高效液相色谱纯化，得到结构式为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ的原人参二醇过氧化衍生物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）所述微生物为犁头霉、枝顶孢、根霉、曲霉、毛霉属的菌株。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）所述微生物为伞枝犁头霉Absidia corymbiferaAS 3.3387、刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450、总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205、少根根霉Rhzopus arrhizus AS 3.3457、顶头孢Acremonium strictum AS 3.2059或黑曲霉Aspergillus flavus Link AS 3.3950。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）所述培养基中原人参二醇的浓度为2-2000 μg/mL。

8.含有权利要求1-3所述原人参二醇衍生物为活性成分的抗肿瘤药物，活性成分选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、或式Ⅲ的化合物中的一种或几种。

9.如权利要求1-3所述原人参二醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。