CN1830995A - 原人参二醇衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

原人参二醇衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类原人参二醇衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的原人参二醇衍生物，其结构式为式I，其中，R1为－OH或H；R2为－CH3或－CH2OH；R3为－CH3或－CH2OH。本发明利用微生物转化技术，对原人参二醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

原人参二醇衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物及其制备方法与应用，特别是涉及原人参二醇衍生物及其制备方法，以及该衍生物的医药用途。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，研究和开发抗肿瘤药物一直是医药领域的重要研究内容。迄今为止，临床上常用的主流抗肿瘤药物大多来源于天然药物，或以天然药物为先导化合物经结构改造后得到的产物。如植物来源的长春新碱，鬼臼毒素改造的依托泊甙，以及风靡世界的紫杉醇等，这表明天然产物仍然是抗肿瘤药物的一个重要来源。
人参是著名的中药，在传统中医药体系中占据了重要的地位。由于其疗效确切，活性多样，一直是研究的热点。近年来，针对人参中主要活性成分人参皂苷进行的研究发现，该类化合物具有良好的抗肿瘤作用，无论是体外细胞试验，还是流行病学调查，结果均表明此类化合物具有抗肿瘤和降低肿瘤风险的活性。值得注意的是，体外试验结果表明，原人参二醇作用优于人参皂苷。但是，原人参二醇属于四环三萜类化合物，缺乏活泼基团，反应位点较少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。
发明内容
本发明的目的是提供一类原人参二醇衍生物及其制备方法。
本发明所提供的原人参二醇衍生物，其结构式为式I，
Figure A20051005361600041
(式I)
其中，R1为-OH或H；R2为-CH3或-CH2OH；R3为-CH3或-CH2OH。
更具体地，本发明的原人参二醇衍生物为结构式为式II、式III或式IV的化合物。
Figure A20051005361600051
(式II)                                                   (式III)
Figure A20051005361600052
(式IV)
本发明原人参二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物，向培养基中加入原人参二醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为小克银汉霉(Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，链格孢(Alternaria)，犁头霉(Absidia)，红酵母(Rhodotorula)，共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属的菌株；2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3)将所述转化物残渣以硅胶柱纯化，所述硅胶柱纯化采用氯仿-乙酸乙酯两相系统梯度洗脱，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。
其中，微生物优选为共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属；步骤1)培养基中原人参二醇的浓度为2-2000μg/mL。
本发明的另一目的是提供本发明原人参二醇衍生物的用途。
本发明发明人通过实验证实，本发明的原人参二醇衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。
这些抗肿瘤药物的活性成分可以是选自结构式为式I，特别是式II、式III和式IV的化合物中的一种或几种。
在以原人参二醇衍生物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明利用微生物转化技术，对原人参二醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
附图说明
图1为转化反应的色谱图
具体实施方式
实施例1、结构式为式II、式III和式IV的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以原人参二醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括：银汉霉(Cunninghamella，毛霉(Mucor)，链格孢(Alternaria)，犁头霉(Absidia)，红酵母(Rhodotorula)，共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属的微生物；其中转化能力较强的是共头霉(Syncephalastrum)和根霉(Rhizopus)属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心(CICC)，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。真菌培养选用马铃薯培养基，细菌培养选用LB培养基。
马铃薯培养基的配制(PDA培养基)：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80℃保温1h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000ml。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3％琼脂。
细菌培养基的制备(LB培养基)：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5％琼脂。
以华根霉Rhizopus chinensis CICC 3043为例，制备结构式为式II、式III、式IV的化合物的过程如下：
1、发酵、转化以及萃取
将华根霉Rhizopus chinensis CICC 3043接入4个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、25℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取5mL的种子液，加入20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg原人参二醇(0.2mL，100mg/mL MeOH溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化5天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣约1.5g。
2、硅胶柱纯化
将所得残渣溶于少量甲醇，与2.5g柱色谱硅胶(200-300目)混合拌样，自然干燥，加至装有60g硅胶(200-300目)的色谱柱顶，用氯仿-乙酸乙酯系统梯度洗脱(6∶1→1∶8)，收集洗脱组分，采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，氯仿-乙酸乙酯(5∶5)展开，10％硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色)将所得到的相似洗脱组分合并。
3、反相高效液相色谱纯化
合并组分用反相高效液相色谱分析、纯化。分析条件为：色谱柱YMC ODS-A 5μm，4.6mmI.D×250mm(日本YMC公司)，洗脱系统为乙腈-水梯度洗脱，具体配比为：30分钟内乙腈-水由(30∶70，V/V)变为(100∶0，V/V)，并维持100％的乙腈10min；41分钟再次变为乙腈-水(30∶70，V/V)并维持10min。流速为0.7ml/min。检测波长为203nm，参比波长为360nm，柱温25℃，进样量10μL。转化反应的色谱图如图1所示
制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS-A 5μm，10mm I.D×250mm(日本YMC公司)，乙腈-水(40∶60v/v)，流速1.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式II、式III、式IV的化合物等3个转化产物。
化合物II，12-羰基-7β，15α-二羟基-20(S)-原人参二醇[12-oxo-7β，15α-dihydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色无定形粉末：
HR-FT-ICR MS(m/z)calculated for C30H50O5Na[M+Na]+513.3550；found513.3545；其1H-NMR及13C-NMR数据如表1所示。
化合物III，12-羰基-7β-羟基-20(S)-原人参二醇[12-oxo-7β-hydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色无定形粉末：
HR-FT-ICR MS(m/z)497.3595[M+Na]+(calculated for C30H50O4Na[M+Na]+，497.3709)。
化合物IV，12-羰基-7β，27-二羟基-20(S)-原人参二醇[12-oxo-7β，27-dihydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色无定形粉末：
HR-FT-ICR MS(m/z)513.3548[M+Na]+(calculated for C30H50O5Na[M+Na]+，513.3550)。
化合物III和化合物IV的1H-NMR及13C-NMR数据如表2所示。
表1.化合物II的氢谱与碳谱数据(C5D5N)
  位置 δH   δC
  123456789101112131415161718192021222324252627282930 0.841.511.851.813.40(1H，dd，J＝5，4.5Hz)---0.98(1H，d，J＝12.5Hz)1.85(1H，m)2.10(1Hα，m)4.05(1Hα，d，J＝10.5Hz)---1.79(1H，m)---2.48(1H，m)2.38(1H，m)---3.51(1Hβ，d，J＝9Hz)---4.86(1Hβ，dd，J＝9，8.5Hz)2.66(1Hβ，m)2.10(1Hα，m)2.89(1Hβ，m)1.46(3H，s)0.92(3H，s)---1.41(3H，s)1.84(2H，m)2.35(1H，m)2.28(1H，m)5.23(1H，t，J＝6.5Hz)---1.62(3H，s)1.57(3H，s)1.02(3H，s)1.20(3H，s)1.22(3H，s)   38.8t28.0t77.6d39.4s53.6d28.1d73.6d41.7s54.6d37.8s39.5t210.8s54.5d57.6s72.7d32.7t40.8d10.8q16.3q73.1s26.0q42.5t23.7t125.7d130.9s25.7q17.6q28.5q16.3q10.9q
表2.化合物II和化合物IV的氢谱与碳谱数据
  位置   δC(III)   δH(III)   δC(IV)   δH(IV)
  123456789101112131415161718192021222324252627282930   38.9t29.6t77.7d39.3s53.7d28.1t73.9d46.5s54.1d37.8s39.6t212.0s57.1d56.4s36.1t24.9t43.1d11.2q16.2q73.3s26.6q42.1t23.6t125.9d130.8s25.8q17.6q28.5q16.3q17.2q 4.03(1H，t，J＝5.5，5.0Hz)3.45(1βH，d，J＝5Hz)1.45(3H，s)0.92(3H，s)1.43(3H，s)5.25(1H，brd)1.64(3H，s)1.60(3H，s)1.18(3H，s)1.02(3H，s)1.05(3H，s)   38.6t27.9t77.5d39.4s53.5d29.3t73.7d46.3s53.9d37.6s39.1t211.8s56.8d56.2s35.9t24.7t42.9d11.0q16.1q73.1s26.3q42.1t23.0t127.3d136.0s21.6q60.6t28.3q16.0q16.0q 3.40(1H，dd，J＝10Hz)4.03(1H，t，J＝5.5，5.0Hz)3.43(1βH，d，J＝5Hz)1.44(3H，s)1.03(3H，s)1.40(3H，s)5.42(1H，t，J＝6.5Hz)1.99(3H，s)1.19(3H，s)1.02(3H，s)0.92(3H，s)
以上结果表明，所得化合物结构正确。
利用前述其他属的微生物，具体如总状共头霉Syncephalastrum racemosum AS3.264、蓝色犁头霉Absidia coerulea AS 3.3389、刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450，均可以采用与上相同的过程来制备化合物II、III和IV。
实施例2、本发明化合物的抗肿瘤活性
1、实验材料
仪器与试剂：酶标仪为TECAN多孔分光光度计(U.S.A)；CO2气体培养箱为BB5060型紫外清洁型CO2培养箱(Heraeus Co.)；高速冷冻离心机为TGL-16G高速冷冻离心机(上海科学仪器厂)。所用化学试剂均为分析纯(北京化学试剂厂)；细胞培养基分别购自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO，USA)和Hyclone公司(Logan，Utah，USA)
测试用肿瘤细胞株：HL-60，人白血病细胞(human leukemia cells)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
测试样品：原人参二醇(PD)及实施例1所合成得到的化合物II-IV，纯度在90％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2、实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM1640培养液配成2×104的细胞悬液，接种于96孔培养板中，在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，再继续培养72h。按MTT法于酶标仪上570nm测定吸收值。每个浓度设三个平行孔。
3、实验结果
根据MTT法测试结果，计算原人参二醇(PD)及本发明化合物II-IV对HL-60细胞的IC50值，结果如表3所示。
表3.测试样品体外细胞毒活性筛选结果
  化合物   化合物对HL-60的IC50(μg/mL)
  顺铂PD化合物II化合物III化合物IV   0.0713.08.677.989.15
结果表明，本发明的化合物II-IV具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

Claims (9)

1、具有式I结构的原人参二醇衍生物，
Figure A2005100536160002C1
(式I)
其中，R1为-OH或H；R2为-CH3或-CH2OH；R3为-CH3或-CH2OH。
2、根据权利要求1所述的原人参二醇衍生物，其特征在于：所述原人参二醇衍生物为结构式为式II、式III或式IV的化合物。
Figure A2005100536160002C2
                (式II)                                              (式III)
(式IV)
3、权利要求1所述原人参二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物，向培养基中加入原人参二醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为小克银汉霉，毛霉，链格孢，犁头霉，红酵母，共头霉或根霉属的菌株；2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3)将所述转化物残渣以硅胶柱纯化，所述硅胶柱纯化采用氯仿—乙酸乙酯两相系统梯度洗脱，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述得到的产物为结构式为式II、式III或式IV的化合物。
5、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述微生物为共头霉或根霉属的菌株。
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述培养基中原人参二醇的浓度为2-2000μg/mL。
7、以权利要求1所述原人参二醇衍生物为活性成分的抗肿瘤药物。
8、根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述活性成分选自结构式为式II、式III和式IV化合物中的一种或几种。
9、权利要求1所述原人参二醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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