JPH09227549A

JPH09227549A - 新生理活性物質

Info

Publication number: JPH09227549A
Application number: JP3508296A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Wakabayashi; 利明若林; Reina Kageyama; 礼奈蔭山; Yasuaki Naruse; 庸彰成瀬; Yumi Yokoyama; 由美横山; Yoshio Watanabe; 吉雄渡辺; Kazuyuki Dobashi; 和之土橋
Original assignee: Eisai Co Ltd; Mercian Corp
Current assignee: Eisai Co Ltd; Mercian Corp
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 1997-09-02
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: JP3786461B2

Abstract

(57)【要約】【課題】新規血管新生阻害物質を提供することにあ
る。【解決手段】 Streptomyces系微生物の培養液を原料と
して、血管新生阻害物質をスクリーニングし精製した結
果、ボレリジン（Borrelidin) の類縁化合物４種を単
離、構造確認した。【効果】血管新生の異常増殖を伴う各種疾患の予防お
よび治療剤として期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は血管新生の異常増殖
を伴う各種疾患に対する予防および治療に有効な新規生
理活性物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】血管新生は胎児期の血管樹形成や各臓器
の形態的、機能的発達時に不可欠な生物学的現象である
が、成熟個体では女性性周期においてのみに生じる。し
かし成熟個体において、血管新生の病的増加が様々な疾
患の発症あるいは進行過程に関与していることが知られ
ている。具体的には癌、リウマチ性関節炎、アテローム
性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管腫、乾せんなどが
血管新生の異常を伴う疾患として挙げられる（Marsha
A. et al., Biotechnology, 9, 630, 1991)。特に固形
癌の増殖は血管新生に依存することが報告されているこ
とから（Folkman J., J. Natl. Cancer Inst., 82, 4 ,
1990）血管新生阻害剤は難治性固形癌に対する新しい治
療薬になると期待されている。

【０００３】これまでいくつかの血管新生阻害物質に関
する報告はあるが、いまだ実用化に耐える有効な物質は
見い出されていない（公開特許公報平3-109324号、公
開特許公報平3-236324号、公開特許公報平3-2184
号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、血管
新生阻害活性を有する新規物質を単離し、血管新生の異
常増殖を伴う各種疾患に対する予防および治療剤を提供
することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記現状に鑑み、本発明
者らは微生物培養液を原料として、阻害活性がより強力
で副作用の少ない新しい血管新生阻害物質の探索スクリ
ーニングを開始した。その結果、ストレプトミセス属に
属する微生物の培養液中に血管新生阻害物質が産生され
ることを見い出し、この活性物質を単離、構造解析の結
果、ボレリジンであることが判明した。この物質の精製
過程において、フォトダイオードアレイ検出器を用いる
HPLC分析の結果、ボレリジンと同一の紫外吸収スペクト
ルを示す４種のピークを確認した。これら化合物を単
離、構造決定の結果、新規物質であり血管新生阻害活性
を有することを確認し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、一般式（Ｉ）で表され
る化合物、その塩またはその水和物、及びそれらの製造
方法、並びにそれらを有効成分とする医薬に関するもの
である。

【０００７】

【化２】

【０００８】（式中、Ｒ₁ は水素原子または低級アルキ
ル基、Ｒ₂はシアノ基またはカルボキシル基を意味す
る。）より具体的には、一般式（Ｉ）において、Ｒ₁がメチル
基、Ｒ₂ がシアノ基であり、12Z、 14Eの立体配置を有す
る化合物（II）、Ｒ₁ がメチル基、Ｒ₂ がシアノ基であ
り、12Z、 14Zの立体配置を有する化合物(III) 、Ｒ₁が
水素原子、Ｒ₂がシアノ基であり、12Z、 14Eの立体配置
を有する化合物 (IV) 、Ｒ₁ がメチル基、Ｒ₂ がカルボ
キシル基であり、12Z、 14Eの立体配置を有する化合物
（Ｖ）、それらの塩またはそれらの水和物、及びこれら
化合物の製造方法、並びにこれら化合物を有効成分とす
る、血管新生の異常増殖を伴う各種疾患に対する予防お
よび治療剤等として有効な医薬に関する。

【０００９】これら化合物はボレリジンの類縁化合物で
あって、ボレリジンはストレプトミセス属の微生物の培
養液から抗生物質として1949年単離構造決定された化合
物である（Berger J. et al., Arch. Biochem. Biophy
s., 22, 476, 1949）。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明化合物の抽出原料である微
生物培養液の微生物種としては、ストレプトミセス属を
選び、 Streptomyces albovinaceus，Streptomyces roc
hei およびStreptomyces sp. C 2989 などボレリジンを
産生するいずれの微生物も使用することができる（Sing
h S.K. et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 27，
239, 1985；Berger J., et al., Arch. Biochem. Bioph
ys.，22，476, 1949 ；Lumb M.et al., Nature, 206 ，
263, 1965)。その例として、例えばストレプトミセス・
ロチェイ（Streputomyces rochei)ATCC 10739などが挙
げられるが、特にボレリジンの生産力が高く好適な菌株
として本発明者等が石垣島の土壌より分離した放線菌 M
er-N7167株が挙げられる。本菌株は以下の菌学的性質を
有する。

【００１１】形態；分岐し良く伸長する基生菌糸と、同
じく良く伸長する気中菌糸とからなり、気中菌糸の先端
は胞子化する。胞子鎖は10〜50個連なり、ゆるやかなラ
セン状を呈するが、曲状のものも見られる。胞子の表面
は平滑で大きさは直径１μm ×１〜２μm 程度である。

【００１２】菌体成分；ジアミノピメリン酸としては、
LL−型を含み、糖はガラクトース、グルコース、マンノ
ース、リボースを含む。

【００１３】各種培地上での生育； ISP-１生育は中程度で、薄く白色の気中菌糸を産す
る。培養裏面はわずかに黄色になる。 ISP-２生育は良好で、白色の気中菌糸上に灰色ないし
灰白色（Light grayishreddish brown ）の胞子を多量
に産する。培養裏面はわずかに黄褐色を呈する。 ISP-３生育は良好で、胞子の色は灰紫色（Grayish pu
rple）、他はISP-２と同様。 ISP-４胞子の色は灰色（Medium gray)他はISP-２と同
様。 ISP-５生育は弱く、白色の気中菌糸を少し産する。改変チロシン培地メラニン色素は産生しない。なお、
いずれの培地でも可溶性色素はほとんど見られない。

【００１４】糖資化性；（＋）グルコース、イノシトール、フラクトース、ラム
ノース、マンノース、アラビノース（±）キシロース（−）ラフィノース、シュクロース（＋）；良く資化する（−）；資化しない（±）；
その中間同定；本株の性状を同時に実施した Streptomyces roch
ei type strain IFO 12908の性状と比較すると、表１に
示すような相違点が見られる。

【００１５】

【表１】

【００１６】このような相違はあるものの種が異なるほ
どの差ではなく、ストレプトミセス・ロチェイ（ Strep
tomyces rochei )の種内変動の範囲であるので、本発明
者らは本菌株をストレプトミセス・ロチェイ（ Strepto
myces rochei ) Mer-N7167と命名した。なお、本菌株
は、平成６年１１月２８日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所に FERM P-14670 として寄託されている。

【００１７】血管新生阻害活性のスクリーニング法とし
て、ラット大動脈片をコラーゲンゲル内にて培養した場
合に観察される管腔形成の阻害度を指標とした（ Nicos
ia R.F., Lab. Invest., 63, 115, 1990）。また、血管
内皮細胞に対する増殖抑制作用及びスレオニン tＲＮＡ
合成酵素阻害活性をも測定した。

【００１８】ストレプトミセス属の微生物を通常の適切
な培養条件にて培養後、培養液を清澄濾過したのちブタ
ノールまたはメチルイソブチルケトンなどの有機溶媒を
加え抽出し、有機溶媒層を減圧下濃縮する。次いでメタ
ノールにて抽出し、石油エーテル（light petroleum)な
どで処理し粗抽出物を得る。次いでシリカゲルなどを用
いる吸着クロマトグラフィー、LH-20 ゲルクロマトグラ
フィー、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフ
ィー、ペーパークロマトグラフィーなどを適宜利用して
分画し、活性スクリーニングにより活性画分を確認す
る。上記手法を適宜組み合わせることにより活性物質を
単離することができる。吸着クロマトグラフィーに使用
する溶媒としては、クロロホルム、メタノール、アセト
ン、ヘキサン、トルエンなど通常使用される有機溶媒を
用い、適宜濃度を選択、組み合わせて使用することがで
きる。結晶化の溶媒としてはクロロホルムとヘキサン、
アセトン、四塩化炭素などの組み合わせを適宜選択して
用いることができる。一つの手法として M. Lumbらの方
法がある（Nature, 206, 263, 1965）。単離した化合物
の構造解析は、元素分析、GC-MS、 NMR、融点、紫外・赤
外吸収スペクトルなど常法の手法によって行うことがで
きる。

【００１９】本発明化合物は強力な血管新生阻害活性を
有することから、異常な血管新生が観察されている疾
患、例えばリウマチ性関節炎、固形癌、アテローム性動
脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管腫、乾せんなどの予防
剤として、また治療薬として期待されるものである。

【００２０】該化合物を各種疾患治療・予防剤として投
与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロッ
プ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧
剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投
与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種
類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約 1
mg〜100mg を１日１〜数回にわけて投与する。

【００２１】製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法
により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する
場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、
その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し
支えない。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によ
りpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加
し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。

【００２２】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、例中の％は特記しない限り重量基準である。

【００２３】実施例１．精製方法種培地として、グリセロール 2.0％、グルコース 2.0
％、大豆粉 2.0％、酵母エキス0.5 ％、塩化ナトリウム
0.25％、炭酸カルシウム0.32％及び微量金属溶液（硫酸
銅0.25％、塩化マンガン0.25％及び硫酸亜鉛0.25％の溶
液を予め調製）0.2 ％の組成からなる培地を用いた。生
産培地としては、種培地のグリセロール 2.0％のかわり
にポテト澱粉 2.0％とし、他の組成は同じものを用い
た。ジャー培養に際しては、消泡剤0.05％を添加した。
殺菌前pHを 7.4に調整して使用した。前記の種培地 100
mlを分注した 500ml容三角フラスコを 120℃で15分間殺
菌し、これにMer-N 7167株の斜面寒天培養の１白金耳を
接種し、28℃で３日間振盪培養して種培養とした。生産
培地15Ｌを、各30Ｌ容ジャー・ファーメンター２基に分
注して 120℃、20分間殺菌し、種培養を各 100mlずつ接
種し、28℃で５日間通気（0.5vvm）、攪拌（300rpm）培
養した。培養終了後遠心分離して上清を集め、pH７に調
整して、ダイヤイオンHP-20 （三菱化成社製）３Ｌに吸
着させ、カラムに充填し、水洗浄、20％メタノール洗浄
後、80％アセトンで溶出させた。溶出液約３Ｌを、減圧
下で濃縮してアセトンを除去し、水を加えて約１Ｌにし
て、酢酸エチル１Ｌで２回抽出した。抽出液を減圧下で
濃縮乾固し、黒褐色の油状物質を得た。この油状物質を
少量のメタノールに溶解し、セファデックス LH-20（フ
ァルマシア・バイオテク社製）カラム（400ml ）の上部
に載せ、メタノールで展開し、活性画分を濃縮乾固し
た。次に少量のクロロホルム：メタノール＝50：１に溶
解し、シリカゲル60（メルク社製）カラム（150ml)の上
部に載せ、クロロホルム：メタノール＝50：１、20：１
及び10：１、各 500mlで溶出させた。クロロホルム：メ
タノール＝50：１〜20：１で溶出される活性画分を集
め、濃縮乾固した。次に少量のアセトンに溶解し、少量
のシリカゲル60と混ぜ、減圧下で濃縮乾固させ、シリカ
ゲル60カラム（150ml)の上部に載せ、ヘキサン：アセト
ン＝３：１、２：１及び１：２、各 500mlで溶出させ
た。ヘキサン：アセトン＝３：１〜２：１で溶出される
活性画分を集め、減圧下濃縮乾固した。この試料を少量
のトルエン: アセトン＝５：１に溶解し、シリカゲル60
カラム（50ml）の上部に載せ、トルエン：アセトン＝
５：１、４：１及び２：１、各 200mlで溶出させた。ト
ルエン：アセトン＝５：１で溶出される活性画分を集
め、減圧下濃縮乾固した。この試料をCOSMOSIL 3C₁₈ カ
ラム（3 μm, 4.6x100mm）、フォトダイオードアレイ検
出器を用いて分析したところ、図１に示すように、ボレ
リジンと同一紫外吸収スペクトルを示す３種のピーク
（それぞれＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３と記す。）を確認し
た（移動相：アセトニトリル:10mM りん酸二水素カリウ
ム緩衝液、 pH3.5＝１：１、イソクラティック溶出、１m
l/min、ＯＤ₂₅₄nm ）。なお、図１のメインピークはボ
レリジンである。

【００２４】実施例２Ｐ−１およびＰ−２の精製と構
造決定 Mer-N7167 株のタンク培養液170 Ｌを遠心分離して上清
140 Ｌを得、これをpH7に調整してダイヤイオンHP-20
７Ｌに吸着させた。HP-20 樹脂を集めカラムに充填し水
洗後、80％アセトン水、20Ｌで溶出した。溶出液を減圧
下濃縮してアセトンを留去し、水を加えて４Ｌにして、
酢酸エチル４Ｌで２回抽出した。酢酸エチル相を併せ減
圧下濃縮乾固し、黒褐色油状物質27g を得た。この油状
物質をメタノールで調製したセファデックスLH-20 カラ
ムに付し、メタノールで展開し、TLC （メルク社製シリ
カゲル60、No.5715、展開溶媒：クロロホルム：メタノー
ル＝９：１、硫酸発色、Rf値 0.42 ）にてモニターしな
がら、ボレリジンを含む画分を集め濃縮乾固した。得ら
れた試料をシリカゲル60（750ml)のカラムに吸着させ、
クロロホルム２Ｌで洗浄後、クロロホルム：メタノール
＝49:1および19:1、各2.5 Ｌで溶出し、ボレリジンを含
む画分を集め濃縮乾固した。得られた試料を更にシリカ
ゲル60(750ml) のカラムに吸着させ、ヘキサン：アセト
ン＝4:1 、２Ｌで洗浄後、同じく 7:3の混合溶媒で溶出
した。ボレリジンを含む画分を集め濃縮乾固し、5.95ｇ
の精製物を得た。生物活性を示すこの精製物をクロロホ
ルム−ヘキサンの混合溶媒から結晶化し、ボレリジンの
無色針状結晶4.29ｇを得た。母液を濃縮乾固し（1.58
g)、少量のジメチルスルホキシドに溶解した後、アセト
ニトリル：10mMりん酸二水素カリウム緩衝液(pH3.5) ＝
2:3 であらかじめ緩衝化しておいたYMC-GEL ODS-AM 120
-S50（ YMC社製、600ml)のカラムに付した。同じ組成の
混合溶媒２Ｌで洗浄後、9:11さらに1:1 の組成の混合溶
媒各２Ｌで溶出し、溶出液をHPLCでモニターしながら、
ボレリジンを純粋に含む画分と目的物質を含む画分とに
分けた。両画分ともにアセトニトリルを留去し、酢酸エ
チルで抽出、酢酸エチルを留去後凍結乾燥して、それぞ
れ820mg と107mg の白色粉末を得た。目的物質を含む試
料は、さらにHPLC( YMC-Pack D-ODS-S-5カラム、5 μm、
20x250mm、移動相、アセトニトリル：10mMりん酸二水素
カリウム緩衝液 pH3.5＝11:9、イソクラティック溶出、1
5ml/min、OD₂₅₄nm ）により分取し、同様に脱塩処理を
行い、ボレリジン12mg、Ｐ−１ 59mg 、Ｐ−２ 11mg を
純粋な白色粉末として単離した。

【００２５】Ｐ−１の物理化学的性状１）融点： 88-90℃ ２）高分解能EI Mass スペクトル：測定の結果、m/z48
9.3087 にM⁺が観測され、分子式はＣ₂₈Ｈ₄₃ＮＯ₆ であ
ると決定した。質量計算値はm/z489.3090 である。３）¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル：図２に示した。４）¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中での
測定結果を表２に示した。

【００２６】Ｐ−２の物理化学的性状１）融点： 88-91℃ ２）高分解能EI Mass スペクトル：測定の結果、m/z48
9.3087 にM⁺が観測され、分子式はＣ₂₈Ｈ₄₃ＮＯ₆ であ
ると決定した。質量計算値はm/z489.3090 である。３）¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル：図３に示した。４）¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中での
測定結果を表２に示した。

【００２７】

【表２】

【００２８】以上の結果から、Ｐ−１は下記式（II）で
表される、ボレリジンの11位における立体異性体（化合
物II）、Ｐ−２は下記式(III) で表される、ボレリジン
の14および15位の二重結合に関する幾何異性体（化合物
III)であると決定した。

【００２９】

【化３】

【００３０】実施例３Ｐ−３の分離と構造解析図１に記載のHPLC解析クロマトに基づいて、Ｐ−３をHP
LC−質量分析計（LC-Mass)にて分析した結果、ボレリジ
ンより分子量が14少ない類縁体であり、図４に示すマス
スペクトル及び図５に示すマススペクトルの開裂様式よ
り、下記式 (IV) で表される10−デスメチルボレリジン
（化合物IV）であることが判明した。

【００３１】

【化４】

【００３２】実施例４Ｐ−４の単離と構造解析 Mer-N7167 株を、グリセロール2.0 ％、酵母エキス0.2
％、コーンスティープリカー2.0 ％および塩化ナトリウ
ム0.3 ％からなる培地にて培養し、得られた培養液の一
部をそのまま等量の1-ブタノールで抽出し、濃縮乾固し
て得た粗抽出物を図１と同様の条件でHPLC分析したとこ
ろ図６に示すごとく、これまでのＰ−１、２、３とは異
なるＰ−４が存在することが確認された。そこで以下の
方法によりＰ−４を単離した。全培養液15ＬをpH３に調
整し、1-ブタノール10Ｌを加え、１時間攪拌後遠心分離
し、1-ブタノール層を減圧下濃縮乾固した。得られた油
状物質を酢酸エチル、水、各々１Ｌに分配し、酢酸エチ
ル層を分離し、減圧下濃縮乾固して黒褐色油状物質4.8g
を得た。次にこの粗抽出物を少量のジメチルスルホキシ
ドに溶解し、YMC-GEL ODS-AM 120-S50のカラム（600ml)
に付した。アセトニトリル：10mMりん酸二水素カリウム
緩衝液 pH3.5＝２：３の混合溶媒２Ｌで洗浄後、17:25
さらに9:11の組成の混合溶媒各２Ｌで溶出し、溶出液を
HPLCでモニターしながら、ボレリジンを純粋に含む画分
とＰ−４を含む画分とに分け、脱塩処理後凍結乾燥し
て、それぞれ617mg と240mg の白色粉末を得た。Ｐ−４
を含む画分は、さらにシリカゲル60カラム（150ml)に吸
着させ、 TLC（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝
４：１、Rf値＝0.11）にてモニターしながら、クロロホ
ルム：メタノール＝49:1、 19:1および４：１の混合溶媒
で溶出し、ボレリジンおよびＰ−４をそれぞれ60mgおよ
び98mgの純粋な白色粉末として単離した。Ｐ−４は、ヘ
キサン−アセトンの混合溶媒から結晶化し、無色結晶51
mgを得た。

【００３３】Ｐ−４の物理化学的性状１）融点：108-111 ℃ ２）高分解能EI Mass スペクトル：測定の結果、m/z50
8.3041 にM⁺が観測され、分子式はＣ₂₈Ｈ₄₄Ｏ₈ である
と決定した。質量計算値はm/z508.3036 である。３）紫外吸収スペクトル： λ_maxMeOH 254nm(ε14,900) λ_max0.01N HCl-MeOH 260nm(ε15,300) λ_max0.01N NaOH-MeOH 249nm(ε16,500) ４）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム中での拡散反射
法による測定結果を図７に示した。５） ¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル：図８に示した。６）¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中での
測定結果を表３に示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】以上の結果から、Ｐ−４は、Ｐ−１の12位
のニトリル基がカルボキシル基に置き換わった、式
（Ｖ）で表されるボレリジン類縁体（化合物Ｖ）である
と決定した。

【００３６】

【化５】

【００３７】実施例５．血管新生阻害活性ラット大動脈片をコラーゲンゲル内にて培養し、観察さ
れる管腔形成の阻害度を血管新生阻害活性とした。Spra
gue-Dawley系雄ラット（８〜12週齢）より摘出した大動
脈をハンクス液で洗浄しながら周辺の脂肪組織を丁寧に
除去した。大動脈を切開し２mm角の切片を作成した後、
24ウエルプレート内へ内皮細胞面を上にして静置する。
次に、中性化したタイプＩコラーゲンゲル（Cellmatrix
type Ｉ−Ａ：新田ゼラチン）500 μl を各ウエルへ注
ぎクリーンベンチ内で室温下約20分間放置してゲルを固
まらせた。ゲルが固まったことを確認した後 500μl の
MCDB 131 （クロレラ工業社製）培地を各ウエルに加え
CO₂ インキュベーター（５％CO₂)で 37 ℃下培養した。
翌日試験検体を含むMCDB 131培地と培養液を交換し、さ
らに培養４日目に再度試験検体含有のMCDB 131培地と交
換して培養を続けた。そして、試験検体添加後７日目の
時点で、大動脈の周囲に形成された毛細血管数を顕微鏡
を用いて測定した。

【００３８】その結果は表４に示すごとく、Ｐ−１、Ｐ
−２、Ｐ−４は濃度依存的に血管新生を阻害した。その
IC₅₀値はそれぞれ 8.4ng/ml、4.4ng/ml、2.8ng/ml であっ
た。なお、阻害活性はサンプル無添加群の毛細血管数と
の比較で表した。

【００３９】

【表４】

【００４０】実施例６．血管内皮細胞に対する増殖抑制
作用ヒト血管内皮細胞（HUVEC:クラボウ）を EGM培地（クラ
ボウ）に30,000cells/mlの濃度で懸濁した後、96ウエル
プレート中に 100μl ずつ添加する。37℃で一晩培養し
た後に、同じ培地で希釈した検体含有液を各ウエルに10
0 μl ずつ添加し３日間培養した。そして、50μl の0.
33％ MTT液を各ウエルに加えて 2-3時間培養した後、培
養液を吸引して除いた。次いで、100 μl のジメチルス
ルホキシドを加えて溶解し、540nm の吸光度をプレート
リーダーを用いて測定した。阻害濃度は無処理群との比
較によって算出した。その結果、Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−
４のIC₅₀値はそれぞれ39ng/ml, 36ng/ml, 10μg/mlであ
り、前二者に強い増殖阻害作用が確認された。

【００４１】実施例７．スレオニンtRNA合成酵素阻害
作用スレオニンtRNA合成酵素の調製は以下の方法で行った。
１×10⁸ 個のヒト鼻咽喉癌(KB)細胞を集め PBSで１回洗
浄後、10mlのlysis buffer(10ml Tris HCl pH7.5, 50mM
KCl, 1mM MgCl₂, 0.1mM DTT, 20% glycerol, 1% NP-4
0) に懸濁し氷冷下30分間放置する。16000rpm(KUBOTA R
K-2000T,RA2 rotor) で20分間遠心して得た上清を -20
℃で保存した。スレオニンtRNA合成酵素阻害作用の測定
は200 μlの反応液にて実施した。50mM HEPES pH8.2, 5
mM ATP, 2.5mM CTP, 40mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.1mM EDT
A, 200 μg/ml Rabbit liver tRNA, 100 μM[³H]Threon
ine, 100 μg/ml酵素溶液に検体を加え30℃で45分間反
応を行った。次に、反応液の100 μl を2.5ml の冷却し
ておいた10％ TCA溶液に加えてtRNAを沈殿させた。グラ
スフィルター（φ 2.1cm) を用いて沈殿を濾取し、10％
TCA(5ml×３), EtOH(２ml×２) の順に洗浄した。そし
て、液体シンチレーションカウンターにより沈殿したス
レオニン量を測定した。その結果、ボレリジン、Ｐ−１
およびＰ−２は酵素阻害作用を示し、そのIC₅₀値はそれ
ぞれ0.06μg/ml、 0.95 μg/ml、 0.75 μg/mlであっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で行ったボレリジン画分のHPLC 3C
₁₈ カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。

【図２】重クロロホルム中でのＰ−１の ¹Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図３】重クロロホルム中でのＰ−２の ¹Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図４】Ｐ−３のLC-Mass チャートである。

【図５】Ｐ−３のマススペクトル開裂様式を示す図で
ある。

【図６】実施例４で行ったボレリジン画分のHPLC 3C
₁₈ カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。

【図７】臭化カリウム中でのＰ−４の赤外吸収スペク
トルである。

【図８】重クロロホルム中でのＰ−４の ¹Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 31/365 ＡＥＤＡ６１Ｋ 31/365 ＡＥＤＣ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｐ 17/08 //(Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:465）Ｃ０７Ｍ 9:00 (72)発明者横山由美茨城県新治郡新治村大畑1510−38 (72)発明者渡辺吉雄神奈川県藤沢市藤が岡２−22−３ (72)発明者土橋和之神奈川県秦野市南が丘３−４−１５− 204

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩
またはその水和物。【化１】（式中、Ｒ₁ は水素原子または低級アルキル基、Ｒ₂ は
シアノ基またはカルボキシル基を意味する。）
【請求項２】一般式（Ｉ）において、Ｒ₁がメチル
基、Ｒ₂ がシアノ基であり、12Z、 14Eの立体配置を有す
る請求項１に記載の化合物、その塩またはその水和物。
【請求項３】一般式（Ｉ）において、Ｒ₁ がメチル
基、Ｒ₂ がシアノ基であり、12Z、 14Zの立体配置を有す
る請求項１に記載の化合物、その塩またはその水和物。
【請求項４】一般式（Ｉ）において、Ｒ₁ が水素原
子、Ｒ₂ がシアノ基であり、12Z、 14Eの立体配置を有す
る請求項１に記載の化合物、その塩またはその水和物。
【請求項５】一般式（Ｉ）において、Ｒ₁ がメチル
基、Ｒ₂ がカルボキシル基であり、12Z、 14Eの立体配置
を有する請求項１に記載の化合物、その塩またはその水
和物。
【請求項６】請求項１ないし５のいずれか一項に記載
の化合物、その塩またはその水和物を有効成分とする医
薬。
【請求項７】ストレプトミセス・ロチェイ（Streptom
yces rochei) Mer-N7167 (FERM P-14670 )を栄養培地中
で培養し、その培養液から請求項１ないし５のいずれか
一項に記載の化合物、その塩またはその水和物を採取す
ることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に
記載の化合物、その塩またはその水和物の製造方法。